CN102220377B - 一种提高动物瘦肉率的新型干扰载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高动物瘦肉率的新型慢病毒干扰载体pLenti6.3-MR085_1，其序列包含基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2。本发明针对绵羊MSTN基因的核苷酸序列设计合成多对miRNA单链寡核苷酸，构建了miRNA表达载体，通过功能性实验筛选，得到了抑制效果较强的pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085-1载体，该载体包含基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2，进一步将基因序列Sequnence NO.1和Sequnence NO.2构建到miRNA慢病毒干扰载体。本发明还公开了上述新型载体的应用。

Description

一种提高动物瘦肉率的新型干扰载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型载体的构建。具体而言，本发明针对绵羊肌肉生长抑制素基因MSTN的核苷酸序列设计合成miRNA单链寡核苷酸，构建了miRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。

背景技术

人们对畜禽肉用性状的研究，主要集中在瘦肉率和肉质方面，其中对瘦肉率的追求一直是科学家和生产者努力的重点。肌肉的产量是肉用畜禽的重要经济性状，对畜牧业的经济效益起着决定性作用。近年来，随着分子遗传学的发展及分子生物技术的革新，育种工作者培育出许多生长速度快、瘦肉率高、节省饲料的畜禽品种，并且研究了主宰这些优良经济性状的主效基因。其中，最使人感兴趣的是造成牛肌肉异常发达“双肌”性状的基因。

1997年McPherron等发现了一种分泌型生长、分化因子，将其命名为GDF-8(growth differentiation factor-8)，其特征是在骨骼肌中特异性表达，对肌肉生长有负调控作用，该基因突变可导致骨骼肌肥大，因此也称为肌肉生长抑制素(mystatin，MSTN)。2001年，由Michel Georges领导的研究小组，历经十余年的研究发现比利时蓝牛(Belginm Blue)的双肌性状是由于肌肉生长抑制素基因突变造成的[Hughes SM.Running without regulators.Nature，1992，360：536-537.]。与此同时，由美国农业部的Tim Smith领导的研究小组和由霍普金斯大学的SejinLee领导的研究小组也发现比利时蓝牛及皮尔蒙特牛(Piedmontese)的双肌性状是肌肉生长抑制素基因突变造成的[Jeanplong F，Sharma M，Somers W G，et a.lGenomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene.Molecular and Cellular Biochemistry，2001，200：31-37.]。通过基因敲除，反义核酸及体内表达肌肉生长抑制素基因拮抗因子的实验，证明肌肉生长抑制素基因是限制肌肉超常发育的负调控基因。MSTN的活性降低或丧失，使得肌肉与其他组织的比例大大提高，因此在畜牧生产上有很好的应用前景。这在脂肪比例较大的家畜中应用潜力很大。

RNAi(RNA interference)是21-23个核苷酸的小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)诱导细胞同源基因mRNA降解、从而特异性抑制基因表达的过程。其作为一项可以高效、特异地降解靶基因mRNA的实验技术已被广泛应用于基因功能的研究[Arziman Z，Horn T，Boutros M.E-RNAi：a web applicationto design optimized RNAi constructs.Nucleic Acids Res 2005；33：W582-W588]。microRNAs(miRNAs，即微小RNA)是19-23个碱基小分子单链RNA，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平对基因表达进行调控。哺乳动物中就可能存在有200-500个miRNA，参与至少10％基因的表达调控[Bartel D(2004).Keystone miRNA and siRNA Symposium.]。人们开始认识到这些普遍存在的小RNA分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。目前已经发现的miRNA中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征：在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有显著差异，这种miRNAs表达模式具有分化的位相性和时序性，提示miRNAs有可能作为参与调控基因表达的分子，具有重要意义。

转基因技术中的重要环节是如何将目的基因高效、安全的导入靶细胞并得到理想的表达。为此，多种基因导入系统被广泛用于转基因动物制备的试验性研究中。非病毒载体如脂质体、纳米粒、微乳、聚合物胶团等具有安全、无免疫原性等优点，但其转染效率相对较低，难以使携带的目的基因得到高效稳定的表达，而慢病毒(Ieniivirus)载体是以HIV-I(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。它的转染效率高，可使目的基因持续、稳定地表达，被较早的应用于转基因动物的制备技术中。Grew等将报告基因LacZ及GFP同时构建到慢病毒载体Pony-GFP-Lacz，并注射到新生鸡蛋的囊胚腔中，在子一代、子二代各组织中均检测到目的基因的表达。慢病毒载体也可与精子介导基因转移(SMGT)技术相结合，将携带外源基因的重组载体注射曲细精管感染动物的精原干细胞，使外源DNA整合到动物精原干细胞上，通过自然受精产生转基因动物。Hamra等[Hamra F，Gatlin J，Chapman K，et al.Production of transgenic ratsby lentiviral transduction of male germline stem cells.Proc Natl AcadSci，2002，99(23)：14931-14936.]用LV-EGFP转染体外培养的精原干细胞，然后将整合有LV-EGFP的精原干细胞移植到经化学方法去除精原细胞的野生型雄性大鼠睾丸，移植60天后，与雌鼠交配，获得44只子代大鼠中，13只子代检测到报告基因，证明LV可整合到精原细胞DNA上经自然交配制备转基因动物。慢病毒载体通过结合RNA干扰(RNAi)等有效的技术手段对许多遗传性疾病及肿瘤的基因治疗都已取得了很大的进步。

为提高脂肪比例较大的家畜的瘦肉率和使瘦肉率高的优良性状得到稳定遗传，本发明构建了针对绵羊MSTN基因的microRNAs(miRNAs，即微小RNA)慢病毒载体，转入绵羊的基因组，抑制MSTN的表达，使其获得双肌性状，为培育瘦肉率高的双肌性状的绵羊新品种奠定了基础。

发明内容

本发明根据GenBank数据库中绵羊MSTN基因的mRNA序列，构建了4对针对MSTN基因的miRNA oligo，其序列为Sequnence NO.1、Sequnence NO.2、Sequnence NO.3、Sequnence NO.4、Sequnence NO.5、Sequnence NO.6、SequnenceNO.7、Sequnence NO.8，另外还设计了一对阴性对照的miRNA oligo其序列为Sequnence NO.9、Sequnence NO.10。并将干扰效果最好的包含Sequnence NO.1、Sequnence NO.2的干扰序列克隆到慢病毒干扰载体上，得到慢病毒干扰载体pLENTi6.3-MR085_1。

本发明通过对所述的5对oligo退火得到双链，并将双链插入到miRNA表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建5个miRNA质粒。

本发明全合成了MSTN基因并构建了所述基因的高表达载体pcDNA3.1-Ovisaries MSTN。

本发明将上述的5个miRNA质粒与MSTN高表达载体共转染293T细胞。24小时后检测荧光的表达，并通过qPCR的方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果。结果显示上述构建的pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085-1干扰质粒的干扰效果最好，其对MSTN基因的沉默效率达92％。

本发明将干扰效果最好的pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085-1干扰质粒，用Eag I酶切，纯化酶切产物，再经BP重组和LR重组得到包含Sequnence NO.1、Sequnence NO.2的慢病毒干扰载体pLENTi6.3-MR085_1。

本发明将上述慢病毒干扰载体转染293T细胞，制备病毒原液并且滴定所得病毒的滴度。包装所得的携带MSTN-miRNA的慢病毒滴度达9.3×10⁹TU/ml。

将所述miRNA慢病毒干扰表达载体pLENTi6.3-MR085_1与脂质体和台酚蓝混合，制备成转染液。然后采用微创手术，将上述转染液分多点注射入绵羊两侧的睾丸中再与雌性交配，得到阳性的转基因子代绵羊。

附图说明

图1MSTN基因用XhoI和EcoRI双酶切电泳照片。1：MSTN基因用XhoI和EcoRI双酶切；2：DNA Marker。

图2pCDNA3.1(+)载体用XhoI和EcoRI双酶切电泳照片。1：pCDNA3.1(+)载体的XhoI和EcoRI双酶切；2：DNA Marker。

图3干扰质粒对MSTN基因的沉默效率。将含有所设计的5对干扰序列(阴性对照、MR085-1、MR085-2、MR085-3、MR085-4)的miRNA表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi与高表达MSTN基因的pcDNA3.1-Ovis ariesMSTN质粒，共转染293T细胞，干扰序列对MSTN基因的沉默效率。

图4内参基因扩增曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的293T细胞其内参基因的扩增情况。

图5内参基因溶解曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的293T细胞其内参基因的检测引物的溶解曲线。

图6MSTN基因扩增曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的293T细胞其MSTN基因的扩增情况，包含所有的样品：转染干扰质粒、对照质粒和空白对照。

图7MSTN基因溶解曲线。共转染干扰质粒和高表达MSTN基因质粒的293T细胞其MSTN基因检测引物的溶解曲线，其只有一个峰，证明该对引物扩增特异性很好。

图8慢病毒干扰质粒病毒包装后24h细胞情况(A：荧光视野；B：可见光视野)。

图9病毒浓缩液稀释10³时荧光表达情况(荧光视野)。

图10病毒浓缩液稀释10⁴时荧光表达情况(荧光视野)。

图11病毒浓缩液稀释10⁵时荧光表达情况(荧光视野)。

图12病毒浓缩液稀释10⁶时荧光表达情况(荧光视野)。

图13病毒浓缩液稀释10⁷时荧光表达情况(荧光视野)。

实施例1慢病毒干扰载体的构建

1.材料和方法

1.1材料

DH5 alpha感受态细胞；T4 DNA ligase(1U/μl)(Invitrogen)；pCDNA3.1(+)载体(invitrogen公司)；EcoR I、Xho I(NEB公司)；Ligase(NEB公司)。HEK293细胞(Shanghai Invitrogen)；DMEM+10％胎牛血清(Invitrogen)；lipofectamine2000(Invitrogen)；OptiMEM培养液(Invitrogen)；0.05％Trypsin(Invitrogen)；Trizol(Invitrogen)；EagI(NEB)；；LR clonase II(Invitrogen)；pDONR221(Invitrogen)；pLenti6.3/V5-DEST(Invitrogen)；包装质粒(Invitrogen)；293FT细胞(Shanghai Invitrogen)；0.05％Trypsin(Invitrogen)；DMEM+10％FBS(Invitrogen)；Opti-MEM培养液(Invitrogen)。

1.2方法

(1)干扰载体的构建

检索GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)，获取sheepmyostatin基因的mRNA序列，其序列号为NM_001009428。根据InvitrogenmiRNA设计系统，针对靶基因设计并合成4对miRNA oligo，和一对阴性miRNAoligo，oligo序列见表一：

表一miRNA oligo序列(含阴性对照序列)

将该5对oligo各自退火成双链。然后用载体构建试剂盒进行重组克隆，将5对双链的miRNA oligo各自插入到miRNA表达载体pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR中，构建5个miRNA质粒，转化入感受态细胞DH5α。经含氨苄青霉素培养基筛选后，每个转化平板分别挑取4个克隆，用载体通用引物进行菌落PCR筛选。筛选得到的阳性克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致。验证无误后扩增质粒备用。

(2)MTSN全基因合成及高表达载体构建

对所需合成的全序列进行分析，设计及合成单链oligo，利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因，然后装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α，经测序验证，重组克隆中基因序列有突变点，通过重叠PCR将基因序列中突变点修复。将突变后的全长片段用XhoI和EcoRI酶切后，16℃连接1h连接至目的载体pCDNA3.1(+)，并转化到感受态细胞DH5α中。测序验证重组克隆中目的基因片段的序列信息。

(3)干扰载体的筛选

干扰质粒和高表达载体的制备

接种干扰质粒和高表达载体菌液至5ml LB培养液中，37度摇床(220rpm)过夜；次日用HQ高纯度质粒抽提试剂盒制备质粒，备用。

干扰载体和高表达载体瞬时共转染靶细胞

将状态良好，处于对数生长期的细胞，按照每孔5×10⁵个细胞接种于六孔板的每个孔中，待细胞覆盖率为80％左右时，用无血清Opti-MEM轻洗细胞两次，加入1.5ml Opti-MEM，然后进行转染。分别加入干扰质粒MR085-1、MR085-2、MR085-3、MR085-4以及阴性对照质粒MR_neg(C-)，及高表达载体pcDNA3.1-Ovis aries MSTN和lipofectamine 2000，共转染293T细胞。在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养4～6小时后，换上完全培养液(不含抗生素)，继续培养，第二天观察是否有荧光表达，并通过qPCR方法检测干扰载体对靶基因的干扰效果。

(4)干扰效果最佳的载体构建为慢病毒干扰载体

用Eag I将筛选出的干扰质粒pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085-1酶切，纯化酶切产物，最终溶于15ul elution Buffer中，经过两次重组反应——BP重组和LR重组后，取5ul重组反应液转化100ul的stbl3感受态细胞，细胞涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，从平板挑单克隆接种于4ml含100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养。提取质粒，测序验证(Invitrogen Shanghai)。

(5)慢病毒的包装

慢病毒包装：取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，按照每个培养皿(10cm)6x 106个细胞数接种于培养皿中，待细胞覆盖率为80％左右时，进行转染，转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液，将Packaging Mix(Invitrogen)、慢病毒表达质粒及lipofectamine2000共转染293T细胞。37℃、5％CO₂条件下培养6h，将培养液换成10％FBS的DMEM培养液继续培养，48h后收集细胞培养上清，3000rpm离心10min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤，将病毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于500ulDMEM培养液中，分装小管，放置于-80℃保存备用。

(6)病毒滴度的测定

慢病毒液滴度测定：将HEK293细胞培养至对数生长期，按照每孔8000细胞接种96孔板，细胞长至30-50％的融合密度时进行感染。转染时，将保存于-80℃冰箱中病毒液冰水浴融化，用含有8ug/ml polybrene和2％FBS的细胞培养液进行梯度稀释，每孔加入100ul，每个稀释度两个重复。第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。

2结果：

2.1干扰载体的构建：针对靶基因构建的四个干扰质粒分别为：

pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085_1，pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085_2，pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085_3，pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmi-MR085_4。

测序结果经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，miRNA干扰载体构建成功。

2.2MSTN全基因合成及高表达载体构建：

经点突变修复后MSTN全基因和pcDNA3.1载体用XhoI和EcoRI双酶切电泳照片见图1和图2。将得到的阳性克隆送测序公司测序，结果显示针对靶基因构建的高表达载体pcDNA3.1-Ovis aries MSTN，经过比对，重组克隆中插入片段序列与目的基因序列完全一致，目的基因高表达载体构建成功。

2.3干扰载体在HEK293细胞中的干扰评价：

干扰载体和MSTN基因高表达载体共转染293T细胞，瞬时转染48小时后收集所述细胞样品，通过qPCR检测目的基因的表达情况。内参定量结果和目的基因定量结果分别见表2和表3，内参扩增曲线和熔解曲线见图4和图5，目的基因扩增曲线和熔解曲线见图6和图7，目的基因MSTN被所构建的干扰质粒沉默的效率见图3。

表2内参定量结果

表3目的基因定量结果

上述结果显示MR085-1对于目的基因的Knockdown效果最佳，干扰效率为92％。

2.4干扰效果最佳的质粒载体转为慢病毒载体：

将构建好的慢病毒载体测序，结果显示针对靶基因构建的慢病毒载体pLENTi6.3-MR085_1，序列比对完全正确，慢病毒载体构建成功。

2.5慢病毒的包装和滴度的测定：

将构建的慢病毒载体pLENTi6.3-MR085_1，转染HEK293细胞，24小时后用荧光显微镜检测，在荧光显微镜下同一视野的荧光和可见光照片见图8。

慢病毒载体pLenti6.3-MR085_1感染HEK293细胞后96小时各孔稀释度下的荧光照片见图9、图10、图11、图12、图13。

结果：pLenti6.3-MR085_1病毒感染细胞HEK293，在稀释度为10^-7的七号孔(100ul)中观察到表达绿色荧光的细胞分别为97个和89个，则病毒的滴度为：9.3×10⁹TU/ml。

实施例2慢病毒干扰载体在培育绵羊新品种中的应用

将所述miRNA慢病毒干扰表达载体pLenti6.3-MR085_1与台酚蓝混合，制备成转染液。然后采用微创手术，将上述转染液分多点注射入绵羊两侧的睾丸中再与雌性交配。

初步的研究结果显示，子代表达绿色荧光蛋白的阳性转基因绵羊，经实时定量PCR技术检测发现所述绵羊的肌肉组织MSTN基因的转录水平显著低于非转基因绵羊，结果见表4。

表4MSTN基因转录水平

Claims (3)

1.一对提高动物瘦肉率的干扰序列MR085_1，其特征在于，所述的干扰序列MR085_1的序列为Sequnence NO.1和Sequnence NO.2。

2.权利要求1所述的干扰序列MR085_1在降低绵羊组织细胞MSTN基因表达的应用。

3.权利要求1所述的干扰序列MR085_1在培养高瘦肉率的绵羊新品种中的应用。

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