CN112741904B - Hedgehog信号通路抑制剂治疗自闭症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Hedgehog信号通路抑制剂治疗自闭症的用途。本发明首次发现通过抑制Hedgehog信号通路能够治疗自闭症，并且实验验证了Hedgehog信号通路抑制剂能够明显改善自闭症行为缺陷，能够用于制备治疗自闭症的药物。

Description

Hedgehog信号通路抑制剂治疗自闭症的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及Hedgehog信号通路抑制剂治疗自闭症的用途。

背景技术

自闭症(Autism)是一类神经系统发育障碍综合症，其症状包括：社交能力障碍，言语与非言语交流能力下降、兴趣狭窄和重复刻板行为等。美国的Kanner教授在1938年观察到自闭症患儿的行为，并且于1943年首次正式向世界报道。

自闭症是婴儿期或儿童期出现表型复杂的神经系统发育障碍，目前尚无有效治疗药物。自闭症患者常常在感觉、行为方面有很大缺陷，但在其他方面正常甚至更好，比如10％自闭症患者的智商显著性高于普通人群。自闭症患者在表型上有很大的个体差异，这为病情的诊断和鉴定带来了很大的困难。自闭症常常伴随高度的焦虑感，例如日常活动、环境或人物转变等情况都会让患者紧张，还经常伴随着自残行为。其他常见症状包括如异常的进食、智障、过度活跃症、注意力涣散、自我控制能力不足、情绪起伏大等。自闭症患者的症状出现很早，一般出生半年内即可观察到明显表型，表型往往持续到成年，困扰患者终生。

所以急需提供能够有效治疗自闭症的药物。

发明内容

本发明的目的是提供Hedgehog信号通路抑制剂用于制备治疗自闭症的药物的用途。

本发明第一方面，提供了一种Hedgehog信号通路抑制剂用于制备治疗自闭症的药物组合物的用途。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组：小分子化合物、核酸或蛋白质。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为CN101072755A中公开的Hedgehog信号转导的吡啶基抑制剂(式I化合物)，或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为CN101072755A中公开的具有式Ib’结构的化合物，或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为具有式Ib’结构的化合物，或其药学上可接受的盐，

其中

环B为C6-C10芳环，或具有1-3个选自下组N、S和O的杂原子的5-10元杂芳环；

X是亚烷基、NR₄C(O)、NR₄C(S)、N(C(O)R₁)C(O)、NR₄SO、NR₄SO₂、NR₄C(O)NH、NR₄C(S)NH、C(O)NR₄、C(S)NR₄、NR₄PO或NR₄PO(OH)；

R₄是H或C1-C6烷基；

各R₃各自独立地为卤素、羟基、C1-C6羧基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、氨基甲酰基；

各R₆各自独立地为羟基、卤素、氨基、硝基、氰基、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基-C＝O-、磺酰基、C1-C6烷基-S(＝O)₂-、C1-C6烷氧基；

R₈为卤素；

o是0、1、2或3，且

m是0、1、2或3。

在另一优选例中，环B为苯环或萘环。

在另一优选例中，X为NR₄CO。

在另一优选例中，R₆为C1-C3烷基-S(＝O)₂-。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组，或其药学上可接受的盐：CN101072755A中公开的化合1-29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、46、47-146、147、148、262-286、287-309、310、311、312、313-368。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为维莫德吉(Vismodegib)，或其药学上可接受的盐

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为CN104003990B中公开的杂环胺类Hedgehog信号通路抑制剂(式II化合物)，或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组，或其药学上可接受的盐：CN104003990B中公开的化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为CN104177363B中公开的双环杂环胺类Hedgehog信号通路抑制剂(式II化合物)，或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组，或其药学上可接受的盐：CN104177363B中公开的化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为CN103992311B中公开的Hedgehog信号通路抑制剂(式I化合物)，或其药学上可接受的盐。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组，或其药学上可接受的盐：CN103992311B中公开的化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24。

在另一优选例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物中，Hedgehog信号通路抑制剂的含量为≥1wt％，较佳地，≥wt 5％、≥10wt％、≥20wt％、≥30wt％、≥40wt％、≥50wt％、≥60wt％、≥70wt％、≥80wt％、≥90wt％、≥95wt％、≥98wt％、≥99wt％，或99.5wt％，按药物组合物总重量计。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂(如注射液或粉针剂)、口服制剂(如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液或酊剂)，更佳地，所述剂型为口服制剂。

在另一优选例中，所述治疗包括降低自闭症行为缺陷的严重程度和/或缩短自闭症行为缺陷的持续时间。

在另一优选例中，所述自闭症行为缺陷选自下组：社交行为障碍、言语交流能力下降、兴趣狭窄、重复刻板行为、愤怒、焦虑，或其组合。

在另一优选例中，所述自闭症为NR2F1基因点突变导致的自闭症。

在另一优选例中，所述自闭症为为NR2F1-R112K点突变导致的自闭症。

在另一优选例中，所述自闭症为自闭症为兴奋性神经元数目减少和/或神经传导活性降低且抑制性神经元神经数目增多和/或神经传导活性增强导致的自闭症。

本发明第二方面，提供了一种治疗自闭症的药物组合物，所述药物组合物包括：

(a)治疗有效剂量的Hedgehog信号通路抑制剂；和

(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，Hedgehog信号通路抑制剂的含量为≥1wt％，较佳地，≥wt 5％、≥10wt％、≥20wt％、≥30wt％、≥40wt％、≥50wt％、≥60wt％、≥70wt％、≥80wt％、≥90wt％、≥95wt％、≥98wt％、≥99wt％，或99.5wt％，按药物组合物总重量计。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：液体制剂(如溶液、乳液、悬浮液)、固体制剂(如冻干制剂)。

在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：注射剂(如注射液或粉针剂)、口服制剂(如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆、口服液或酊剂)，更佳地，所述剂型为口服制剂。

本发明第三方面，提供了一种治疗自闭症的方法，包括步骤：给有需要的对象施用治疗有效量的种Hedgehog信号通路抑制剂。

在另一优选例中，所述对象为哺乳动物。

在另一优选例中，所述对象为人、大鼠或小鼠。

在另一优选例中，所述对象携带NR2F1基因点突变。

在另一优选例中，所述对象携带NR2F1-R112K点突变。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为不同基因型小鼠的数目统计结果。

图2为针对怀孕后12.5天(E12.5)的小鼠大脑进行qPCR实验分析后的结果。

图3-4为针对出生后2个月的小鼠大脑皮层进行免疫染色的结果。

图5为微小兴奋电位突触电流(mEPSC)的示意图(A)和统计结果(B)，和微小抑制电位突触电流(mIPSC)的示意图(C)和统计结果(D)。

图6为野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠进行第一轮三箱实验(Sociabilitytest)的示意图(A)和统计结果(B)。

图7为野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠进行第二轮三箱实验(Socialnovelty test)的示意图(A)和统计结果(B)。

图8为野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠进行Y迷宫实验(Y-maze test)后的统计结果，实验统计小鼠连续进入不同实验臂的变化率(Alteration％)来测试其空间记忆能力。

图9为野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠进行自捋毛实验(Self-groomingtest)后的统计结果，统计野生型和杂合突变型小鼠的自捋毛行为的时间。

图10为野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠进行高架十字实验(Elevtaed-plusmaze)后的统计结果。

图11为维莫德吉的给药方法。

图12为给药后野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠在三箱实验中(Sociabilityand social novelty test)的行为统计结果，其中安慰剂组为喂食药物载体(Vehicle)组，药物组为喂食维莫德吉组。

图13为给药后野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠在自捋毛实验(Self-grooming test)中的行为统计结果；其中安慰剂组为喂食药物载体组(Vehicle)，药物组为喂食维莫德吉组。

图14为给药后野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠在Y迷宫实验(Y maze test)中的变化率(Alternation％)统计结果；其中安慰剂组为喂食药物载体组，药物组为喂食维莫德吉组。

图15为给药后野生型(+/+)和杂合点突变(+/m)小鼠在高架十字实验中(Elevated-plus maze)的行为统计结果；V其中安慰剂组为喂食药物载体组，药物组为喂食维莫德吉组。

各图中，+/+指野生型小鼠；+/m指杂合突变型小鼠。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，首次发现通过抑制Hedgehog信号通路能够治疗自闭症，并且实验验证了Hedgehog信号通路抑制剂能够明显改善自闭症行为缺陷，能够用于制备治疗自闭症的药物。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

除非另有表述，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C1-6表示1-6个碳)。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。

除非另有表述，术语"烷氧基"或“烷基氧基”、"烷氨基""或“烷基氨基”和"烷硫基"或“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，指代分别经氧原子、氨基或硫原子连接于分子的其余部分的那些烷基。此外，对于二烷基氨基，烷基部分可以相同或不同，也可和与各烷基相连的氮原子组合形成3-7元环。

除非另有表述，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”等术语表示包括单卤代烷基或多卤代烷基。例如，术语“C_1-4卤代烷基”表示包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有表述，术语“芳基”或“芳环”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基(或环)，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多三环)。术语"杂芳基"或“杂芳环”是指含有1至5个选自N、O、和S的杂原子的芳基(或环)，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(双环、最多三环)其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基(benzotriazin基)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基(isobenzofur基)、异吲哚基、中氮茚基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等等。

如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

本发明的某些化合物拥有不对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(例如，分离的对映体)均应包括在本发明范围内。当本文提供的化合物具有确定的立体化学(表示为R或S，或具有虚线或楔形键指明)时，被本领域技术人员将理解那些化合物为基本上不含其他异构体(例如至少80％，90％，95％，98％，99％和至多100％不含其他异构体)。

术语“本发明的抑制剂”、“本发明的化合物”、“本发明的抑制剂化合物”、“Hedgehog信号通路抑制剂”和“Hedgehog信号通路抑制剂化合物”可互换使用，指本发明的Hedgehog信号通路抑制剂。

本发明所述的“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除、消退疾病，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能，并不需要100％抑制、消灭和逆转。

如本文所用，术语“杂合突变型小鼠”和“突变型小鼠”可互换使用，指本发明的携带NR2F1基因点突变的杂合突变模型小鼠。

如本文所用，术语“本发明化合物”指Hedgehog信号通路抑制剂。

Hedgehog信号通路

Hedgehog基因是一种分节极性基因，因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。Hedgehog信号传递受靶细胞膜上抑制型受体Patched(Ptc)和激活型受体Smoothened(Smo)的控制。在正常情况下，Ptc抑制Smo蛋白活性，从而抑制下游通路，这时下游的Gli蛋白在蛋白酶体(Proteasome)内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。当Ptc和Hedgehog结合以后，解除对Smo的抑制作用，促使Gli蛋白与PKA及一些未知因子与微管形成大分子复合物，使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。

Hedgehog信号通路抑制剂

如本文所用，“Hedgehog信号通路抑制剂”是指能降低Hedgehog信号通路活性或阻断Hedgehog信号通路的物质。

本发明的Hedgehog信号通路抑制剂对Hedgehog信号通路的抑制包括可逆性抑制或不可逆性抑制。

典型地，所述Hedgehog信号通路抑制剂选自下组：小分子化合物、核酸或蛋白质。

优选地，所述Hedgehog信号通路抑制剂包括(但并不限于)：CN101072755A、CN104003990B、CN104177363B、CN103992311B等专利中公开的具有抑制Hedgehog信号通路作用的化合物。

更优选地，所述Hedgehog信号通路抑制剂为具有式Ib’结构的化合物，或其药学上可接受的盐，

其中，环B、X、R₃、R₆、R₈、o和m如上定义。

在另一优选例中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为维莫德吉(Vismodegib)，或其药学上可接受的盐。

本发明的Hedgehog信号通路抑制剂可通过商业途径购买或者利用市售原料，或通过现有技术中合成方法合成。

在本发明中，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：甲苯磺酸、盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐，适合形成盐的碱包括但并不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等无机碱，氨水、三乙胺、二乙胺等有机碱。

本发明的抑制剂可以以无定形、晶型或它们的混合物形式使用。

药物组合物、用途

本发明的药物组合物包括：(a)治疗有效剂量的Hedgehog信号通路抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。

本发明的药物组合物能够改善/缓解自闭症。尤其是缓解自闭症行为缺陷，典型地，所述行为缺陷包括(但并不限于)：社交行为障碍、言语交流能力下降、重复刻板行为、愤怒、焦虑，或其组合。

如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。本发明药物的“治疗有效剂量”也包括“预防有效剂量”，“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

在某些实施方式中，本发明的Hedgehog信号通路抑制剂在相同或分开的制剂中与作为联合治疗方案的部分的其它试剂同时使用，或与所述其它试剂依次使用。

本发明的Hedgehog信号通路抑制剂或药物组合物的治疗有效剂量的一般范围将是：约1-2000mg/天、约10-约1000mg/天、约10-约500mg/天、约10-约250mg/天、约10-约100mg/天，或约10-约50mg/天。治疗有效剂量将以一个或多个剂量给予。然而，应理解，对于任何特定患者的本发明化合物的特定剂量将取决于多种因素，例如，待治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况、饮食、个体响应，给予时间、待治疗的疾病的严重性、施用的具体化合物的活性、剂型、应用模式和伴用药物。给定情况的治疗有效量能用常规实验测定，并在临床医生或医师能力和判断范围内。在任何情况中，所述化合物或组合物将基于患者的个体情况以多个剂量给予并以允许递送治疗有效量的方式给予。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次发现通过抑制Hedgehog信号通路能够治疗自闭症，并且实验验证了Hedgehog信号通路抑制剂能够改善自闭症行为缺陷，能够用于制备治疗自闭症的药物。

2.本发明为治疗自闭症提供了新的治疗思路，使得已知Hedgehog信号通路抑制剂化合物都可作为治疗自闭症的候选药物，对快速、节约的开发治疗自闭症的药物来说具有重要意义。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

2.实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1小鼠

野生型C57BL/6小鼠由购自斯莱克实验动物中心的2对种鼠在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所实验动物中心繁殖。至本实验开始时，野生型与突变型小鼠在中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所实验动物中心繁殖传代超过5代，饲养环境保持12:12h的昼夜节律，温度保持20-24摄氏度，空气湿度约50-60％，动物饲养于刨花垫料的(28*12*16)cm3的标准树脂鼠笼中，足量自由摄取水和饲料。动物饲养以及所有实验操作均遵循中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所实验动物伦理委员会的相关规定。

2.1.2试剂

Pregnant mare serum gonadotropin(PMSG；宁波三生药业)；

氯化钠注射液(山东华鲁制药有限公司)；

Chorionic Gonadotropin for injection(HCG；宁波三生药业)；

兔源多抗：

Cux1(1:25,Santa Cruz Inc.)；

Ctip2(1:200,Abcam)；

PV(1:4000,Abcam)；

SST(1:4000,a gift from Penisula lab)；

Gad1(1:200,Sigma)；

Cy3-偶联的羊抗小鼠IgG(1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories)；

Cy3-偶联的羊抗兔IgG(1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories)；

FITC-偶联的羊抗小鼠IgG(1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories)；

FITC-偶联的羊抗兔IgG(1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories)；

其他免疫相关试剂:

多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA储液：10％in 1×PBS，终浓度：4％)；正常羊血清(normal goat serum，NGS，Gibco)；正常小鼠IgG(normal mouse IgG，Santa Cruz)；正常兔IgG(normal rabbit IgG，Santa Cruz)；DAPI(Sigma，储液：5mg/ml，终浓度：1μg/ml-2μg/ml，可反复使用)；封片剂Mowil购自Calbiochem；OCT冰冻切片包埋剂购自Leica公司。ProteinA、ProteinG PLUS Agarose(Santa Cruz)；Dynabeads Protein A/G(Invitrogen)；Protein A/G Agarose/Salmon Sperm DNA(Upstate).

维莫德吉购自美国LC laboratories，浓度为>99％。

维莫德吉(Vismodegib)。

2.1.3仪器

Biorad PTC-100/S1000PCR仪，ABI 2720PCR仪，Eppendorf Realplex2定量PCR仪，Beckman DU650紫外分光光度计，BioRad Pac 3000电泳仪，UVP M26紫外照胶仪，SONY DP71热敏打印机，Eppendorf 5417冷冻离心机，Thermo Pico17室温离心机，Beckman Avanti J-E JSE 07B10大型冷冻离心机，Beckman L-100K超速冷冻离心机，BayGene小型离心机，Mettler Toledo PH计，Eppendorf MixMate振荡器，Thermo-Forma-80℃冰箱、细胞培养箱及ClassII生物安全柜，苏静安泰细胞培养超静台，Aria流式细胞分选仪，Olympus BX51/IX71荧光显微镜，Olympus SZX10/16体式显微镜，BioRad Radiance 2100倒置激光共聚焦显微镜，Leica SP2正置激光共聚焦显微镜，Turner Design 2020型Lumimetor，LeicaCM1900冰冻切片机，三星16℃恒温酒柜，BioRad Pac basic和Tanon EPS300电泳仪、电泳转膜装置，上海一恒恒温生化培养箱，太仓华利达HZ-9210K恒温摇床，DGX-9023和9140鼓风干燥器，WH-986静音混合器、ZD9550和ZD9556摇床，上海Anke TDL-4DB室温离心机,比利时Diagenode公司的Bioruptor UCD-200非接触式全自动超声波破碎仪。

2.2实验方法

2.2.1NR2F1基因突变小鼠的构建与鉴定

1.实验开始前2天下午约5点钟向三周大小的C57BL/6野生型雌鼠腹腔注射0.08ml孕马血清促性腺激素。

2.实验开始当天下午约5点钟向上述C57BL/6野生型雌鼠腹腔再次注射0.08ml人绒毛膜促性腺激素，并将其与三周大小的C57BL/6野生型雄鼠合笼进行交配。

3.实验结束第二天上午对雌鼠进行检栓，挑出见栓雌鼠备用。

4.实验结束第二天下午使用颈椎脱臼法处死见栓雌鼠，取其体内受精卵备用。

5.使用injection buffer(10mM Tris-HCl,pH 7.4,0.25mM EDTA)稀释混合Cas9mRNA、sgRNA和donor oligos，浓度分别为50、50和100ng/uL。

6.通过胞浆注射仪将上述液体注入受精卵中。

7.将注射完的受精卵在二氧化碳培养箱中培养到第二天中午，培养条件是37摄氏度，5％CO₂；

8.将胚胎用玻璃针移植到0.5dpc的假孕ICR受体的输卵管中。

9.取P10左右小鼠，剪取尾尖组织，抽提DNA PCR鉴定基因型。

2.2.2小鼠行为学实验：

2.2.2.1高架十字迷宫实验

利用老鼠在新环境中喜爱探究的特性和对高处开臂上的恐高形成矛盾冲突的行为来考察小鼠的相关焦虑状态。为了提高小鼠入臂总次数，避免其躲在闭合臂中，通常将动物放置在空旷的环境中活动5min再放入迷宫。同样将小鼠在实验开始一小时前放入放有高架实验装置的房间中适应环境，开红光，保持室温25摄氏度。实验开始，将小鼠托入手心，面向闭合臂放置在十字的正中间，并迅速离开此房间，然后另一人在另一房间开始录像追踪小鼠的活动踪迹，过程中会统计实验小鼠进入开放、进入闭合臂的次数，分别在开放臂停留和在闭合臂停留的时间；整个过程记录5min后停止实验，轻抚小鼠，将其放回到鼠笼中，用70％的酒精清洗高架十字台，进行下一只小鼠的实验。

2.2.2.2三箱实验

a.实验人员A于实验前一小时进入行为室，将放于隔壁房间的实验小鼠拿出一笼(四只)放于行为室1hour，同时将实验中所需要的两只小鼠(注意此处用的小鼠和实验小鼠不能为同窝，同时性别要相同)也放于行为室1hour。开启灯光，让其适应环境；

b.实验人员A在实验前半小时左右开始清洗实验所用的三箱设备，将30％的酒精喷在三箱各个地方，再用白布轻轻擦拭，擦拭完成后再用一块新的干净的白布擦干。然后清洗两个笼子和两个物体。并将用于遮拦人员与实验区域的遮布搭起。

c.于此同时，实验人员B开始调试电脑操作软件：打开三箱实验程序，确认三箱的位置是否与软件所划分的位置重合，如不重合，请协助实验人员A调整好；设定实验动物编号及实验方法，具体操作是点击程序左上方“实验”，选择“动物”开始设定实验人员、实验内容、实验时间、实验对象以及编号；选择“方法”开始设定实验时长以及是否延迟(通常有两人做实验不需要延迟)。同时需要开始一次预实验，看是否录像设备正常及是否会存储实验数据。

d.一切准备就绪后，实验第一回合，由实验人员A将2号及3号区域放入相同的物体，如瓶盖等。将1和2、1和3之间的通道关闭。将第一只实验小鼠轻轻抓其尾巴，放于实验人员A的手臂袖子上大概1min左右，熟悉实验人员味道。然后将小鼠轻轻放于区域1，让其熟悉实验环境，此步时长5min。

e.5min后，准备开始实验，由实验人员A双手各负责一侧之间通道，与此同时，实验人员B点击准备实验，将“自动开始”取消，“准备实验”点击完成后，A和B配合，当A将两侧通道打开时，B立即点击“开始实验”(但要等到实验人员A的手离开摄像区域)。实验时长10min，软件将记录小鼠在每个区域所逗留的时间以及距离等数据。这时实验人员A应退回到人员活动区域，轻轻将帘子拉上。

f.10min后，软件会自动停止实验，这时由实验人员A将小鼠轻轻引导至区域1中，关闭两侧通道。轻轻将小鼠提起放于手臂袖子上将其转移到一个事先准备好的空笼中，待用。

g.由实验人员A清洗实验设备，将30％的酒精喷在三箱各个地方，再用白布轻轻擦拭，擦拭完成后再用一块新的干净的白布擦干。

h.清洗完成后，将2号区域的物体换为一只小鼠，3号区域不变。开始第二回合，将实验鼠轻轻转移到1号区域，步骤同第一回合。时长10min。

i.第二回合结束后，处理方法同第6步，清洗设备同第7步，清洗完成后，2号区域的小鼠不用移动，将3号区域的物体换成另一只老鼠。开始第三回合，将实验鼠轻轻转移到1号区域，步骤同第一回合。时长10min。

j.第三回合结束后，即完成了一只实验鼠的全部实验，将小鼠放回笼中，清洗设备，开始下一只实验。每只小鼠实验所需时间约50min。

2.2.2.3自捋毛实验

将实验小鼠放置于饲养笼中，底部铺满饲料，高度不超过1cm。记录10min内小鼠进行捋毛行为的时间。捋毛的位置包括面部，头部，颈部，耳部等。

2.2.2.4 Y型迷宫实验

将实验小鼠放置于Y型迷宫中，记录8min内小鼠进入Y型迷宫三个臂的次数和顺序。连续进入3个不同臂被视为1次有效进臂。有效进臂率＝有效进臂次数/(总进臂次数-2)％。

2.2.3小鼠脑组织的获取和脑片染色

(1)小鼠脑组织的获取及固定

a.一支针管吸满1×PBS，另一支吸4％PFA固定液(4℃)，搁置待用。

b.注射约180-200μl 4％的水合氯醛将小鼠麻醉。待小鼠不动后，立刻背朝下，腹部向上放平小鼠，并将四肢用钉子固定在白色泡沫平板上。小心剖开胸腔防止过多出血，小心并迅速切开肋骨，剪去横隔膜，暴露心脏。

c.小心将吸有1×PBS的针管刺入左心室，剖开右心室排液。缓慢但持续将1×PBS灌入心脏(如图3，灌流正常，血液丰富器官，如肝脏，脾脏和肾脏将转呈灰白色)。

d.当多数血液已流出后，拨去1×PBS的针管将吸有4％PFA固定液的针管插入左心室同一进针处，以20ml固定液缓慢灌流小鼠。

e.灌流结束后，用手术剪沿着头骨的中线将头骨剥开，暴露出大脑，然后用镊子在脑干的部位插入，小心翼翼的将脑组织完整的取下，放入盛有4％PFA固定液的做好标记的15ml corning管中，于4℃过夜。

f.第二天将4％PFA弃掉，用PBS洗2次，换成20％的蔗糖溶液，放于4℃冰箱中，待小鼠脑组织沉到底部既可用于切片及染色实验。

(2)小鼠脑组织的切片

a.将小鼠脑组织从蔗糖中取出，用吸水纸将表面的蔗糖溶液吸净，用刀片将嗅球和小脑部分切除，只保留完整的大脑部分，并且切除部位要平整，以便小鼠脑组织可以垂直立在冰切的底座上。

b.在冰切的底座上涂抹一些OTC包埋剂，然后将小鼠脑组织垂直立在上面，放到-80℃冰箱中，30min左右后小鼠脑组织已经冻实且稳固在底座上就可以用于冰切。

c.将冻好的小鼠脑组织背面向上腹面向下安放在冰切机上，调整冰切机，切片厚度在15mm左右，切除靠近嗅球部分的大部分脑组织，待切到海马开始出现的时候，就可以收集脑片了。收集的时候要保持脑片的平整。切到海马开始向下弯曲的时候就可以结束冰切。收集所有脑片于-20℃冰箱保存。

(3)脑片染色

a.从冰箱中取出切片，在室温放置10min,使切片上的水汽晾干。

b.在1×PBS中浸泡10min，使℃T溶解在1×PBS中，然后在洗两次，每次5min。

c.用70％的甲酸(7ml甲酸+3mlH₂O)浸泡脑片20min。

d.用1×PBS洗脑片3次，每次5min。

e.用100μl含0.3％Triton X-100的1×PBS覆盖脑片20min。

f.在玻片上均匀滴加100μl含0.3％Triton X-100，0.5％NGS，5％BSA的封闭液，在玻片上盖一个parafilm膜，使封闭液分布均匀，室温封闭1hr。在接下来的一抗、二抗孵育过程中也以parafilm膜覆之。

g.加上100μl一抗(按适宜比例配于封闭液中)，置于湿盒中，室温作用3h或4℃过夜。PBS洗3次，每次10min。

h.加上100μl荧光二抗，置于湿盒中，室温避光放置2h。PBS洗3次，每次10min。

i.加上100μl DAPI(1：3000，用去离子水稀释)，室温2-5min，PBS洗2次，每次5min。

j.用封片剂Mowoil封上盖玻片，避免气泡，在室温避光晾干后于荧光镜下观察。制好的片子在4℃避光保存。

2.2.4逆转录PCR

(1)细胞总RNA的抽提(参考Trizol(Invitrogen)提供的方法)

a.细胞样品吸去培液，用PBS洗一次，吸去后加入1ml Trizol，室温放置10min。

转移到1.5ml RNase-free的离心管中，Vortex混匀，加入200μl RNase-free氯仿，用力混匀，室温放置5min。

b.12,000g，4℃离心15min。吸取上清(约400μl)，加入等体积异丙醇，室温放置10min。

c.12,000g，4℃离心10min。弃上清，加入1ml 80％乙醇-DEPC洗盐(可冻于-80℃长期保存)。

d.7500g，4℃离心5min，弃上清，晾干至无酒精味。

e.加20-40μl的nuclease-free(NF)水溶解RNA，取2μl稀释100倍，通过OD260/280进行定量。

(2)反转录RNA并扩增(RT-PCR)(参考SuperScript RTIII(Invitrogen)提供的方法)

a.取5μg RNA，加1μl random primer(Takara)，加NF水补至12μl。在65℃变性5min，取出冰浴5min。

b.加入4μl 5*first strand buffer，2μl DTT，1μl 10mM dNTP，1μlSuperScriptIII RNase H逆转录酶(Invitrogen)，按下列程序反应：25℃，10min；50℃，60min；70℃，10min。

c.反应后将RT产物稀释至200μl，分装后-20℃保存备用。PCR反应考察看家基因GAPDH的表达验证RT效果。

2.2.5定量PCR反应(Q-PCR)

反应体系(20μl):

2×Taq Mixture:10μl；Evagreen:0.5μl；20μM primer(5’+3’):1μl；cDNAtemplate:2μl；双蒸水:6.5μl.

反应条件:

定量PCR实验注意事项：

为了尽可能减少反应间的误差，PCR采用20μl的反应体系；并减少加样过程中的操作，如除模板外其他试剂可先混合配成Mixture然后分装。每次qPCR操作最好控制在30min内，如果有耽误，应置于冰上防止酶与试剂失活。

加样时保持一致性，避免样品、试剂的损失和差异；PCR管避免因标记或者其他接触的污染，从而影响荧光读取。

根据实验需要而选择采用合适的荧光化学方法，主要为DNA结合染料(SYBR GreenI和Evagreen)和荧光染料标记的序列特异性引物或探针，前者适合低通量、单重实验，对于高通量实验后者更加合适。

每对用于定量PCR反应的引物，应先通过溶解曲线(melting curve)测定考察其扩增专一性，并可根据计算得到的Tm值，在上下一定范围内进行温度梯度PCR，检测在何种退火温度下CT值最小从而确定反应的退火温度。

所用引物的扩增产物应该在100bp左右，不要超过200bp；并且尽量避免会产生引物二聚体，如果无法避免，而且其扩增产物的溶解曲线温度高于延伸温度，则可以将读板温度设定在两者之间，从而去除引物二聚体对于CT值读取的影响。

每次反应都应设看家基因为对照(本实验中以GAPDH为对照)，针对每个实验组的目标和参照基因需做2-3个重复，重复间的CT值相差不应大于0.5。

为了使反应充分可以达到荧光定量，PCR设置40个或以上循环；保证cDNA样品浓度不能偏低，否则目标基因的CT值偏大且重复间差异增大，可以考虑增加模板浓度或者加样量改善。

定量PCR结果分析方法

采用以参照基因为标准而进行的相对定量，即2-ΔΔCT法，定义实验样本的目标基因和参照基因的CT值分别为：CT(TARGET,TEST)和CT(REF,TEST)，而校准样本的为：CT(TARGET,CAL)和CT(REF,CAL)，则计算步骤如下：

对所有的实验样本和校准样本，用参照基因的CT值归一目标基因的CT值：

ΔCT(TEST)＝CT(TARGET,TEST)-CT(REF,TEST)

ΔCT(CAL)＝CT(TARGET,CAL)-CT(REF,CAL)

用校准样本的ΔCT值归一实验样本的ΔCT值：

ΔΔCT＝ΔCT(TEST)-ΔCT(CAL)

计算目标基因在实验样本和校准样本间的表达水平比率：

2-ΔΔCT＝表达量的比值

实施例1

3.1建立携带NR2F1基因点突变的小鼠模型

为了研究NR2F1基因点突变在体内的作用和机制，利用CRISPR/Cas9系统对于C57BL/6背景的小鼠进行基因编辑。通过直接向受精卵里注射Cas9的mRNA和转录出来的sgRNA，得到了2只雄性Founder小鼠，经过鉴定，仅有第109位位点(对应人的NR2F1的第112位位点)发生了突变(由Arg突变为Lys)，而且都是杂合突变。对可能的脱靶位点也进行了测序，没有发现明显的脱靶现象。选取了1只雄性Founder小鼠，提取其精子，使与野生型雌鼠的卵子受精，然后注射回代孕母鼠子宫内，从而得到F1代，将F1代中的杂合子挑出进行交配，通过对F2代的观察和统计，如图1所示。

一共收取3批小鼠，共71只，对其基因型进行鉴定的统计结果；Nr2f1^+/+，野生型小鼠；Nr2f1^+/m，杂合突变型小鼠；Nr2f1^m/m，纯合突变型小鼠。

其中野生型小鼠共有26只，杂合突变型小鼠共有45只，纯合点突变型小鼠共有0只。在出生后的P0天很难得到纯合突变型小鼠(m/m)，而杂合突变的小鼠(+/m)与野生型小鼠(+/+)的比例接近于2:1，符合孟德尔遗传定律。这暗示纯合点突变的小鼠在出生后很难存活，与NR2F1基因缺失突变型小鼠类似。

实施例2

3.2出生前杂合突变型小鼠大脑中Hedgehog信号通路标志物的检测

首先对出生前小鼠(E12.5，怀孕后12.5天)的大脑中Hedgehog信号通路的标志物的表达水平进行检测。结果如图2所示。

通过qPCR实验，发现与野生型小鼠相比，Hedgehog信号通路的抑制型转录因子-Gli3的表达量在杂合突变型小鼠的大脑中显著性降低；而Hedgehog信号通路的激活型转录因子-Gli1和Shh的表达量在杂合突变型小鼠的大脑中显著性上升，这些结果显示，Hedgehog信号通路在杂合突变型小鼠大脑中被特异性激活。

实施例3

3.3杂合突变型小鼠的大脑形态学分析

收取2个月的野生型和杂合突变型小鼠的大脑，对大脑皮层进行剥离，切片染色，染色结果如图3-4。图3中，Cux1(A)和Ctip2(B)是兴奋性神经元的标志物，免疫染色的结果显示，杂合突变型小鼠的大脑皮层中兴奋性神经元的数目减少(C)。图4中，GAD1(A),PV(B)和SST(C)是抑制性神经元的标志物，免疫染色统计的结果显示，杂合突变型小鼠的大脑皮层中抑制性神经元的数目增多(D)。

从上述结果可以看出，突变型小鼠的大脑浅层皮层中兴奋性投射神经元的数目减少，而抑制性中间神经元的数目增多。显然，杂合点突变型小鼠皮层中兴奋性/抑制性神经元的比例失衡。

实施例4

3.4杂合突变型小鼠的电生理检查

从实施例4发现点突变型小鼠大脑皮层中兴奋性神经元的数目减少以及抑制性神经元的数目增多，接下来检测兴奋性与抑制性神经元的神经传导活性。微小兴奋电位突触电流(mEPSC)的示意图和统计结果(A，B)如图5，可以看出突变型小鼠大脑皮层中兴奋性神经元的神经传导活性显著性低于野生型小鼠；而抑制性神经元的神经传导活性显著性高于野生型小鼠。

实施例5

3.5杂合突变型小鼠的行为学研究

称野生型小鼠为+/+,而杂合突变型小鼠为+/m。选取了三箱实验，Y迷宫实验，自捋毛实验和高架十字实验来检测小鼠的行为学特征。

三箱实验主要检测小鼠的社交能力。实验仪器是透明的三个箱子，箱子连在一起，中间有可控的闸门。预实验将实验小鼠放在中间一个箱子里，并且将两边箱子的闸门打开，让小鼠可以运动到两边箱子里，熟悉环境。正式实验分为2个回合，第一回合是将实验小鼠放在中间箱子里，一边箱子里放一个陌生的静止的物体，另一边箱子里放一只陌生小鼠，这只小鼠与实验小鼠同性别，年龄相仿，而且不能是同窝。将闸门打开后，记录实验小鼠在两个箱子里所呆的时间，正常小鼠更喜欢与同类生物交流，而并未在自闭症小鼠身上发现这种偏好性，如图6，实验小鼠与同类相处的时间与社交能力呈正比。杂合突变型小鼠与同类小鼠相处的时间显著少于野生型小鼠，说明杂合突变型小鼠的社交能力受损。

第二回合是将实验小鼠放在中间箱子里，原先放置静止物体的箱子里放一只全新的陌生小鼠，这只小鼠与实验小鼠同性别，年龄相仿，而且不能是同窝；原来放置同类小鼠的箱子里仍然放熟悉的小鼠。野生型小鼠虽然可以和熟悉小鼠沟通，但更喜欢和陌生小鼠产生更多的沟通；而并未在自闭症小鼠身上发现这种偏好性，如图7，实验小鼠与陌生同类相处的时间与社交能力呈正比。杂合突变型小鼠与陌生小鼠相处的时间显著少于野生型小鼠，说明杂合突变型小鼠的社交能力受损。

然后，通过Y迷宫检测小鼠的重复刻板行为。实验的仪器是一个Y字型的闭合高架，将小鼠放入迷宫中，记录进臂次数和进臂顺序，只有连续进入不同的三个臂，才算一次有效得分。最后统计野生型和杂合突变型小鼠的变化率(有效进臂次数/总进臂次数)，变化率越高，证明其重复刻板行为越少。实验结果表明：杂合突变型小鼠的变化率要明显低于野生型，这说明杂合突变型小鼠有明显的重复刻板行为，如图8。

随后进行了自捋毛实验来检测重复刻板行为。实验发现，突变型小鼠的自捋毛行为明显，累计统计时间要显著性多于野生型小鼠，如图9。这说明，突变型小鼠拥有明显的重复刻板行为。

高架十字实验主要用来检测小鼠的焦虑行为。使用的仪器是十字形的架子，一半敞开，另一半封闭起来，正常小鼠虽然喜欢封闭的环境，但是好奇心的驱使会让它去探索敞开的空间，而焦虑小鼠更倾向于呆在封闭，安全的环境中。实验结果显示：杂合突变型小鼠呆在封闭臂里的时间要远远长于野生型小鼠，而野生型小鼠呆在开放臂里的时间要长于杂合突变型小鼠，如图10。这说明杂合突变型小鼠更加焦虑，倾向于呆在封闭安全的环境中，不喜欢探索新环境。

实施例6

在本实施例中，使用一种Hedgehog信号通路抑制剂维莫德吉(Vismodegib)来验证能否通过抑制Hedgehog信号通路缓解突变型小鼠的行为缺陷。

详细的给药方案如下：给药方式是灌胃处理，给药浓度为25mg/kg的维莫德吉，给药时间是出生后3-5周，给药频率是2天一次。在出生后8周开始检测小鼠行为学，维莫德吉的给药方法如图11。

首先，三箱实验发现，喂食维莫德吉的突变型小鼠与同类小鼠互动的时间显著性增加，但是与陌生小鼠的互动时间未出现显著性增加，如图12，这说明突变型小鼠的社交缺陷被部分缓解。

其次，通过自捋毛实验实验发现，喂食维莫德吉的突变型小鼠的自捋毛时间显著性减少，如图13，这说明突变型小鼠的重复刻板行为被部分缓解。

随后，通过Y迷宫实验发现，喂食维莫德吉后的突变型小鼠，其有效进臂的变化率出现显著性增加，如图14，这个结果显示喂食维莫德吉后的突变型小鼠的重复刻板行为得到部分缓解。

最后，通过高架十字实验发现，喂食维莫德吉的突变型小鼠探索开放臂的时间显著性增加，如图15，这说明突变型小鼠的焦虑行为被部分缓解。

上述实验证明，通过抑制Hedgehog信号通路能够显著缓解突变型小鼠的行为缺陷，从而治疗自闭症，所以Hedgehog信号通路抑制剂可以作为治疗自闭症的候选药物。

讨论

2014年发表在The American Journal of Human Genetics的文章首次鉴定出与自闭症相关的NR2F1-R112K点突变，随后越来越多的研究发现大量自闭症病人的基因组携带NR2F1基因突变。

本发明建立了携带NR2F1-R112K突变的小鼠模型，前期在细胞水平对大量(约2000个)的转录因子表达量的监测，最终发现与Hedgehog信号通路相关的调控因子存在异常表达，并进一步通过小鼠实验，验证了在受孕后12.5天的突变型小鼠的大脑中Hedgehog信号通路的靶基因的表达上调，例如Gli1和Ptch1；而Hedgehog信号通路的负调控因子的表达下调，例如Gli3；从而首次发现并证实了Hedgehog信号通路被特异性激活与自闭症有关。

然后，采用Hedgehog信号通路抑制剂(如维莫德吉)来抑制突变型小鼠大脑中的Hedgehog信号通路，检验抑制Hedgehog信号通路能否治疗自闭症，实验证明，存在社交行为障碍、重复刻板行为和焦虑等自闭症行为障碍的突变型小鼠施用Hedgehog信号通路抑制剂后这些行为出现明显改善，证明了通过抑制Hedgehog信号通路治疗自闭症是可行的，也提示了Hedgehog信号通路抑制剂可作为治疗自闭症的候选药物。

本发明为自闭症的药物开发提供了新的思路，对实现自闭症精准医疗具有重要意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种Hedgehog信号通路抑制剂用于制备治疗自闭症的药物组合物的用途，其中，所述自闭症为NR2F1基因点突变导致的自闭症；

其中，所述Hedgehog信号通路抑制剂为维莫德吉(Vismodegib)，或其药学上可接受的盐

。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗包括降低自闭症行为缺陷的严重程度和/或缩短自闭症行为缺陷的持续时间。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述自闭症行为缺陷选自下组：社交行为障碍、重复刻板行为、焦虑，或其组合。

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