CN109061193A - 糖基化依赖性细胞黏附分子1作为抗肿瘤耐药靶点的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤耐药标志蛋白或/和基因及其作为抗耐药肿瘤药物靶点的用途，该蛋白或/和基因为糖基化依赖性细胞黏附分子1(GLYCAM1)。本发明中揭示了糖基化依赖性细胞黏附分子1对肿瘤药物治疗的影响，并由此提供了糖基化依赖性细胞黏附分子1的抑制剂在制备降低或消除肿瘤化疗和靶向药物耐药性的药物中的用途。糖基化依赖性细胞黏附分子1作为肿瘤耐药标志物及其作为耐药肿瘤预测、诊断以及耐药肿瘤药物设计和筛选的靶点的应用。本发明为克服肿瘤耐药、提高疗效提供新的机理，为抗肿瘤耐药提供新的靶点。

Description

糖基化依赖性细胞黏附分子1作为抗肿瘤耐药靶点的用途

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤防治领域，更具体而言，本发明涉及预测、诊断和治疗肿瘤耐药性领域。本发明中提供了一种新的肿瘤耐药标志物：在肿瘤组织中高表达并导致肿瘤耐药的糖基化依赖性细胞黏附分子1(GLYCAM1，即glycosylation dependent celladhesion molecule 1)，将该蛋白或/和基因作为靶点，可设计出针对该蛋白或/和基因及其相关分子的预测、诊断肿瘤耐药试剂盒，筛选针对该蛋白及其相关分子的治疗肿瘤耐药的药物。

背景技术

恶性肿瘤(癌症)是一类常见的、严重危害人类生命健康的疾病，据世界卫生组织公布的数据显示，每年全球有大约1270万新发癌症病例，并有约760万人死于癌症，预计新发和死亡病例将继续上升，到2030年每年死于癌症的人数将有超过1310万。癌症的常规治疗手段包括外科手术、化学治疗和放射治疗。化学治疗也被人们称为药物治疗，在癌症治疗中一直发挥着重要作用，但是其治疗效果却受到其剂量依赖性毒性的影响，目前药物治疗的效果已经进入平台期。分子靶向治疗指以癌症相关分子作为靶点，将药物、抗体等有效成分靶向定位于癌细胞及相关成分，从而达到治疗癌症的目的。分子靶向治疗具有定向、定位的优势，可以减少用药剂量，提高治疗效果，减少毒副反应，正成为全世界癌症治疗的研究热点。在分子靶向治疗研究过程中，靶点分子的确具有重要意义，可以为癌症的分子靶向治疗提供理论和实践依据。然而与化疗相同，靶向治疗过程中也产生的肿瘤耐药，这成为影响肿瘤治疗效果的一大障碍。对肿瘤耐药发生机制的研究和寻找开发逆转耐药的药物是当前肿瘤防治中的重要研究领域。

为了逆转肿瘤耐药，提高化疗及靶向治疗的疗效，降低耐药风险及延长生存率，本领域迫切需要通过多种方式研究肿瘤耐药发生的机制、肿瘤耐药的关键基因靶点，并根据这些靶点设计治疗肿瘤耐药的新药，从而引导肿瘤耐药靶向性治疗。

糖基化依赖细胞黏附分子1(glycosylation-dependent cell-adhesionmolecule1，GlyCAM1)是一种粘蛋白样内皮糖蛋白，分泌到外周和肠系膜淋巴结的高内皮微静脉中。糖基化依赖细胞黏附分子1蛋白存在于小鼠、牛、山羊及人的乳汁的可溶性乳清成分中，且在泌乳期的乳腺上皮细胞中呈特异性表达，在肺、子宫和耳蜗中也检测到了表达。该基因存在于人的12号染色体上，该序列区域长2.5kbp，被翻译成三个阅读框。糖基化依赖细胞黏附分子1作为L-选择素的配体，它是循环白细胞表面的一种糖结合蛋白，具有参与细胞识别、信号转导以及介导白细胞粘附和淋巴细胞向次级淋巴结的转运等生物学功能，而且在免疫应答、炎症反应等过程中起重要作用。

发明内容

鉴于上述和/或现有肿瘤药物及其应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种肿瘤耐药的关键基因靶点及蛋白靶点，为逆转肿瘤耐药、提高化疗疗效提供更为有效的工具。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗肿瘤耐药靶点，所述靶点为糖基化依赖性细胞黏附分子1和/或其参与的细胞识别、信号转导以及细胞黏附途径。

作为靶点的糖基化依赖性细胞黏附分子1可以包括糖基化依赖性细胞黏附分子1的基因序列(SEQ ID NO:1)、以及糖基化依赖性细胞黏附分子1的蛋白序列(具有不同亚型，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)。

本发明的另一个目的是提供一种糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂在降低和预消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用。所述糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂直接作用于糖基化依赖性细胞黏附分子1、和/或介入糖基化依赖性细胞黏附分子1参与的细胞识别、信号转导以及细胞黏附途径，通过降低或下调糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达发挥抗肿瘤耐药性的作用。

作为本发明所述的靶点蛋白抑制剂在消除或/和降低肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂包括：抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的抗体，糖基化依赖性细胞黏附分子1与受体结合抑制剂，糖基化依赖性细胞黏附分子1介导的代谢途径抑制剂，针对糖基化依赖性细胞黏附分子1基因编码序列的反义寡核苷酸或RNA干扰分子。

作为本发明所述的靶点蛋白抑制剂在消除或/和降低肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的抗体是对具有特异性的抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的单克隆抗体和多克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段。

作为本发明所述的靶点蛋白抑制剂在消除或/和降低肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述具有免疫活性的抗体片段包括：抗体重链、抗体轻链、(Fab)2或Fab’片段、基因工程改造的单链Fc分子或嵌合抗体。

作为本发明所述的靶点蛋白抑制剂在消除或/和降低肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述针对糖基化依赖性细胞黏附分子1基因编码序列的RNA干扰分子包括：shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA。

作为本发明所述的靶点蛋白抑制剂在消除或/和降低肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用的一种优选方案，其中：所述肿瘤包括：乳腺癌、肝癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌或膀肤癌。

本发明的还一个目的是提供一种药物组合物，其包括：所述糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂、肿瘤治疗剂以及药学上能够接受的载体或赋形剂。

作为本发明所述药物组合物的一种优选方案，其中：所述肿瘤治疗剂包括肿瘤化疗药物、肿瘤靶向药物以及其他所有用于治疗肿瘤疾病的药物，包括过继性细胞免疫治疗的特异性细胞等。

作为本发明所述药物组合物的一种优选方案，其中：所述药学上能够接受的载体或赋形剂包括：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇中的一种或几种。

本发明的再一个目的是提供一种筛选抗耐药的肿瘤治疗药物的方法，其包括：

(a)提供表达糖基化依赖性细胞黏附分子1的肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物；

(b)将候选药物与步骤(a)中提供的肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物接触，作为给药组；

(c)检测给药组中糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物的糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平进行比较；

如果检测结果显示，给药组的糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平显著低于对照组，则表明该候选药物是抗耐药的肿瘤治疗药物。

本发明的有益效果：

(1)揭示了糖基化依赖性细胞黏附分子1与肿瘤耐药性之间的关系，为设计和筛选耐药肿瘤药物提供了新的途径和靶点；

(2)提供了通过抑制糖基化依赖性细胞黏附分子1及其相关信号传导途径来提高肿瘤对肿瘤治疗的敏感性的新方法，从而起到了提高肿瘤治疗效果、减少肿瘤治疗剂用量、缓解患者痛苦的积极作用，具有临床的实用性及潜在、良好的应用前景。

附图说明

图1为RNA质量检测结果图。Lane 1、2、3为曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H的三个重复样本；Lane 4、5、6为对照组细胞株BT-474/C的三个重复样本。

图2为表达谱芯片检测曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H与对照组细胞株BT-474/C之间GLYCAM1基因的相对表达。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明的具体实施方式做详细的说明。本发明所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H的构建

复苏普通的人乳腺癌细胞BT-474(购自中国科学院上海细胞库)至25cm细胞培养瓶中，加入含10％特级胎牛血清的RPM工1640培养基培养，所述25cm细胞培养瓶置于37℃、5％的C02培养箱中培养待用，待单层培养细胞生长至80％汇合，即对数生长期后，用浓度为0.25％的胰酶消化，进行一分为二的传代培养至两个新的25cm细胞培养瓶中。继续置于37℃、5％的C02培养箱中培养。待单层培养细胞生长至50％汇合时，其中一瓶细胞加入曲妥珠单抗(购自RoChe公司，规格320mg/支)至有效浓度为20ug/ml，然后每隔3-4天更换含有同等浓度曲妥珠单抗的新鲜培养基，待细胞生长至80％汇合时，用浓度为0.25％的胰酶消化，传代至新的25cm细胞培养瓶中培养，如此连续处理4个月，存活细胞可以在此浓度条件下稳定生长、传代、冻存和复苏，即获得通过体外诱导的曲妥珠单抗耐药的BT-474细胞(记作BT-474/H)。另一瓶细胞除不加入曲妥珠单抗外，其他操作同上，作为对照组细胞培养(记作BT-474/C)。

实施例2：表达谱芯片检测曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H与对照组细胞株BT-474/C之间的基因差异

将生长至80％汇合的曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H与对照组细胞株BT-474/C，用浓度为0.25％的胰酶消化，传代至新的25cm细胞培养瓶中培养。每株细胞准备三个重复样，继续原方式培养至细胞铺满细胞瓶底部。用浓度为0.25％的胰酶消化，离心，去除上清液，每个样品加入1ml Trizol。按操作规程提取细胞总RNA，使用NanoDrop ND-1000评估RNA量和质量。RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行评估。实验研究使用Agilent公司全基因组表达谱芯片，样品标记和芯片杂交根据Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis实验方案(Agilent Technology)执行。

主要过程如下：

(1)来自每个样品的总RNA被线性扩增，并使用Cy3-UTP标记；

(2)使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化标记的cRNAs，并用NanoDrop ND-1000检测浓度和活性；

(3)芯片杂交；

(4)杂交芯片被洗涤，固定并扫描(Agilent DNA Microarray Scanner(partnumber G2505C))。

使用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)获得芯片图，并读值，得到原始数据。使用GeneSpring GX v12.1软件(Agilent Technologies)对原始数据进行Quantile标准化和随后的数据处理。原始数据标准化后经过筛选高质量探针(某探针在6个样品中至少有3个被标记为Detected)进行进一步分析。两组样品间具有统计学意义的差异表达基因通过火山图筛选。两个样品间差异表达基因通过Fold Change筛选。使用R脚本进行层次聚类。使用标准的富集计算方法进行GO分析和Pathway分析。差异基因筛选标准为变化幅度≥2为上调基因，变化幅度＜-2为下调基因。实验由数谱(上海)生物科技有限公司完成。

实验结果：

经质量检测，如图1所示，两组样品(每组三个重复)的RNA质量合格。经芯片检测，与对照组细胞株BT-474/C相比，曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H中糖基化依赖细胞黏附分子1(glycosylation-dependent cell-adhesion molecule 1，GlyCAM1)基因mRNA转录量增高了10.1457811倍(P-value值为6.83461E-07，图2)。该实验结果表明，与对照组细胞株BT-474/C相比，糖基化依赖细胞黏附分子1在曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株BT-474/H中有更高水平的表达。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所

<120> 糖基化依赖性细胞黏附分子1作为抗肿瘤耐药靶点的用途

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 781

<212> DNA

<213> 人(Human)

<400> 1

cttcagcaac tctaagcagc ctcccccagg aaaaactgat cctgctacag ctccaccatg 60

aagttcttca tggtcctgct gccagccagc ctagccgcca cctctctcgc catccttgat 120

gttgaatctg gcctccttcc acaactctca gtcccctaag ggttattgag ctgtcagctg 180

gagagacctc agcactagaa agggccttcc ttaatccttg taatatgctg tgtggagagg 240

tggaaagctg cagaaccaaa agttcacacc tgggatgacc tagagccaga aggtgaaatt 300

cactcggaga ctcagcctgc agatgcctct gcccaggtca cccctagcag ccaccccaag 360

aaggaccatg tttccaatga agcctctcta ggagcgcttc atctccaaag aagagctggt 420

ttccaaaaag aatgctgtca aaagagcaca caccccaaga ggacaatttc aaaaatgtta 480

agctccaatt agaagagact acagaactgg ctcccagggc tggtatgagc cagggaaggg 540

gcaagccccc gggcagtact cctcagcaac cgcctcagag ggaaaacttg ccaaactggc 600

ccataaaatc gggaagaatc tggacaaagc attgaaagga atcataaact atctgaaaaa 660

cctaatccct agcgccaatg atgtcatgag gccctaatga tgagggtgcc tgaattccag 720

gctaggctgt gggagacgcc acatccaaaa gccatctttc ggctcctcaa attcatgtat 780

t 781

<210> 2

<211> 47

<212> PRT

<213> 人(Human)

<400> 2

Met Lys Phe Phe Met Val Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ala Ser Thr Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Asp Val Glu Ser Gly Leu Leu Pro Gln Leu Ser Val

20 25 30

Leu Leu Ser Asn Arg Leu Arg Gly Lys Thr Cys Gln Thr Gly Pro

35 40 45

<210> 3

<211> 33

<212> PRT

<213> 人(Human)

<400> 3

Met Lys Phe Phe Met Val Leu Leu Pro Ala Ser Leu Ala Ser Thr Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ile Leu Asp Val Glu Ser Gly Leu Leu Pro Gln Leu Ser Val

20 25 30

Pro

Claims (8)

1.糖基化依赖性细胞黏附分子1和/或其参与的细胞识别、信号转导以及细胞黏附途径作为抗肿瘤耐药靶点的应用。

2.糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂在降低和预消除肿瘤治疗中的耐药性的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂包括：抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的抗体，糖基化依赖性细胞黏附分子1与受体结合抑制剂，糖基化依赖性细胞黏附分子1介导的代谢途径抑制剂，针对糖基化依赖性细胞黏附分子1基因编码序列的反义寡核苷酸或RNA干扰分子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的抗体是对具有特异性的抗糖基化依赖性细胞黏附分子1的单克隆抗体、多克隆抗体和/或具有免疫活性的抗体片段；

进一步，所述具有免疫活性的抗体片段包括：抗体重链、抗体轻链、Fab’或(Fab)2片段、基因工程改造的单链Fc分子或嵌合抗体；

所述针对糖基化依赖性细胞黏附分子1基因编码序列的RNA干扰分子包括：shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括：乳腺癌、肝癌、胶质瘤、结肠癌、子宫颈癌、肺癌、胰腺癌、胃癌或膀胱癌。

6.一种药物组合物，包括：如权利要求2-5任一项所述的糖基化依赖性细胞黏附分子1抑制剂、肿瘤治疗剂以及药学上能够接受的载体或赋形剂。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述肿瘤治疗剂包括肿瘤化疗药物、肿瘤靶向药物以及其他所有用于治疗肿瘤疾病的药物；所述药学上能够接受的载体或赋形剂包括：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇中的一种或几种。

8.一种筛选抗耐药的肿瘤治疗药物的方法，包括下述步骤：

(a)提供表达糖基化依赖性细胞黏附分子1的肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物；

(b)将候选药物与步骤(a)中提供的肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物接触，作为给药组；

(c)检测给药组中糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平，并与未给予候选药物的对照肿瘤培养物、肿瘤细胞系或荷瘤动物的糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平进行比较；

根据给药组的糖基化依赖性细胞黏附分子1的表达水平判断候选药物是否为抗耐药的肿瘤治疗药物。