CN111194724A - Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的功能和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的功能和应用。本发明以Sh3rf2基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂高胆固醇饮食诱导的肥胖小鼠模型，发现与对照组野生型C57小鼠相对比，Sh3rf2基因敲除小鼠体重增加，小鼠肝重、肝脏/体重、脂质成分病理染色等结果均说明HFHC组的Sh3rf2‑KO小鼠脂肪肝病变明显严重、脂质蓄积增加，这些结果表明Sh3rf2基因敲除显著恶化非酒精性脂肪肝病的疾病进程。针对Sh3rf2的上述作用，其可用于制备预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物。

Description

Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药 物中的功能和应用

技术领域

本发明属于基因的功能和应用领域，特别涉及一种(SH3 domain-containingRING finger protein 2，Sh3rf2)Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的功能和应用。

背景技术

随着老龄化人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改变，肥胖、非酒精性脂肪肝病、代谢综合征和糖尿病等代谢异常人群剧增，现已经成为全球性的公众健康的重要危害。

肝脏是糖代谢的最主要的器官之一，是物质代谢的中枢，它具有许多重要的生理功能，如葡糖糖的合成和分解，脂质合成和分解，胆汁合成和分泌等。脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪肝为一种较为常见的临床不良表现，可由多种疾病诱发，是众多肝脏疾病对肝脏正常功能影响的综合表现。临床表现轻者无症状，重者可危及生命。其病因可分为多种，包括酒精性和非酒精性脂肪肝。其中非酒精性脂肪肝病是指除去酒精和其它明确肝损伤导致的肝细胞内脂肪堆积的临床病理综合征，其进一步发展将进化为单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。随着社会经济发展加速及高节奏生活方式的影响，非酒精性脂肪肝病正严重威胁我国人群的健康，已经成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，亦被公认为隐蔽性肝硬化的常见病因。

非酒精性脂肪肝病除可直接导致肝硬化肝细胞癌等，还可参与II型糖尿病的发病，在有些患者中肝脏脂肪沉积可能是影响其II型糖尿病发展的主要因素。另一方面，如果II型糖尿病控制不佳或者充分发展，又会促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重。现阶段，II型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病的患病率正逐年增加，因此未来应该制定特异的筛选标准以及治疗方案以期应用于临床II型糖尿病和非酒精性脂肪肝病患者，尤其是II型糖尿病和非酒精性脂肪肝病合并的患者。

Sh3rf2又称作POSHER,是一种E3泛素连接酶，属于SH3RF家族，含有3个SH3结构域，一个Ring结构域。SH3RF1-3，作为c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路的抗凋亡调节因子，参与细胞的存活与凋亡。Sh3rf2缺失会激活JNK及其靶标c-Jun。SH3RF2可以通过降解另一个SH3RF家族成员POSH(SH3RF1)促进神经元PC12细胞的存活。此外，SH3RF2是一种癌基因产物，在人类癌症中过表达，并调节p21活化激酶4(PAK4)蛋白的稳定性，可能作为癌基因发挥作用。2018年，Wang等人发现Sh3rf2对神经元发育很重要，小鼠Sh3rf2单倍剂量不足导致典型的ASD样行为，以及海马树突棘发育、谷氨酸能受体亚单位的组成和兴奋性突触传递的选择性单侧紊乱。

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的功能和应用，即利用Sh3rf2基因的表达与非酒精性脂肪肝病和II型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝的靶基因Sh3rf2的新用途，进而把Sh3rf2基因应用于非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的治疗。

本发明主要集中于研究Sh3rf2基因表达与非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病之间的关系，以期待为非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的治疗找出新的作用靶点。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明以Sh3rf2基因敲除小鼠(Sh3rf2-KO)和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂高胆固醇饮食(HFHC)诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity,DIO)模型研究Sh3rf2基因的功能，发现与对照组野生型C57小鼠相对比，Sh3rf2-KO小鼠体重增加，肝脏/体重、肝功能检测以及脂质成分病理染色等结果均说明HFHC组的Sh3rf2-KO小鼠脂肪肝病变明显严重、脂质蓄积增加，这些结果表明Sh3rf2基因敲除显著促进肝脏脂质积累，促进非酒精性脂肪肝病的发生。

因此，Sh3rf2基因可以作为药物靶点，构建Sh3rf2基因过表达的体外细胞模型或者动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物和/或生物试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗脂肪肝的目的。

本发明方案研究Sh3rf2基因在脂肪肝疾病中的功能，具体体现在sh3rf2具有维持改善肝的功能。针对Sh3rf2的改善脂肪肝的功能，Sh3rf2可在制备用于预防、缓解和/或治疗脂肪肝疾病的药物方面应用。具体方案如下：

本发明提供的Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用。

作为优选方案，所述Sh3rf2基因作为药物靶点，构建Sh3rf2基因过表达的体外细胞模型或者动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物和/或生物试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的目的。

进一步地，所述药物是促进Sh3rf2基因表达的药物。

更进一步地，所述非酒精性脂肪肝病包括：单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现sh3rf2基因的新功能，即Sh3rf2基因具有能够改善脂肪肝疾病的作用。

(2)基于Sh3rf2在改善脂肪肝和/或II型糖尿病疾病的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝的药物。

附图说明

图1是WT和Sh3rf2-KO小鼠的体重结果图(＊：p<0.05vs WT NC组；**：P<0.01vs WTHFHC组)。

图2为肝脏重量统计图(n.s.：p＞0.05vs WT NC组；**：P<0.01vs WT HFHC组)。

图3为肝脏重量与小鼠本身身体重量比值统计图(n.s.：p＞0.05vs WT NC组；**：P<0.01vs WT HFHC组)。

图4是WT和Sh3rf2-KO小鼠甘油三酯含量结果(n.s.：p＞0.05vs WT NC组；**：P<0.01vs WT HFHC组)。

图5是WT和Sh3rf2-KO小鼠总胆固醇含量结果(****：p<0.0001vs WT NC组；***：P<0.001vs WT HFHC组)。

图6是WT和Sh3rf2-KO小鼠肝脏HE染色图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源:C57BL/6(C57)小鼠和肝脏特异性Sh3rf2基因敲除(Sh3rf2-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6(WT)小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。

实验动物饲料配方：高脂高胆固醇饲料(HFHC)(购自特洛菲，货号TP26304)，能量构成比：蛋白14％，脂肪42％，碳水化合物44％，胆固醇0.2％,4.5Kcal/g。对照组饲料低脂饲料(Normal chow,NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：能量构成比：蛋白20％，脂肪10％，碳水化合物70％，3.85Kcal/g。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12h小时交替照明，温度24±2°，湿度40-70％，小鼠自由饮水进食。

实施例Sh3rf2缺失加重非酒精性脂肪肝及Ⅱ型糖尿病的进程

(1)实验动物分组及模型诱导：选用8周龄，雄性，C57小鼠和Sh3rf2-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料TP26304高脂高胆固醇饲料(HFHC)和D12450B低脂饲料(Normal chow,NC)饲养，即WTNC组，KO NC组，WT HFHC组，KO HFHC组共4个组别，饲养8W。

(2)血清采集血脂测定：

在饲养8周，小鼠用乙醚吸入麻醉，经眼眶静脉采血，分离血清。

开启电脑Labman软件，打印机，再开启生化分析仪；选择并清洗探针、比色杯，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；加入待检测血清样品50ul，开始检测；待检测完毕后记录检测数值

(3)体重检测

禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

称重：将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。

(4)终末肝脏组织取材

小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。

石蜡标本：切取部分肝脏置于10％中性福尔马林中固定；冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡箔纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。

(5)肝脏组织处理及病理染色相关实验

①肝脏脱水、透明、浸蜡

切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水中冲洗30min以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，a.脱水:75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；b.透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；c.浸蜡(65℃):石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。

②肝脏组织切片

使用切片机切片，切片厚度5um

③肝脏组织苏木精-伊红(HE)染色

将肝脏组织石蜡切片放入65°烘箱(30min)→二甲苯中(5分钟X 3次)→100％酒精(1min)→90％酒精(1min)→70％酒精(1min)→蒸馏水洗→苏木素(5min)→自来水洗去切片上的浮色→1％盐酸酒精(1至3秒)→自来水洗数下→伊红(1min)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下100％酒精(30秒X 3次)→二甲苯(2min X 3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

小鼠体重检测结果如图1所示，小鼠经HFHC饲养后，体重显著高于NC组，而在HFHC饲养后，Sh3rf2-KO组小鼠体重较C57小鼠体重增加更显著；同时肝脏重量、肝脏/体重也比C57小鼠显著增加(如图2，3)。

检测血清中的甘油三酯及总胆固醇，发现Sh3rf2敲除后，经HFHC饲养甘油三酯及总胆固醇上调(如图4，5)。

进一步通过组织切片，进行HE染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织的病理改变。通过肝脏HE染色，可以观察到在HFHC饲养条件下，Sh3rf2-KO小鼠肝脏组织有较多的脂肪沉积、空泡化且融合连成片状，小鼠肝脏质变情况显著高于HFHC饲养的C57小鼠。

上述结果显示Sh3rf2-KO小鼠在HFHC的诱导下发生的脂肪肝病变及II型糖尿病显著加重。这些结果表明Sh3rf2基因对改善II型糖尿病和非酒精性脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明Sh3rf2基因在非酒精性脂肪肝、II型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述Sh3rf2基因作为药物靶点，构建Sh3rf2基因过表达的体外细胞模型或者动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物和/或生物试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的目的。

3.根据权利要求1或2所述的Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述药物是促进Sh3rf2基因表达的药物。

4.根据权利要求1或2所述的Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述非酒精性脂肪肝病包括：单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

5.根据权利要求3所述的Sh3rf2在制备治疗非酒精性脂肪肝病和/或II型糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述非酒精性脂肪肝病包括：单纯性肝脏脂肪肝变性、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。

Images