CN109288849A - 脆弱拟杆菌抑制剂及甘氨熊去氧胆酸在防治代谢综合征方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了脆弱拟杆菌抑制剂及甘氨熊去氧胆酸在防治代谢综合征方面的应用。本发明发现：(1)甘氨熊去氧胆酸GUDCA可以有效改善代谢紊乱，可以用于制备防治代谢综合征的药物；(2)抑制脆弱拟杆菌的生长降低其产生的BSH含量，可以引起GUDCA在肠道的积累，进而改善代谢紊乱，脆弱拟杆菌的抑制剂或胆汁酸水解酶BSH的抑制剂可以用于制备防治代谢综合征的药物；(3)二甲双胍为有效的脆弱拟杆菌抑制剂。上述发现没有被现有技术报道过，也不存在技术启示，具有突出的实质性特点和显著的进步。

Description

脆弱拟杆菌抑制剂及甘氨熊去氧胆酸在防治代谢综合征方面 的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及防治代谢综合征的药物的发现，具体涉及脆弱拟杆菌抑制剂及甘氨熊去氧胆酸在防治代谢综合征方面的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，代谢综合征已成为危害人类健康的重要疾病。代谢综合征是一组以肥胖、高血糖(糖尿病或糖调节受损)、血脂异常(高甘油三酯血症和/或低高密度脂蛋白胆固醇血症)以及高血压等聚集发病并严重影响机体健康的临床症候群，是在代谢上相互关联的危险因素组合，这些因素引起代谢综合征的危险因子主要包括高血压、血脂异常、糖尿病、肥胖以及高尿酸与凝血因子不正常等，直接促进了动脉硬化性心血管疾病的发生，也增加了发生二型糖尿病的风险。最近的流行病学调查发现，中国目前已经成为世界上成年代谢综合征患者最多的国家。

因此，发现并开发防治代谢综合征的药物迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在提供脆弱拟杆菌抑制剂及甘氨熊去氧胆酸在防治代谢综合征方面的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

甘氨熊去氧胆酸在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

一种用于防治代谢综合征的药物，活性成分为甘氨熊去氧胆酸，还含有药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

进一步地，所述载体包括固体或液体辅料。

进一步地，所述剂型包括片剂、丸剂、胶囊、膏剂、散剂、溶液剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂。

脆弱拟杆菌的抑制剂在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

一种用于防治代谢综合征的药物，活性成分为脆弱拟杆菌的抑制剂，还含有药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

进一步地，所述载体包括固体或液体辅料。

进一步地，所述剂型包括片剂、丸剂、胶囊、膏剂、散剂、溶液剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂。

胆汁酸水解酶BSH的抑制剂在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

二甲双胍用于制备脆弱拟杆菌抑制剂的用途。

有益效果：

本发明发现：(1)甘氨熊去氧胆酸GUDCA可以有效改善代谢紊乱，可以用于制备防治代谢综合征的药物；(2)抑制脆弱拟杆菌的生长降低其产生的BSH含量，可以引起GUDCA在肠道的积累，进而改善代谢紊乱，脆弱拟杆菌的抑制剂或胆汁酸水解酶BSH的抑制剂可以用于制备防治代谢综合征的药物；(3)二甲双胍为有效的脆弱拟杆菌抑制剂。

附图说明

图1为糖尿病小鼠接受GUDCA处理后的代谢表型。(A)GUDCA灌胃一周后小鼠回肠胆汁酸谱。(D)体重。(E、F)葡萄糖耐量试验(E)及曲线下面积(F)。(G)胰岛素耐量试验。(H)空腹血浆葡萄糖水平。(I)空腹血浆胰岛素水平。(J)HOMA-IR指数。 (K)单位质量肝脏中的甘油三酯含量。(L、M)血清中肝脏损伤的相关酶ALT(L)和AST (M)的水平。(N)qPCR检测小鼠肝脏脂质合成和氧化相关基因的mRNA水平。(O)小鼠肝脏HE和油红O染色显示肝细胞空泡变性和脂质沉积，比例尺：200μm。n＝5。与Vehicle 对比，*P＜0.05，**P＜0.01。Vehicle为溶媒对照，下同。

图2为服用二甲双胍前后病人粪便脆弱拟杆菌丰度的变化。n＝22。与BM对比，q值(FDR- 矫正的P值)。Bacteroides.fragilis为脆弱拟杆菌。

图3为病人服用二甲双胍前后UDCA、GUDCA代谢的变化。运用代谢组学方法对病人服用二甲双胍前后粪便和血清中的UDCA、GUDCA进行定量分析。(A)粪便中UDCA、 GUDCA的绝对含量。(B)血清中UDCA、GUDCA的绝对含量。n＝22。与BM对比。

图4为二甲双胍直接抑制脆弱拟杆菌生长。不同浓度的二甲双胍对离体培养的脆弱拟杆菌的生长抑制作用，n＝9。

图5为二甲双胍降低脆弱拟杆菌中的BSH含量。离体培养脆弱拟杆菌并检测其菌体蛋白水解GUDCA的能力。(A)脆弱拟杆菌菌体蛋白对GUDCA的水解能力，n＝3。(C)宏基因组分析显示二型糖尿病病人服用二甲双胍前后粪便菌群中BSH的基因拷贝数，n＝22。(D) 通过检测粪便对GUDCA的水解能力显示二甲双胍前后粪便菌群中BSH活性，n＝22。

图6为二甲双胍抑制脆弱拟杆菌BSH所介导的GUDCA水解。10mM二甲双胍、1mM CAPE及其叠加处理条件下的脆弱拟杆菌对GUDCA的水解能力，n＝5。

图7为病人粪便移植实验方案。

图8为病人粪便移植效率验证。(A)qPCR检测小鼠在抗生素处理前、后和粪便移植后肠道菌群的丰度，n＝8。(B)qPCR检测Trans-BM和Trans-BM组小鼠在接受粪便移植前后粪便中脆弱拟杆菌的丰度，n＝8。与Vehicle或Vehicle-BM对比，**P＜0.01；与Trans-BM 对比，^##P＜0.01。

图9为小鼠接受粪便移植后的代谢表型。(A)体重。(B、C)核磁结果显示体脂绝对(B)和相对含量(C)。(D、E)葡萄糖耐量试验(D)及曲线下面积(E)。(F)胰岛素耐量试验。(G)空腹血浆葡萄糖水平。(H)空腹血浆胰岛素含量。(I)HOMA-IR指数。 (J)单位质量肝脏中的甘油三酯含量。(K)qPCR检测肝脏糖异生相关基因的mRNA相对含量。(L)qPCR检测肝脏脂质合成、摄取和氧化相关基因的相对表达量，n＝8。与Trans-BM 对比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图10为小鼠接受脆弱拟杆菌移植后的代谢表型。(A)16s qPCR验证脆弱拟杆菌的移植效率。(B)体重。n＝5。(C、D)葡萄糖耐量试验(C)及曲线下面积(D)。(E)胰岛素耐量试验。(F)空腹血浆葡萄糖水平。(G)空腹血浆胰岛素含量。(H)HOMA-IR指数。 (I)单位质量肝脏中的甘油三酯含量。(J、K)血清中肝脏损伤的相关酶ALT(J)和AST(K) 的水平。n＝8。与Vehicle(同等剂量的热灭活脆弱拟杆菌)对比，*P＜0.05，**P＜0.01。

图11为小鼠二甲双胍和脆弱拟杆菌移植叠加处理的代谢表型。(A)体重。(B、C)葡萄糖耐量试验(B)及曲线下面积(C)。(D)胰岛素耐量试验。n＝5。(E)空腹血浆葡萄糖水平。(F)空腹血浆胰岛素水平。(G)HOMA-IR指数。(H)单位质量肝脏中的甘油三酯含量。(I、J)血清中肝脏损伤的相关酶ALT(I)和AST(J)的水平。(K、L)呼吸代谢笼检测小鼠的能量消耗率曲线(K)及其统计图(L)。(M、N)呼吸代谢笼检测小鼠的氧气消耗率(M)及其统计图(N)。(O、P)呼吸代谢笼检测小鼠的二氧化碳产生率曲线 (O)及其统计图(P)。(Q)小鼠摄食量。(R)呼吸代谢笼检测小鼠的呼吸商。(S)呼吸代谢笼检测小鼠的活动度。n＝7。与Vehicle(同等剂量的热灭活脆弱拟杆菌)对比，*P＜ 0.05，**P＜0.01；与Metformin(同等剂量的热灭活脆弱拟杆菌)对比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、试验材料和方法

1、实验所用细菌和动物

1.1所用细菌

名称	公司
		脆弱拟杆菌(B.fragilis)	美国ATCC公司

1.2实验动物

C57BL/6J小鼠：6-8周雄性C57BL/6J野生型小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。

2、溶液配制

2.1细胞培养溶液

高糖DMEM培养基

高糖DMEM粉	10g
		NaHCO<sub>3</sub>	3.7g
丙酮酸钠	0.11g
		HEPES	2.4g
青霉素	200,000IU
		链霉素	100,000IU

调节pH值至7.4，三蒸水定容至1L，用高压除菌的滤器(含0.22μm滤膜)过滤培养基，分装后4℃保存待用，现用现加10％的血清。

磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)

成分	1×PBS(细胞用)	10×PBS(组化用)
			NaCl	8.0g	8.5g
KCl	0.2g
			Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·12H<sub>2</sub>O	2.896g	30.084g
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O		2.49g
			KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.2g

调pH值至7.4，双蒸水定容至1L，高压灭菌(细胞用)，4℃保存待用。

0.125％胰蛋白酶溶液(Trypsin)

成分	质量或体积
		胰酶粉末	0.125g
PBS	100ml
		EDTA	0.04g

调pH值至7.4，三蒸水定容至200ml，用滤器(0.22μm)过滤，4℃保存待用。

BHIS固体培养板

主要成分	质量或体积
		脑心浸出液培养基粉末(BHI)	49g
琼脂糖(Agar)	15g
		添加物
5μl/mlVitaminK(溶于EtOH)	500μl
		0.5％Hemin(溶于0.1NNaOH)	1000μl

先加入主要成分，三蒸水定容至1L，120℃高温灭菌，待冷却至40-50℃时，将其它添加物加入其中并混匀，倒入10cm培养皿，制作BHIS固体培养板，倒置于4℃保存待用。

PPS培养基

主要成分	质量或体积
		蛋白胨	20g
酵母粉	5g
		NaCl	5g
添加物
		50％葡萄糖	2ml
25％K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>	2ml
		5％L-cysteine	1ml
0.5％Hemin(溶于0.1NNaOH)	100μl
		5μl/mlVitaminK(溶于EtOH)	50μl

先加入主要成分，三蒸水定容至100ml，120℃高温灭菌，待冷却至40-50℃时，现用现加入其它添加物加入其中并混匀，倒置于4℃保存待用。

2.2动物实验溶液

EDTA抗凝液

成分	质量
		EDTA	20g

调pH值至7.4，双蒸水定容至200ml待用。

4％多聚甲醛溶液

成分	质量
		多聚甲醛	40g

加0.1M PBS定容至1L，60℃水浴溶解4-6小时。

20％蔗糖溶液

成分	质量
		蔗糖	20g

加0.1M PBS定容至100mL，4℃保存待用。

油红O溶液

成分	质量
		油红O	1g

溶于200ml异丙醇中，混匀过夜，作为储存液保存在4℃。使用前加入双蒸水稀释，配置成60％的油红O工作液，现用现配，并用双层滤纸过滤。

3、临床样本收集

病人样本来自于22例满足如下条件的二型糖尿病病人服药前后的粪便和血清：初诊为二型糖尿病的病人并且单纯服用二甲双胍(1000mgb.i.d)三天；排除标准如下：(1)一型糖尿病；(2)发生严重糖尿病并发症(糖尿病肾病，糖尿病视网膜病变，糖尿病足)；(3) 严重的肝脏疾病；(4)严重的器官病变，包括癌症，冠心病，心肌梗死或感染性疾病；(5) 连续一个月服用减肥药；(6)参与实验三个月内曾服用抗生素三天以上；(7)胃肠道手术。临床样本收集受助于首都医科大学附属北京朝阳医院。

4、动物实验

4.1小鼠胰岛素抵抗模型

6周雄性小鼠随机分组，分笼饲养，每笼4-6只，并每周一、周四换水和换粮。每周一上午10点称量体重。小鼠接受随机饮食(NCD)一周，第二周开始给予60％HFD饮食，持续喂养4-12周。

4.2葡萄糖耐量试验

小鼠禁食16h后，腹腔注射2g/kg葡萄糖；取鼠尾血，并用拜耳的血糖仪测量0、15、30、90、120min等时间点的血糖，并绘制血糖浓度随时间变化的曲线。

4.3胰岛素耐量试验

小鼠禁食4h后，腹腔注射1.8IU/kg胰岛素；取鼠尾血，并用拜耳的血糖仪测0、15、30、90、120min等时间点的血糖，并绘制血糖浓度随时间变化的曲线。

4.4病人粪便移植实验

·病人粪便收集与处理

选4对服药前后病人粪便样本，每个病人对应2只小鼠。取20mg粪便于无菌管中，加1ml 生理盐水溶解，震荡3min，4℃，200g离心3min，将上清液转移到无菌管中，每只小鼠灌胃 100μl，现用现配。

·抗生素饮水配方

抗生素名称	浓度(剂量)
		万古霉素	(0.5mg/ml)50mg/kg
甲硝唑	(1mg/ml)100mg/kg
		卡那霉素	(1mg/ml)100mg/kg
氨苄霉素	(1mg/ml)100mg/kg

·小鼠处理流程

6周雄性小鼠随机分组，分笼饲养，每笼4-6只，给予60％HFD喂养，并给予抗生素饮水三天，之后换正常饮水。正常饮水后的第一周和第三周的周一进行菌群移植。收集抗生素饮水前后和第一次粪便移植后第七天小鼠的新鲜粪便，用于移植效率验证。

4.5脆弱拟杆菌定植实验

将-80℃冷冻的脆弱拟杆菌放置在37℃孵箱进行复苏，5000rpm，5min离心，弃上清，用PBS将菌的沉淀重悬至5×10⁸CFU/ml。6周雄性小鼠随机分组，分笼饲养，每笼4-6只，给予 60％HFD喂养，每周一和周四进行热灭活的脆弱拟杆菌(对照组)或正常脆弱拟杆菌(10⁸CFU/ 鼠)灌胃移植，持续处理4周。

4.6GUDCA灌胃实验

6周雄性小鼠随机分组，分笼饲养，每笼4-6只，给予60％HFD喂养，进行GUDCA灌胃(50 mg/kg/d)，持续处理四周。

4.7二甲双胍饮水实验

6周雄性小鼠随机分组，分笼饲养，每笼4-6只，给予60％HFD喂养，每周一和周四更换二甲双胍(1.5mg/ml,250mg/kg/d)饮水。

4.8小鼠取材

小鼠取材前禁食4h，内眦取血，并用EDTA抗凝后置于冰上。3000rpm，4℃离心10min，取上层血浆置于-80℃备用。脱颈椎处死小鼠，取其肝脏、回肠上皮、盲肠内容物、腹股沟脂肪、附睾脂肪和棕色脂肪，用于免疫组化实验或置于-80℃备用。

5、细菌培养实验：脆弱拟杆菌培养

(1)将购买的脆弱拟杆菌菌种涂板(BHIS板)，并于厌氧培养箱(37℃)培养两天，直至长出单菌落

(2)将单克隆菌落转移至液体培养基(PPS培养基)，过夜培养至指数增长期(OD 值为0.7)，作为液体菌种保存在-80℃待用

(3)按1:500比例将液体菌种进行扩大培养，OD值达0.7时，分装保存-80℃待用

6、分子生物学实验

6.1组织总蛋白提取和定量

(1)研钵内包上锡纸，倒入液氮，在之中取米粒样大小组织(如肝组织)

(2)配制蛋白裂解液，按1:100加入PMSF

(3)每个组织样中加入200μl蛋白裂解液，打碎组织

(4)离心(13000rpm，15min)，取上清蛋白样

(5)测蛋白浓度：

a)取2.5μl的蛋白样和不同浓度的白蛋白标准溶液(0、25、125、250、500、750、1000、 1500μg/ml)，加至96孔板中，并加入22.5μl双蒸水

b)取蛋白定量混合液A、B，以50:1混合，每孔加200μl

c)37℃，孵育30min

d)测定吸光度

e)用Excel软件绘制标准曲线，并根据标准曲线计算蛋白样品的浓度

6.2蛋白质免疫印迹

(1)配制不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)：上层5％浓缩胶，根据分子量配制(8％、10％、12％)下层分离胶

(2)用Bio-Rad Mini-PROTEAN 3Cell系统进行电泳，先在55V电压电泳蛋白分子量Marker分开，再以120V电压电泳，待溴酚兰跑至分离胶最下端时停止电泳

(3)割取适宜大小的凝胶(样品所在区域)，用Bio-Rad Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell系统进行电转，在200mA恒流条件下电转3h，根据分子量调换电流和时间，保证蛋白转到PVDF膜上，电转过程要在冰浴条件下进行

(4)PVDF膜在室温下用封闭液孵育1h

(5)用5％BSA按1:1000比例稀释一抗，4℃孵育，震荡过夜

(6)用TBST洗膜3×10min

(7)用5％脱脂牛奶按1:20000比例稀释二抗，室温孵育1h

(8)TBST洗膜3×10min

(9)发光：使用荧光二抗时，用Odyssey红外成像系统检测荧光条带并分析条带灰度；使用HRP标记二抗时，用发光液以1:1比例混合A液和B液，配制工作液，暗室中依次过显影液、蒸馏水和定影液，晾干胶片

(10)由Odyssey导出图像或者由扫描仪扫描胶片导出图像

6.3总RNA提取

(1)准备细胞样品时，弃培养液，PBS洗3次，加入1ml Trizol吹下细胞；准备组织样本时，在液氮中取适宜大小的组织块，先加200μl Trizol，打碎组织后再加入800μl Trizol

(2)加入200μl氯仿，上下颠倒充分混匀，冰上静置5min至分层

(3)4℃、13000g离心15min，小心吸取上层清液约500μl置RNAase-free的EP管

(4)加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃沉淀RNA至少30min

(5)4℃，13000g，离心15min，弃去上清，加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，洗涤RNA沉淀

(6)4℃，13000g，离心5min，弃去乙醇，室温静置干燥5min，加入RNAase-free 水10-20μl，并置于55℃溶解RNA 10min

(7)取0.5-1μl RNA样本，测量样品RNA浓度

(8)逆转录(按照逆转录试剂盒说明书)：取2μg总RNA，加RNAase-free水至16μl，并加入4μl 5×逆转录混合物。逆转录：25℃，20min；85℃，5min；25℃，保持

6.4实时定量PCR

(1)将逆转录的cDNA按定量PCR说明配制如下：

试剂	体积
		2×定量PCR混合物	10μl
双蒸水	5μl
		5μM上下游引物混合物	1μl
cDNA	4μl

(2)混合物94℃热启动7min后，94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸35sec，重复40个循环，72℃延伸5min

(3)分析数据

6.5RT-PCR引物列表

引物名称	引物序列
		musSrebp1c upper	GGAGCCATGGATTGCACATT
musSrebp1c lower	GCTTCCAGAGAGGAGGCCAG
		musFasn upper	AAGTTGCCCGAGTCAGAGAACC
musFasn lower	ATCCATAGAGCCCAGCCTTCCATC
		musScd1 upper	TTCTTGCGATACACTCTGGTGC
musScd1 lower	CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT
		musAcaca upper	CAAATTCTGCTGGAGAAGCC
musAcaca lower	TACAGGATGGTTTGGCCTTT
		musElovl6 upper	CCAATGGATGCAGGAAAACT
musElovl6 lower	AACTTGGCTCGCTTGTTCAT
		musCd36 upper	GCGACATGATTAATGGCACA
musCd36 lower	CCTGCAAATGTCAGAGGAAA
		musCpt1 upper	GATGAACTTCTTCTTCCAGGAGTGC
musCpt1 lower	ATGGCAGAGGCTCACCAAGC
		musAcox1 upper	TAACTTCCTCACTCGAAGCCA
musAcox1 lower	AGTTCCATGACCCATCTCTGTC

6.6测肝脏TC、TG(普利莱测定试剂盒)

(1)精确称取20mg的肝脏，按1：20加入裂解液

(2)静置10min

(3)取适量上清到1.5ml离心管，70℃加热10min

(4)加热后，室温2000rpm离心10min，上清用于酶学测定

(5)取5μl上清液于96孔板

(6)加入200μl的测定液

(7)37℃放置(TC 6min；TG 10min)

(8)490nm处测OD值

(9)依照标准曲线计算其浓度，并用肝重矫正

6.7测血ALT、AST(普利莱测定试剂盒)

(1)每孔加10μl的血(96孔板)，冰上进行

(2)每孔加100μl的测定液，冰上进行

(3)混匀(轻轻摇动)

(4)37℃放置1min

(5)半自动酶标仪测OD值

(6)ΔOD/ΔTime*1746即为所测定的值

6.8肝脏石蜡包埋

(1)70％酒精2h

(2)80％酒精2h

(3)90％酒精+正丁醇1:1过夜

(4)95％酒精+正丁醇1:10.5h

(5)95％酒精+正丁醇1:10.5h

(6)正丁醇0.5h

(7)正丁醇15min

(8)浸蜡2h

6.9冰冻包埋

直接将4％多聚甲醛固定后的肝脏放入OCT中，并置于-40℃而不放入液氮。

6.10肝脏油红O染色

(1)双蒸水洗3次，2min/次

(2)60％异丙醇5-10min

(3)油红O染色30min

(4)60％异丙醇，快速涮洗(随时观察，洗去浮色即可)

(5)双蒸水洗3次，2min/次

(6)苏木精复染，5-15s

(7)自来水洗，返蓝，5-10min

(8)90％甘油封片

6.11肝脏石蜡切片HE染色

(1)片子吹干10min

(2)二甲苯3min，三次

(3)酒精逐级脱蜡：100％乙醇3min，三次→95％乙醇3min→90％乙醇3min→80％乙醇3min→70％乙醇3min

(4)双蒸水3min，三次

(5)苏木精30s

(6)自来水洗，返蓝

(7)伊红1min(准备70％、80％、90％酒精分色)

(8)逐级脱水：95％乙醇3min，两次→100％酒精3min，两次

(9)二甲苯透明：3min，两次

(10)树胶封片

6.12测B.fragilis生长曲线

(1)准备厌氧管

(2)加入5ml PPS液体培养基

(3)反复充氮气抽空气，保证无氧状态

(4)1ml注射器加入其它培养基所需物质

(5)加入50μlB.fragilis

(6)置于37℃培养

(7)每小时测一次OD₆₀₀值，持续测24h。每组3样，重复3次。

6.13 BSH活性检测

(1)将0.5g粪便或适量的脆弱拟杆菌加入到5ml pH为7.4的PBS(1:100加入PMSF)

(2)冰上超声裂解，10000rpm，10min离心取上清

(3)BCA测定上清蛋白浓度

(4)加入如下孵育体系(200μl)

物质	含量
		上清液	0.1mg/ml(蛋白终浓度)
d5-GUDCA/GUDCA/TUDCA	1μM
		pH5.2的3mM醋酸钠缓冲液	补齐

37℃孵育20min

(5)直接放入干冰停止反应

(6)加入100μl的乙腈，震荡20min，1500rpm

(7)14000g离心20min

(8)取5μl上清上机。

6.14胆汁酸谱测定

组织准备：-80℃低温保存的血清样品，置于4℃解冻。定量移取50μl于1.5ml EP管中，加入0.5μg/ml内标溶液(氯磺丙脲)10μl；-80℃低温保存的组织或粪便样品，置于4℃解冻。定量称取约10mg于1.5ml EP管中，加入100μl水，用均质仪在速度为3000rpm，加入3个3mm 研磨珠打碎100s，加入2.5μg/ml内标溶液10μl。

胆汁酸提取：加入冷蛋白沉淀液(含浓氨水0.1％的甲醇溶液)300μl，涡旋45s，4℃下以16000g离心10min，取上清液200μl，吹干，用甲醇50μl复溶，涡旋30s，4℃下以20000g离心5min，取上清液。用甲醇:水(8:2)稀释5倍，进样5μl。制备好的样品用于UPLC-TOF MS分析，和LC-MS/MS定量分析。

UPLC-TOF MS分析：采用AB SCIEX Triple TOF 5600仪，C18色谱柱(2.1x100mm，3.5 μm)，以10mM乙酸胺0.1％甲酸水溶液(A)和80％甲醇20％乙腈0.1％甲酸有机溶液(B)为流动相进行梯度洗脱，色谱条件为0～0.5min 65％A，0.5-3.0min 40％A，3.0-10.0min20％A， 10.0-16.0min 10％A，16.0-20.5min 65％A，20.5-23.0min 65％A，采集负离子模式的质谱信号，用PeakView1.2软件将样品中的胆汁酸定性。

LC-MS/MS定量分析：采用AB Qtrap 5500定量分析样品中的各种胆汁酸，色谱条件与 UPLC-TOF MS分析相同，根据UPLC-TOF MS定性分析结果确定质谱参数，并用MultiQuant2.1 对定性的胆汁酸定量。

7统计学处理

利用GraphPad Prism 7.0进行数据分析和作图，实验结果显示为平均值±标准误(Mean± SEM)。病人数据采用双尾配对Wilcoxon检验进行分析(two-tailed Wilcoxonmatched-pairs signed rank test)；小鼠两组实验数据采用双尾非配对学生T检验(two-tailed unpaired Student’s t-test)，多组结果进行比较时采用方差分析(ANOVA)；相关性分析采用Pearson相关系数检验(nonparametric Spearman’s test)，其中^*P＜0.05，^**P＜0.01认为有统计学差异。采用柯尔莫可洛夫-斯米洛夫检验(Kolmogorov-Smirnovnormality test)分析样本分布。

二、实验结果

1、GUDCA具有改善代谢紊乱的治疗作用

为了探究GUDCA是否具有治疗代谢紊乱的作用，我们给予小鼠16周的60％HFD饮食诱发代谢紊乱，并在最后4周给予GUDCA灌胃处理。GUDCA灌胃处理组小鼠，回肠中 GUDCA水平明显高于对照组小鼠，单其它种类胆汁酸水平没有明显变化(图1A)。GUDCA 灌胃处理可以减轻60％HFD饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗，并降低小鼠肝脏的甘油三酯含量以及肝脏损伤的相关指标(ALT和AST)(图1D、图1E、图1F、图1G、图1H、图1I、图1J、图1K、图1L、图1M、图1N)。对肝脏切片进行HE和油红O染色，进一步验证 GUDCA灌胃处理改善长期60％HFD诱导的脂肪肝表型(图1O)。

2、抑制脆弱拟杆菌具有升高GUDCA的作用，二甲双胍为有效的脆弱拟杆菌抑制剂

我们收集了22例满足如下条件的二型糖尿病病人服药前后的粪便和血清：初诊为二型糖尿病的病人并且单纯服用二甲双胍(1000mg b.i.d)三天。排除标准如下：(1)一型糖尿病； (2)发生严重糖尿病并发症(糖尿病肾病，糖尿病视网膜病变，糖尿病足)；(3)严重的肝脏疾病；(4)严重的器官病变，包括癌症，冠心病，心肌梗死或感染性疾病；(5)连续一个月服用减肥药；(6)参与实验三个月内曾服用抗生素三天以上；(7)胃肠道手术。对粪便样本提取的菌群DNA进行宏基因组测序并与疾病指标进行相关性分析。我们发现，口服二甲双胍能显著降低脆弱拟杆菌的含量(图2)；服药后粪便中UDCA的含量降低(UDCA 为GUDCA的水解产物)，而GUDCA的含量升高最为显著(图3A)；血清中也检测到升高的GUDCA(图3B)。

体外培养体系中加入不同浓度(1mM、5mM和10mM)的二甲双胍，脆弱拟杆菌的生长被抑制且药物浓度越高抑制作用越明显(图4)。

GUDCA在肠道的水解过程主要由表达在脆弱拟杆菌等肠道菌的胆汁酸水解酶BSH介导。体外培养脆弱拟杆菌并提取菌体蛋白进行胆汁酸水解实验，结果表明脆弱拟杆菌蛋白提取液可水解GUDCA的效率高达90％以上(图5A)。宏基因组的结果表明，病人粪便中BSH基因拷贝数在服用二甲双胍后显著降低(图5C)。二甲双胍处理组的小鼠粪便水解GUDCA 的BSH活性也被抑制(图5D)。

为了进一步明确GUDCA水解过程的降低是否是由于BSH的活性下降所导致，我们对脆弱拟杆菌进行了离体培养和处理。10mM的二甲双胍可直接降低单位体积的细菌培养液中脆弱拟杆菌对GUDCA的水解能力，但在CAPE(BSH活性抑制剂)处理的基础上，叠加给予二甲双胍没有进一步的抑制效应(图6)。

上述结果说明，二甲双胍可直接通过抑制脆弱拟杆菌的生长从而降低其产生的BSH含量，抑制GUDCA水解成UDCA，引起GUDCA在肠道的积累。

3、抑制脆弱拟杆菌可以改善代谢紊乱

我们选取上述满足条件的二型糖尿病病人(代谢紊乱模型)服用二甲双胍前后的粪便样本，进行移植实验，移植方案见图7。结果显示，抗生素处理能显著减少小鼠肠道菌群的丰度；进行粪便移植一周后，病人的肠道菌群在小鼠体内成功定植(图8A)。相对于移植服药前病人粪便的60％HFD喂养的小鼠(Trans-BM)，接受服药后病人粪便移植的60％HFD喂养的小鼠(Trans-AM)肠道内具有更低含量的脆弱拟杆菌(图8B)。Trans-AM组的小鼠禁食后血糖和胰岛素水平、HOMA-IR指数的变化，以及抵抗60％HFD诱导的肥胖、糖耐量异常和胰岛素抵抗等现象，进一步说明了粪便移植可将二甲双胍改善糖尿病的作用从病人复制到小鼠上(图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、图9F、图9G、图9H、图9I)。相对于 Trans-BM组的小鼠，Trans-AM组小鼠的肝脏中甘油三酯的含量(图9J)，以及肝脏糖异生和脂质合成相关基因表达量也有明显下调(图9K、图9L)。

为了进一步验证脆弱拟杆菌的在体效应，我们设计了如下的两个动物实验方案：(1)给予60％HFD喂养的小鼠热灭活脆弱拟杆菌或正常脆弱拟杆菌灌胃处理四周，探究脆弱拟杆菌对小鼠代谢的影响；(2)饮水给予60％HFD喂养的小鼠二甲双胍，在此处理基础上再叠加给予脆弱拟杆菌灌胃处理四周，探究脆弱拟杆菌是否能够逆转二甲双胍的改善作用。

16s qPCR结果表明，灌胃处理后B.fragilis组小鼠的粪便中脆弱拟杆菌丰度明显增加(图 10A)，证明脆弱拟杆菌在小鼠肠道内成功定植。与60％HFD喂养的对照组小鼠相比，接受脆弱拟杆菌移植的小鼠表现出体重增加、糖耐量异常、胰岛素敏感性降低等代谢紊乱表型(图 10B、图10C、图10D、图10E、图10F、图10G、图10H)。另外，脆弱拟杆菌移植引起60％HFD喂养的小鼠肝脏甘油三酯含量、血清中肝脏损伤指标ALT和AST水平升高(图10I、图10J、图10K)。在二甲双胍饮水处理的基础上，叠加给予脆弱拟杆菌可部分消除二甲双胍改善肥胖小鼠糖脂代谢紊乱的作用(图11A、图11B、图11C、图11D、图11E、图11F、图11G)，并可以逆转对肝脏脂质沉积和肝损伤的改善作用(图11H、图11I、图11J)。通过呼吸代谢笼方法检测发现，口服二甲双胍可以提高小鼠的基础代谢率，表现为能量消耗率、氧气消耗率和二氧化碳产生率增加，但这种作用被脆弱拟杆菌灌胃处理消除(图11K、图11L、图11M、图11N、图11O、图11P)。二甲双胍饮水处理以及脆弱拟杆菌灌胃处理并不影响小鼠摄食、呼吸商和活动度等指标(图11Q、图11R、图11S)。

上述结果说明，脆弱拟杆菌会引起代谢紊乱，抑制脆弱拟杆菌则可以显著改善代谢紊乱。

综上，本发明发现：(1)甘氨熊去氧胆酸GUDCA可以有效改善代谢紊乱，可以用于制备防治代谢综合征的药物；(2)抑制脆弱拟杆菌的生长降低其产生的BSH含量，可以引起GUDCA在肠道的积累，进而改善代谢紊乱，脆弱拟杆菌的抑制剂或胆汁酸水解酶BSH的抑制剂可以用于制备防治代谢综合征的药物；(3)二甲双胍为有效的脆弱拟杆菌抑制剂。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (10)

1.甘氨熊去氧胆酸在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

2.一种用于防治代谢综合征的药物，其特征在于：活性成分为甘氨熊去氧胆酸，还含有药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述载体包括固体或液体辅料。

4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于：所述剂型包括片剂、丸剂、胶囊、膏剂、散剂、溶液剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂。

5.脆弱拟杆菌的抑制剂在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

6.一种用于防治代谢综合征的药物，其特征在于：活性成分为脆弱拟杆菌的抑制剂，还含有药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述载体包括固体或液体辅料。

8.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述剂型包括片剂、丸剂、胶囊、膏剂、散剂、溶液剂、颗粒剂、混悬剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂。

9.胆汁酸水解酶BSH的抑制剂在制备防治代谢综合征的药物中的应用。

10.二甲双胍用于制备脆弱拟杆菌抑制剂的用途。