CN108210918A - 含otu功能域去泛素化酶1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 - Google Patents

含otu功能域去泛素化酶1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含OTU功能域去泛素化酶1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。本发明以正常人肝细胞L02细胞系为研究对象，利用慢病毒构建OTUD1敲低及过表达载体系统，得到OTUD1基因敲低或过表达的L02细胞。通过棕榈酸（PA）、油酸（OA）联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究OTUD1基因在脂肪变性中的功能。结果显示，在相同的PA+OA刺激下，与OTUD1基因正常表达的L02细胞相比，OTUD1基因敲除的L02细胞内红色脂肪滴大而多；相反的，OTUD1基因过表达的L02细胞内红色脂肪低小而少。结果表明OTUD1基因可显著抑制肝脏脂质沉积，抑制脂肪肝的发生。

Description

含OTU功能域去泛素化酶1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物 中的应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种去泛素化酶，即含OTU 功能域的去泛素化酶1(OTU Deubiquitinase 1,OTUD1)在非酒精脂肪肝中的功能和应用，以及OTUD1作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝药物中的应用。
背景技术
随着经济的发展以及生活水平的提高，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fattyliver disease，NAFLD)的发病率逐年升高，已成为全世界最常见的肝脏疾病之一。 NAFLD是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征[1][2]，在普通人群中发病率为25％-30％，按照病理发展过程可分为单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化和肝硬化[3][4]。据统计，有10％-20％的NAFLD患者发展为NASH，若病情不能有效控制，将进一步发展成为肝硬化、肝衰竭甚至更为严重的肝细胞癌[5][6]。虽然现阶段许多抗氧化剂、胰岛素增敏剂、细胞保护剂等药物被用于该疾病的治疗中，但控制和治疗的效果仍不太理想[7]。NAFLD及其相关的肝脏和代谢性疾病给社会带来了巨大的经济负担，并成为一种影响社会发展的重大公共卫生问题。寻找积极有效的干预措施遏制NAFLD的进展尤为重要。
OTUD1基因是半胱氨酸蛋白酶OTU超家族中的一员，其编码的蛋白可以从多聚泛素链上切除泛素基团，是一个高度特异性的泛素肽酶。OTUD1可以稳定 p53的蛋白水平从而可能会抑制肿瘤的发生。但是关于本发明中OTUD1在脂肪肝中的功能及其应用目前尚未见报道。
参考文献
[1].Musso G,Cassader M,Gambino R.Nonalcoholic fatty liver disease(NAFLD): emerging molecular targets for novel therapeutic strategies.Nat RevDrug Discov 2016；15:249-274.
[2].朱鹏,徐宗,王宇明.世界胃肠病学会全球指南:非酒精性脂肪性肝病及非酒精性脂肪性肝炎.临床肝胆病杂志2014；30:842-845.
[3].Review T,LaBrecque DR,Abbas Z,Anania F,Ferenci P,Khan AG,etal.World Gastroenterology Organisation global guidelines:Nonalcoholic fattyliver disease and nonalcoholic steatohepatitis.J Clin Gastroenterol 2014；48:467-473.
[4].Bellentani S.The epidemiology of non-alcoholic fatty liverdisease.Liver Int 2017；37Suppl 1:81-84.
[5].Michelotti GA,Machado MV,Diehl AM.NAFLD,NASH and liver cancer.NatRev Gastroenterol Hepatol 2013；10:656-665.
[6].Hardy T,Oakley F,Anstee QM,Day CP.Nonalcoholic Fatty LiverDisease: Pathogenesis and Disease Spectrum.Annu Rev Pathol 2016；11:45-496.
[7].Nguyen TA,Sanyal AJ.Pathophysiology guided treatment ofnonalcoholic steatohepatitis.J Gastroenterol Hepatol 27.s2(2012):58-64.
发明内容
为解决现有技术的缺陷和不足，本发明旨在提供一种OTUD1基因的表达与脂肪肝之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因OTUD1的新用途，进而把OTUD1基因应用于脂肪肝的治疗中。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明第一方面，提供含OTU功能域的去泛素化酶1在制备保护肝脏的药物中的应用。
优选地，所述药物具有抑制肝脏脂质堆积的功能。
本发明第二方面，提供含OTU功能域的去泛素化酶1在制备预防、缓解和/ 或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
本发明涉及的含OTU功能域的去泛素化酶1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，所述的药物的活性成分是含OTU功能域的去泛素化酶1。
本发明涉及的含OTU功能域的去泛素化酶1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用，具体的是含OTU功能域的去泛素化酶1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高含 OTU功能域的去泛素化酶1表达量的试剂。
优选地，提高含OTU功能域的去泛素化酶1表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。
所述的含OTU功能域的去泛素化酶1或OTUD1，包括基因或蛋白。所述的 OTUD1基因在对象体内经转录翻译为含OTU功能域的去泛素化酶1蛋白产物。
所述脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
本发明通过试验确定了含OTU功能域的去泛素化酶1的表达与脂肪肝及相关疾病之间的关系：
本发明以正常人肝细胞L02细胞系为研究对象，利用慢病毒构建OTUD1敲低及过表达载体系统，得到OTUD1基因敲低或过表达的L02细胞。通过棕榈酸(palmitate，PA)、油酸(oleic acid，OA)联合诱导的脂肪肝细胞模型来研究 OTUD1基因在脂肪变性中的功能。结果显示，在相同的PA+OA刺激下，与 OTUD1基因正常表达的L02细胞相比，OTUD1基因敲除的L02细胞内红色脂肪滴大而多；相反的，OTUD1基因过表达的L02细胞内红色脂肪低小而少。结果表明OTUD1基因可显著抑制肝脏脂质沉积，抑制脂肪肝的发生。本发明人的研究证明了：在PA+OA联合刺激诱导的L02细胞脂肪肝体外模拟模型中，OTUD1 具有抑制脂质沉积、保护肝细胞的作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明发现OTUD1基因的新功能，即OTUD1基因具有能够保护脂肪肝的作用。
(2)基于OTUD1在保护脂肪肝中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/ 或治疗脂肪肝的药物。由于OTUD1是机体内源性蛋白质，因此作为药物的安全性很高。
附图说明
图1是L02-OTUD1稳定过表达及敲低细胞系的Western blot鉴定结果图；
图2是L02-OTUD1稳定敲低细胞系的在PA及OA刺激之后的油红O染色结果图；
图3是L02-OTUD1稳定过表达细胞系的在PA及OA刺激之后的油红O染色结果图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本发明中的实验所涉及的试剂在国内外市场购买，或按照说明书中的配方自行配制；未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
实验用细胞及培养：
人肝脏细胞系L02购自中国科学院细胞库(目录号GNHu6)，人胚肾HEK293T 细胞购自美国菌种保藏中心(American type culture collection，ATCC)。上述细胞均采用DMEM高糖培养基(含10％FBS，1％青霉素-链霉素)置于5％CO2的 37℃恒温细胞专用培养箱培养，实验用细胞培养时间不超过三个月，每三个月进行一次支原体检测。细胞冻存采用含10％DMSO的FBS冻存。
Western blot操作方法：
1)细胞中蛋白提取
细胞加入裂解液，裂解完成后离心取上清，运用BCA Protein Assay Kit定量收集蛋白样品。
2)上样与电泳
配置好电泳凝胶，并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE 胶加样孔内，点样完成后开始电泳。
3)转膜
①配制转膜液，于4℃预冷。
②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。
③取出凝胶板中的凝胶，用转膜液洗涤凝胶，将凝胶平铺在负极的滤纸上，将PVDF膜覆盖其上，夹上夹板。
④将夹板放入转膜槽中，灌满转膜液以淹没凝胶。
⑤转膜槽接通电源，电压设为250V，电流设为0.2A。转移1.5h。
⑥转移结束后，取出PVDF膜。
4)封闭
把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1-4h。
5)一抗孵育
①用TBST洗涤蛋白膜3次，每次5min。
②封口机将薄膜封入杂交袋中，加上一抗，Anti-OTUD1 Antibody(ATLAS，HPA038504)。
③将杂交袋放入4℃摇床中，过夜。
6)二抗孵育
①将薄膜取出用TBST洗涤3次，每次5min，回收一抗。
②将膜放入对应的加有二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司， BF03008/BF03008X)的二抗稀释液中，避光孵育1h。
7)蛋白检测
孵育后用TBST洗涤3次，每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。
油红O染色具体操作：
1)样品组和对照组用1×PBS洗涤2次，加入300μl 3％多聚甲醛固定20min；
2)加入1×PBS洗涤2次后，加入60％异丙醇漂洗10s；
3)加入1×PBS洗涤2次，通风橱吹干；
4)每孔500μl加入油红O染色1h；
5)加入1×PBS洗涤2次，60％异丙醇进行分选，再加入1×PBS洗2次；镜检，拍照。
稳定转染细胞系的构建：
1.OTUD1慢病毒过表达质粒构建
1)PCR扩增OTUD1基因，引物为：
OTUD1-SBP-PHAGE F：
5’-CTAGCTAGCATGGACGAGAAGACCACCGG-3’；
OTUD1-SBP-PHAGE R：
5’-CCGCTCGAGCGAGAGCATGCATTTTGTTCAATATACAT-3’；
2)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，随后使用DNA凝胶回收试剂盒(天根) 进行DNA片段的回收；
3)将所得DNA产物和限制性内切核酸酶FastDigest restriction enzymes(Thermo)、buffer or Green buffer、ddH2O混合均匀(50μl体系)，置于37℃条件下反应。使用AxyPrepTMPCR Clean-Up Kit(Axygen)回收酶切产物；
4)使用PCR一步定向克隆试剂盒(Novoprotein)按照试剂盒说明书进行重组反应；
5)制作大肠杆菌感受态细胞，将上述连接产物进行转化实验，涂板，置于 37℃培养箱，过夜培养；
6)从37℃培养箱中取出过夜培养的平板，挑克隆摇菌，并检测菌落PCR阳性克隆；
7)将PCR鉴定为阳性的菌液吸取5-10μl接种至5ml LB(含抗性)培养基中，在220rpm，37℃摇床中过夜培养；
8)取出过夜培养的菌液，对已经混浊的菌液进行质粒提取(天根质粒DNA 小提试剂盒)；
9)提取后的质粒可直接用于OTUD1瞬转或构建慢病毒稳转细胞系。
2.OTUD1CRISPR-Cas9质粒的构建：
1)OTUD1gRNA序列为：
OTUD1-gRNA1-F:CACCGACCGGTCTCGGGCTCGGGCG；
OTUD1-gRNA1-R:AAACCGCCCGAGCCCGAGACCGGTC；
2)将gRNA的序列克隆到LentiCRISPRv2的(从addgene购买，Plasmid#98291) 载体中，并进行转化和氨苄抗性筛选。
3)所得质粒可用于慢病毒介导的OTUD1KO细胞系构建；
3.慢病毒载体的构建和包装：
1)用胰酶消化并记数HEK293T细胞，按1×106个HEK293T/孔传至6孔板中；
2)第二天细胞汇合度至80％时开始转染；
3)取1.5ml灭菌EP管，加入2个包装质粒pSpax(Addgene，12260)和pMD2.G(Addgene，12259)和过表达或干扰质粒各1μg溶于100μl的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。
4)取1.5ml灭菌EP管，取3μl PEI(1.6μg/μl)溶于100μl无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。
5)将DNA溶液和PEI溶液轻柔混匀，室温孵育15min；
6)将上述DNA-PEI混合液，逐滴加入6孔板中；
7)转染6h后，换新鲜培养基；
8)转染后48-72h收获含病毒的上清，3000rpm离心10min，去除沉淀，并用0.45μm的滤膜过滤；
9)过滤后的病毒可立即用于感染或-80℃贮存。
4.细胞感染：
(1)细胞铺板：每种病毒感染两个孔，并留出一孔作为空白对照，以便后期筛选细胞用。
(2)第一次感染：将病毒液与待感染的细胞(和普通转染密度一致)培养基混合，混合比率取决于病毒滴度和细胞承受能力(本次每孔使用500μl病毒液 +2ml完全培养基)，并随后加入2.5μl聚凝胺(8mg/ml)，使其终浓度为8μg/ml。
(3)感染后最快2h即可换液终止感染，若细胞承受力强，最长可持续感染 24h。
(4)第二次感染：感染24h后，再感染一次。
5.加药筛选细胞
第一次感染48h后，在六孔板中(包括空白孔)加入含有嘌呤霉素的完全培养基(终浓度为1μg/ml)，待空白孔细胞完全死亡，将六孔板中细胞传代至T25 培养瓶，一般空白细胞在24～48h后全部死亡。待细胞长满后，收取一部分细胞做 WB验证过表达，并冻存部分细胞。
【实施例1】建立OTUD1稳定转染的L02细胞系
根据实施方式中L02稳定转染细胞系建立的步骤，建立OTUD1过表达和敲低的L02稳转细胞系。之后收集细胞，WB验证OTUD1的表达情况。结果如图1所示，感染OTUD1过表达慢病毒系统的L02细胞中，OTUD1的表达显著升高；感染 OTUD1敲低慢病毒系统的L02细胞中，OTUD1的表达显著降低，说明细胞系建立成功。
【实施例2】OTUD1敲低对肝细胞脂肪堆积的影响
(1)实验细胞分组：正常L02细胞对照组、OTUD1稳定敲低L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUD1稳定敲低L02细胞实验组。
(2)脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞一贴壁，细胞培养到50％愈合度之后，向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4 mM)进行刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。
油红O染色结果如图2所示，对照组细胞无明显红色，实验组在加入PA+OA 刺激后，细胞中红色脂肪滴的面积显著增多，且OTUD1稳定敲低L02细胞中的红色脂肪滴的面积增加程度更为明显。该结果说明OTUD1表达的敲低可加重 PA+OA联合刺激诱导的脂质沉积。
【实施例3】OTUD1过表达对肝细胞脂肪堆积的影响
1.实验细胞分组：正常L02细胞对照组、OTUD1稳定过表达L02细胞对照组、正常L02细胞实验组、OTUD1稳定过表达L02细胞实验组。
2.脂肪肝细胞模型的建立与检测：待细胞贴壁，细胞培养到50％愈合度之后，向两个实验组中加入棕榈酸酯(PA)及油酸(OA)(PA 0.2mM+OA 0.4mM)刺激，对照组中加入同等量的BSA，12h后收集各组细胞样品，进行油红O染色。
油红O染色结果如图3所示，对照组细胞无明显红色，而当实验组中加入 PA+OA进行刺激后，实验组中红色脂肪滴的面积的细胞相比于对照组显著增多，但OTUD1稳定过表达L02细胞实验组中的红色脂肪滴的面积相对于正常L02细胞实验组则显著减少。该结果说明，OTUD1过表达可抑制因PA+OA刺激产生的脂质沉积。
上述结果显示OTUD1基因过表达可显著抑制肝细胞脂质堆积，抑制脂肪肝的发生发展。OTUD1基因对脂肪肝病具有显著的抑制作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 含OTU功能域去泛素化酶1在制备治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctagctagca tggacgagaa gaccaccgg 29
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagc gagagcatgc attttgttca atatacat 38
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgaccgg tctcgggctc gggcg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccgcccg agcccgagac cggtc 25

Claims (7)

1.含OTU功能域的去泛素化酶1在制备保护肝脏的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物具有抑制肝脏脂质蓄积的功能。
3.含OTU功能域的去泛素化酶1在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，脂肪肝及相关疾病包括但不限于：胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖、糖尿病、高血糖、高血脂症、单纯性肝脏脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化、肝硬化、肝癌等。
5.权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物的活性成分是含OTU功能域的去泛素化酶1。
6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述的应用是含OTU功能域的去泛素化酶1作为药物靶点筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝及相关疾病的药物，所述药物是提高含OTU功能域的去泛素化酶1表达量的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的提高含OTU功能域的去泛素化酶1表达量的试剂，给药方式为直接裸DNA注射法、脂质体包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法、PEG修饰蛋白药物注射法、脂质体包裹蛋白静脉注射法，或蛋白微球制剂皮下注射法。
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CN116240176A (zh) * 2023-04-28 2023-06-09 北京大学口腔医学院 一种分泌型中性粒细胞及用途

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