CN106957845A - 抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种抑制小鼠促性腺激素抑制激素(Gonadotropin inhibitory hormone,GnIH)基因表达的siRNA，该siRNA的正义链具有SEQ ID NO：1‑4中所示的任一序列。本发明构建了含有上述siRNA的编码基因的慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果表明慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA，并对GnIH基因进行特异性抑制，且有两条siRNA片段能使小鼠卵巢颗粒细胞GnIH mRNA表达降低70％以上。GnIH表达受到抑制后能够显著上调小鼠卵巢颗粒细胞的增殖、雌激素的分泌，抑制颗粒细胞凋亡。因而，本发明的siRNA片段及其表达载体可用于制备小鼠促性腺激素抑制激素表达的制剂。

Description

抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA片段及其应用。
背景技术
在动物性腺类激素的分泌调控中，促性腺激素释放激素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnRH)一直被认为是唯一的一种调节性腺类激素合成和分泌的神经肽，直到2000年于日本鹌鹑下丘脑中分离一种新的具有12个氨基酸序列的RF酰胺肽(SIKPSAYLPLRFamide)，由于其在激素分泌的调节中的作用与GnRH相反，因此被称为促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH)。随后的研究中，在不同的动物中分离出GnIH的同源类似物。GnIH作用于垂体或GnRH神经元，通过其受体即G蛋白偶联受体147(GPR147)抑制卵泡刺激素(FSH)及黄体生成素(LH)的合成与分泌，进而对动物的繁殖产生调控作用。
RNAi是近几年发展起来的一种基因阻断技术，其主要功能成分为siRNA。siRNA的发现，使得RNAi技术得到更加广泛的应用。研究表明，siRNA发挥特异性基因沉默的功能需经过三个阶段：起始阶段，外源的dsRNA被一种具有RnaseⅢ活性的核酸内切酶Dicer核酸酶特异识别，在ATP的作用下dsRNA切割成长约21-23nt(或bp)的小片段dsRNA，这种小片段的dsRNA即为siRNA(small interfering RNAs,siRNA)，siRNA与Dicer结合并形成为复合物。效应阶段，siRNA与核酸酶等蛋白质在其反义链的指导下结合形成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，此复合体为蛋白/RNA复合体，在ATP提供能量的作用下，siRNA双链解开，激活RISC。活化后的RISC使得siRNA正义链解离出来，siRNA正义链与同源mRNA靶向结合后，mRNA替代siRNA正义链的位置与siRNA反义链特异性结合，从而实现基因沉默的目的。放大阶段，siRNA与靶向mRNA结合诱导沉默，形成的mRNA降解产物，此产物可激活细胞中RNA依赖的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRPs)。在RdRPs的作用下，以siRNA为底物、靶向mRNA为模板，合成大量dsRNA分子，这些新合成的dsRNA分子，重新进入到RNA干扰的启动阶段，循环利用，从而放大RNA干扰的作用。
要实现对目的基因的特异性沉默，首先需将外源的shRNA序列高效地转录入靶细胞，而且能在细胞中长期表达。对于外源基因导入细胞常用的方法有脂质体转染法、电转法以及显微注射法。但是以上方法存在着自身的缺陷，如脂质体转染法对原代和非分裂期细胞转染效率低、电转法对细胞损伤大、显微注射操作难度大等，而且以上几种方法对于转录的基因都无法实现长期稳定的表达。以病毒为载体则可实现高效的转染以及长期表达的目的。慢病毒载体是一种常用的逆转录病毒，是在人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiency virus,HIV)的基础上改装而来，特点是免疫原性低，能够感染分裂期与非分裂期的细胞，能将自身携带的片段整合入宿主细胞基因组中。以慢病毒携带的shRNA在肿瘤及丙肝病毒等领域的研究中已卓见成效。目前研究表明慢病毒载体能够在各种类型的哺乳动物的细胞中稳定表达siRNA，并且可长效地抑制目的基因表达。
siRNA作为基因沉默的工具，在众多的研究领域中都得到了广泛的应用，但是对于小鼠的促性腺激素抑制激素的siRNA还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制小鼠促性腺激素抑制激素(简称GnIH)基因表达的siRNA，同时提供该siRNA的应用。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA，所述siRNA的正义链为下述任一核苷酸序列：
GnIH-1：GCAACTTCAAGCTTCTTAACA(SEQ ID NO：1)；
GnIH-2：GCAGGGACCAGGAGCCATTTC(SEQ ID NO：2)；
GnIH-3：GCTCCAGCGAGTTGCTCTACG(SEQ ID NO：3)；
GnIH-4：GCGAGTTGCTCTACGTCATGA(SEQ ID NO：4)。
含上述siRNA的shRNA的编码基因两端带有BamH I和EcoR I酶切位点的序列，正、反向序列间加入CTCGAG的loop结构，正义链序列的3’端连续5个T，便于构建表达质粒。其双链核苷酸序列如下：
GnIH-1dsDNA正义链：GATCCGCAACTTCAAGCTTCTTAACACTCGAGTGTTAAGAAGCTTGAAGTTGCTTTTTG(SEQ ID NO：5)，反义链：AATTCAAAAAGCAACTTCAAGCTTCTTAACACTCGAGTGTTAAGAAGCTTGAAGTTGCG(SEQ ID NO：6)；
GnIH-2dsDNA正义链：GATCCGCAGG GACCAGGAGCCATTTCCTCGAGGAAATGGCTCCTGGTCCCTGCTTTTTG(SEQ ID NO：7)，反义链：AATTCAAAAAGCAGGGACCAGGAGCCATTTCCTCGAGGAAATGGCTCCTGGTCCCTGCG(SEQ ID NO：8)；
GnIH-3dsDNA正义链：GATCCGCTCCAGCGAGTTGCTCTACGCTCGAGCGTAGAGCAACTCGCTGGAGCTTTTTG(SEQ ID NO：9)，反义链：AATTCAAAAA GCTCCAGCGAGTTGCTCTACGCTCGAGCGTAGAGCAACTCGCTGGAGCG(SEQ ID NO：10)；
GnIH-4dsDNA正义链：GATCCGCGAGTTGCTCTACGTCATGACTCGAGTCATGACGTAGAGCAACTCGCTTTTTG(SEQ ID NO：11)，反义链：AATTCAAAAA GCGAGTTGCTCTACGTCATGACTCGAGTCATGACGTAGAGCAACTCGCG(SEQ ID NO：12)。
一种表达载体由上述shRNA的编码基因与出发载体构建，既将shRNA编码基因插入出发载体上构建而成。该出发载体为慢病毒载体pYr-Lvsh。
本发明的siRNA可制备成基因药物或其他合适的制剂用于抑制小鼠促性腺激素抑制激素的表达，应用于调控动物的繁殖性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的siRNA沉默效果高，能够有效地沉默小鼠卵巢颗粒细胞GnIH基因的表达，并对雌激素分泌及颗粒细胞凋亡产生重要作用。通过实时荧光定量PCR检测，发现有两条siRNA片段能使GnIH mRNA表达量降低70％以上，ELSIA检测结果表明雌激素分泌增加，流式细胞技术检测结果表明，颗粒细胞凋亡减少。本发明构建了含有上述siRNA的编码基因的慢病毒干扰质粒，并对其进行了体外细胞水平实验，结果证明慢病毒干扰质粒转入细胞后能表达shRNA并对GnIH基因进行特异性抑制，因而在制备用于GnIH下调的转基因制剂中有应用价值。
附图说明
图1是PCR扩增曲线图。
图2是PCR扩增产物电泳图。
其中，1：GnIH，2：GnIH-R，3：GAPDH，M：DL 2000Maker。
图3是慢病毒系统质粒图。
其中，A为慢病毒表达质粒，B为慢病毒包装质粒。
图4是pYr-Lvsh空质粒酶切图。
其中，1：pYr-Lvsh空质粒，2：EcoR I和BamH I双酶切，M：DL 8000Maker。
图5是小鼠pLV-GnIH-shRNA的酶切鉴定电泳图。
其中，1：Xho I酶切pLV-GnIH-shRNA1产物，2：Xho I酶切pLV-GnIH-shRNA2产物，3：Xho I酶切pLV-GnIH-shRNA3产物，4：Xho I酶切pLV-GnIH-shRNA4产物，5:pXho I酶切pYr-Lvsh空质粒产物，6：pYr-Lvsh空质粒，M：DL 8000Maker。
图6是慢病毒干扰质粒滴度测定图。
其中，A：pLV-GnIH-shRNA1，B：pLV-GnIH-shRNA2，C：pLV-GnIH-shRNA3，D：pLV-GnIH-shRNA4，E：pLV-shNC；a：病毒液量为9×100，b：病毒液量为9×10-1，c：病毒液量为9×10-2、d：病毒液量为9×10-3、e：病毒液量为9×10-4、f：病毒液量为9×10-5、g：病毒液量为9×10-6、h：病毒液量为9×10-7。
图7是pLV-GnIH-shRNA转染颗粒细胞96h荧光显微镜图(100×)。
图8是慢病毒干扰质粒对小鼠卵巢颗粒细胞中GnIH mRNA表达水平的影响，其中b表示差异性显著(P<0.05)。
图9是转染空质粒病毒和慢病毒干扰质粒后对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖的影响，其中b表示差异性显著(P<0.05)。
图10是慢病毒干扰质粒转染小鼠卵巢颗粒细胞72h后流式细胞仪测定细胞凋亡图。
其中，A：pLV-shNC；B：pLV-GnIH-shRNA2；C：pLV-GnIH-shRNA4。
图11是慢病毒干扰质粒转染小鼠卵巢颗粒细胞72h后的细胞凋亡率，b表示差异性显著(P<0.05)。
图12是转染空质粒病毒和慢病毒干扰质粒96h后对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌的影响，其中b表示差异性显著(P<0.05)。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
实施例1验证小鼠卵巢颗粒细胞中GnIH的表达
1.按照Invitrogen公司的TRIzoL Reagent试剂盒提取小鼠卵巢颗粒细胞(细胞为本实验室保存)的RNA，所用的器材均经过0.1％DEPC水浸泡过夜后，高压灭菌。所用的试管均为RNA-free EP管，收集的细胞经Trizol溶解后，在氯仿抽提及异丙醇沉淀后，用0.1％DEPC水溶解RNA，并以此为模板合成cDNA第一链。
2.以cDNA第一链为模板，设计PCR引物：小鼠促性腺激素抑制激素(GnIH)序列(GeneBank登录号NM021892)，上游引物序列：ATGCCTATCACATTGCTG(SEQ ID NO：13)，下游引物序列：CAAGGTGAAGACGGAAGC(SEQ ID NO：14)；GnIH受体GnIH-R(GeneBank登录号NM13392)，上游引物序列：CAGAAAGCAGGTGGATGG(SEQ ID NO：15)，下游引物序列：CTCCAGGTCCCCAAATCC(SEQ ID NO：16)；以小鼠GAPDH为内参，上游引物序列：CCGTGTTCCTACCCCCAATG(SEQ ID NO：17)，下游引物序列：AGCCCAAGATGCCCTTCAGT(SEQ ID NO：18)，进行荧光定量PCR扩增，扩增产物大小分别为GnIH 114bp、GnIH-R 247bp、GAPDH 128bp。PCR反应体系：2×MasterMix 5μL、上游引物(10μM)0.3μL、下游引物(10μM)0.3μL、cDNA模板2μL、补加ddH2O至10μL。反应条件：95℃，2min；95℃，15s；61℃，30s；72℃，20s，39个循环后72℃，10min延伸。反应结束后显示具有GnIH的扩增曲线(图1)，然后将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳片段与预期一致(图2)，表明小鼠卵巢颗粒细胞中有GnIH的表达。
实施例2构建pLV-GnIH-shRNA慢病毒干扰质粒
1.根据小鼠促性腺激素抑制激素的mRNA序列信息，按照siRNA的设计方法和靶序列筛选，设计四条siRNA序列，与促性腺激素抑制激素基因的mRNA反向互补，分别命名为GnIH-1、GnIH-2、GnIH-3、GnIH-4，其正义链序列分别为：GnIH-1，如SEQ ID NO:1所示；GnIH-2，如SEQ ID NO:2所示；GnIH-3，如SEQ ID NO:3所示；GnIH-4，如SEQ ID NO:4所示。
2.根据靶序列设计构建抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA载体所需的DNA序列：GnIHshRNA模板，两端引入BamH I和EcoR I酶切位点，正向序列与反向序列之间插入CTCGAG的loop结构，正义链序列的3’端连续5个T终止反应，送南京金斯瑞公司合成。具体序列如下(F表示正义链，R表示反义链)：
GnIH-1shRNA F：SEQ ID NO：5，GnIH-1shRNA R：SEQ ID NO：6；
GnIH-2shRNA F：SEQ ID NO：7，GnIH-2shRNA R：SEQ ID NO：8；
GnIH-3shRNA F：SEQ ID NO：9，GnIH-3shRNA R：SEQ ID NO：10；
GnIH-4shRNA F：SEQ ID NO：11，GnIH-4shRNA R：SEQ ID NO：12。
3.将合成好的上述核苷酸序列溶解并分别用无菌水稀释到20μM，8条序列分成4对(GnIH-1shRNA F和GnIH-1shRNA R为一对，GnIH-2shRNA F和GnIH-2shRNA R为一对，GnIH-3shRNA F和GnIH-3shRNA R为一对，GnIH-4shRNA F和GnIH-4shRNA R为一对)。4对序列分别进行退火反应。反应体系为：DNA模板单链1(GnIH-1shRNA F)5μL、DNA模板单链2(GnIH-1shRNA R)5μL、10x退火溶液5μL、ddH2O补充至50μL。反应条件为：混匀后在95℃水浴锅中反应10min，然后自然冷却至室温，退火后浓度为2μM。-20℃保存。GnIH-2shRNA F和GnIH-2shRNA R，GnIH-3shRNA F和GnIH-3shRNA R以及GnIH-4shRNA F和GnIH-4shRNA R的退火反应体系同上，DNA模板单链替换为相应的序列即可。
4.pYr-Lvsh空质粒载体(购自长沙赢润生物公司，见图3)酶切。酶切体系如下：10×NEB Buffer 2μL、BamH I 1μL、EcoR I 1μL、pYr-Lvsh空质粒1μL、ddH2O补充至20μL。37℃反应1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图4，胶回收试剂盒回收载体片段。
将步骤3所得的退火产物与经双酶切的空质粒进行连接，连接体系如下：10×Buffer 1μL、pYr-Lvsh双酶切产物2μL、T4DNA连接酶1μL、退火产物2μL、ddH2O补至10μL。充分混匀后于16℃反应过夜，进行连接。
5.转化与酶切鉴定。转化连接产物，挑取单个菌落，接种到LB培养基中，37℃恒温摇床震荡16h后，根据Axygen质粒提取试剂盒提取质粒。由于shRNA序列中插入的loop结构CTCGAG也为Xho I的酶切位点，pYr-Lvsh质粒中也有一个Xho I的酶切位点，经Xho I单酶切后会形成2000bp左右的片段。提取的质粒经Xho I酶切，体系为10×NEB Buffer 2μL、重组质粒1.5μL、Xho I 0.5μL、ddH2O补充至10μL。37℃反应1h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图5。
6.阳性克隆测序：选择酶切正确的质粒送南京金斯瑞生物公司测序，并利用Blast进行同源性分析。将构建成功的四种慢病毒干扰质粒分别命名为pLV-GnIH-shRNA1，pLV-GnIH-shRNA2，pLV-GnIH-shRNA3以及pLV-GnIH-shRNA4(pLV-GnIH-shRNA是在pYr-Lvsh质粒中插入GnIH的shRNA序列构成)。
实施例3慢病毒包装及滴度测定
1.慢病毒质粒转染293FT细胞。将pLV-GnIH-shRNA1、pLV-GnIH-shRNA2、pLV-GnIH-shRNA3、pLV-GnIH-shRNA4以及空质粒pYr-Lvsh(命名为pLV-shNC)分别与包装质粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG，见图3B)共转染293FT细胞，收集病毒液，进行病毒浓缩后测定其滴度。
脂质体转染，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。
(1)转染前一天，在新的培养皿中接种细胞，细胞要完全吹散成单个状态以保证均匀分布，待细胞汇合度达70-80％时进行转染；
(2)在转染之前2h，将培养液更换为无血清的新鲜培养基；
(3)按10μg，6.5μg，3.5μg，2.5μg的比例分别把干扰质粒(空质粒)，pLP1，VSVG及pLP2加入装有1500μL OPTI-MEM的离心管内混匀；
(4)另外取35μL LipofectamineTM2000加入装有1500μL OPTI-MEM的另一离心管中混匀；
(5)将两者迅速混合并混匀，在室温下静止15min；
(6)缓慢地加入到培养293FT细胞的培养皿中，轻轻晃动培养皿混匀；
(7)转染12h后将培养液更换为含2％FBS无双抗的培养基，以收获病毒。
2.病毒收集。收获病毒培养基到离心管内，迅速置于冰上进行预冷。在4℃、1500G的条件下离心30min。病毒液经0.45μM滤器过滤后，加入4×病毒浓缩液，加入比例为3:1。浓缩液加入后在4℃的冰箱中静置过夜，在4℃、1500G转速下离心45min，弃上清液。用500μL无血清培养基吹打重悬病毒聚集团块，制成病毒液。
3.滴度测定。取10μL获取的病毒液加入到90μL稀释液中，以此为第一稀释度，然后从此稀释度中取10μL加入到另一90μL稀释液中，以此为第二稀释度，以此类推，形成8个稀释度(病毒液量为9×100-9×10-7μL)。然后取90μL稀释病毒液加入96孔板，感染4d后，进行荧光观察计数。病毒滴度(TU/mL)等于荧光表达量除以病毒液量。
结果发现，当病毒液量为9×10-7时，视野下均无荧光，当病毒液量为9×10-6时，pLV-GnIH-shRNA1、pLV-GnIH-shRNA2、pLV-GnIH-shRNA3、pLV-GnIH-shRNA4、及pLV-shNC感染的视野下的荧光个数为2、2、3、3、2，见图6，因此根据常规滴度计算公式，其滴度分别为2×108TU/mL、2×108TU/mL、3×108TU/mL、3×108TU/mL、2×108TU/mL。
实施例4RNA干扰有效靶点的筛选
1.病毒液感染小鼠卵巢颗粒细胞。培养的颗粒细胞密度达70-80％时，以合适的感染复数(MoI＝100)将感染慢病毒的病毒液感染细胞。以不感染任何慢病毒的小鼠卵巢颗粒细胞为空白对照，以感染pLV-shNC病毒液的小鼠卵巢颗粒细胞为阴性对照。
细胞感染96h后收集细胞，-70℃保存，用于RNA提取。
2.感染细胞总RNA提取。采用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取感染细胞的总RNA。
3.Real time-PCR检测细胞内GnIH的表达水平
GnIH的引物如下，GnIH上游引物序列：TGATGCCTCATTTTCACAGCA(SEQ ID NO：19)，下游引物序列：CTGCGGGGCTTCTTTTCTC(SEQ ID NO：20)，PCR扩增片段为225bp。以小鼠GAPDH为内参基因(GAPDH上游引物序列为：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG(SEQ ID NO：21)；下游引物序列为：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA(SEQ ID NO：22))，扩增片段为123bp，引物由南京金斯瑞生物公司合成。
以提取的RNA为模板，用Thermo公司逆转试剂盒，以Oligo-dT为引物进行RT反应。取总RNA 5μg、Oligo-dT 2.5μL、DEPC水补至12.5μL，于72℃反应5min后立即置于冰上；在冰浴的状态下加入5×Reaction Buffer 4μL、RiboLockRNase inhibitor 0.5μL、dNTP mix(10mM)2μL、RevertAid Reverse Transcriptase 1μL，于42℃反应1h后，再于72℃反应10min逆转录形成cDNA。
在荧光定量PCR 96孔板中，按如下体系加入试剂：2×qPCR Mix 10μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、cDNA模板2μL、加DEPC水至20μL，每个基因三个平行。小心将离心管盖压紧，短暂离心。
按BioRad荧光定量PCR仪的操作说明放入96孔PCR板，设置PCR反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，30s；72℃,20s，42个循环后72℃，10min进行延伸。各目的基因的表达水平可用2-△Ct法进行计算，△Ct＝(目的基因Ct-内参基因Ct)。转染96h后，小鼠卵巢颗粒细胞中的荧光表达见图7。
结果发现，慢病毒干扰病毒液感染小鼠卵巢颗粒细胞后，与空白组相比空质粒病毒液组感染后基因表达几乎无变化，与空白组相比慢病毒干扰组显著抑制细胞中GnIHmRNA的表达水平(见图8)，其中pLV-GnIH-shRNA1的抑制效率为44.5％，pLV-GnIH-shRNA2的抑制效率为77.6％，pLV-GnIH-shRNA3的抑制效率为72.3％，pLV-GnIH-shRNA4的抑制效率为74.1％(见图8)
由此可见，体外细胞实验表明本发明涉及的GnIHshRNA干扰质粒可有效地抑制GnIH基因的表达，其中pLV-GnIH-shRNA2及pLV-GnIH-shRNA4的抑制效率最高，可用于抑制小鼠促性腺激素抑制激素的功能的研究。
实施例5GnIH干扰对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖作用
1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以未感染任何病毒液的颗粒细胞为空白组，以感染pLV-shNC颗粒细胞为阴性对照组，感染pLV-GnIH-shRNA2及pLV-GnIH-shRNA4慢病毒为干扰组。
2.MTT法测定细胞增殖情况
(1)96孔板板中，以每孔5000个细胞的接种量，铺板感染慢病毒的颗粒细胞于96孔板中(每组三个平行)；
(2)在慢病毒感染细胞24h、48h、72h及96h后，于每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT(Sigma)溶液，37℃、5％CO2培养箱中培养4h后弃上清液；
(3)150μL的DMSO加于每孔中，然后在振荡器轻轻震荡10min；
(4)充分溶解结晶物后，在酶标仪上在490nm波长大的条件下测定各孔光吸收值，记录结果。
结果可见，经过96h培养，细胞增长了将近3倍，在72h时颗粒细胞增长速度减缓。相对于空白对照与阴性对照组，pLV-GnIH-shRNA2及pLV-GnIH-shRNA4均可促进颗粒细胞增殖，而在72h时的促进作用最明显，相对于空白组，促进效率分别为25.7％和23.9％(见图9)。实施例6GnIH干扰对小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡作用
1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以感染pLV-shNC颗粒细胞为对照组，感染pLV-GnIH-shRNA2及pLV-GnIH-shRNA4慢病毒为干扰组。
2.流式细胞仪测定细胞凋亡
采用南京凯基生物公司的Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行；
(1)慢病毒感染细胞72h后，胰酶消化贴壁细胞，并离心收集细胞；
(2)细胞沉淀用PBS洗涤两次后，加入500μL的缓冲液将细胞吹打制成悬浮液，用血球计数板测定细胞悬液浓度；
(3)取约10000个细胞的悬液加入装有5μL Annexin V-APC的流式管中，再加5μL的Propidium Iodide后吹打混合均匀，室温孵育15min；
(4)用PBS补足至500μL后于400目筛网过滤，滤液加入流式细胞仪中测定细胞凋亡状况，见图10。
结果发现，pLV-shNC、pLV-GnIH-shRNA2以及pLV-GnIH-shRNA4组的细胞凋亡率分别为29.97％、22.19％和26.60％(见图11)。因此，相对于pLV-shNC组，pLV-GnIH-shRNA2对细胞凋亡的抑制率为26.3％，而pLV-GnIH-shRNA4组对细胞凋亡的抑制率为11.2％。这些结果说明了pLV-GnIH-shRNA2组和pLV-GnIH-shRNA4组对颗粒细胞的凋亡均有抑制作用，而pLV-GnIH-shRNA2组的作用更明显。
实施例7GnIH干扰对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素分泌作用
1.慢病毒感染小鼠卵巢颗粒细胞。以未感染任何病毒液的颗粒细胞为空白组，以感染pLV-shNC颗粒细胞为阴性对照组，感染pLV-GnIH-shRNA2及pLV-GnIH-shRNA4慢病毒为干扰组。
2.采用上海丽臣公司小鼠雌激素ELISA试剂盒的操作说明测定雌激素含量。
(1)于4℃冰箱中取出实验所需的板条，在室温下放置20min；
(2)在酶标仪上的450nm波长的条件下，用不同浓度的标准液测定其吸光度，制定标准曲线；
(3)取慢病毒感染96h后的细胞培养液10μL于装有40μL稀释液的孔中；
(4)每孔中加入100μL辣根过氧化物酶HRP标记的检测抗体(空白组不加)在37℃水浴锅中孵育1h；
(5)去掉液体后用洗涤液洗涤5遍；
(6)洗涤后每孔中均加入50μL底物A/B，在37℃的恒温箱中避光孵育15min；
(7)每孔加入50μL的终止液终止反应，并于15min内在酶标仪上以450nm的波长测定各组的吸光度。
(8)以标准品的吸光度制作标准曲线，根据测定的各组的吸光度计算雌激素浓度。
结果显示，空白组的雌激素浓度为25.67pg/mL；pLV-shNC组的雌激素浓度为24.64pg/mL；pLV-GnIH-shRNA2组中雌激素浓度为29.37pg/mL；pLV-GnIH-shRNA4组的雌激素浓度为28.89pg/mL。与空白组对比pshNC组减少，但差异性不显著(P>0.05)，与空白组对比，pLV-GnIH-shRNA2和pLV-GnIH-shRNA4组雌激素浓度分别增加14.4％(P<0.05)和12.5％(P<0.05)(见图12)。因此在颗粒细胞中GnIH表达受到抑制时，雌激素分泌增加。
综上所述，以shRNA2和shRNA4为靶点设计的慢病毒干扰质粒对GnIH mRNA的表达具有明显的抑制效果，GnIH表达受到抑制后对小鼠卵巢颗粒细胞的增殖及雌激素的分泌具有促进作用，对凋亡具有抑制作用。因此，抑制促性腺激素抑制激素的基因表达，可用于动物的繁殖调控研究中。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA及其应用
<130> 11
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaacttcaa gcttcttaac a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagggacca ggagccattt c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctccagcga gttgctctac g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcgagttgct ctacgtcatg a 21
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatccgcaac ttcaagcttc ttaacactcg agtgttaaga agcttgaagt tgctttttg 59
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aattcaaaaa gcaacttcaa gcttcttaac actcgagtgt taagaagctt gaagttgcg 59
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gatccgcagg gaccaggagc catttcctcg aggaaatggc tcctggtccc tgctttttg 59
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattcaaaaa gcagggacca ggagccattt cctcgaggaa atggctcctg gtccctgcg 59
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gatccgctcc agcgagttgc tctacgctcg agcgtagagc aactcgctgg agctttttg 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aattcaaaaa gctccagcga gttgctctac gctcgagcgt agagcaactc gctggagcg 59
<210> 11
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gatccgcgag ttgctctacg tcatgactcg agtcatgacg tagagcaact cgctttttg 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aattcaaaaa gcgagttgct ctacgtcatg actcgagtca tgacgtagag caactcgcg 59
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgcctatca cattgctg 18
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caaggtgaag acggaagc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cagaaagcag gtggatgg 18
<210> 16
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<213> 人工序列
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ctccaggtcc ccaaatcc 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgtgttcct acccccaatg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agcccaagat gcccttcagt 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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tgatgcctca ttttcacagc a 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctgcggggct tcttttctc 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (5)

1.一种抑制小鼠促性腺激素抑制激素基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链为下述核苷酸序列：
GnIH-1：GCAACTTCAAGCTTCTTAACA；
GnIH-2：GCAGGGACCAGGAGCCATTTC；
GnIH-3：GCTCCAGCGAGTTGCTCTACG；
GnIH-4：GCGAGTTGCTCTACGTCATGA。
2.一种shRNA，其特征在于，编码基因是下述双链核苷酸序列：
GnIH-1dsDNA正义链如SEQ ID NO：5所示，反义链如SEQ ID NO：6所示；
GnIH-2dsDNA正义链如SEQ ID NO：7所示，反义链如SEQ ID NO：8所示；
GnIH-3dsDNA正义链如SEQ ID NO：9所示，反义链如SEQ ID NO：10所示；
GnIH-4dsDNA正义链如SEQ ID NO：11所示，反义链如SEQ ID NO：12所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该载体由权利要求2所述shRNA的编码基因与出发载体构建而成。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述出发载体为慢病毒载体pYr-Lvsh。
5.权利要求1所述的siRNA在制备抑制小鼠促性腺激素抑制激素表达的药物或试剂中应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016483A (zh) * 2019-04-18 2019-07-16 安徽农业大学 一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160257735A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-08 Institute of Animal Reproduction and Food Research PAS Regulation of npvf gene and its products: a method for modulating energy imbalance
CN106544421A (zh) * 2016-10-21 2017-03-29 武汉科技大学 Spag6基因作为卵巢肿瘤诊断和治疗标志物的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160257735A1 (en) * 2015-03-02 2016-09-08 Institute of Animal Reproduction and Food Research PAS Regulation of npvf gene and its products: a method for modulating energy imbalance
CN106544421A (zh) * 2016-10-21 2017-03-29 武汉科技大学 Spag6基因作为卵巢肿瘤诊断和治疗标志物的用途

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANJUM SHABANA等: "《Inhibitory roles of the mammalian GnlH ortholog RFRP-3 in testicular activities in adult mice》", 《JOURNAL OF ENDOCRINOLOGY》 *
GERAGHTY ANNA C.等: "《Knockdown of hypothalamic RFRP3 prevents chronic stress-induced infertility and embryo resorption》", 《ELIFE》 *
SINGH PADMASANA等: "《Effects of gonadotropin-inhibitory hormone on folliculogenesis and steroidogenesis of cyclic mice》", 《FERTILITY AND STERILITY》 *
杨咏洁: "《绵羊程序性细胞死亡因子10（PDCD10）克隆、表达及功能研究》", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 *
淡新刚: "《GnIH对小鼠繁殖的调控及其分子机制和基因免疫技术研究》", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 *
王琼: "《小鼠SOCS1基因沉默重组慢病毒载体的构建及其在DC2.4细胞中的表达》", 《2016全国中西医结合皮肤性病学术年会论文汇编》 *
陈风雷: "《HERP在小鼠卵泡颗粒细胞凋亡中的作用及其机制研究》", 《中国博士学位论文全文数据库农业科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110016483A (zh) * 2019-04-18 2019-07-16 安徽农业大学 一种研究卵母细胞体外成熟中卵丘细胞基因功能的方法

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