CN110215523A - 一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法，其检测步包括：小鼠腋下接种U14宫颈癌细胞，建立荷瘤小鼠模型，灌胃给药9d，观测肿瘤生长情况，计算抑瘤率；HE染色观察组织病理变化；测定肝、肾功能、血糖、血脂。甲基hispolon作用U14细胞株24h的IC50值为27.1μg/mL；作用48h的IC50值为18.5μg/mL。甲基hispolon高剂量（15mg/kg.d‑2）组显著降低移植瘤体积，抑瘤率为32.0%。血液生化指标分析显示，甲基hispolon对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇、葡萄糖、甘油三酯有明显的作用。结论：甲基hispolon能显著抑制肿瘤细胞的生长，但对器官组织没有明显的影响，治疗剂量下无明显毒副作用，体内外结果基本一致。探讨甲基hispolon对小鼠U14移植瘤的影响，为甲基hispolon的利用提供依据。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药理领域，特别涉及一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法。
背景技术
宫颈癌作为妇科常见恶性肿瘤之一，重威胁广大育龄妇女健康和生命的安全，宫颈癌发生率呈增加趋势和年轻化趋势，宫颈癌一度成为严肿瘤性疾病[11-12]。手术切除、放疗和化疗等是宫颈癌患者重要的治疗手段，但是宫颈癌患者对化疗药物容易产生抵抗性和耐受性[13]，在肿瘤治疗中，中药作为现在具有发展前景的药物[3]，积极探索在宫颈癌治疗中中药的价值具有重要的临床意义。
桑黄具有抗肿瘤、提高免疫功能、抗突变、抗氧化、保肝、抗炎、抗菌、降血糖、抗胃溃疡等多种药理活性[1-2]。特别是其良好的抗肿瘤作用，引起学者的广泛关注和深入研究[3]。多糖是抗肿瘤的活性成分[8]，且与传统抗肿瘤药物联用可起到协同效果 [9]。近年来的研究发现，除多糖类外，桑黄的其他提取物也表现出明显的抗肿瘤活性[9]。从桑黄中分离的有效成分hispolon具有很好的抗肿瘤作用[4]，对正常细胞低毒，具有良好的研究和开发利用前景[5-7]，因此得到广泛关注。但桑黄品种多，不同品种hispolon的含量差异大，有必要对其类似成分进行抗肿瘤作用研究。忍冬木层孔菌[Phellinus lonicerinus ( Bond. )Bond. et Sing ]是湖北等地习用的桑黄品种，也是土家族常用药[10]，因此，我们以忍冬木层孔菌为材料，分离得到甲基hispolon，观察甲基hispolon的抗肿瘤作用，为桑黄的进一步开发利用提供依据。
体内外实验表明甲基hispolon 对宫颈癌等妇科肿瘤具有抗癌作用，没有明显的毒副作用。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法。
本发明的技术解决方案：本发明的目的是要提供一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法，它不仅在治疗剂量下无明显毒副作用，对器官组织没有明显的影响，能显著抑制肿瘤细胞的生长，还对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇、葡萄糖、甘油三酯有明显的作用，甲基hispolon对抗宫颈癌作用机制有了进一步的认识。
为了达到上述目的，本发明的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法的操作如下：
（1）肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存。
（2）肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠，脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，以无菌注射器吸取乳白色腹水，以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL。以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤，于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL，常规饲养。接种5天后小鼠全部成瘤，随机分组给药。用药前，各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异。
（3）分组和给药 荷瘤小鼠30只，按体质量随机分为3组，每组10只。
每日灌胃给一次药，甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2，甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2，共9天。停药24h后处脱颈死裸鼠，分离瘤体称重。
（4）瘤体积的变化每组小鼠从给药后，隔日用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等。肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积（V），以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制移植瘤生长曲线。
（5）抑瘤率检测 末次给药24h后，称体重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠，称体质量，解剖剥离瘤块，称瘤质量。计算给药组肿瘤生长抑制率(%)。肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重）*100%
（6）脏器指数测定 将小鼠解剖，称取脾脏及胸腺质量，分别计算小鼠的脏器指数，脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/体重(ｇ)，
（7）血清生化指标测定取血，离心，取血清，按试剂盒说明书进行测定。
（8）组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10％甲醛溶液固定24ｈ，常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后，进行苏木素－伊红(hematoxylin -eosin HE)染色，于光学显微镜下进行病理形态学观察。
（9）统计学处理采用SPSS19.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析。结果以x±s表示，组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验。以P＜0.01为有显著性差异。
说明书附图
图1 甲基hispolon对U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用
图2 甲基hispolon对移植瘤小鼠肝组织的影响
图3 甲基hispolon对移植瘤小鼠肺组织的影响
图4 甲基hispolon对移植瘤小鼠肾组织的影响
图5 甲基hispolon对移植瘤小鼠心脏组织的影响
图6 甲基hispolon对移植瘤小鼠胸腺组织的影响
具体实施方式
材料与仪器
1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠，雌性，体重18-22g，由三峡大学实验动物中心提供，屏障系统，饮水、摄食、光照均符合《湖北省实验动物质量控制标准》，实验动物生产许可证号为SCXK(鄂)2017-0012，饲养于三峡大学动物中心SPF级动物实验室，昆明小鼠适应环境１周后即进行成瘤实验，实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2017-0061。
细胞株小鼠宫颈癌U14细胞株来自肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室（三峡大学）。
药物及试剂 DMEM干粉培养基、美国Gibco公司)；进口胎牛血清(美国Gibco公司)；二甲基亚砜(DMSO,天津市科密欧化学试剂有限公司)；噻唑蓝(MTT,美国Amresco公司)；胰蛋白酶。
主要仪器 ME215S十万分之一电子天平,德国Sartorios公司；SW-CJ-2ED超净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司；CO2 培养箱,美国SHELLJB;RM-220艾科浦超纯水系统,美国艾科浦国际有限公司；5415R小型台式高速冷冻离心机,德国艾本德股份公司；TDZ4-WS台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。
方法与指标
2.1 肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存。
肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠，脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，以无菌注射器吸取乳白色腹水，以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL。以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤，于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL，常规饲养。接种5天后小鼠全部成瘤，随机分组给药。用药前，各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异。
分组和给药 荷瘤小鼠30只，按体质量随机分为3组，每组10只。
每日灌胃给一次药，甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2，甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2，共9天。停药24h后处脱颈死裸鼠，分离瘤体称重。
瘤体积的变化每组小鼠从给药后，隔日用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等。肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积（V），以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制移植瘤生长曲线。
抑瘤率检测 末次给药24h后，称体重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠，称体质量，解剖剥离瘤块，称瘤质量。计算给药组肿瘤生长抑制率(%)。肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重）*100%
2.6 脏器指数测定 将小鼠解剖，称取脾脏及胸腺质量，分别计算小鼠的脏器指数，脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/体重(ｇ)，
2.7 血清生化指标测定取血，离心，取血清，按试剂盒说明书进行测定。
组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10％甲醛溶液固定24ｈ，常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后，进行苏木素－伊红(hematoxylin -eosin HE)染色，于光学显微镜下进行病理形态学观察。
统计学处理采用SPSS19.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析。结果以x±s表示，组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验。以P＜0.01为有显著性差异。
结果
3.1 甲基hispolon对U14细胞的抑瘤作用
如表1所示，药物作用24h和48h，甲基hispolon在 2.5-80μg/ml 浓度范围内对U14细胞的生长有显著抑制作用，作用24h的IC50值为 27.1μg/mL；作用48h的IC50值为18.5μg/mL。
表1 甲基hispolon作用24h和48h对U14细胞生长的作用(x±s,n=3)
| 组别 | 剂量(μg/mL) | 24h OD值 | 48 h OD值 |
| 空白组 | ---- | 0.976±0.017 | 0.963±0.019 |
| 甲基hispolon组 | 80 | 0.426±0.007<sup>**</sup> | 0.142±0.005<sup>**</sup> |
| 40 | 0.278±0.005<sup>**</sup> | 0.124±0.010<sup>**</sup> | |
| 20 | 0.471±0.022<sup>**</sup> | 0.218±0.018<sup>**</sup> | |
| 10 | 0.687±0.032<sup>**</sup> | 0.523±0.028<sup>**</sup> | |
| 5 | 0.804±0.034<sup>**</sup> | 0.798±0.084<sup>**</sup> | |
| 2.5 | 0.856±0.082<sup>**</sup> | 0.854±0.057<sup>**</sup> |
注：与空白组比较* P＜0.05，** P＜0.01
3.2 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用
如表2、3所示，用药前，各组小鼠体重、肿瘤体积无显著差异，用药3天后，与模型组相比，甲基hispolon高低剂量组(15mg/kg) 差异具有显著性。第10天处理小鼠称取瘤重，计算抑瘤率，甲基hispolon高剂量组的抑瘤率为50.9%，甲基hispolon低剂量组对肿瘤细胞生长抑制作用随时间延长而减弱。
表2 甲基hispolon对U14移植瘤生长的影响(x±s,n=10)
注：与模型组比较* P＜0.05，** P＜0.01
表3 甲基hispolon对U14移植瘤的抑制作用(x±s,n=10)
| 组别 | 体重 | 瘤重（g） | 抑瘤率（%） |
| 模型组 | 40.98±3.17 | 4.82±0.55 | |
| 甲基hispolon (15mg/kg) | 38.81±3.82 | 3.26±0.54<sup>**</sup> | 32 |
| 甲基hispolon (5mg/kg) | 38.56±1.77 | 4.42±0.22 | 8 |
注：与模型组比较* P＜0.05，** P＜0.01
3.3 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠脏器指数的影响
与模型组相比，甲基hispolon高剂量和低剂量组对脾脏、肝脏指数差异具有显著性，但是对小鼠的肾脏指数和胸腺指数无明显变化。
表4 甲基hispolon对移植瘤小鼠脏器指数的作用(x±s,n=10)
| 组别 | 脾脏指数 | 肝脏指数 | 胸腺指数 | 肾脏指数 | 子宫指数 |
| 模型组 | 1.32±0.47 | 8.52±1.86 | 0.25±0.11 | 1.24±0.10 | 0.62±0.28 |
| 甲基hispolon (15mg/kg) | 0.70±0.30<sup>**</sup> | 6.25±0.91<sup>**</sup> | 0.21±0.08 | 1.16±0.13 | 0.60±0.19 |
| 甲基hispolon (5mg/kg) | 0.72±0.30<sup>**</sup> | 4.11±1.44<sup>**</sup> | 0.23±0.05 | 1.18±0.13 | 0.67±0.13 |
注：与模型组比较* P＜0.05，** P＜0.01
3.4 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠组织结构病理学的影响
3.4.1 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肝组织的影响
如图2所示，在光学显微镜下观察(×10)，正常组、模型组和给药组，小鼠肝脏形态正常。肝表面光滑，边缘锐利，质地柔软；肝小叶结构完整，有肝小叶和汇管区，无炎症细胞浸润；肝组织细胞围绕中央静脉呈放射状有序排列，相邻肝板吻合连接成网状，肝细胞核圆，位于细胞中央，着色较浅，肝细胞无明显的脂肪变性、水肿、坏死等，排列整齐。
注：A：对照组；B：模型组；C：甲基hispolon高；D：甲基hispolon低
3.4.2 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肺组织的影响
如图3所示，在光学显微镜下观察(×10)，正常组、模型组和给药组肺组织形态正常。肺泡结构正常，肺泡腔大小一致，肺泡间质薄厚均匀清晰可见，支气管上皮完整，无明显炎症反应。
注：A：对照组；B：模型组；C：甲基hispolon高；D：甲基hispolon低
3.4.3 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肾组织的影响
如图4所示，在光学显微镜下观察(×10)，正常组、模型组和给药组肾组织形态正常。组织细胞排列紧密，肾小球清晰，管腔清晰，肾小管形态规则，无炎症浸润。
注：A：对照组；B：模型组；C：甲基hispolon高；D：甲基hispolon低
3.4.4 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠心脏组织的影响
如图5所示，在光学显微镜下观察(×10)，正常组、模型组和给药组心组织形态正常。心肌组织胞浆丰富而红染，胞核卵圆形，位于细胞中央，横纹清晰，间质少量血管及结缔组织；心肌细无胞变性、坏死、血管充血，局部无炎细胞浸润。
注：A：对照组；B：模型组；C：甲基hispolon高；D：甲基hispolon低
3.4.5 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠胸腺组织的影响
如图6所示，在光学显微镜下观察(×10)，在各组中，胸腺组织结构可见皮髓质分界清楚，皮质部染色较深的淋巴细胞密集，核呈紫蓝色，胞浆为淡红色，髓质部染色较浅的网状细胞较多，各组之间差异不明显。
注：A：对照组；B：模型组；C：甲基hispolon高D：甲基hispolon低
3.5 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠血清生化指标的影响
如表5所示，与空白组相比，模型组肝功能异常，应用甲基hispolon治疗之后，与模型组相比，肝功能好转。与空白组相比，模型组脂代谢紊乱，总胆固醇明显降低，甘油三酯明显升高，应用甲基hispolon治疗之后，与模型组相比，总胆固醇明显升高，甘油三酯明显降低，且与空白组相比没有明显的差异；与空白组相比，模型组和给药组葡萄糖均降低；甲基hispolon对肾功能基本没有影响。
表5 甲基hispolon对小鼠血液生化指标的影响(x ±s,n=10)
| 测定指标 | 空白 | 模型 | 甲基hispolon高剂量组 | 甲基hispolon低剂量组 |
| CRE(umol/L) | 15.50±1.44 | 15.25±0.76 | 16.06±0.25** | 16.13±0.15 |
| ALT(U/L) | 14.99±1.37 | 53.85±2.02<sup>##</sup> | 27.23±5.21<sup>**</sup> | 36.69±0.16<sup>**</sup> |
| AST(U/L) | 37.35±5.94 | 94.76±1.28<sup>##</sup> | 50.96±7.72<sup>**</sup> | 97.89±8.67 |
| T-CHO(mmol/L) | 3.26±0.01 | 2.63±0.14<sup>##</sup> | 3.01±0.03<sup>*</sup> | 3.13±0.23<sup>*</sup> |
| Glu(mmol/L) | 7.27±0.67 | 6.07±0.39<sup>#</sup> | 5.88±0.29 | 4.00±0.03<sup>**</sup> |
| HDL-C(mmol/L) | 4.01±0.14 | 3.19±0.01<sup>##</sup> | 2.83±0.06<sup>*</sup> | 3.28±0.07 |
| LDL-C(mmol/L) | 1.12±0.16 | 0.88±0.25 | 0.87±0.35 | 1.06±0.23 |
| TG(mmol/L) | 0.99±0.10 | 1.96±0.14<sup>##</sup> | 1.36±0.02<sup>*</sup> | 1.21±0.23<sup>**</sup> |
注：与空白组比较# P＜0.05，## P＜0.01；与模型组比较* P＜0.05，** P＜0.01。
Claims (3)
1.本发明公开一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法，其检测步骤包括：
a.）体内抑瘤实验；
b.）检测甲基hispolon对U14细胞的抑瘤作用；
c.）检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用；
d.）检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠脏器指数的影响；
e.）检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠组织结构病理学的影响；
f.）检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠血清生化指标的影响。
2.根据权利要求1所述的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法，其特征在于：所述步骤 a.）体内抑瘤实验按如下步骤进行：
（1）肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存；
（2）肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠，脱颈椎处死小鼠，消毒腹部皮肤，以无菌注射器吸取乳白色腹水，以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL；以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤，于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL，常规饲养；接种5天后小鼠全部成瘤，随机分组给药；用药前，各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异；
（3）分组和给药 荷瘤小鼠30只，按体质量随机分为3组，每组10只；每日灌胃给一次药，甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2，甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2，共9天；停药24h后处脱颈死裸鼠，分离瘤体称重；
（4）瘤体积的变化 每组小鼠从给药后，隔日用游标卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积；并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等；肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积（V），以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标，处理时间为横坐标，绘制移植瘤生长曲线；
（5）抑瘤率检测 末次给药24h后，称体重，摘眼球取血，脱颈处死小鼠，称体质量，解剖剥离瘤块，称瘤质量；计算给药组肿瘤生长抑制率(%)；肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重）*100%；
（6）脏器指数测定 将小鼠解剖，称取脾脏及胸腺质量，分别计算小鼠的脏器指数，脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/体重(ｇ)；
（7）血清生化指标测定 取血，离心，取血清，按试剂盒说明书进行测定；
（8）组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10％甲醛溶液固定24ｈ，常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后，进行苏木素－伊红(hematoxylin -eosin HE)染色，于光学显微镜下进行病理形态学观察；
（9）统计学处理 采用SPSS19.0统计软件对数据处理；先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析；结果以`x±s表示，组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验；以P＜0.01为有显著性差异。
3.根据权利要求1中a、b、c、d、e、f、所述的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法，其特征在于：甲基hispolon能显著抑制肿瘤细胞的生长，但对器官组织没有明显的影响，治疗剂量下无明显毒副作用，体内外结果基本一致。
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