CN104174021A - 蛋白酶体抑制剂在制备治疗慢性低度炎症性疾病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域，涉及蛋白酶体抑制剂的新用途。本发明提供了蛋白酶体抑制剂类化合物调控TM4的表达，产生抗炎与调节能量代谢的功能，应用所述蛋白酶体抑制剂MG132、MG341、MG519等，可使TM4上调、过表达USP19或降低期降解亦能上调TM4，从而发挥抗炎、调节代谢的效应；进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物的用途，所述的治疗慢性低度炎症性疾病的药物可用于肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的防治。本发明并从体内、体外，基因剔除、过表达，动物、人群，等诸多方面验证了高脂-TM4-炎症-肥胖这一全新机制，具有较高的临床价值。

Description

蛋白酶体抑制剂在制备治疗慢性低度炎症性疾病药物中的用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及蛋白酶体抑制剂（proteinsome inhibitor）的新用途；具体涉及蛋白酶体抑制剂及USP-19（ubiquitin specific peptidase 19经四次穿膜蛋白（TM4）途径产生抗炎与调节能量代谢的功能，进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。 

背景技术

研究公开了，真核细胞中存在着多种蛋白降解途径，其中最主要的途径有两种：（1）溶酶体途径：主要是降解细胞吞入的胞外蛋白质；（2）泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome Pathway, UPP)：经细胞颗粒中蛋白酶体降解泛素化的细胞内蛋白质，其中，泛素-蛋白酶体途径为近期受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统。通常情况下，细胞内膜相关蛋白和某些在应激状态下产生的蛋白质以及通过内吞过程从胞外摄取的蛋白质等主要经溶酶体途径降解，其中，泛素-蛋白酶体通路负责降解对体内调控细胞增殖和凋亡信号传导的蛋白,如抑癌因子p53、p21、促凋亡蛋白Bax、细胞周期蛋白、核因子抑制蛋白I-κB、C-Jun 氨基端激酶（C-Jun N-terminal kinase，JNK）等；而参与凋亡的重要蛋白酶caspase-3 也受到所述UPS 调节；因此，泛素-蛋白酶体通路在调控细胞周期和肿瘤生长中发挥极为重要的作用，渐成为肿瘤治疗的新靶点。目前，经美国食品药物管理局（FDA）批准，蛋白酶体抑制剂PS-341已经进入Ⅱ期临床应用于肿瘤的治疗，并取得了比较理想的治疗效果。此外，利用所述蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性正在免疫、炎症等研究领域的关注点。 

肥胖症和糖尿病已经成为全球性的流行病，其发病率仍在不断地增加；据世界卫生组织统计，至2002年全球将有10亿成人处于超重，其中3亿达到肥胖标准；北美、英国、西欧、中东、太平洋群岛及中国等地区1980年以来肥胖患者数量增加了3倍，其中美国约1/3的人口是肥胖患者，我国肥胖和超重的发病率从1992至 2002年由20%增加到29%。最为令人担忧的是，肥胖可诱发和加重多种疾病，如2型糖尿病、心血管系统疾病（高血压、动脉粥样硬化）、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪肝、肾脏损害、关节炎、哮喘以及某些肿瘤。其中，由肥胖引发的直接和间接经济开支亦是惊人，例如，2000年美国由肥胖导致的开支达1170亿美元。肥胖已经成为危害人类健康和增加国家经济负担的一个重要因素；因此，肥胖预防和治疗已经成为新时代医学领域的新的重大课题。 

    有研究指出，肥胖的发病机制就是机体能量代谢失衡，即能量摄入大于能量消耗，导致能量以脂肪的形式储存在体内；能量摄入过多，包括食欲增强或亢进、胃肠消化吸收功能改变等；研究显示，食欲的调控中枢位于下丘脑，下丘脑同时接受胃肠道、脂肪、胰腺等组织器官分泌激素的调控，进一步分泌食欲调控激素调节机体摄食活动；下丘脑调控食欲的激素主要包括弓状核分泌的促进食欲的刺鼠相关肽（AgRP）、神经肽Y(NPY)及室旁核分泌的抑制食欲的可卡因-苯丙胺调控转录物 (CART)、阿黑皮素 (POMC)；胃肠道分泌的调控食欲的激素包括：Ghrelin、胆囊收缩素（CCK）、高血糖素样肽1 （GLP-1）、多肽YY（PYY）、胃泌酸调节素（Oxm）、胃泌素等，胰腺分泌胰岛素、胰多肽、胰岛淀粉样多肽等，脂肪组织有瘦素（Leptin）；当上述激素的分泌出现紊乱或异常时，引起机体食欲的变化，影响机体食物的摄入量；有实验显示，当小鼠剔除Leptin基因时，抑制摄食中枢活动的信号通路受阻，小鼠的食欲明亢进，进食量显著增加，出现明显的肥胖表型；呈现肥胖时，可引起leptin抵抗，使得脂肪组织分泌leptin增加，但进入下丘脑的leptin减少，削弱了leptin对食欲的抑制作用；此外，下丘脑分泌的激素还受到记忆、环境因素、情绪、昼夜节律等的影响；而胃肠道能量代谢的调节首先通过分泌激素调控了机体摄食中枢的活性，其次，胃肠道内各种菌群差异也是引起肥胖的一个重要因素，胃肠本身的大小长短亦影响机体对食物的储留和营养的吸收。肥胖发病的第二个原因是，机体能量利用或消耗减少：（1）机体活动减少，对能量的需求和消耗均减少，导致能量摄入相对过多，如工作强度和生活习惯的改变；（2）机体参与能量代谢的激素、酶及其他相关蛋白的含量、活性发生改变，如甲状腺激素、儿茶酚胺类、糖皮质激素、胰岛素、脂连素、抵抗素、UCP-1/2、GLUT-4、leptin及其受体、PPAR-γ、白介素(IL)、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等含量或活性异常均能够引起机体能量代谢异常；其中，所述白介素、肿瘤坏死因子等为炎症因子，而所述因子受代谢性因素（糖、脂、糖基化产物等）的刺激，在巨噬细胞和脂肪细胞的表达和分泌均显著增加，可引起明显的胰岛素抵抗，因此慢性炎症与肥胖的关系成为新的研究热点。 

研究表明，肥胖和2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病。临床流行病学调查显示，肥胖和2型糖尿病患者血中纤维蛋白原、TNF-a、IL-6、C反应蛋白等均显著升高，且TNF-a等可引起机体明显的胰岛素抵抗，表明肥胖的发生发展与炎症的发生有着密不可分的联系。有研究证实，高糖高脂等代谢性因素可通过多种途径激活炎症细胞，释放炎症介质，引起机体胰岛素抵抗等；如高糖提高细胞核内NF-κB 与DNA的结合，减少IκB的表达，增加IKKa、IKKβ激酶蛋白水平，增强该两种激酶对IκBa/β的磷酸化，促进IκBa/β通过泛素途径进行降解；同时高糖增加促炎症转录因子AP-1和Egr-1蛋白水平；而高脂则直接通过toll样受体4活化PKC，诱导下游IKK和JNK两条炎症相关通路的激活，引起机体胰岛素抵抗，破坏机体能量代谢平衡。研究还显示，在脂肪组织中，脂肪细胞内脂质沉积增加，导致脂肪细胞肥大，分泌多种炎症因子，如TNF-α、白介素6（IL-6）、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、纤溶酶原激活物抑制物1等；其中MCP-1的增加进一步促进单核巨噬细胞向脂肪组织侵润、活化、吞噬脂质并释放炎症因子，导致脂肪组织炎症的加剧，改变脂肪组织各类炎症因子及脂肪因子的分泌量，促使机体肥胖加重。有关研究还显示，NF-kB信号通路的两个重要调控分子IKKβ、IKKε的基因剔除模型证实抑制炎症信号通路可明显改善机体胰岛素抵抗及抑制高热量饮食诱发的肥胖，但肥胖和炎症的关系尚未完全阐明；目前主要认为上述两者通过以下途径发挥相互作用：toll样受体途径、氧化应激途径、内质网应激途径等。本申请的发明人拟应用蛋白酶体抑制剂MG132使TM4上调、过表达USP19上调TM4，提供该蛋白酶体抑制剂的抗炎、调节代谢的新用途，进一步用于制备防治肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的药物。 

发明内容

本发明的目的是提供蛋白酶体抑制剂（proteinsome inhibitor）的新用途；具体涉及蛋白酶体抑制剂及其相互作用蛋白经四次穿膜蛋白（TM4）途径产生抗炎与调节能量代谢的作用，进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。 

本发明运用表达序列标签(EST)及cDNA芯片技术研究证实人下丘脑、脂肪等组织和高糖高脂糖尿病猴主动脉、胰腺等组织中的基因表达谱，克隆得到有关新基因与肥胖及2型糖尿病的发病机制有关，尤其是其中的表达的蛋白含有4个穿膜结构袢的基因，本发明命名为4次穿膜（Transmembrane 4, TM4）蛋白，TM4为跨膜蛋白，存在于细胞膜及核膜，该基因在糖尿病猴组织中下调最为明显。 

本发明所述的蛋白酶体抑制剂包括MG132、MG341、MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5和USP19。 

本发明中，通过酵母双杂交获得TM4相互作用蛋白，包括Nur77、RNF-5（ring finger protein-5）、USP-19（ubiquitin specific peptidase 19）等，并通过pull down试验证实TM4与Nu77相互作用； 

本发明中，实验证实了蛋白酶体抑制剂与相互作用蛋白USP 19能够增加TM4的量；

本发明所述的USP19可增加TM4含量，USP19降解抑制剂可作为治疗慢性炎症。

本发明中，制备了TM4基因剔除小鼠，并从基因组水平和蛋白水平鉴定模型构建成功；通过TM4基因剔除小鼠模型，证实在高脂饮食诱导下TM4基因剔除小鼠呈现显肥胖表型，肥胖鼠脂肪、体重比明显增加，且摄食量显著增加，糖耐量减退；TM4基因剔除的肥胖小鼠脂肪和肝脏micro-array结果显示Nur77和NFκB表达明显增高，糖耐量减退； 

本发明中，高脂诱导条件下，可以显著下调TM4蛋白表达水平，通过构建慢病毒干扰TM4后，可引起Nur77蛋白水平上调，且该调控作用不在转录水平，进而导致IKKβ和IKKε的表达增强，从而调节NF-κB炎症通路的信号转导，使得各类炎症因子分泌增加，其中，IKKε还可抑制UCP-1表达，使得脂肪组织通过UCP表达减少，抑制脂肪的分解，诱发或加重肥胖；本发明的实际临床标本中，验证TM4在糖尿病病人中显著下调；

本发明中，经试验证实，Nur77的上调使得IKK-b表达增强； 过表达TM4可引起Nur77蛋白水平下调，IKK-b表达降低；

本发明中，经试验证实TM4基因剔除小鼠模型血压高于正常对照组小鼠，血管张力实验证实基因剔除后小鼠舒张功能受限；. db/db小鼠过表达TM4基因后，肥胖、高血压、高血糖得到明显缓解；本发明的临床实验中，96个肥胖患者观察到4例病人TM4外显子杂合突变（L26F 、S128P、 P227S），进一步家系筛查发现这些突变和肥胖共分离。

本发明中，实验显示，在下丘脑-垂体轴中，Nur77调控食欲的关键激素a-MSH前体物POMC的表达，Nur77通过结合POMC上游抑制性调控元件抑制PMOC的转录，减少POMC的产生；机体能量过剩可以引起下丘脑内质网应，导致IKKb--NF-kB通路的激活，继而改变下丘脑内AGRP神经元活性，导摄食改变，并引起机体胰岛素抵抗、leptin抵抗和糖代谢紊乱，研究发现，乙酰化可以调节糖脂代谢酶类的活性，从而改变能量代谢。 

   本发明的实验结果显示，蛋白酶体抑制剂不仅通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用；实验结果表明，TM4在代谢性因素所致代谢性炎症过程中尤其在肥胖和2型糖尿病发生发展过程中具有关键作用；所述的TM4可进一步作为肥胖和2型糖尿病的预防和治疗的治疗靶点。 

本发明提供了蛋白酶体抑制剂类化合物调控TM4的表达，产生抗炎与调节能量代谢的功能，应用所述蛋白酶体抑制剂MG132可使TM4上调、过表达USP19或抑制其降解能上调TM4，从而发挥抗炎、调节代谢的效应；进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物的用途，所述的治疗慢性低度炎症性疾病的药物可用于肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的防治。本发明并从体内、体外，基因剔除、过表达，动物、人群，等诸多方面验证了高脂-TM4-炎症-肥胖这一全新机制，具有较高的临床价值。 

附图说明

图 1 蛋白酶体抑制剂MG132上调TM4表达。 

图2a 干扰USP 19后TM4下调 ， 图2b 过表达USP 19后TM4上调。 

图3 TM4基因剔除小鼠模型及其鉴定（211、221为野生型，219、222为纯合子）。 

图4 左侧为TM剔除小鼠 、右侧为野生型。 

图5 左侧为TM4剔除小鼠、右侧为野生型。 

图6左侧为TM4剔除小鼠、右侧为野生型。 

图7  小鼠体重比较。 

图 8 小鼠摄食量比较。 

图9 口服糖耐量实验检测小鼠血糖。 

图10 酵母双杂交筛选相互作用蛋白及部分测序结果。 

图11 Nur77蛋白表达纯化 。 

图12  pull down 。 

图13  siRNA干扰序列的筛选。 

图14 慢病毒干扰TM4表达及对下游靶蛋白的影响。 

图15 干扰TM4对下游TM4的影响。 

图16 TM4对IKK-b的影响。 

图17  RT-PCR检测 IKK-b 。 

图18过表达TM4可以下调Nur77及下游的IKK-b、NF-kB。 

图19 小鼠血压， 

WT：wild type          KO：knock out   。

图20  血管张力测定。 

图21  TM4过表达使db/db小鼠的肥胖缓解。 

图22  TM4过表达使db/db小鼠的高血压缓解。 

图23  TM4过表达使db/db小鼠的高血糖缓解。 

图24  TM4过表达使db/db小鼠的糖耐量改善。 

图25   TM4的细胞定位。 

图26  TM4基因在糖尿病猴和糖尿病患者的主动脉中表达下调。 

图27 高糖下调血管平滑肌细胞中TM4基因表达的剂量曲线。 

图28  TM4在胰岛中主要表达于胰岛α细胞。 

图29  TM4在a细胞（G9）高表达，在b细胞（INS-1）低表达。 

图30 高糖下调TM4在血管平滑肌细胞中的表达。 

图31 肥胖患者中筛查倒的L26F（c.76 C→T）杂合突变测序图。 

图32 肥胖患者中筛查倒的S128P（c.382 T→C）杂合突变测序图。 

图33 肥胖患者中筛查倒的P227S（c.679 C→T）杂合突变测序图。 

    图34 是实施例1中的回收产物测序结果。 

具体实施方式

实施例1  克隆得到跨膜蛋白TM4基因 

1.  TM4基因的克隆

1)   引物设计：

根据TM4基因信息(人NM_001144072.1，小鼠NM_026861)以及pcDNA-GFP Lentivector(CD511A-1, System Biosciences)载体，使用Oligo6.6引物设计软件，设计引物如下：

TM4(人)-上游引物：5’- G(保护碱基) GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACCGG -3’ 

TM4(人)-下游引物：5’- CG(保护碱基) GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAG-3’ 

TM4(小鼠)- 上游引物：5’-G(保护碱基)GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACC-3’

TM4(小鼠)- 下游引物：5’- CG(保护碱基) GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAGGAA-3’ 

2)  引物合成：

     Page级纯化,2OD合成量；

2. PCR扩增TM4 cDNA

1) 反应体系和条件

(1) PCR扩增体系如下表所示：

(2) PCR反应条件如下表所示：

2)PCR产物5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增条带大小；

3) PCR产物纯化（切胶回收）

PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，切胶后使用DNA胶回收试剂盒回收，紫外分光光度法测定浓度，-20℃保存待用。胶回收步骤如下：

    (1) 对于PCR产物，全量上样，用琼脂糖凝胶电泳进行分离；

(2) 用干净的手术刀切取含有要回收DNA的凝胶目的条带，放入1.5 ml离心管中；

(3) 加入3倍体积溶胶液，混匀后置于50℃水浴中10分钟，使胶彻底融化，其间每2分钟混匀一次；

(4) 将溶液转移至离心柱中离心，12,000×g，1分钟；

(5) 倒出收集管中溶液，向离心柱中加入700μl洗涤溶液，离心，12,000×g，1分钟，倒出收集管中溶液；

(6) 重复上一步骤；

(7) 离心甩净液体，12,000×g，2分钟；

(8) 将柱子放入新的干净1.5ml离心管中；

(9) 向离心柱中心加入30μl洗脱溶液，静置2分钟，离心，12,000×g，1分钟，即得到回收纯化产物；

(10) 回收产物采用紫外分光光度计测定浓度为500ng/ul，-20℃保存待用；

2. TM4基因序列

回收产物测序结果使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库进行序列比对，与TM4标准序列完全一致（如图34 所示）；

经上述实验，克隆得到含有4个穿膜结构袢的基因，本发明命名为4次穿膜（Transmembrane 4, TM4）蛋白，TM4为跨膜蛋白，存在于细胞膜及核膜，该基因在糖尿病猴组织中下调最为明显。

  

实施例2

实验证实了蛋白酶体抑制剂与USP 19能够增加TM4的量：

（一）构建USP19真核表达载体（步骤同前述）；

（二）进行慢病毒包装（步骤同前述）；

(三)  USP19 过表达   

1．转染HUVEC 

1） 细胞培养及接种 

2）病毒感染 

24小时后，镜下观察细胞完全贴壁，对细胞进行换液，进行病毒感染实验，加入预先混好含 MOI=50 的重组病毒完全培养液，置 37℃、5％CO2孵箱中孵 育； 

3）换液 正常培养 12小时后，对细胞进行换液，使用完全培养基， 37℃和5%CO2，

细胞名称  HUVEC 

使用培养基  HUVEC 全培养基 

接种数目  2×104

培养条件  37℃和5%CO2

条件下培养； 

检测USP19及TM4蛋白表达 

 继续培养72 h 后western-blot 检测 USP19 及TM4蛋白表达，western-blot 方法同前所述。

(四）MG132干预 HUVEC 

1.   将MG132 加入培养皿中，使得其终浓度达50μM ，

2.   分别于0h，0.5h，1h，2h，4h 收集细胞蛋白 ，

3．  western-blot 检测TM4 蛋白，方法同前述，

（五）western-blot 方法检测 TM4相关因子的蛋白表达（方法同前述）。

  

实施例3

制备了TM4基因剔除小鼠，并从基因组水平和蛋白水平鉴定模型构建成功；

(一)     TM4基因突变小鼠的制备、繁育

ES细胞囊胚显微注射和胚胎移植委托上海南方模式动物中心制作，将得到的雄性嵌合体小鼠与雌性C57BL/6J小鼠交配繁殖，所得初生小鼠，在3-4周龄与亲代分离，根据性别，将雌雄小鼠分笼饲养(每笼5-6只)；在F1代仔鼠中选取毛色为灰色的仔鼠，抽提鼠尾DNA，用PCR方法在DNA水平鉴定出TM4基因突变杂合子小鼠；将性成熟的雄性杂合子小鼠与雌性C57BL/6J近交系小鼠交配繁殖，获得的F2代雄性杂合子小鼠，再继续与雌性C57BL/6J近交系小鼠交配，如此交配至第8代以后获得遗传背景稳定的TM4基因突变小鼠，用于观察表型（如图4所示）；将雄性杂合子小鼠与雌性杂合子小鼠交配后，同时分别获得野生型、杂合子、纯合子小鼠；

转基因小鼠按实验动物饲养标准饲养（饲养于复旦大学上海医学院动物试验中心二楼 IVC 室，光照及黑暗时间每隔 12 小时循环，室温恒定在 21-23℃，自由进食饮水，每只小鼠脚趾标记编号）；

(二) 鼠尾基因组DNA的提取

1.        小鼠在10-14天龄时，剪取鼠尾约0.5厘米，加入500μl鼠尾裂解液，置恒温水浴槽中，55℃消化过夜；

2.        鼠尾组织裂解充分，12000rpm4℃离心10分钟；

3.       取上清，加入等体积的异丙醇颠倒混匀后，见白色絮状物沉淀，12000rpm4℃离心10分钟，弃上清；

4.        用70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm4℃离心10分钟，弃上清，干燥沉淀5-10分钟，加入100μ1 TE溶液溶解；

5.        测OD，用TE将浓度调至250ng/μl；

(三)  DNA水平鉴定小鼠TM4基因缺失突变

根据基因诱捕原理设计三对引物：第一对引物的上游引物在tag上，下游引物在靠近插入载体3’端的TM4基因组序列上，此对引物可以扩增出TM4正常等位基因（引物1）；第二对引物的上游引物和下游引物均在插入载体上，此对引物能鉴别出发生突变的TM4等位基因（引物2）；第三对引物的上游引物在tag上，下游引物在插入载体的5’端序列上，此对引物可以扩增出 TM4突变等位基因上的一段序列（引物3）；

三对引物的序列如下表所示：

(四)     mRNA水平鉴定小鼠TM4基因突变

取三只野生型小鼠（wildtype，WT），三只纯合子小鼠（knockout，KO），获取肝组织抽提RNA，并逆转录成cDNA作为PCR模板，在RNA水平鉴定TM4基因是否发生突变；

Real-time PCR采用的引物序列如下表所示：

引物	序列
		β-actin	5'  AGATGTGGATCAGCAAGCAGG  3'
	5'  GCACGAAGGCTCATCATTCA  3'
		TM4	5'  GTGCAGTATTCGCTTGGTGTC  3'
	5'  TGGAGCACTTTGCGGTCA  3'

(五) Western blot鉴定小鼠TM4基因突变（方法同前）；

实施例 4  糖耐量、血压、血管张力测定

小鼠葡萄糖耐量的测定（腹腔注射葡萄糖耐量 intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）：

实验前一天晚上小鼠禁食不禁水14小时，第二天将小鼠分笼（3-5只/笼），试验前称量小鼠体重，尾静脉取 5μl全血用罗氏快速血糖仪测定空腹（0min）血糖浓度；用50％注射用葡萄糖水，按 2g/kg体重计算每只小鼠所用液体体积，进行小鼠腹腔注射，之后分别在15min，45min，60min，90min，120min时测定血糖值；结果显示，通过TM4基因剔除小鼠模型，证实在高脂饮食诱导下TM4基因剔除小鼠呈现显肥胖表型，肥胖鼠脂肪、体重比明显增加，且摄食量显著增加，糖耐量减退；TM4基因剔除的肥胖小鼠脂肪和肝脏micro-array结果显示Nur77和NFκB表达明显增高，糖耐量减退； 

鼠尾血压的测定：

(1) 在安静的环境下，将小鼠置于鼠袋中，保持恒温，使鼠尾血管扩张；

(2) 采用仪器通过环套在鼠尾跟部的传感器检测血流脉冲振荡；

(3) 当脉冲波达到能够被测量的状态时，开始，气泵自动充放气开始测量；

(4) 经数据采集软件系统记录血压数据；

(5) 共试验3次，每次每只小鼠设定为测量3-5次，取其平均值；

小鼠腹主动脉环的制备及离体血管张力的测定：

(1) 常规方法处理实验小鼠，将其腹主动脉置于充有95%O2、5%CO2混合气的低温Krebs液中，在显微镜下分离主动脉血管；

(2) 在Myograph 系统槽里，放置5 ml Krebs 液，持续通混合气体，并通过内置加热系统将槽内溶液温度调至37℃；

(3) 将分离的主动脉制成长度2mm的血管环后，移至Myograph 系统槽；

(4) 血管环中穿入两根直径为80μM的金属丝，一根金属丝固定于标本架上，另一根与张力换能器（PowerLab data acquisition system）连接，平衡90分钟后调节基础张力为6 mN，平衡过程中调试基础张力使其维持在6mN；

(5) 血管活性的鉴定：待血管平衡后，将Krebs液更换为60 mM高钾溶液，引发血管收缩，检测血管收缩功能，然后用PSS液洗至基线，反复3次；

(6) 加入药物刺激，时间分别为3分钟，检测不同血管对苯肾上腺素的收缩作用的反应性以及对乙酰胆碱舒张作用的反应性；

小鼠体脂检测：

常规方法处理实验小鼠，用双能X线骨密度检测仪对活体小鼠进行X线扫描，形成高质量图像，并且能够测量组织构成、脂肪以及骨骼。

  

实施例5

TM4在代谢性因素所致代谢性炎症过程中尤其在肥胖和2型糖尿病发生发展过程中的关键作用实验

（一）高脂对 HUVEC 细胞 TM4 表达的影响：

1. 高脂干预HUVEC细胞 

(1) 游离脂肪酸：棕榈酸+BSA+生理盐水 ，

(2) 将HUVEC细胞按1X10⁵每孔接种与六孔板中 ，

(3) 待细胞密度长至70%左右加游离脂肪酸处理，浓度分别为0uM、100uM、250 uM、500 uM、1.0 mM、2.0 mM，处理24h后收集细胞，裂解；

2. Western blot方法同前；

（二）高糖干预HUVEC细胞： 

(1) 待HUVEC 细胞生长至对数生长期时开始予高糖干预，高糖干预浓度分别为5.6mM、10mM、20mM、30mM，干预时间为24h；

(2) Western Blot 观察高糖对巨噬细胞中TM4 蛋白表达的影响：蛋白抽提、蛋白定量、SDS 电泳、Western Blot 等实验方法及实验步骤同前；

（三）TM4敲除小鼠在高脂饮食诱导下出现胰岛素抵抗表型（同实验例4）。

  

实施例6  

构建TM4过表达的慢病毒载体，过表达TM4可引起Nur77蛋白水平下调，IKK-b表达降低。db/db小鼠过表达TM4基因后，肥胖、高血压、高血糖得到明显缓解； 

一、 实验动物

1. db/db小鼠 (雄性，2周龄)；

二、主要设备仪器

1. 电子天平(JY2001型，上海方瑞仪器有限公司)，

2. 血糖仪(罗氏)，

3. BP-98A 智能无创血压计(Softron Biotechnology Incorporated)，

4. Anke TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂)，

5. SCREEN MASTER 3000半自动生化分析仪(北京富利泰医学科技有限公司)，

6. 石蜡切片机(Leica) ，

7. 普通显微镜(nikon)，

8. 电动匀浆器(DY89-1，宁波新芝)，

9. 其他同前；

三、实验方法 

(一) 小鼠分组与饲养

3组小鼠分别予Lv-TM4(小鼠)、空病毒、生理盐水尾静脉注射，

db/db小鼠饲养于IVC 室，光照及黑暗时间每隔 12 小时循环，室温恒定在 21-23℃，自由进食饮水，高脂饲料喂养，采用如下高脂饲料配方（斯莱克 M04-F）：

水分（％） 8.6

粗蛋白（％）18.8

粗脂肪（％）16.2

粗灰分（％）5.2

粗纤维（％）3.98

无氮浸出物（％）45.2

钙（％）1.24

磷（％）0.83

钙：磷 1.49

赖氨酸（％）1.38

蛋氨酸+胱氨酸（％）0.78

能量（kcal) 379

(二) 慢病毒干预

1. 使用dPBS(pH=7.8)将病毒颗粒浓度调整至1×10⁴ifu/μl

2.  3组小鼠共高脂饲养10周，每周干预1次，至12周龄，方案如下表所示：

组号	干预方案
		1	尾静脉注射生理盐水1ml
2	尾静脉注射空病毒  1×107ifu (病毒液1ml)
		3	尾静脉注射Lv-TM4  1×107ifu (病毒液1ml)

(三) 表型观察

1. 体重、进食量称量

，将塑料容器置于天平上去皮，然后取每只小鼠称重，读取数值并记录，使用同样的方法对食料进行称量；

2.      小鼠尾动脉血压测定

(1) 在安静的环境下，将小鼠置于鼠袋中，放于预热的加热管中，保持恒温，使鼠尾血管扩张；

(2) 将传感器环套在鼠尾跟部，仪器将自动检测小鼠尾巴的血流脉冲振荡；

(3) 当脉冲波达到能够被测量的状态时，按下开始键，气泵自动充放气开始测量，这样有效避免了误测，提高了测量的准确度；

(4) 经计算机数据采集软件系统记录血压数据；

(5) 共试验3次，每次每只小鼠设定为测量3-5次，取其平均值，前两次使小鼠适应环境，以减少试验误差，取第3次的数据作为实验数据；

3. 小鼠葡萄糖耐量的测定（腹腔注射葡萄糖耐量 intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）

小鼠饲养10周后（12周龄时）行IPGTT，实验前一天晚上将小鼠笼内换垫料，禁食不禁水14小时，第二天早上将小鼠分笼（3-5只/笼），试验前称量小鼠体重，用无菌刀片划破尾静脉取 5μl 左右全血用罗氏快速血糖仪测定空腹（0min）血糖浓度；

采用50％注射用葡萄糖溶液，按2 mg葡萄糖/g体重计算好每只小鼠所用葡萄糖溶液体积，进行小鼠腹腔注射，之后分别在30min，60min，120min时测定血糖值；

4. 空腹血糖测定(同IPGTT时的0min血糖测定方法)；

5. 胰岛素抵抗水平及胰岛β细胞功能评估

采用稳态模型(HOMA)指数，计算公式如下：

　　HOMA-IR= FPG×FINS/22.5 

HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5) (%)

FPG：空腹血糖水平(mmol/L)；FINS：空腹胰岛素水平(mIU/l)；

(四) 血脂测定。

小鼠摘眼球取血，3000r/min离心10min，分离血清，在半自动生化仪上测定总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。 

Claims (10)

1.蛋白酶体抑制剂在制备用于治疗慢性低度炎症性疾病药物中的用途。

2.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂包括MG132、MG341 MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5和USP19。

3.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的慢性低度炎症性疾病包括肥胖、2型糖尿病或动脉粥样硬化。

4.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的 USP19降解抑制剂在用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。

5.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂及其相互作用蛋白USP-19降解的抑制剂经四次穿膜蛋白（TM4）途径产生抗炎与调节能量代谢作用后，用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。

6.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白含有4个穿膜结构袢的基因，命名为4次穿膜（ TM4）蛋白，该TM4为跨膜蛋白，定位在细胞膜及核膜上。

7.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4与Nu77相互作用，干扰TM4引起Nur77蛋白水平上调，且该调控作用不在转录水平。

8.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的Nur77上调使IKK-b表达增强。

9.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4过表达引起Nur77蛋白水平下调，IKK-b表达降低。

10.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白在制备筛查肥胖、高血压、高血糖患者制剂中的用途。