CN106466487B - 双特异性磷酸酶14在治疗非酒精性脂肪肝和ⅱ型糖尿病中的功能和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种DUSP14基因在脂肪肝糖尿病疾病中的功能和应用。以DUSP14基因敲除小鼠和野生型C57小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型，结果表明与野生型C57小鼠对比，DUSP14‑KO小鼠表现出肥胖，空腹血糖水平高于对照组WT小鼠，肝功能明显差于WT小鼠。通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现DUSP14‑KO小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分病理染色结果等均说明高脂饮食的DUSP14‑KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。因此，DUSP14可作为筛选治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物靶标，其促进剂可用于制备治疗脂肪肝和/或II型糖尿病的药物。

Description

双特异性磷酸酶14在治疗非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的 功能和应用

技术领域

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种双特异性磷酸酶14(Dual-specificity phosphatase 14,DUSP14)作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。

背景技术

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染和精神因素等多种因素引发的机体胰岛功能减退、胰岛素抵抗，最终导致糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。Ⅱ型糖尿病(T2DM)又称非胰岛素依赖型糖尿病，是一种以高血糖为表现特征的代谢综合征^[1]，约占糖尿病总人数的90％以上，已成为继癌症、心血管疾病之后的第三大影响人类健康的疾病。其可并发冠心病、末梢血管病、高血压、肾病等多种疾病，累及心脑血管、肾脏、视网膜、神经等重要脏器和组织，肝脏也是其重要的靶器官之一。随着糖尿病病程的延长，发生肝脏病变的危险性及其病变程度也随之增加。糖尿病性肝损伤是指糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化，是糖尿病的一种慢性并发症。

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以患者虽然无过量饮酒史，但是肝实质细胞却出现脂肪变性和脂肪堆积为病理特征的慢性肝脏疾病^[2-4]。流行病学调查发现非酒精性脂肪肝(NAFLD)已逐渐成为我国第一大肝病，其危害不仅可进展为非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝细胞癌，而且作为代谢综合征的重要组分与心脑血管疾病密切相关，严重影响了人们的身体健康和生活质量，也给社会带来沉重负担。

随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加。研究结果显示，在糖尿病人群中，NAFLD患病率可高达80％^[5]。在有些患者中肝脏脂肪沉积可能是影响其T2DM发展的主要因素^[6]。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分发展，不仅促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维变性、肝硬化及肝细胞癌。T2DM合并NAFLD将大大增加由于肝硬化、肝细胞癌和心血管并发症导致的死亡风险^[7]。目前，虽然控制高脂血症在T2DM伴NASH患者中的治疗作用仍有待探究，但是NAFLD的治疗主要包括针对糖尿病和心血管风险因子的积极控制。研究表明，在合并T2DM和NASH的患者中，只有噻唑烷二酮类药物吡格列酮显示出肝脏组织学的明显改善。因此未来我们应该制定特异的筛选标准以及治疗方案以期应用于临床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPKS)是细胞内的一类丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶，已经证实，MAPKS信号通路存在于大多数细胞内，在细胞增殖、分化、转化、凋亡等细胞反应中发挥重要作用。双特异性磷酸酶(DUSP)，是蛋白质酪氨酸磷酸酶超家族的一个亚家族，是一类双向特异性苏/酪氨酸磷酸酯酶。不仅能使磷酸化的苏氨酸/丝氨酸去磷酸化，还可使磷酸化的酪氨酸去磷酸化^[8]。根据其结构特征和序列的相似性可分为典型的和非典型的。研究表明，现已知的大多数家族成员均作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPKS)的负向调节剂参与细胞增殖、分化、代谢、基因转录、离子通道、细胞细胞通信、免疫应答等以及肿瘤的形成。

Dual-specificity phosphatase 14(DUSP14；also known as MKP6)，非典型双特异性磷酸酶亚组的一员，MAPKS信号通路重要的负向调节剂，已被证实在炎症免疫反应，肿瘤，细胞分化，增殖方面发挥重要作用。DUSP14首先作为CD28胞质尾区相互作用的蛋白被克隆出来，后来发现在心脏，胚胎，肝脏等组织器官相对高表达^[9]。另外Klinger S等发现当β细胞表达显性负调控的DUSP14S时，通过增加ERK激活，细胞增殖率则表现出明显的增加趋势^[10]。

参考文献：

[1]Katsiki N，Athyros V，Gkaragiannis A，etal.Metabolic syndrome andnon-cardiac Vascular diseases:an update from human studies[J].Curr Pharm Des，2014,20(31)：4944-52

[2]Krawczyk M，Bonfrate L，Portincasa P.Nonalcoholic fatty liverdisease[J].Best Pract R es Clin Gastroenterol，2010，24(5):695-708.

[3]George J，Pera N，Phung N，et al.Lipid peroxidation，stellate cellactivation and hepatic fibrogenesis in a rat model of chronic steatohepatitis[J].J Hepatol，2003，39(5):756-764.

[4]Mansour GF，Vahhabi MM，Joukar F，et al.Noninvasive evaluation ofnonalcoholic steatohepatitis(NASH)[J].Caspian J Inter Med，2013，4(4):797-798.

[5]Fan JG,Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liverdisease in china.J Hepatol.2009；50:204-210.

[6]Loria P,Lonardo A,Anania F.Liver and diabetes.A viciouscircle.Hepatol Res.2013；43:51-64.

[7]Cusi K.Treatment of patients with type 2diabetes and non-alcoholicfatty liver disease:Current approaches and futuredirections.Diabetologia.2016；59:1112-1120.

[8]Liu C，Shi Y，Du Y，et al.Dual-specificity phosphatase DUSP1protectsoveractivation of hypoxia-inducible factor1through inactivating ERK MAPK[J].Experimental Cell Research，2005，309(2)：410-418.

[9]Marti F,Krause A,Post NH,Lyddane C,Dupont B,Sadelain M,King PD(2001)Negative-feedback regulation of CD28costimulation by a novel mitogen-activated protein kinasephosphatase,MKP6.J Immunol 166:197–206.

[10]Klinger S,Poussin C,Debril MB,Dolci W,Halban PA,ThorensB(2008)Increasing GLP-1-induced b-cell proliferation by silencing the negativeregulators of signaling cAMP response element modulator-a and DUSP14.Diabetes57:584–593.

发明内容

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供DUSP14基因的表达与非酒精性脂肪肝及Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗非酒精性脂肪肝，Ⅱ型糖尿病的靶基因DUSP14的新用途，进而把DUSP14基因应用于非酒精性脂肪肝Ⅱ型糖尿病的治疗中。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明以野生型C57小鼠与DUSP14肝脏特异性基因敲除小鼠(DUSP14-KO)为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究DUSP14基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，DUSP14-KO小鼠表现出肥胖，其体重明显高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且DUSP14-KO的空腹血糖水平高于对照组WT小鼠，DUSP14-KO小鼠的肝功能明显差于WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现DUSP14-KO小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从肝脏重量及肝脏/体重比以及肝脏甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸含量检测结果等均说明HFD组(High fat diet，高脂饮食)的DUSP14-KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。这表明DUSP14基因敲除会加剧脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，DUSP14基因能够改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。

本发明人的研究证明了：在高脂诱导的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，DUSP14具有抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，特别是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。

针对DUSP14的上述功能，提供DUSP14作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。

针对DUSP14的上述功能，提供DUSP14作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

以上药物是指能够促进DUSP14基因表达的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现DUSP14基因的新功能，即DUSP14基因具有能够保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于DUSP14在保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是Dusp14-KO小鼠构建策略图。

图2是WT和DUSP14-KO小鼠的空腹血糖结果图；

A为空腹血糖水平统计图，B为空腹血清胰岛素水平图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图3是WT和DUSP14-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；

A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve，AUC)比较图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vsWT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图4是DUSP14-KO和WT小鼠的肝脏重量结果图；

A为肝脏重量统计柱状图，B为肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图5是DUSP14-KO和WT小鼠的肝脏脂质结果图；

分别为肝脏胆固醇，肝脏甘油三酯及肝脏游离脂肪酸统计柱状图(*：p＜0.05vsWT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6小鼠(WT)和DUSP14肝脏特异性基因敲除(DUSP14-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，DUSP14肝脏特异性基因敲除小鼠(DUSP14-KO)由DUSP14-floxed小鼠与受蛋白启动子控制、肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre(购自The Jackson Laboratory，货号003574)杂交得到，构建策略见图1。

肝脏特异性DUSP14基因敲除小鼠的构建：

根据基因信息利用CRISPR Design(网址：http://crispr.mit.edu/)分别在内含子2和外显子3的右边中各设计一个CRISPR的打靶位点。

靶序列分别为：

DUSP14-sRNA 1：ggATAAGTCATTTTCTATTGACCAT TGG

DUSP14-sRNA 2：GGTTCTCCCGAGAGGGTTTCTACGC TGG

此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。

①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。

②供体载体(Donor Vector)的构建：根据引物设计原则，设计如下引物(表1)用于扩增供体载体的左右同源臂(LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点

引物名称	引物序列	酶切位点
			DUSP14LA-F	GGGGTACCCCGGCTCAATGATTTCCTCT	KpnI
DUSP14LA-R	GCGTCGACCATTGGGAGATGTAGCCTGCA	SalI
			DUSP14M-F	TCTACCGGTGTCAATAGAAAATGACTTATATGCTTC	AgeI
DUSP14M-R	GACCTTAAGTAGAAACCCTCTCGGGAGAAC	AflII
			DUSP14RA-F	CGACGCGTCGCTGGGTGTTCGGGTT	MluI
DUSP14RA-R	ATAAGAATGCGGCCGCCCTGGCTGATAAAAGGGAAA	NotI

③打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分(负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA)分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体(pST1374-Cas9)用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGEmMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion)进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒(Ambion)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)进行纯化。

④DUSP14-floxed条件性敲除小鼠的制作

将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得DUSP14-floxed纯合小鼠。

⑤肝脏特异性DUSP14基因敲除小鼠的制作

将上述DUSP14-floxed小鼠与肝脏特异性Albumin-Cre转基因小鼠交配，筛选得到DUSP14^{floxed/floxed}/Albumin-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到肝脏细胞特异性DUSP14基因敲除小鼠。

实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

饲养环境及条件：SPF级实验动物中心，室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。

【实施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得

(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和DUSP14-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。

(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确DUSP14基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和DUSP14-DUSP14小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力，第14周终末取材。

【实施例2】小鼠空腹血糖水平及血清胰岛素水平测定

(1)小鼠空腹血糖水平检测

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

(2)血清胰岛素水平检测

①试剂及耗材准备：

样品(冰冻血清)，去离子水一瓶(1000mL)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒(Millipore，货号EZRMI-13K)含胰岛素ELISA酶标板(1块，储存于2-8℃)、酶标板封口膜(1片)、10×HRP洗脱缓冲液(2瓶，每瓶50mL,使用前使用去离子水稀释10倍)、胰岛素标准品(浓度为：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每种量为0.25mL)、胰岛素质量对照buffer(0.25mL)、基质溶液(0.5mL)、分析缓冲液(20mL)、胰岛素检测抗体(10mL)、酶溶液(12mL)、底物(12mL)、终止溶液(12mL)。

②实验步骤：

A.确认温箱开启，熟悉酶标仪操作，将待检测的血清标本从-80℃冰箱中找出；

B.将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；

C.稀释10×HRP洗脱缓冲液，每瓶用450mL去离子水稀释；

D.将取下来的酶标板条安装到一个空的酶标板架上300μL TBS洗脱缓冲液洗涤3次。洗涤完毕将酶标板倒扣在吸水纸上，轻轻拍几次，将残液吸净(注意：在进行下一步之前避免酶标板干燥，将未使用的酶标板条密封在装酶标板的袋子里，2-8℃保存)；

E.将10μL分析缓冲液加入非特异性孔(NSB)和所有的样品孔；

F.在NSB孔，标准孔和对照孔加入10μL基质溶液；

G.在预设的标准孔里加入10μL胰岛素标准品；

H.在预设的质量对照孔里加入胰岛素质量对照buffer1和2各10μL；

I.在每个样品孔里加入10μL样品；

J.每孔中加入80μL胰岛素检测抗体(以上所有加样步骤在1个小时之内完成，室温孵育2小时，在此期间将酶标板至于酶标板振荡器上，调整转速为400-500rpm震荡)；

K.取下封口膜，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍打，吸净残液；

L.使用洗脱缓冲液洗板3次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液；

M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室温下酶标板振荡器震荡30分钟，取下封口膜，弃去溶液，拍打吸干；

N.使用洗脱缓冲液洗板6次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液加入100μL底物溶液，酶标板震荡器上震荡15分钟左右。此时可以看到标准孔出现深浅渐变的蓝色。(注意：在这一步，蓝色的出现和进展可能明显快于15分钟，也可能明显慢于15分钟，取决于室温温度。请通过视觉来判断孵育的时间。或者使用酶标仪370nm波长检测，读数在1.2到1.8之间，则为合适的孵育时间)

O.加入100μL终止溶液，震荡酶标板确保充分的混匀，此时蓝色变为黄色。5分钟内在450nm和590nm处分别读取吸光值。根据测定的标准曲线，通过吸光值换算出浓度。

Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，这些指标均与糖尿病严重程度正相关。血糖变化结果如图1所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第2周开始的空腹血糖水平及血清胰岛素水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的DUSP14-KO小鼠空腹血糖水平及血清胰岛素水平也明显高于WT组小鼠(见图2A、B)。表明DUSP14基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，DUSP14基因能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明DUSP14基因能显著抑制高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病。

【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第12周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和DUSP14-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后30分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且DUSP14-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平(图3A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(areaunder the curve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，DUSP14-KO HFD组的AUC显著大于WT HFD组的AUC(图3B)，表明DUSP14对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力。

【实施例4】肝脏大体外观及肝脏组织脂质成分及脂质代谢情况测定

(1)终末肝脏组织取材

1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。

(2)小鼠肝组织脂质检测

1)从-80℃冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于1mLPBS中，混匀后再与1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育过夜。

2)以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。

3)将分离出的脂质层物质溶于200μL含1％Triton X-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。

4)开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；

5)选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；

6)在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。

7)将制得的混匀液上机检测，分析。

结果见图4所示，在HFD组的DUSP14-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高。而如图5所示，从肝脂的结果所示，HFD组的DUSP14-KO小鼠均较HFD组的WT小鼠高，这些结果说明DUSP14基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。

上述结果显示DUSP14-KO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明DUSP14基因对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明DUSP14基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 双特异性磷酸酶14在治疗非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> DUSP14-sRNA 1

<400> 1

ggataagtca ttttctattg accattgg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> DUSP14-sRNA 2

<400> 2

ggttctcccg agagggtttc tacgctgg 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> DUSP14 LA-F

<400> 3

ggggtacccc ggctcaatga tttcctct 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> DUSP14 LA-R

<400> 4

gcgtcgacca ttgggagatg tagcctgca 29

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> DUSP14 M-F

<400> 5

tctaccggtg tcaatagaaa atgacttata tgcttc 36

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> DUSP14 M-R

<400> 6

gaccttaagt agaaaccctc tcgggagaac 30

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> DUSP14 RA-F

<400> 7

cgacgcgtcg ctgggtgttc gggtt 25

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> DUSP14 RA-R

<400> 8

ataagaatgc ggccgccctg gctgataaaa gggaaa 36

Claims (2)

1.DUSP14基因作为药物靶标在筛选预防、缓解或治疗脂肪肝的药物中的应用，其特征在于：所述的筛选预防、缓解或治疗脂肪肝的药物，是指筛选能够促进DUSP14基因表达的药物；所述的应用是非诊断和非治疗的。

2.DUSP14在制备预防、缓解或治疗脂肪肝的药物中的应用。