CN110215523A - 一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法,其检测步包括:小鼠腋下接种U14宫颈癌细胞,建立荷瘤小鼠模型,灌胃给药9d,观测肿瘤生长情况,计算抑瘤率;HE染色观察组织病理变化;测定肝、肾功能、血糖、血脂。甲基hispolon作用U14细胞株24h的IC50值为27.1μg/mL;作用48h的IC50值为18.5μg/mL。甲基hispolon高剂量(15mg/kg.d‑2)组显著降低移植瘤体积,抑瘤率为32.0%。血液生化指标分析显示,甲基hispolon对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇、葡萄糖、甘油三酯有明显的作用。结论:甲基hispolon能显著抑制肿瘤细胞的生长,但对器官组织没有明显的影响,治疗剂量下无明显毒副作用,体内外结果基本一致。探讨甲基hispolon对小鼠U14移植瘤的影响,为甲基hispolon的利用提供依据。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药理领域,特别涉及一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法。
背景技术
宫颈癌作为妇科常见恶性肿瘤之一,重威胁广大育龄妇女健康和生命的安全,宫颈癌发生率呈增加趋势和年轻化趋势,宫颈癌一度成为严肿瘤性疾病[11-12]。手术切除、放疗和化疗等是宫颈癌患者重要的治疗手段,但是宫颈癌患者对化疗药物容易产生抵抗性和耐受性[13],在肿瘤治疗中,中药作为现在具有发展前景的药物[3],积极探索在宫颈癌治疗中中药的价值具有重要的临床意义。
桑黄具有抗肿瘤、提高免疫功能、抗突变、抗氧化、保肝、抗炎、抗菌、降血糖、抗胃溃疡等多种药理活性[1-2]。特别是其良好的抗肿瘤作用,引起学者的广泛关注和深入研究[3]。多糖是抗肿瘤的活性成分[8],且与传统抗肿瘤药物联用可起到协同效果 [9]。近年来的研究发现,除多糖类外,桑黄的其他提取物也表现出明显的抗肿瘤活性[9]。从桑黄中分离的有效成分hispolon具有很好的抗肿瘤作用[4],对正常细胞低毒,具有良好的研究和开发利用前景[5-7],因此得到广泛关注。但桑黄品种多,不同品种hispolon的含量差异大,有必要对其类似成分进行抗肿瘤作用研究。忍冬木层孔菌[Phellinus lonicerinus ( Bond. )Bond. et Sing ]是湖北等地习用的桑黄品种,也是土家族常用药[10],因此,我们以忍冬木层孔菌为材料,分离得到甲基hispolon,观察甲基hispolon的抗肿瘤作用,为桑黄的进一步开发利用提供依据。
体内外实验表明甲基hispolon 对宫颈癌等妇科肿瘤具有抗癌作用,没有明显的毒副作用。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的是提供一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法。
本发明的技术解决方案:本发明的目的是要提供一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法,它不仅在治疗剂量下无明显毒副作用,对器官组织没有明显的影响,能显著抑制肿瘤细胞的生长,还对谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆固醇、葡萄糖、甘油三酯有明显的作用,甲基hispolon对抗宫颈癌作用机制有了进一步的认识。
为了达到上述目的,本发明的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法的操作如下:
(1)肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存。
(2)肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠,脱颈椎处死小鼠,消毒腹部皮肤,以无菌注射器吸取乳白色腹水,以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL。以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤,于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL,常规饲养。接种5天后小鼠全部成瘤,随机分组给药。用药前,各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异。
(3)分组和给药 荷瘤小鼠30只,按体质量随机分为3组,每组10只。
每日灌胃给一次药,甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2,甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2,共9天。停药24h后处脱颈死裸鼠,分离瘤体称重。
(4)瘤体积的变化每组小鼠从给药后,隔日用游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等。肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积(V),以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标,处理时间为横坐标,绘制移植瘤生长曲线。
(5)抑瘤率检测 末次给药24h后,称体重,摘眼球取血,脱颈处死小鼠,称体质量,解剖剥离瘤块,称瘤质量。计算给药组肿瘤生长抑制率(%)。肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重)*100%
(6)脏器指数测定 将小鼠解剖,称取脾脏及胸腺质量,分别计算小鼠的脏器指数,脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/体重(g),
(7)血清生化指标测定取血,离心,取血清,按试剂盒说明书进行测定。
(8)组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10%甲醛溶液固定24h,常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后,进行苏木素-伊红(hematoxylin -eosin HE)染色,于光学显微镜下进行病理形态学观察。
(9)统计学处理采用SPSS19.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析。结果以x±s表示,组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验。以P<0.01为有显著性差异。
说明书附图
图1 甲基hispolon对U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用
图2 甲基hispolon对移植瘤小鼠肝组织的影响
图3 甲基hispolon对移植瘤小鼠肺组织的影响
图4 甲基hispolon对移植瘤小鼠肾组织的影响
图5 甲基hispolon对移植瘤小鼠心脏组织的影响
图6 甲基hispolon对移植瘤小鼠胸腺组织的影响
具体实施方式
材料与仪器
1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠,雌性,体重18-22g,由三峡大学实验动物中心提供,屏障系统,饮水、摄食、光照均符合《湖北省实验动物质量控制标准》,实验动物生产许可证号为SCXK(鄂)2017-0012,饲养于三峡大学动物中心SPF级动物实验室,昆明小鼠适应环境1周后即进行成瘤实验,实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2017-0061。
细胞株小鼠宫颈癌U14细胞株来自肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室(三峡大学)。
药物及试剂 DMEM干粉培养基、美国Gibco公司);进口胎牛血清(美国Gibco公司);二甲基亚砜(DMSO,天津市科密欧化学试剂有限公司);噻唑蓝(MTT,美国Amresco公司);胰蛋白酶。
主要仪器 ME215S十万分之一电子天平,德国Sartorios公司;SW-CJ-2ED超净工作台,天津市泰斯特仪器有限公司;CO2 培养箱,美国SHELLJB;RM-220艾科浦超纯水系统,美国艾科浦国际有限公司;5415R小型台式高速冷冻离心机,德国艾本德股份公司;TDZ4-WS台式低速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司。
方法与指标
2.1 肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存。
肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠,脱颈椎处死小鼠,消毒腹部皮肤,以无菌注射器吸取乳白色腹水,以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL。以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤,于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL,常规饲养。接种5天后小鼠全部成瘤,随机分组给药。用药前,各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异。
分组和给药 荷瘤小鼠30只,按体质量随机分为3组,每组10只。
每日灌胃给一次药,甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2,甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2,共9天。停药24h后处脱颈死裸鼠,分离瘤体称重。
瘤体积的变化每组小鼠从给药后,隔日用游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤体积。并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等。肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积(V),以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标,处理时间为横坐标,绘制移植瘤生长曲线。
抑瘤率检测 末次给药24h后,称体重,摘眼球取血,脱颈处死小鼠,称体质量,解剖剥离瘤块,称瘤质量。计算给药组肿瘤生长抑制率(%)。肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重)*100%
2.6 脏器指数测定 将小鼠解剖,称取脾脏及胸腺质量,分别计算小鼠的脏器指数,脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/体重(g),
2.7 血清生化指标测定取血,离心,取血清,按试剂盒说明书进行测定。
组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10%甲醛溶液固定24h,常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后,进行苏木素-伊红(hematoxylin -eosin HE)染色,于光学显微镜下进行病理形态学观察。
统计学处理采用SPSS19.0统计软件对数据处理。先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析。结果以x±s表示,组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验。以P<0.01为有显著性差异。
结果
3.1 甲基hispolon对U14细胞的抑瘤作用
如表1所示,药物作用24h和48h,甲基hispolon在 2.5-80μg/ml 浓度范围内对U14细胞的生长有显著抑制作用,作用24h的IC50值为 27.1μg/mL;作用48h的IC50值为18.5μg/mL。
表1 甲基hispolon作用24h和48h对U14细胞生长的作用(x±s,n=3)
组别 | 剂量(μg/mL) | 24h OD值 | 48 h OD值 |
空白组 | ---- | 0.976±0.017 | 0.963±0.019 |
甲基hispolon组 | 80 | 0.426±0.007<sup>**</sup> | 0.142±0.005<sup>**</sup> |
40 | 0.278±0.005<sup>**</sup> | 0.124±0.010<sup>**</sup> | |
20 | 0.471±0.022<sup>**</sup> | 0.218±0.018<sup>**</sup> | |
10 | 0.687±0.032<sup>**</sup> | 0.523±0.028<sup>**</sup> | |
5 | 0.804±0.034<sup>**</sup> | 0.798±0.084<sup>**</sup> | |
2.5 | 0.856±0.082<sup>**</sup> | 0.854±0.057<sup>**</sup> |
注:与空白组比较* P<0.05,** P<0.01
3.2 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用
如表2、3所示,用药前,各组小鼠体重、肿瘤体积无显著差异,用药3天后,与模型组相比,甲基hispolon高低剂量组(15mg/kg) 差异具有显著性。第10天处理小鼠称取瘤重,计算抑瘤率,甲基hispolon高剂量组的抑瘤率为50.9%,甲基hispolon低剂量组对肿瘤细胞生长抑制作用随时间延长而减弱。
表2 甲基hispolon对U14移植瘤生长的影响(x±s,n=10)
注:与模型组比较* P<0.05,** P<0.01
表3 甲基hispolon对U14移植瘤的抑制作用(x±s,n=10)
组别 | 体重 | 瘤重(g) | 抑瘤率(%) |
模型组 | 40.98±3.17 | 4.82±0.55 | |
甲基hispolon (15mg/kg) | 38.81±3.82 | 3.26±0.54<sup>**</sup> | 32 |
甲基hispolon (5mg/kg) | 38.56±1.77 | 4.42±0.22 | 8 |
注:与模型组比较* P<0.05,** P<0.01
3.3 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠脏器指数的影响
与模型组相比,甲基hispolon高剂量和低剂量组对脾脏、肝脏指数差异具有显著性,但是对小鼠的肾脏指数和胸腺指数无明显变化。
表4 甲基hispolon对移植瘤小鼠脏器指数的作用(x±s,n=10)
组别 | 脾脏指数 | 肝脏指数 | 胸腺指数 | 肾脏指数 | 子宫指数 |
模型组 | 1.32±0.47 | 8.52±1.86 | 0.25±0.11 | 1.24±0.10 | 0.62±0.28 |
甲基hispolon (15mg/kg) | 0.70±0.30<sup>**</sup> | 6.25±0.91<sup>**</sup> | 0.21±0.08 | 1.16±0.13 | 0.60±0.19 |
甲基hispolon (5mg/kg) | 0.72±0.30<sup>**</sup> | 4.11±1.44<sup>**</sup> | 0.23±0.05 | 1.18±0.13 | 0.67±0.13 |
注:与模型组比较* P<0.05,** P<0.01
3.4 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠组织结构病理学的影响
3.4.1 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肝组织的影响
如图2所示,在光学显微镜下观察(×10),正常组、模型组和给药组,小鼠肝脏形态正常。肝表面光滑,边缘锐利,质地柔软;肝小叶结构完整,有肝小叶和汇管区,无炎症细胞浸润;肝组织细胞围绕中央静脉呈放射状有序排列,相邻肝板吻合连接成网状,肝细胞核圆,位于细胞中央,着色较浅,肝细胞无明显的脂肪变性、水肿、坏死等,排列整齐。
注:A:对照组;B:模型组;C:甲基hispolon高;D:甲基hispolon低
3.4.2 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肺组织的影响
如图3所示,在光学显微镜下观察(×10),正常组、模型组和给药组肺组织形态正常。肺泡结构正常,肺泡腔大小一致,肺泡间质薄厚均匀清晰可见,支气管上皮完整,无明显炎症反应。
注:A:对照组;B:模型组;C:甲基hispolon高;D:甲基hispolon低
3.4.3 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肾组织的影响
如图4所示,在光学显微镜下观察(×10),正常组、模型组和给药组肾组织形态正常。组织细胞排列紧密,肾小球清晰,管腔清晰,肾小管形态规则,无炎症浸润。
注:A:对照组;B:模型组;C:甲基hispolon高;D:甲基hispolon低
3.4.4 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠心脏组织的影响
如图5所示,在光学显微镜下观察(×10),正常组、模型组和给药组心组织形态正常。心肌组织胞浆丰富而红染,胞核卵圆形,位于细胞中央,横纹清晰,间质少量血管及结缔组织;心肌细无胞变性、坏死、血管充血,局部无炎细胞浸润。
注:A:对照组;B:模型组;C:甲基hispolon高;D:甲基hispolon低
3.4.5 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠胸腺组织的影响
如图6所示,在光学显微镜下观察(×10),在各组中,胸腺组织结构可见皮髓质分界清楚,皮质部染色较深的淋巴细胞密集,核呈紫蓝色,胞浆为淡红色,髓质部染色较浅的网状细胞较多,各组之间差异不明显。
注:A:对照组;B:模型组;C:甲基hispolon高D:甲基hispolon低
3.5 甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠血清生化指标的影响
如表5所示,与空白组相比,模型组肝功能异常,应用甲基hispolon治疗之后,与模型组相比,肝功能好转。与空白组相比,模型组脂代谢紊乱,总胆固醇明显降低,甘油三酯明显升高,应用甲基hispolon治疗之后,与模型组相比,总胆固醇明显升高,甘油三酯明显降低,且与空白组相比没有明显的差异;与空白组相比,模型组和给药组葡萄糖均降低;甲基hispolon对肾功能基本没有影响。
表5 甲基hispolon对小鼠血液生化指标的影响(x ±s,n=10)
测定指标 | 空白 | 模型 | 甲基hispolon高剂量组 | 甲基hispolon低剂量组 |
CRE(umol/L) | 15.50±1.44 | 15.25±0.76 | 16.06±0.25** | 16.13±0.15 |
ALT(U/L) | 14.99±1.37 | 53.85±2.02<sup>##</sup> | 27.23±5.21<sup>**</sup> | 36.69±0.16<sup>**</sup> |
AST(U/L) | 37.35±5.94 | 94.76±1.28<sup>##</sup> | 50.96±7.72<sup>**</sup> | 97.89±8.67 |
T-CHO(mmol/L) | 3.26±0.01 | 2.63±0.14<sup>##</sup> | 3.01±0.03<sup>*</sup> | 3.13±0.23<sup>*</sup> |
Glu(mmol/L) | 7.27±0.67 | 6.07±0.39<sup>#</sup> | 5.88±0.29 | 4.00±0.03<sup>**</sup> |
HDL-C(mmol/L) | 4.01±0.14 | 3.19±0.01<sup>##</sup> | 2.83±0.06<sup>*</sup> | 3.28±0.07 |
LDL-C(mmol/L) | 1.12±0.16 | 0.88±0.25 | 0.87±0.35 | 1.06±0.23 |
TG(mmol/L) | 0.99±0.10 | 1.96±0.14<sup>##</sup> | 1.36±0.02<sup>*</sup> | 1.21±0.23<sup>**</sup> |
注:与空白组比较# P<0.05,## P<0.01;与模型组比较* P<0.05,** P<0.01。
Claims (3)
1.本发明公开一种检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法,其检测步骤包括:
a.)体内抑瘤实验;
b.)检测甲基hispolon对U14细胞的抑瘤作用;
c.)检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠肿瘤的抑制作用;
d.)检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠脏器指数的影响;
e.)检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠组织结构病理学的影响;
f.)检测甲基hispolon对小鼠宫颈癌U14移植瘤小鼠血清生化指标的影响。
2.根据权利要求1所述的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法,其特征在于:所述步骤 a.)体内抑瘤实验按如下步骤进行:
(1)肿瘤的传代保存 U14 宫颈癌于昆明小鼠腹腔接种后取腹水传代保存;
(2)肿瘤的接种 取腹水传代第10日的U14宫颈癌荷瘤小鼠,脱颈椎处死小鼠,消毒腹部皮肤,以无菌注射器吸取乳白色腹水,以注射用生理盐水调整肿瘤细胞密度为1*107细胞/mL;以酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤,于皮下接种U14 宫颈癌瘤细胞悬液0.2mL,常规饲养;接种5天后小鼠全部成瘤,随机分组给药;用药前,各组间平均肿瘤体积大小无显著性差异;
(3)分组和给药 荷瘤小鼠30只,按体质量随机分为3组,每组10只;每日灌胃给一次药,甲基hispolon低剂量组5mg/kg.d-2,甲基hispolon高剂量组15mg/kg.d-2,共9天;停药24h后处脱颈死裸鼠,分离瘤体称重;
(4)瘤体积的变化 每组小鼠从给药后,隔日用游标卡尺测量肿瘤大小,计算肿瘤体积;并观察昆明小鼠的精神状态、活动力、反应、肿瘤生长情况、大便形态等;肿瘤体积(V)=长径*短径2/2 计算肿瘤体积(V),以每组小鼠瘤体积平均值为纵坐标,处理时间为横坐标,绘制移植瘤生长曲线;
(5)抑瘤率检测 末次给药24h后,称体重,摘眼球取血,脱颈处死小鼠,称体质量,解剖剥离瘤块,称瘤质量;计算给药组肿瘤生长抑制率(%);肿瘤抑瘤率(IR%) =(对照组平均瘤重-各治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重)*100%;
(6)脏器指数测定 将小鼠解剖,称取脾脏及胸腺质量,分别计算小鼠的脏器指数,脏器指数(mg/g)=脏器质量(mg)/体重(g);
(7)血清生化指标测定 取血,离心,取血清,按试剂盒说明书进行测定;
(8)组织病理学观察 U14荷瘤小鼠皮下移植瘤组织与脾脏组织经10%甲醛溶液固定24h,常规脱,水、包埋、切片、脱蜡处理后,进行苏木素-伊红(hematoxylin -eosin HE)染色,于光学显微镜下进行病理形态学观察;
(9)统计学处理 采用SPSS19.0统计软件对数据处理;先进行数据的正态分布检验,方差齐性检验,组间比较采用方差分析;结果以`x±s表示,组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用q检验;以P<0.01为有显著性差异。
3.根据权利要求1中a、b、c、d、e、f、所述的检测甲基hispolon抗宫颈癌的研究方法,其特征在于:甲基hispolon能显著抑制肿瘤细胞的生长,但对器官组织没有明显的影响,治疗剂量下无明显毒副作用,体内外结果基本一致。
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