CN107881231A - Lmo3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Lmo3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了LMO3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用，具体为生物医药技术领域。所述的产品通过检测LMO3基因及其表达来诊断胶质瘤。所述的LMO3表达作为胶质瘤预后预测和预警诊断的新生物靶标。所述的胶质瘤诊断药物至少包括一对特异性扩增LMO3的基因的引物和标准品，所述的引物由上游和下游引物组成，以LMO3为基础的诊断药物可方便快捷的在基因水平上实现肿瘤的检测，以LMO3为靶点的药物有望成为胶质瘤靶向治疗的一种新手段。

Description

LMO3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及LMO3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用，具体为生物医药技术领域。
背景技术
星形胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤，其中恶性度最高的是多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM，IV级)。由于GBM的增殖能力强、侵袭能力高及对放化疗的耐受，即使采取以手术切除为主，放、化疗为辅的综合治疗措施，患者平均生存期仍不足两年。近年来，越来越多的研究聚焦于以细胞关键基因和调控分子为靶点的“分子靶向治疗”，但是疗效依然无显著改善。因此，发现新的具有诊断或治疗意义的分子靶点，不但可为胶质瘤的分子诊断及分型奠定基础，而且有助于胶质瘤的靶向治疗。
LMO3属于仅有两个富含半胱氨酸的锌指样LIM结构域(LIM1和LIM2)的LMOs(LIMonly protein，LMO)转录调节因子家族，该家族有4个结构高度保守、功能相似的成员组成(LMO1-LMO4)。LMOs家族其他三个成员(LMO1、LMO2、LMO4)在肿瘤发生中的关键作用已有大量文献报道，尤其LMO2、LMO4的异常表达促进白血病、乳腺癌发生发展的作用引起了各国学者广泛关注。近期文献报道癌基因LMO2在乳腺癌、结肠癌中通过WNT通路抑制肿瘤的生长(2013)，提示LMO2在肿瘤中具有相反的功能，LMOs家族其他成员是否具有相似的双重功能值得进一步的研究。已有文献报道LMO3可以显著促进细胞增殖，LMO3在神经母细胞瘤、肺癌、甲状腺癌、T细胞性白血病中表达上调，提示LMO3与肿瘤发生的密切关系。已有临床研究显示LMO3低表达的神经母细胞瘤患者的预后明显好于高表达患者，LMO3是神经母细胞瘤发生、发展及不良预后的预测分子。胶质瘤中LMO3因启动子低甲基化表达增加，检测LMO3甲基化水平可以作为胶质瘤预后预测的指标之一(CN.102329870A)。可见LMO3在肿瘤发生、发展等方面有重要作用，并且LMO3的组织表达与肿瘤的分级及预后密切相关，现有研究均显示LMO3具有癌基因的特性。但LMO3在胶质瘤中的表达改变对胶质瘤的作用及机制尚不清楚，其表达变化对胶质瘤常规化疗药物替莫唑胺的影响有待研究。但现有技术中尚未出现LMO3mRNA表达与胶质瘤的发生、发展及预后的关系研究，LMO3表达改变对胶质瘤生长、增殖的体内外研究尚不清楚。为了克服现有技术中存在的问题，本发明的目的在于公开研究LMO3在胶质瘤生长、增殖、化疗药物敏感性中的作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种降低肿瘤细胞增殖的方法，为提高肿瘤细胞中LMO3的表达水平，从而减低细胞的生长和增殖。更进一步提供了一个新的抑癌基因在胶质瘤预后预测、诊断，制备预防、治疗胶质瘤药物的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：LMO3基因在制备诊断、预防和治疗胶质瘤的产品中的应用。
进一步的，所述的产品通过检测LMO3基因及其表达来诊断胶质瘤。
进一步的，所述的LMO3表达作为胶质瘤预后预测和预警诊断的新生物靶标。
进一步的，所述的胶质瘤诊断药物至少包括一对特异性扩增LMO3基因的引物和标准品，所述的引物由上游和下游引物组成，上游引物具有如5'-CTTTGTGTTGTGTAGCCCTAACGTC-3'(SEQ.ID.NO.5)的序列，下游引物具有如5'-ACTCAGCACTCTGTTGGAGTGGA-3'(SEQ.ID.NO.6)的核苷酸序列。
进一步的，所述的标准品是包含有LMO3序列的重组质粒pGEM-T-LMO3，所述标准品具有如SEQ.ID.NO.7所述的序列。
进一步的，所述的LMO3为基础的胶质瘤诊断方法是采用荧光定量RT-PCR法，以GAPDH为对照。
进一步的，所述的LMO3基因作为胶质瘤治疗药物敏感性的生物指标，至少但不限于替莫唑胺等化疗药物。
进一步的，所述的治疗或预防胶质瘤的表达载体和慢病毒，它是由LMO3和pLL3.7-CMV-IRES-puro载体构建而成。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种新抑癌基因及该基因在制备胶质瘤诊断、预防或治疗药物中的应用，以LMO3为基础的诊断药物可方便快捷的在基因水平上实现肿瘤的检测，通过LMO3表达水平的检测预测患者的化疗效果和预后，以LMO3为靶点的药物有望成为胶质瘤靶向治疗的一种新手段。
附图说明
图1为生物信息学数据库分析正常脑组织、不同级别胶质瘤组织中LMO3mRNA的表达水平(A、B、C)和LMO3mRNA表达与患者生存期的关系。
图2为LMO3过表达对胶质瘤细胞生长、增殖影响的CCK、EDU检测。
图3为LMO3表达水平与替莫唑胺处理胶质瘤细胞对细胞生长、增殖影响的剂量、时间效应。
图4为LMO3过表达对胶质瘤裸鼠移植瘤生长的影响。
图5为HE染色及免疫组化检测裸鼠胶质瘤细胞移植瘤模型鼠肿瘤中LMO3、Ki67的表达。
图6为qRT-PCR检测胶质瘤患者肿瘤标本中LMO3mRNA的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1.LMO3基因在正常脑组织和胶质瘤组织中的生物信息学分析。从NCBI网站的基因表达数据库中下载GSE2223数据集和GSE4271数据集，从UCSC基因表达数据库下载TCGA中胶质瘤相关数据库，对各数据集中胶质瘤组织芯片数据进行配对比较。GSE2223数据集包括41例胶质瘤组织、14例少突胶质瘤组织和4正常脑组织例肿瘤组织，GSE4271数据集包括24例III级胶质瘤组织、76例胶质母细胞瘤组织，TCGA lower grade glioma andglioblastoma-1152数据集包括有检测数据的517例低级别胶质瘤和151例胶质母细胞瘤组织，TCGA lower grade glioma and glioblastoma 697数据集包括530例低级别胶质瘤和166例胶质母细胞瘤组织。数据已经通过质量控制和均一化处理,下载的数据通过应用Graphpad Prism 7软件分析胶质瘤组织中LMO3mRNA表达差异情况。生存分析：从公共基因芯片数据库(GEO)以及TCGA中寻找并下载神经胶质瘤基因芯片数据，应用Graphpad Prism7软件进行Kaplan-Meier分析，绘制生存函数曲线，用Log-rank test法进行差异显著性检验。
通过对GEO以及TCGA中胶质瘤相关数据库LMO3基因在神经胶质瘤及正常脑组织中的表达情况进行分析，结果显示，LMO3基因在正常脑组织的表达高于少突胶质瘤和胶质母细胞瘤组织(p<0.05或0.01，如图1中的A所示)，同时，随神经胶质瘤恶性程度的增加，LMO3基因表达水平降低更加明显,III级胶质瘤组织中LMO3的表达显著低于IV级胶质瘤(P<0.05，图1中的B所示)；低级别胶质瘤组织中的表达低于高级别的胶质母细胞瘤(P<0.01，图1中的C，D所示)。同时，为了探讨LMO3的表达水平与临床预后的关系，通过来源于TCGA数据库下载基因芯片数据中1152例胶质瘤患者生存期数据，分析了LMO3的表达与患者的生存时间，根据LMO3基因的表达水平，我们将数据库中的神经胶质瘤样本分为两组，再通过Kaplan-Meier分析两组患者生存时间的差异，发现LMO3的表达水平显著影响患者的生存，与低表达组相比，LMO3高表达的肿瘤患者存活时间较长，并经Log-rank检验，检验统计量的值为8.623，P<0.01(图1中的E所示)。
以上结果提示，LMO3表达与胶质瘤的病理等级及患者的预后密切相关，随胶质瘤发生发展，LMO3表达水平降低；LMO3高表达的患者预后较好，LMO3低表达的患者生存期较短，提示LMO3mRNA的表达可以作为胶质瘤患者肿瘤进展和生存预后的预测指标之一。
实施例2.本实施例提供了LMO3蛋白、蛋白编码的基因、含有该编码基因的表达盒、重组载体、重组菌。含有人LMO3基因开放读框的真核表达质粒pcDNA4-Myc/HisA-LMO3由药明康德构建，根据LMO3基因的序列及慢病毒载体pLL3.7-CMV-IRES-puro的克隆位点,设计引物如SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2，使用PrimeSTAR高保真酶，以LMO3真核表达质粒为模板扩增LMO3的编码区序列，PCR程序设置：94℃、4min，25×(94℃、30s，56℃、30s，72℃、30s)，72℃、4min。胶回收目的片段，用BamHI、Xhol双酶切pLL3.7-CMV-IRES-puro质粒，采用金斯瑞公司的CloneEZ PCR克隆试剂盒(CloneEZ PCR Cloning Kit，L00339)，该试剂盒为非内切酶依赖的克隆系统，可快速和高通量地将PCR产物定向克隆到任何载体中。连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态，将连接产物加入感受态后轻轻混匀几次，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴1min，加入300μl无抗液体LB后直接涂板。用无菌枪头挑取单克隆至PCR管中，用20μl灭菌水稀释，取1μl菌液进行PCR反应，电泳检测PCR结果并测序鉴定重组慢病毒质粒。其中，LMO3基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，LMO3核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。
实施例3.本实施例提供了含有LMO3蛋白编码基因的病毒，如慢病毒载体及重组细胞。本项目采用四质粒系统，并用293T细胞包装慢病毒颗粒，主质粒为pLL3.7-CMV-LMO3-IRES-puro质粒，三个包装质粒为pMDLg/pRRE、pVSV-G和pRSV-Rev。转染前一天将293T细胞铺于100mm培养皿，次日，当密度达到80％左右进行转染。在转染前2小时换液，加入5mL预热的DMEM。按照磷酸钙转染法进行转染，取两个1.5mL的管子，第一个管中加入425μL的超纯水，50μL 2.5M CaCl2，以及四种不同的病毒包装质粒，质粒量为pLL3.7-LMO3，12μg，PMDL 6μg，TRE 6μg，VSVG 6μg，震荡混匀。取另外一个管子，加入2×HBS 500μL。把混好质粒的EP管一边震荡一边逐滴加入500μL的2×HBS，震荡均匀。室温下放置5min，逐滴加入培养皿中，一边滴加一边混匀。培养6-8小时后更换新的DMEM(含2％血清的DMEM)培养基10-15mL，继续培养至48-54小时，收集细胞上清，3500g×5min离心去除大的细胞碎片，0.45μm滤器过滤，将上清病毒转移至新管冻存于-80℃备用。慢病毒感染时，SHG44细胞以2×105铺于细胞培养板内，使感染时的细胞密度约为40-60％。感染时病毒量占培养基总体积的50％。之后在病毒培养基混合液中加入终浓度为8-10μg/ml polybrene，摇匀后培养16-24小时，更换新鲜培养液。72小时后，培养液换成含有puromycin的工作浓度为2μg/mL的新鲜培养液。实验组细胞因能合成抗筛选药物的蛋白而得以存活，以空载的细胞为阴性对照，判定筛选状况，直至筛选完全。分别得到LMO3稳定过表达的SHG44细胞株。
实施例4.LMO3基因过表达降低SHG44细胞的增殖能力。将上述过表达LMO3的SHG44细胞细胞作为处理组，将感染pLL3.7-CMV-IRES-puro空载体慢病毒的SHG44细胞作为空载体对照组，检测过表达LMO3对胶质瘤细胞增殖的影响。
(1)采用CCK8法检测检测LMO3过表达组、空载体对照组、空白对照组细胞活性随时间的变化，将3组细胞分别接种于96孔培养板中，每孔细胞悬液100ul。分别培养24h、48h、72h、96h，每个时间点设5个复孔，CCK-8法检测细胞增殖，在上述时间点每孔加10ul的CCK-8，培养4小时后，于450nM波长处用多功能酶标仪测定各孔吸光度值。
通过CCK8法检测发现，(如图2中A所示),LMO3过表达组24h、48h、72h及96h的细胞增值率与空载体对照组、空白对照组比较均显著减低(p＜0.001)，空载体对照组、空白对照组24-96h每个时间点增值率比较无显著差异(p＞0.05)，提示LMO3过表达降低SHG44、U87胶质瘤细胞增殖能力。
(2)采用EDU染色法检测LMO3过表达对胶质瘤细胞增殖的影响，取对数生长期细胞，三组细胞分别以以每孔4×103个细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。用DMEM细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入100μL50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；PBS清洗细胞1-2次，每次5分钟。细胞固定化：每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；(加强)每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。Apollo染色：每孔加入100μL的染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂；DNA染色：用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μL1×Hoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μLPBS清洗1-3次；图像获取及分析：建议染色完成后立即进行观测照相，统计分析各组阳性染色细胞数与总可见细胞数并计算各组阳性细胞数比例。
实验结果(如图2中B、C所示)，各组细胞中EDU阳性染色为红色荧光显示，统计各组细胞EDU阳性细胞与各组细胞比值，发现LMO3过表达组EDU阳性率显著低于与空载体对照组、空白对照组(p<0.05),空载体对照组与空白对照组无显著差异，结果表明，LMO3过表达抑制胶质瘤细胞的增殖。
实施例4.LMO3过表达增加胶质瘤细胞对胶质瘤化疗药物替莫唑胺的敏感性。
接种三组细胞于96孔细胞培养皿中，每组4个复孔，将替莫唑胺用DMSO溶解后配置成工作液，在接种后第二天分别用不同浓度的替莫唑胺处理三组细胞，其终浓度分别为0，50、100，200μmol/L，分别培养24、48、72h后，避光条件下每孔加入100μl的CCk8，酶标仪检测各孔吸光度值。
结果如图3所示，用不同浓度的TMZ培养培养72h后，三组细胞中LMO3过表达组的细胞存活率随TMZ浓度增加而降低，100ul、200uM的存活率显著低于空白对照组和空载体对照组SHG44细胞(p<0.01)；随细胞培养时间的延长，LMO3过表达组SHG44细胞48h、72h的存活率显著低于空白对照组和空载体对照组SHG44细胞(p<0.01)，表明LMO3提高了TMZ对胶质瘤的增殖抑制能力，表明高表达LMO3可以增加胶质瘤对TMZ的敏感性。
实施例5.本实施例提供了上述LMO3在抑制体内胶质瘤细胞生长的应用。
为进一步检测LMO3对胶质瘤体内增殖抑制的作用，将裸鼠分为LMO3过表达组、空白对照组和空载体对照组，每组各7只裸鼠，将生长状态良好的三组细胞按照5×107个/只注射于裸鼠背侧皮下建立裸鼠移植瘤模型，观察各组裸鼠生长及肿瘤形成情况，10周后处死所有裸鼠，检测肿瘤形成情况。如图4所示，三组裸鼠中空白对照组和空载体对照组7只均形成肿瘤，空白对照组体积除1只较小，约为0.2cm3外，其余体积约为1.0-1.2cm3；空载体对照组7只肿瘤体积较大，且较均一，大小约为1.2-1.4cm3，LMO3过表达组2只裸鼠未形成肿瘤，5只形成肉眼可见的大小不一的肿瘤，整体体积偏小，大小约从0.1到1.2cm3不等,(图4.A、B)。统计结果显示，LMO3过表达组肿瘤体积均小于空白对照组和空载体对照组，差异具有显著性(p<0.05)，提示LMO3在体内高表达可以抑制肿瘤的生长。
实施例6.HE染色及免疫组化检测裸鼠胶质瘤细胞移植瘤模型鼠肿瘤中LMO3、Ki67的表达。
为了解各组胶质瘤细胞在胶质瘤肿瘤中的组织形态变化及相关因子表达情况，我们用实施例5中获得的肿瘤组织做石蜡切片，进行HE染色和免疫组化染色检测各组肿瘤组织中Ki67、LMO3的表达。HE染色结果显示,LMO3组细胞多为椭圆形、长梭形，细胞核形态完整，核内成较染色均匀的蓝色；而空白对照组和空载体对照组细胞排列较凌乱，胞核形态不规则，细胞大小不一，形态不规则，核、胞浆比例增大，细胞核界限不清，核染色质不均匀.免疫组化染色可见，LMO3蛋白在三组细胞中均有表达，主要在胞浆表达，其中LMO3过表达组表达量较高；三组肿瘤组织中Ki67均成黄褐色颗粒，表达分布在细胞核中，LMO3过表达组Ki67阳性细胞数量明显少于空白对照组和空载体对照组，表明LMO3过表达可以在体内抑制胶质瘤细胞的增殖。
实施例7.以LMO3mRNA基因为基础的胶质瘤诊断方法。
一种胶质瘤诊断药物，它包括一对特异性扩增LMO3基因的引物，具有如图2所示的序列，上游序列具有SEQ ID，No 7所示的序列，下游序列具有SEQ ID，No8所示的序列；还包括一个包含LMO3序列的重组质粒pGEM-T-LMO3-Easy，具有如图所示的SEQ ID，No5；所述的诊断药物是以检测LMO3基因为基础的诊断药物，检测手段为荧光定量RT-PCR。
诊断方法为：收集经组织病理确诊的人脑胶质瘤手术标本,年龄15～71岁。肿瘤组织按WHO胶质瘤分级标准分为：Ⅱ级4例，Ⅲ级9例，Ⅳ级10例，脑外科切除的脑胶质瘤周围正常脑组织6例，所有患者术前均未接受放疗与化疗。提取组织总RNA提取及逆转录，取组织块约0.2克，加入适量液氮，在研钵中碾成粉末，加入TRIZOL 1ml，按说明书抽提总RNA。全波长酶标仪检测其260nm和280nm紫外线吸光度，计算其浓度，分装，-80℃保存备用。取恒定量总RNA 2.0ug,用M-MLV逆转录酶合成cDNA，反应体系及条件详见试剂说明书。PCR标准品的制备：以脑组织cDNA为模板，用LMO3上游引物SEQ.ID.NO.7.5'-CTTTGTGTTGTGTAGCCCTAACGTC-3'，下游引物SEQ.ID.NO.8.LMO3：5'-ACTCAGCACTCTGTTGGAGTGGA-3'进行PCR反应，其中cDNA2ul，20×premixTaq 50ul，引物各1.0ul，灭菌超纯水44ul。反应条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，循环反应35次；72℃5min。15g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,用胶回收试剂盒对目的片段进行提纯和浓缩；按以下体系建立建立连接复合物：5×T4DNA连接酶缓冲液5μl，T4DNA连接酶1μl,pGEM-T Easy质粒1μl,纯化的目的片段3μl,4℃循环水浴过夜；将5μl连接反应混合物加于JM109感受态细菌中,冰浴30min，42℃水浴90s后,速转至冰浴5min。加500μlLB培养基于37℃水浴预温后转至37℃摇床上,温育60min。采用α互补法和氨苄青霉素筛选法筛选转化后的菌株,PCR扩增法鉴定重组质粒pGEM-T-LMO3的特异性，质粒提取试剂盒提取重组质粒,测OD260,换算为质粒的拷贝数，浓度换算公式如下：质粒拷贝数＝(OD260×稀释倍数×50×6.02×1023×10-9)÷600÷碱基数(拷贝/μl)。将原液梯度稀释成1010、108、106、104、102、1拷贝/μl，以蒸馏水作为零标FQ-PCR梯度参考标准。PCR反应体系20μl，cDNA 1μl，2×SYBR premix Ex Taq荧光定量预混反应液10ul,10μmol/L上下游引物各0.2μl,ROX reference Dye(50×)0.4μl，Mili-Q水补足至20μl。2min预变性后，95℃10s；95℃5s,60℃31s,循环45次。分别以1010、108、106、104、102拷贝/μl的LMO3及GAPDH的标准品扩增的量制作标准曲线。标准曲线以质粒的拷贝数对数为横坐标,以荧光强度为纵坐标。根据各样品的荧光值,读取标准曲线中对应的起始拷贝数，每个样品均做3复管，实验重复三次。结果以LMO3copies/G3PDH copies表示LMO3mRNA在各组起始RNA中的相对含量。数据统计采用graphpad prism7.0分析软件，采用非参数T检验方法进行统计分析，著性水平a＝0.05。
qRT-PCR检测结果显示，正常脑组织与胶质瘤组织中LMO3的表达有显著性差异，胶质瘤中的表达低于正常脑组织((P<0.01)，图2)。表明通过该药物的应用可以用于胶质瘤病人的的诊断，结合实施例1、2、3、4的结果，可以初步判断胶质瘤病人对替莫唑胺治疗的敏感性和可能的预后评估。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 中国人民解放军兰州军区兰州总医院
<120> LMO3基因在制备胶质瘤抗肿瘤药物中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> AGAGAATTCGGATCCATGCTCTCAGTCCAGCCAGA
<400> 1
agagaattcg gatccatgct ctcagtccag ccaga 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> CTTCCATGG CTC GAGTCAGCGAACCTGGGGTGCAT
<400> 2
cttccatggc tcgagtcagc gaacctgggg tgcat 35
<210> 3
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<223> ATGCTCTCAGTCCAGCCAGACACCAAGCCGAAAGGTTGTGCTGGCTGCAACCGAAAGATCAAGGACCGGTATCTTCTAAAGGCACTGGACAAATACTGGCATGAAGACTGCCTGAAGTGTAAGGACCGGTATCTTCTAAAGGCACTGGACAAATACTGGCATGAAGACTGCCTGAAGTGTGCCTGCTGTGACTGTCGCTTGGGAGAG
<400> 3
atgctctcag tccagccaga caccaagccg aaaggttgtg ctggctgcaa ccgaaagatc 60
aaggaccggt atcttctaaa ggcactggac aaatactggc atgaagactg cctgaagtgt 120
aaggaccggt atcttctaaa ggcactggac aaatactggc atgaagactg cctgaagtgt 180
gcctgctgtg actgtcgctt gggagaggtg ggctccaccc tgtacactaa agctaatctt 240
atcctttgtc gcagagacta tctgaggctc tttggtgtaa cgggaaactg cgctgcctgt 300
agtaagctca tccctgcctt tgagatggtg atgcgtgcca aggacaatgt ttaccacctg 360
gactgctttg catgtcagct ttgtaatcag agattttgtg ttggagacaa atttttccta 420
aagaataaca tgatcctttg ccagacggac tacgaggaag gtttaatgaa agaaggttat 480
gcaccccagg ttcgctga 498
<210> 4
<211> 498
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys
1 5 10 15
Cys Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Cys Gly Ala Ala
20 25 30
Ala Gly Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys
35 40 45
Ala Ala Cys Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly
50 55 60
Ala Cys Cys Gly Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala
65 70 75 80
Gly Gly Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Cys
85 90 95
Thr Gly Gly Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys
100 105 110
Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly
115 120 125
Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala
130 135 140
Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Ala Cys Thr Gly Gly Cys
145 150 155 160
Ala Thr Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Ala
165 170 175
Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Ala Cys
180 185 190
Thr Gly Thr Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly
195 200 205
Thr Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Ala
210 215 220
Cys Ala Cys Thr Ala Ala Ala Gly Cys Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr
225 230 235 240
Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly
245 250 255
Ala Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Thr Thr
260 265 270
Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala Cys
275 280 285
Thr Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Thr Ala
290 295 300
Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Thr
305 310 315 320
Thr Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Thr
325 330 335
Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Thr Gly Thr Thr Thr
340 345 350
Ala Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Thr Thr
355 360 365
Thr Gly Cys Ala Thr Gly Thr Cys Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Thr
370 375 380
Ala Ala Thr Cys Ala Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly
385 390 395 400
Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr
405 410 415
Cys Cys Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Thr Gly
420 425 430
Ala Thr Cys Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly
435 440 445
Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Thr Thr Thr
450 455 460
Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Thr Thr Ala Thr
465 470 475 480
Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr
485 490 495
Gly Ala
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ctttgtgttg tgtagcccta acgtc 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
actcagcact ctgttggagt gga 23
<210> 7
<211> 172
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ctttgtgttg tgtagcccta acgtcattta gcttgttgtc tgatgcctcc agtaggacac 60
ctccgatgga gctttgattt ctgagcagcg aaagctccct tcctaagatg catctcgcat 120
aggctgccta tgatgaagga ccgtgcacct ccactccaac agagtgctga gt 172

Claims (8)

1.LMO3基因在制备诊断、预防和治疗胶质瘤的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的产品通过检测LMO3基因及其表达来诊断胶质瘤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的LMO3表达作为胶质瘤预后预测和预警诊断的新生物靶标。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的胶质瘤诊断药物至少包括一对特异性扩增LMO3的基因的引物和标准品，所述的引物由上游和下游引物组成，上游引物具有如5'-CTTTGTGTTGTGTAGCCCTAACGTC-3'的序列，下游引物具有如5'-ACTCAGCACTCTGTTGGAGTGGA-3'的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的标准品是包含有LMO3序列的重组质粒pGEM-T-LMO3，所述标准品具有如SEQ.ID.NO.7所述的序列。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的LMO3为基础的胶质瘤诊断方法是采用荧光定量RT-PCR法，以GAPDH为对照。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的LMO3基因作为胶质瘤治疗药物敏感性的生物指标，至少但不限于替莫唑胺等化疗药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的治疗或预防胶质瘤的表达载体和慢病毒，它是由LMO3和pLL3.7-CMV-IRES-puro载体构建而成。
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