CN108339113A - E3泛素连接酶rnf14在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents

E3泛素连接酶rnf14在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了E3泛素连接酶RNF14在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。属于RNF14的新用途。本发明以人正常肝细胞系L02、RNF14过表达的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸（PA）、油酸（OA）联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究RNF14基因的功能。研究发现，RNF14过表达能够显著改善肝脏细胞内脂质堆积，说明RNF14能够保护肝脏细胞免受脂肪样变性，RNF14在肝脏脂质代谢性疾病中起着保护作用。由于RNF14是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。

Description

E3泛素连接酶RNF14在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的 应用
技术领域
本发明属于基因的功能和应用领域，涉及了E3泛素连接酶RNF14在治疗脂肪肝中的功能和应用，以及RNF14作为靶基因在研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物中的应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的肝病，在西方国家中的发病率为15％至30％，中国香港为27％，东南亚、韩国、日本及中国台湾为15％至45％，在中国为20％[1]。非酒精性脂肪肝分为两类，一种是较轻微的非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver,NAFL)，一种是较严重的非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)。非酒精性脂肪肝继续发展可导致肝硬化及肝癌，严重威胁人类健康[2]。
肝脏是体内物质代谢的中枢，它具有许多重要的生理功能，如脂质合成和分解，葡萄糖的合成和分解，胆汁合成和分泌等。肝脏是人体生化工厂，脂质由肝脏合成和输出。随着非酒精性脂肪肝病程的延长，发生肝脏病变的可能性及其病变程度也随之增加，非酒精性脂肪肝炎一旦发展成为肝硬化将极大影响患者的生活质量和生命健康[3]。因此对非酒精性脂肪肝炎的早期诊断及防治就显得尤为重要。
E3泛素连接酶RNF14(Ring Finger Protein 14，RNF14)是一种E3泛素连接酶，该基因编码了包含涉及到蛋白相互作用的RING锌指结构基序，作为E3泛素连接酶能够接收泛素并将其转移到底物上。RNF14在癌症的发生发展中起着重要的作用。在前列腺癌中，RNF14可以和雄激素受体(AR)相互作用并且作为雄激素受体的共激活子诱导雄激素受体靶基因的表达并且此基因的结构域负调突变体能够抑制雄激素受体诱导的前列腺癌细胞的生长[4]。在结肠癌细胞中， RNF14和TCF相互作用并结合到靶基因的启动子，同时稳定β-catenin来正向调节 Wnt信号通路[5]。除此之外，有研究报道在肌肉细胞中，RNF14作为一个潜在的转录调节子，能够增加12个线粒体基因组编码蛋白的表达并最终影响线粒体的功能[6]。但是关于RNF14在脂肪肝中的功能及其应用目前尚未见报道。
参考文献
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[6]RNF14is a regulator of mitochondrial and immune function inmuscle.Ingham AB,et al.BMC Syst Biol.2014Jan 29；8:10.
发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种RNF14基因的表达与脂肪肝病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝病的靶基因 RNF14的新用途，进而把RNF14应用于脂肪肝病的治疗。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明第一方面，提供E3泛素连接酶RNF14在制备保护肝脏的药物中的应用。
优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。
本发明第二方面，提供E3泛素连接酶RNF14在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
本发明涉及的E3泛素连接酶RNF14在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是E3泛素连接酶RNF14。
本发明涉及的E3泛素连接酶RNF14在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是E3泛素连接酶RNF14作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高E3泛素连接酶RNF14 表达量的试剂。
优选地，提高E3泛素连接酶RNF14表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA 注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。
所述的E3泛素连接酶RNF14或RNF14，包括基因或蛋白。所述的RNF14 基因在对象体内经转录翻译为E3泛素连接酶RNF14蛋白产物。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明通过试验确定了E3泛素连接酶RNF14的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：
本发明以人正常肝细胞系L02、RNF14过表达的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸(PA)、油酸(OA)联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究RNF14基因的功能。研究发现，RNF14过表达能够显著改善肝脏细胞内脂质堆积，说明 RNF14能够保护肝脏细胞免受脂肪样变性，RNF14在肝脏脂质代谢性疾病中起着保护作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现RNF14基因的新功能，即RNF14基因具有能够保护脂肪肝疾病的作用。
(2)基于RNF14在保护脂肪肝疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物。由于RNF14是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。
附图说明
图1是野生型和过表达RNF14的L02细胞系的WB鉴定图。
图2是野生型和过表达RNF14的L02细胞系油红O染色图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明中的试验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
实验用细胞及培养：
人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T 细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO2的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。
RNF14慢病毒过表达质粒构建：
1)PCR扩增RNF14基因，引物为：
正向：5’-CGCGGATCCATGTCGTCAGAAGATCGAGA-3’
反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCTTCTACCTCATCTT-3’；
2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收；
3)将所得DNA产物或者载体和限制性内切核酸酶BamHI及NotI FastDigestrestriction enzymes(Thermo)、buffer orGreen buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。之后使用 AxyPrepTMPCRClean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；
4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；
5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于 37℃培养箱，过夜培养；
6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；
7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；
8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒)；
9)提取后的质粒可直接用于RNF14瞬时转染或构建慢病毒稳定转染细胞系。
慢病毒载体的构建和包装：
1)用胰酶消化并记数293T细胞，按1×106个293T/孔传至6孔板中；
2)第二天细胞汇合度至80％时开始转染；
3)取1.5ml灭菌EP管，加入2个包装质粒pSpax(Addgene，12260)和pMD2.G(Addgene，12259)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。
4)取1.5ml灭菌EP管，取3μl PEI(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。
5)将DNA溶液和PEI溶液轻柔混匀，室温孵育15min；
6)将上述DNA-PEI混合液，逐滴加入6孔板中；
7)转染6h后，换新鲜培养基；
8)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；
9)过滤后的病毒可立即用于感染汇合度为30％的L02细胞。
细胞感染
(1)细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。
(2)第一次感染：将病毒液与待感染的细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl病毒液 +2mL完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/mL)，使其终浓度为8μg/ml。
(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染 24h。
(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。
加药筛选细胞
第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/mL)，待空白孔细胞完全死亡，将六孔板中细胞传代至T25 培养瓶，一般空白细胞在24～48h后全部死亡。待细胞长满后，收取一部分细胞做 WB验证RNF14的过表达，并冻存部分细胞。
Western blot实验方法：
1)细胞中蛋白提取
细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。
2)上样与电泳
配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内，点样完成后开始电泳。
3)转膜
①配制转膜液，于4℃预冷。
②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。
③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将PVDF膜覆盖其上，夹上夹板。
④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。
⑤转膜槽接通电源，电压设为250V，电流设为0.2A。转移1.5h。
⑥转移结束后，取出PVDF膜。
4)封闭
把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。
5)一抗孵育
①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。
②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗(RNF14，Abcam，ab134927)。
③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。
6)二抗孵育
①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。
②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司， BF03008/BF03008X)的稀释液中，避光孵育1h。
7)蛋白检测
孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。
油红O染色实验操作：
1)样品组和对照组用1×PBS洗涤2次，加入300μl 3％多聚甲醛固定30min；
2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s；
3)加入1×PBS洗涤2次，通风橱吹干；
4)每孔500μl加入油红O染色1-3min；
5)加入1×PBS洗涤2次，镜检并拍照。
【实施例1】RNF14基因过表达对肝细胞脂肪堆积的影响
构建过表达RNF14的慢病毒表达载体，转染HEK-293T细胞，包装慢病毒，感染L02细胞构建过表达RNF14的稳定细胞株，同时过表达空载体作为对照 (Con)，通过WB检测稳定细胞株是否表达RNF14；表达成功的L02细胞种板，细胞贴壁后加入棕榈酸酯(PA，终浓度0.2mM)及油酸(OA，终浓度0.4mM) 刺激，同时设置加药对照组(加入同等量的BSA)，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。
WB检测结果如图1所示，感染过表达RNF14慢病毒的L02细胞株中RNF14 的蛋白表达量显著高于空载对照组。油红O染色显示BSA处理细胞时，对照组和RNF14过表达组细胞均无明显着色，而当加入PA+OA刺激后，两组细胞中红色脂肪滴数目明显增多。但在相同PA+OA刺激下，与对照组相比，RNF14过表达组细胞被油红O染色的细胞数目及着色程度显著减弱(图2)。
上述结果表明RNF14过表达能够抑制PA及OA联合刺激导致的肝细胞脂质沉积，RNF14在肝脏脂肪变性的病理过程中起着保护作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> E3泛素连接酶RNF14在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcggatcca tgtcgtcaga agatcgaga 29
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataagaatgc ggccgcctag tcttctacct catctt 36

Claims (7)

1.E3泛素连接酶RNF14在制备保护肝脏的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物具有抑制肝脏脂质蓄积的功能。
3.E3泛素连接酶RNF14在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
5.权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物的活性成分是E3泛素连接酶RNF14。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述的应用是E3泛素连接酶RNF14作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高E3泛素连接酶RNF14表达量的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的提高E3泛素连接酶RNF14表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。
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