CN108452308A - E3泛素连接酶trim32在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了E3泛素连接酶TRIM32在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以人正常肝细胞L02细胞系、TRIM32过表达的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸、油酸联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究TRIM32基因的功能。结果发现在相同的棕榈酸、油酸刺激下，TRIM32过表达L02细胞的红色脂肪滴的面积比对照组显著加增大，表明TRIM32过表达会恶化棕榈酸、油酸联合诱导产生的脂质累积，即TRIM32基因能够促进脂肪肝及相关疾病的发生发展。因此，TRIM32为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物提供靶标。

Description

E3泛素连接酶TRIM32在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的 应用

技术领域

本发明属于基因的功能和应用领域，涉及了E3泛素连接酶TRIM32在治疗脂肪肝中的功能和应用，以及TRIM32作为靶基因在研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的肝病，在西方国家中的发生率为15％至30％，中国香港为27％，东南亚、韩国、日本及中国台湾为15％至45％，在中国大陆为20％[1]。非酒精性脂肪肝分为两类，一种是较轻微的非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic fatty liver,NAFL)，一种是较严重的非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)。非酒精性脂肪肝继续发展可导致肝硬化及肝癌，严重威胁人类健康[2]。

肝脏是体内物质代谢的中枢，它具有许多重要的生理功能，如脂质合成和分解，葡萄糖的合成和分解，胆汁合成和分泌等。肝脏是人体生化工厂，脂质由肝脏合成和输出。随着非酒精性脂肪肝病程的延长，发生肝脏病变的可能性及其病变程度也随之增加，非酒精性脂肪肝炎一旦发展成为肝硬化将极大影响患者的生活质量和生命健康[3]。因此对非酒精性脂肪肝炎的早期诊断及防治就显得尤为重要。

Tripartite Motif Containing 32(TRIM32)是一种E3泛素连接酶，该基因编码了3个锌指结构基序：RING、一型B-box和二型B-box结构域，拥有E3连接酶的活性。TRIM32基因能够泛素化DTNBP1并且促进该蛋白质的降解。另外，TRIM32 能够在体内特异的结合到HIV-1Tat蛋白的激活结构域并且调节该蛋白的生物学活性[4]。TRIM32在心肌肥厚中也起着重要的作用，TRIM32通过阻止AKT依赖的信号通路保护了病理性的心肌肥厚[5]。TRIM32被广泛报道在各种癌症中高表达，在胃癌和肝癌中，高表达的TRIM32与不良的预后紧密相关，过表达的TRIM32 能够加速G1/S期的转换促进细胞的增殖速率，并且能够使肝癌病人抵抗抗肿瘤药物奥沙利铂[6]。但是关于本发明中TRIM32在脂肪肝中的功能及其应用目前尚未见报道。

参考文献

[1]NAFLD in Asia--as common and important as in the West.Farrell GC,et al. Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2013；10:307-18.

[2]Clinical features of nonalcoholic fatty liver disease associatedhepatocellular carcinoma.Duan XY,et al.Hepatobiliary Pancreat.Dis Int 2012；11:18-27.

[3]Wong RJ,Cheung R,Ahmed A.Nonalcoholic steatohepatitis is the mostrapidly growing indication for liver transplantation in patients withhepatocellular carcinoma in the U.S.Hepatology 2014；59:2188-95.

[4]Tripartite containing motif 32modulates proliferation of humanneural precursor cells in HIV-1neurodegeneration.Fatima M，et al.Cell DeathDiffer.2016 May；23(5):776-86.

[5]Tripartite motif 32prevents pathological cardiac hypertrophy.ChenL,et al.Clin Sci(Lond).2016May 1；130(10):813-28.

[6]Upregulated TRIM32correlates with enhanced cell proliferation andpoor prognosis in hepatocellular carcinoma.Cui X,et al.Mol Cell Biochem.2016Oct；421(1-2):127-37.

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种TRIM32基因的表达与脂肪肝病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝病的靶基因 TRIM32的新用途，进而把TRIM32基因应用于脂肪肝病的治疗。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以人正常肝细胞L02细胞系、TRIM32过表达的L02细胞系为实验对象，通过棕榈酸、油酸联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究TRIM32基因的功能。结果发现在相同的棕榈酸、油酸刺激下，TRIM32过表达L02细胞的红色脂肪滴的面积比对照组显著增大，表明TRIM32过表达会恶化棕榈酸、油酸联合诱导产生的脂质累积，即TRIM32基因能够促进脂肪肝及相关疾病的发生发展。

在此基础上，本发明第一方面，提供E3泛素连接酶TRIM32作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。

本发明第二方面，提供E3泛素连接酶TRIM32作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

本发明第三方面，提供E3泛素连接酶TRIM32的抑制剂在制备预防、缓解和 /或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

优选的，所述E3泛素连接酶TRIM32的抑制剂是抑制E3泛素连接酶TRIM32 蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制E3泛素连接酶TRIM32的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

优选的，所述抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括E3泛素连接酶TRIM32的抗体、抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合 E3泛素连接酶TRIM32但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合E3泛素连接酶 TRIM32。

优选的，所述E3泛素连接酶TRIM32的抗体包括但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链 Fv(scFv)(包括双特异性scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的 Fv(sdFv)和任何上述的表位结合片段。特别地，用于本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。用于本发明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。优选地，抗体是人或人源化单克隆抗体。

如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从由人基因表达抗体的小鼠或其它动物分离的抗体。

优选的，抑制E3泛素连接酶TRIM32的mRNA水平的抑制剂可以是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制E3泛素连接酶 TRIM32的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

本发明药物的剂型可以是口服剂的形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、糖浆剂等；也可以是注射给药的剂型，例如注射液、粉针剂等，通过静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内的途径。所有使用的剂型形式都是药学领域普通技术人员所熟知的。

本发明的药物可施用于会发生或已经发脂肪肝及相关疾病的任何动物。这些动物包括人类和非人类的动物，例如宠物或牲畜等。

本发明的药物可以本领域已知的途径施用于受试者，包括但不限于口服，胃肠外，皮下，肌内，静脉内，腹腔内，肝内，心肌内，肾内，阴道，直肠，颊，舌下，鼻内，透皮方式等。

施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，联用药物的种类，治疗频率，给药途径等。药物可以单一日剂量施用，或者总日剂量以每天两次，三次或四次的分开剂量施用。剂量可以施用一次或多次，施药时间可以单日至几个月或更长时间。

所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现TRIM32的新功能，即TRIM32具有恶化脂肪肝病的作用。

(2)基于TRIM32在恶化脂肪肝中的功能，其为研制预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物提供靶标。

(3)TRIM32的抑制剂可用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝病的药物。

附图说明

图1是野生型和过表达TRIM32L02细胞系的免疫印迹实验图。

图2是野生型和过表达TRIM32的L02细胞系油红O染色图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。

实验用细胞及培养：

人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T 细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO₂的37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。

TRIM32慢病毒过表达质粒构建：

1)PCR扩增TRIM32基因，引物为：

正向：5’-CGCGGATCCATGGCTGCAGCAGCAGCTTC-3’；

反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCTATGGGGTGGAATATCTTC-3’；

2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收；

3)将所得DNA产物或者载体和限制性内切核酸酶BamHI及NotI FastDigestrestriction enzymes(Thermo)、buffer orGreen buffer、ddH₂O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。之后使用 AxyPrep^TM PCRClean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；

4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；

5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于 37℃培养箱，过夜培养；

6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；

7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；

8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒)；

9)提取后的质粒可直接用于TRIM32瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。

慢病毒载体的构建和包装：

1)用胰酶消化并记数293T细胞，按1×10⁶个293T/孔传至6孔板中；

2)第二天细胞汇合度至80％时开始转染；

3)取1.5ml灭菌EP管，加入2个包装质粒pSpax(Addgene，12260)、pMD2G (Addgene，12259)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。

4)取1.5ml灭菌EP管，取3μl PEI(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。

5)将DNA溶液和PEI溶液轻柔混匀，室温孵育15min；

6)将上述DNA-PEI混合液，逐滴加入6孔板中；

7)转染6h后，换新鲜培养基；

8)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；

9)过滤后的病毒可立即用于感染汇合度为30％的L02细胞。

细胞感染

(1)细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。

(2)第一次感染：将病毒液与待感染的细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl病毒液 +2ml完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/ml)，使其终浓度为8μg/ml。

(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染 24h。

(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。

加药筛选细胞

第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/ml)，待空白孔细胞完全死亡，将六孔板中细胞传代至T25 培养瓶，一般空白细胞在24～48h后全部死亡。待细胞长满后，收取一部分细胞做 WB验证TRIM32的过表达，并冻存部分细胞。

Western blot检测方法：

1)细胞中蛋白提取

细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。

2)上样与电泳

配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内，点样完成后开始电泳。

3)转膜

①配制转膜液，于4℃预冷。

②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。

③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将PVDF膜覆盖其上，夹上夹板。

④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。

⑤转膜槽接通电源，电压设为250V，电流设为0.2A。转移1.5h。

⑥转移结束后，取出PVDF膜。

4)封闭

把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。

5)一抗孵育

①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。

②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗(TRIM32，Abcam，ab131223)。

③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。

6)二抗孵育

①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。

②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司， BF03008/BF03008X)的二抗稀释液中，避光孵育1h。

7)蛋白检测

孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。

油红O染色实验操作：

1)样品组和对照组用1×PBS洗涤2次，加入300μl 3％多聚甲醛固定30min；

2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s；

3)加入1×PBS洗涤2次，通风橱吹干；

4)每孔500μl加入油红O染色1-3min；

5)加入1×PBS洗涤2次，镜检并拍照。

【实施例1】建立TRIM32过表达的L02稳定转染细胞系

根据实施方式中L02稳转细胞系建立的步骤，建立TRIM32过表达的L02稳转细胞系。之后收集细胞，WB验证TRIM32的表达情况。结果如图1所示，可见感染TRIM32过表达慢病毒系统的L02细胞中，TRIM32的表达显著升高，说明细胞系建立成功。

【实施例2】TRIM32基因过表达对肝细胞脂肪堆积的影响

1.实验细胞分组：L02空载对照组、TRIM32过表达的L02稳定细胞系对照组、L02-空载实验组、TRIM32过表达的L02稳定细胞系实验组。

3.脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞贴壁，细胞培养到50％愈合度之后，向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA0.4mM)进行刺激，对照组中加入同等量的BSA。12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色实验。

油红O染色结果如图2所示，对照组细胞无明显红色，而当加入PA+OA刺激 12h后，被油红O染红的细胞相比于对照组显著增多。相同的PA+OA联合刺激下， TRIM32过表达的L02稳定细胞系实验组中红色脂肪滴的面积明显高于L02-空载实验组，说明TRIM32的过表达可加剧PA+OA刺激诱导的L02细胞脂质沉积，即 TRIM32基因对脂肪肝及相关疾病具有显著的恶化作用。

上述结果显示TRIM32基因敲低可显著抑制肝细胞脂质堆积，抑制脂肪肝及相关疾病的发生发展，TRIM32基因对脂肪肝及相关疾病具有显著的恶化作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> E3泛素连接酶TRIM32在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcggatcca tggctgcagc agcagcttc 29

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataagaatgc ggccgcctat ggggtggaat atcttc 36

Claims (9)

1.E3泛素连接酶TRIM32作为药物靶标在筛选保护肝脏的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的保护肝脏的药物是抑制E3泛素连接酶TRIM32表达的药物。

3.E3泛素连接酶TRIM32作为药物靶标在筛选制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物是抑制E3泛素连接酶TRIM32表达的药物。

5.E3泛素连接酶TRIM32的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及其相关疾病药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述E3泛素连接酶TRIM32的抑制剂是抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂、或者抑制E3泛素连接酶TRIM32的mRNA水平的抑制剂，其抑制活性是可逆的或不可逆的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂包括E3泛素连接酶TRIM32的抗体、抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、天然化合物、合成化合物、有机物、无机物；所述抑制E3泛素连接酶TRIM32蛋白质活性或蛋白质水平的抑制剂是指可以结合E3泛素连接酶TRIM32但在结合时不产生生物应答的物质，或者所述抑制剂可以阻断、抑制或减弱由激动剂介导的应答，并可与激动剂竞争结合E3泛素连接酶TRIM32。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制E3泛素连接酶TRIM32的mRNA水平的抑制剂是其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者其它能够抑制E3泛素连接酶TRIM32的mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、化合物。

9.权利要求3-8任一项所述的应用，其特征在于，脂肪肝及其相关疾病包括但不限于：单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌。