CN105907757B - Linc00052基因的用途及其相关药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及LINC00052基因的用途及其相关药物。本发明通过广泛而深入的研究，首次发现，LINC00052在肝癌细胞中低表达。并且，通过体外与体内实验均证实过表达LINC00052能够明显减弱肝癌细胞的侵袭能力、抑制肝癌的癌细胞转移。基于此，本发明提供了LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的全新用途，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

LINC00052基因的用途及其相关药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及LINC00052基因的用途及其相关药物。
背景技术
肝细胞肝癌，简称HCC，是一种常见的恶性肿瘤。流行病学统计发现HCC的发病率在世界上众多常见的固体肿瘤中排在第五位，死亡率却排在第三位，并且每年有100万以上的人新患此病。由于HCC的恶性程度极高，发生发展迅速，病人预后差，导致每年有超过50万患者死于肝癌。并且在我国，肝癌的发病率占全世界的50％，发病率和死亡率均高于世界平均水平。目前，肝癌根治性切除后病人的5年生存率极低，其主要致死原因是肝癌细胞的侵袭和转移。因此，深入研究肝癌细胞的侵袭和转移机制十分重要。
侵袭和转移是肿瘤细胞生物学特性之一，是临床上导致大部分病人死亡的主要原因，但目前没有好的防治方法。癌症的转移是指肿瘤细胞脱离原发生长部位，通过各种途径的转运，在机体远隔部位的器官和组织继续生长，形成同样质肿瘤(转移瘤)的过程。癌症的侵袭转移是一个多步骤的复杂的生物学过程，但都包含以下重要步骤：细胞从原发部位脱离、进入血液或淋巴系统、在循环中进入靶器官以及在靶器官中增殖侵袭。肝细胞癌的转移可分为远处转移和肝内复发(即肝内转移)。肝癌细胞的侵袭性源于其遗传性状的改变，涉及到多种参与肝癌转移的基因，如癌基因、抑癌基因、免疫基因、肿瘤细胞间黏附分子、新生血管的形成基因、蛋白水解酶基因、细胞的侵袭能力等等，这些因素不仅仅是促进肝癌转移发生的主要因素，并且使得肿瘤细胞能适应微环境从而成功转移。为了更好了解肝癌转移的机制，寻找并定位参与了肝癌转移这一活动的基因显得十分重要。
肿瘤侵袭与转移受很多基因的调控，其中包括ncRNAs。Long non-protein codingRNA，简称LncRNAs，是ncRNAs中的一大类，参与了肿瘤侵袭与转移的调控。Long non-codingRNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的、不能编码蛋白质的RNA。研究者对LncRNA的研究是最近几十年才开始的。LncRNAs是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能，并且在很长的一段时间里，LncRNAs被认为是基因组转录的“噪音”。但是，随着高通量基因测序技术等一系列高端、精细技术的发展，越来越多的LncRNAs被认为对原核生物mRNA的表达起着重要的调控起作用。同时，LncRNAs还参与了很多重要的生命调节活动，如：表观遗传调控、剂量补偿效应、细胞周期调控、细胞分化调节、基因组印记、记忆染色质修饰、转录激活、核内运输、转录干扰、RNA的合成及修饰等多中重要的调控过程。
但是，现有技术中尚未出现LINC00052基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于公开与LINC00052基因相关的治疗方法及药物，研究LINC00052在肿瘤细胞的迁移过程中的作用。
为了实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面公开了：分离的LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者用于制备或筛选肿瘤诊断药物中的用途。
优选地，所述肿瘤选自肝癌。
优选地，所述分离的LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将LINC00052基因直接应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将LINC00052基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
优选地，所述将LINC00052基因直接应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将LINC00052基因作为针对肿瘤细胞的药物或制剂成分之一，制备肿瘤治疗药物。
优选地，所述将LINC00052基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将LINC00052基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以促进或提高LINC00052基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的过表达LINC00052质粒即是以LINC00052基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖、迁移作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将LINC00052基因作为作用对象。
优选地，所述肿瘤治疗药物为能够特异性促进LINC00052基因的转录或翻译，或能够特异性促进LINC00052的表达或活性的分子，从而提高肿瘤细胞中LINC00052基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
优选地，所述肿瘤治疗药物能够明显减弱肝癌细胞的侵袭能力、抑制肝癌的癌细胞转移。
优选地，所述分离的LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤诊断药物，是指将LINC00052基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备或筛选。
通过real time PCR方法检测LINC00052基因在A554中及其他肝癌细胞系中的表达水平。研究发现：LINC00052基因在肝癌细胞中的表达量显著低于正常肝细胞。提示LINC00052基因可能作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用；LINC00052基因的表达水平可能成为肿瘤诊断的标志。
所述通过分离的LINC00052基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：ncRNA、反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够提高LINC00052基因的转录或翻译，或者足够提高LINC00052的表达或活性的剂量。以使LINC00052基因的表达至少被提高50％、80％、90％、95％或99％。
本发明的第二方面，提供了LINC00052基因促进剂在制备肿瘤治疗药物中的用途。
优选地，所述LINC00052基因促进剂是指能够提高LINC00052基因表达水平的物质。进一步地，所述LINC00052基因促进剂能够促进LINC00052基因的转录或翻译，或促进LINC00052的表达或活性。
所述LINC00052基因促进剂包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：ncRNA、反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够提高LINC00052基因的转录或翻译，或者足够提高LINC00052的表达或活性的剂量。以使LINC00052基因的表达至少被提高50％、80％、90％、95％或99％。
所述肿瘤细胞选自其生长与LINC00052的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优地，所述肿瘤细胞选自肝癌。
本发明的第三方面，提供了一种肿瘤治疗药物，所述肿瘤治疗药物的活性成分中含有LINC00052基因过表达载体。
优选地，所述肿瘤选自肝癌。
优选地，所述过表达载体由pcDNA3.1(+)质粒改造获得，即在pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点区域中插入一段包含LINC00052基因的插入序列。
优选地，所述插入序列的插入位点为EcoRV和HindⅢ酶切位点之间。
本发明的第四方面，以过表达为手段，研究了LINC00052在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性促进LINC00052的转录或翻译，或能够特异性促进LINC00052的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
所述肿瘤细胞选自其生长与LINC00052的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的，所述肿瘤细胞选自肝癌。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够促进LINC00052基因的转录或翻译，或者足够促进LINC00052的表达或活性的剂量。进一步的，所述LINC00052基因的表达至少被提高50％、80％、90％、95％或99％。
所述分子可以选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：ncRNA、反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有LINC00052基因的启动子序列或LINC00052基因的信息序列。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过促进LINC00052基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效促进LINC00052基因表达水平的物质给药于患者。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过广泛而深入的研究，首次发现，LINC00052在肝癌细胞中低表达。并且，通过体外与体内实验均证实过表达LINC00052能够明显减弱肝癌细胞的侵袭能力、抑制肝癌的癌细胞转移。基于此，本发明提供了LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的全新用途，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1：pU21质粒“捕获”基因的鉴定。
图2：LINC00052在A554细胞系和其他肝癌细胞系中的表达；其中，A：LINC00052在A554和对照组SMMC7721细胞的表达；B：LINC00052在几种肝癌细胞系中的表达，正常肝细胞LO2作为对照组，以β-actin为内参。
图3：Real time PCR实验检测LINC00052的干扰效率及过表达稳定细胞系，其中，A：LINC00052干扰RNA序列干扰效率检测，siRNA1的干扰效率约是78％；siRNA2的干扰效率约是20％；B：LINC00052过表达质粒过表达效率检测，过表达效率大约是16倍，亦即1600％；C：LINC00052过表达稳定细胞系过表达效率检测，以β-actin为内参。
图4：Transwell小室实验检测LINC00052对肝癌SMMC7721细胞侵袭能力的影响。
图5：裸鼠转移模型，A：转移模型中的裸鼠；B：肿瘤细胞的肝转移情况；C：肿瘤细胞的肺脏转移情况。
图6：HE检测裸鼠转移模型中肝组织和肺组织癌细胞的浸润情况.A:HE染色检测肿瘤细胞在裸鼠转移模型中肝脏中的转移情况。B:HE染色检测肿瘤细胞在裸鼠转移模型中肺脏中的转移情况。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1 5’-Full RACE实验及基因测序确认被pU21质粒捕获的基因
通过一种能够随机插入并整合到细胞染色体中的捕获载体pU21质粒捕获、G418抗生素筛选成功转染pU21质粒的稳定细胞系、通过Transwell侵袭实验和细胞划痕实验筛选出与原始SMMC7721细胞株细胞侵袭和迁移能力发生变化的单克隆细胞株，通过5'RACE实验、分子生物学等方法确定被获载体pU21质粒捕获的基因。
本实验采用的基因捕获载体pU21质粒是一种无启动子、含抗生素筛选基因和LacZ报告基因的载体。pU21质粒具有一个剪接受体SA(Splicing Acceptor)片段，该片段能有效地随机插入到细胞的染色体中。由于pU21质粒本身没有启动子，其抗生素筛选基因的表达完全依赖于该质粒所整合的基因的启动子。一旦pU21质粒整合在具有强启动子的基因中，其抗性筛选基因就会出现强表达，如果该质粒整合在弱启动子的基因，则抗性筛选基因就弱表达甚至不表达。捕获载体可以通过电击或病毒转染方式进入细胞并随机地整合到细胞的染色体上某个基因中，利用基因自身的转录启动子开始转录基因捕获载体的序列。由于基因捕获载体中有翻译终止信号，理论上将会抑制该基因的表达，从而达到敲除一半该基因的效果。
成功整合pU21质粒基因组后，我们得到的单克隆细胞系的迁移和侵袭能力发生了不同程度的改变。是什么基因被pU21质粒“捕获”后导致了这些单克隆细胞系功能的改变呢？因此，我们将侵袭能力、迁移能力发生较大变化的细胞系，如A16、A18、A28、A26、A22、A38、A554等细胞系用于做5’-Full RACE实验。在A554细胞系中我们设计的引物扩了一条约500bp的条带。然后我们将这些产物进行T克隆后进行测序。结果显示，在A554细胞系中，被pU21质粒捕获的基因是long intergenic non-protein coding RNA 52(LINC00052)(图1.A,B)。进一步检测发现，该基因在A554细胞系中的表达被抑制(图1.C)。
实施例2LINC00052在A554细胞及其他几种肝癌细胞中表达降低
我们用real time PCR进一步检测了LINC00052在A554中及其他肝癌细胞系中的表达情况。实验结果显示，LINC00052在A554细胞中的表达比未转染pU21质粒的SMMC7721细胞表达下降，同时，我们检测了LINC00052基因在SMMC7721、SK-Hep1、Hu7、HepG2和AD38五种肝癌细胞系中的表达情况，正常人肝脏细胞LO2为对照组。实验结果显示，在这五种肝癌细胞中，LINC00052的表达均比正常肝脏细胞LO2表达降低(图2)。这说明LINC00052可能与肝癌的发生发展有关。
实施例3LINC00052能抑制体外肝癌细胞SMMC7721的侵袭能力
为了检测LINC00052是否与肝癌的侵袭能力有关，我们做了Transwell小室实验。用LINC00052的过表达质粒和合成的干扰RNA转染到肝癌SMMC7721细胞中，通过划痕实验和侵袭实验研究，LINC00052对肝癌细胞的侵袭转移能力的影响。
根据实验需要构建相应的重组质粒，构建质粒的引物如表1所示。由于LINC00052是ncRNA，故我们在构建LINC00052的过表达质粒时，扩增其全长。因此将该基因开头的20bp和结尾的20bp作为扩增片段的上游引物和下游引物，基因组DNA为模板扩增，pcDNA3.1(+)质粒为载体，EcoRV/HindⅢ为双酶切位点，构建pcDNA3.1-LINC00052过表达重组质粒。质粒构建好后提取质粒进行基因测序，确定质粒中插入片段是否正确。然后将重组过表达质粒转染SMMC7721细胞，提取总RNA进行逆转录成cDNA进行real time PCR实验，检测过表达质粒的过表达效率。
表1
Real time PCR primer Primer sequence(5’-3’) SEQ ID NO
LINC00052F CCTGAAGTTTCTCCATGAATTGTG 1
LINC00052R GAGGGAGGGAGACTGAGATT 2
β-actin F GTGGATCAGCAAGCAGGAGT 3
β-actin R TGTGTGGACTTGGGAGAGGA 4
LINC00052过表达F ACTCAGCTCTCTCACCATGC 5
LINC00052过表达R GGCCTTGTATAATAACTGGT 6
我们合成了两条LINC00052的干扰序列(分别为siRNA1和siRNA2)以及一条对照序列(NC)，具体序列详见表2。将干扰RNA转染SMMC7721细胞，提取总RNA进行逆转录后进行real time PCR实验，检测干扰RAN的干扰效果。
表2
Real time PCR primer Sequence(5’-3’) SEQ ID NO
siRNA1 CAUGCAGUGAUGUGAAUAATT 7
siRNA2 GAGCUUGGCAUAUCUGAAATT 8
NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 9
实验结果显示，LINC00052的两条siRNAs中，siRNA1的干扰效率最好，高达约78％。因此后续实验将用siRNA1来完成(图3A)。同时，LINC00052的过表达质粒构建成功(图3B)。为了后续动物模型实验，成功构建了LINC00052的过表达稳定细胞系，并用real timePCR实验检测单克隆细胞的过表达效率，筛选时，共采用6株细胞，最终筛选出表达LINC00052的量最高最稳定的过表达稳定细胞系，用于后续试验(图3C)。
如图4，实验结果显示，过表达LINC00052基因以后，与pcDNA3.1对照组相比，SMMC7721细胞的侵袭能力明显减弱，而干扰了LINC00052基因以后，与NC对照组相比，SMMC7721细胞的侵袭能力明显增强(图4)。这说明LINC00052基因能影响肝癌细胞SMMC7721细胞的侵袭能力。
实施例4LINC00052能抑制体内肝癌细胞SMMC7721的侵袭能力
为了探讨LINC00052在体内对癌细胞转移的影响，构建该基因的过表达质粒和合成其干扰RNA检测该基因在肿瘤细胞侵袭、迁移、增殖等方面的功能，将捕获基因的过表达稳定细胞系和干扰稳定细胞系分别注入BALB/c裸鼠肝脏，构建体外移植瘤模型和转移模型，检测该基因是否在体内能影响肿瘤发生发展。
LINC00052干扰实验组A554细胞(siRNA1干扰组)接种后第16天，有一只裸鼠身体状况极差，枯瘦如柴，接种后第19天死亡，另外有几只裸鼠也出现身体状况极差，枯瘦如柴的状态。为了防止实验组裸鼠再次死亡，在接种肿瘤细胞24天后，全部处死裸鼠。干扰LINC00052的实验组(A554组，siRNA1的干扰效)与对照组(SMMC7721组)相比，实验组的裸鼠体型明显瘦于对照组。过表达LINC00052组(pcDNA3.1-LING00052组)与其对照组(pcDNA3.1组)相比，实验组的裸鼠身体状况比对照组好很多(图5A)。解剖后发现，实验组(A554组)裸鼠的胸腔肋骨上有很多白色颗粒，而对照组(SMMC7721组)裸鼠的胸腔肋骨上基本上没有白色颗粒。过表达LINC00052组(pcDNA3.1-LING00052组)与其对照组(pcDNA3.1组)相比，实验组的裸鼠胸腔肋骨上没有白色颗粒，而其对照组的裸鼠胸腔肋骨上偶尔会发现一两颗白色颗粒。裸鼠尸体解剖后，取出了裸鼠的肝脏、肾脏、心脏和肺等组织，观察癌细胞对这些组织的浸润情况。结果发现，干扰LINC00052的实验组(A554组)与对照组(SMMC7721组)相比，实验组的裸鼠的肝组织上有白色颗粒，对照组上基本上没有。过表达LINC00052组(pcDNA3.1-LING00052组)与其对照组(pcDNA3.1组)相比，实验组的裸鼠的肝组织上组没有白色颗粒，而对照组裸鼠的肝组织是偶尔会发现一两颗白色颗粒(图5B)。但是，干扰LINC00052的实验组(A554组)与对照组(SMMC7721组)相比，实验组的裸鼠的肺组织上布满了白色颗粒，有的肺组织完全被白色颗粒浸润，对照组的肺组织上基本上没有。过表达LINC00052组(pcDNA3.1-LING00052组)与其对照组(pcDNA3.1组)相比，实验组的裸鼠肺组织上没有白色颗粒，而其对照组的裸鼠的肺组织上偶尔会发现一两颗白色颗粒(图5C)。
综上所述，体内实验表明，过表达LINC00052能够抑制移植瘤的癌细胞转移，而干扰LINC00052的表达后能够促进移植瘤的癌细胞的转移。
实施例5HE染色检测转移模型中癌细胞在肝脏和肺中的转移情况
为了了解肿瘤细胞在肝组织和肺组织中的转移情况，我们用实施例4转移模型中的肝组织和肺组织做石蜡切片做HE染色。HE染色结果显示，在肝组织中，与对照组SMMC7721组相比，干扰LINC00052的A554组中，有大量的癌症细胞浸润，并且在肝脏组织中发现大量的淋巴细胞；而过表达LINC00052的pcDNA3.1-LINC00052组中，与其对照组pcDNA3.1相比，发现极少的肿瘤细胞，并且没有淋巴细胞浸润。两对照组中发现少量的癌细胞，没有淋巴细胞(图6A)。在肺组织中，与对照组SMMC7721组相比，干扰LINC00052的A554组中，大量的癌症细胞布满整个肺组织，找不到正常肺组织的形状；而过表达LINC00052的pcDNA3.1-LINC00052组中，与其对照组pcDNA3.1相比，有完整的肺组织形状，发现极少的肿瘤细胞。两对照组中有少量的癌细胞浸润，但是能清晰看到完整的肺组织形状(图6B)。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (7)

1.分离的LINC00052基因用于制备或筛选肝癌治疗药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述分离的LINC00052基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将LINC00052基因直接应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将LINC00052基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
3.LINC00052基因促进剂在制备肝癌治疗药物中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述LINC00052基因促进剂是指能够提高LINC00052基因表达水平的物质。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述LINC00052基因促进剂的活性成分中含有LINC00052基因过表达载体。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述过表达载体由pcDNA3.1(+)质粒改造获得，即在pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点区域中插入一段包含LINC00052基因的插入序列。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述插入序列的插入位点为EcoRV和HindⅢ酶切位点之间。
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