CN102648924A

CN102648924A - 红缘拟层孔菌发酵产物的抗肿瘤和增强免疫活性

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Publication number: CN102648924A
Application number: CN2012101370647A
Authority: CN
Inventors: 包海鹰; 孙雪
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2012-08-29

Abstract

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的抗肿瘤和免疫增强活性，并提供其发酵制备方法及条件，研究表明红缘拟层孔菌发酵菌丝体对肝癌H₂₂荷瘤具有较好的抑制作用，且能明显的增强小鼠的免疫活性。该研究属于菌物生药发酵产物的制备及其在医药与保健品领域的应用方法，并为预防及治疗肿瘤药开发提供依据。

Description

红缘拟层孔菌发酵产物的抗肿瘤和增强免疫活性

技术领域：

背景技术：

癌症，医学术语又称恶性肿瘤，是控制细胞生长增殖机制的失常而引起的疾病，是目前危害人类健康和生命的重要疾病之一。近些年来肿瘤的发病率在不断上升，已经成为人类的头号杀手。

随着天然产物化学的发展，真菌作为自然界中的一大生物类群，以其药理活性好，副作用较小，并且并可通过发酵手段大量获得，越来越被人们所重视。多孔菌科真菌是担子菌中的一大类群，例如中药灵芝、猪苓、茯苓等都属于这一类群，多孔菌类的抗肿瘤活性也多有研究报道，被称为桑黄的菌类以及灵芝和桦褐孔菌的抗肿瘤活性都很好，因此研究真菌中抗肿瘤成分并将其开发成药品或保健品的需求是十分迫切的。

红缘拟层孔菌Fomitopsis pinicola (Sw.:Fr.)P. Karst.，又名“红缘层孔菌”等。隶属于担子菌纲（Basidiomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）多孔菌科(Polyporaceae)，拟层孔菌属(Fomes)。红缘拟层孔菌是世界性分布的木腐性真菌，它大多生长在阔叶树活立木、针叶树、腐朽木以及倒木上，对很多种类的阔叶树木具有很强的危害性。红缘拟层孔菌具祛风除湿，强心，解热，滋补强壮，扶正培本、补肺益肾，安神定志、和胃健脾等作用，对癌症、心脏病、脑溢血、贫血、糖尿病、肾炎和支气管炎等疾病有很好的治疗效果。民间用其治疗矿工的“寒腿”病。在中国东北长白山地区为常见种类，在春季、夏季和秋季均会出现。味微苦、性平。有研究表明，红缘拟层孔菌提取物具有抗肿瘤、抑菌、抗炎、抗氧化、抑制肥胖、保护肝脏、抑制水肿并能清除游离基、调节中枢神经系统、治疗糖尿病、增强人体免疫力。

发明内容：

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的制备方法，具体如下：

（1）最适基础培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁1.5g/L，维生素B1 0.4g/L。

（2）各级种子的制备：用接种环将红缘拟层孔菌母种斜面培养基上的菌丝接在两个500ml摇瓶内，每个摇瓶装有筛选出的最佳培养基100ml，置于28℃的恒温振荡器中，转速130r/min，PH自然，发酵周期为80小时，作为一级液种。将这200ml一级液种分成四等份后转接入四瓶2000ml摇瓶中，每瓶装有200ml培养液，同一级液种的培养条件培养64小时作为二级液种。

（3）升罐培养实验：将35L筛选出的最佳培养基装入50L的发酵罐中，在121℃条件下对发酵罐内的培养基进行灭菌25min后将培养好的红缘拟层孔菌的二级液种在火焰下转接入50L发酵罐中，在28℃的条件下培养96小时，初始搅拌数为150rpm，罐压0.05Mpa，起始溶氧为100％，通气量1：0.5，PH自然。最佳发酵周期为56~64h，在此条件下菌丝体湿重达到6.8901g/L，胞外粗多糖含量达到0.2965g/L。

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的小鼠抗肿瘤活性的研究，方法与结果如下：

无菌条件下，取接种7d的种鼠腹水肝癌H₂₂细胞，用生理盐水制成细胞个数为1×10⁶-5×10⁶/mL的细胞悬液，以每鼠0.1mL接种于小鼠左后肢腋窝皮下，随机分组，每组10只。次日开始给药，阳性药组隔天腹腔注射环磷酰胺（25mg/kg），体积为0.2mL/10g，受试药组（100mg/kg，200mg/kg）和对照组（生理盐水）灌胃给药，体积为0.2mL/10g，连续10d，第11天处死小鼠，摘取瘤块、胸腺和脾脏，分别称重。肿瘤抑制率=（对照组平均瘤重－给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。胸腺指数为每g体重中胸腺的mg数，脾指数为每g体重中脾脏的mg数，各数值均以平均值±标准差（

）来表示。通过软件spss 18.0统计分析数据的代表性，p<0.05说明在统计学上差异显著，p<0.01说明在统计学上差异极显著。

发酵产物组的体内抗肿瘤作用如表1所示。除了CTX组对小鼠移植瘤的抑制率达到80.59%之外，发酵产物组对小鼠的移植瘤具有极明显的抑制作用，但不存在量效关系，在剂量为100mg/kg/d时的抑制率达到62.54%，同对照组相比存在显著性差异（P＜0.01）。

表1 红缘拟层孔菌的发酵产物对荷瘤小鼠肿瘤的影响

注：与对照组相比：* P<0.05；** P<0.01；

发酵产物组对小荷瘤鼠免疫系统的影响如表2所示。从表中可知，除了CTX组明显低于对照组外（P＜0.01），各提取物给药组脾脏指数均明显高于正常组（P＜0.01），与对照组相比并无显著性差异（P＞0.05）；除正常组外，其他各组的脾脏指数均高于CTX组（P＜0.01）。另外各组小鼠的胸腺指数均低于正常组，对照组、正常组和发酵产物高剂量组的胸腺指数均高于CTX组（P＜0.01）。说明红缘拟层孔菌发酵产物组作用后，荷瘤小鼠的胸腺指数发生了改变，荷瘤小鼠的胸腺指数升高，说明红缘拟层孔菌发酵产物和单体化合物具有一定的调节小鼠免疫活性的作用。

表2 红缘拟层孔菌的发酵产物对荷瘤小鼠免疫器官的影响

注：与对照组相比：* P<0.05；** P<0.01；与正常组相比，^# P<0.05；^## P<0.01；与阳性组相比：^▽▽P<0.01 , ^▽P<0.05.

本发明公开了红缘拟层孔菌发酵菌丝体的小鼠免疫增强活性的研究，方法与结果如下：

1.实验方法

试验动物 4-6周龄昆明系小鼠20只，全部为雌鼠，体重(20±2)g。将小鼠按随机分为2组，分别为阴性对照组和实验组，每组10只小鼠。受试药组（200mg/kg）灌胃给予小鼠，按0.2ml/10g的剂量开始给药，对照组动物给予生理盐水，自由取食饮水。每天观察记录小鼠状态，连续7d。

（1）器官免疫指数测定实验：试验结束后，小鼠称重，然后颈椎脱臼处死，完

整摘取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重，计算器官免疫指数。

（2）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验将1mL 的20% (v/v)鸡红细胞( 2000rpm, 10min ) 悬混液注射于实验小鼠的腹腔内，注射完成后轻揉小鼠的腹部保证鸡血球悬混液均匀的分布于小鼠的腹腔。等待30min之后处死动物并将动物固定在鼠板上，注射2ml生理盐水于小鼠的腹腔内。之后摇动鼠板使生理盐水在小鼠体内混合均匀后吸取小鼠的腹腔洗液1ml滴在载玻片上，将载玻片放于垫有湿纱布的瓷盘内，在37℃的恒温箱内放置30min后用生理盐水清洗，干燥后取一滴甲醇滴在涂片上再自然干燥，用以固定血液。取2滴瑞氏染液和两滴纯净水于玻片上均匀的涂开，等待1-2分钟之后用清水冲洗染液，然后用吸水纸吸干载玻片上的液体。之后在油镜下观察并计数，每片统计100个巨噬细胞。记录吞噬细菌的巨噬细胞数。

（3）血清溶血素实验受试小鼠眼球采血，分离血清，每只取100uL；心脏采豚鼠血（要求豚鼠体重250g以上，心脏采血后待其凝固，将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再将其放于4℃的冰箱内三到四小时。在血液凝固，血块收缩时,用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，分装后置4℃冰箱中保存备用，即为补体。取100倍稀释的小鼠血清1mL加入5% 鸡红细胞，再加10% 补体，以不加补体的做空白对照，37℃，作用30min，取出后用冰水中止反应，然后取出，1000rpm离心5min，在540nm处比色，采用分光光度法测定吸光度值，并计算出溶血素水平（HC）。

（4）ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞转化实验（体内法）给实验每只小鼠注射配置好的ConA，每只小鼠注射0.3mg。注射完后在室温下饲养小鼠三天，自由饮食饮水。三天之后，对实验小鼠采取眼静脉取血，将取出的血液加入装有抗凝剂的试管中混匀。取一滴抗凝血处理后的血液滴在载玻片上均匀的推开之后干燥。干燥后取一滴甲醇滴在涂片上再自然干燥，用以固定血液。取2滴瑞氏染液和两滴纯净水于玻片上均匀的涂开，等待1-2分钟之后用清水冲洗染液，然后用吸水纸吸干载玻片上的液体。之后在显微镜下观察，计算淋巴细胞的转化率。（5）小鼠碳廓清实验于末次给药1 h后, 各组小鼠按体重尾静脉注射100ml/kg印度墨汁生理盐水液，于注射墨汁后2min及10min, 用毛细玻璃管从小鼠眼眶后静脉丛取血20 μl,之后将其立即加入2ml的0.1% Na₂CO₃溶液中, 摇匀,于分光光度计600 nm波长处测吸光度(OD ) 值, 以Na₂CO₃溶液作为空白对照溶液。之后将小鼠处死，取脾脏和肝脏，用滤纸吸取脏器表面的血污，分别称重并记录。

（6）胸腺指数=胸腺重（mg）/体重（g），脾脏指数=脾脏重（mg）/体重（g）。

吞噬率(%)=吞噬细菌的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100%

分光光度法测定溶血素水平（HC）公式：样品（HC）=样品吸光度值/鸡红细胞半数溶血时吸光度值×稀释倍数

转化率=转化的淋巴细胞数/（转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数）×100%，在淋巴细胞的转化过程当中，可见核分裂相细胞、过度型淋巴母细胞、淋巴母细胞和成熟淋巴细胞等几种常见的类型。在统计转化率时，转化的细胞也包括核分裂相细胞和过度型淋巴母细胞。

廓清指数:K = ( logOD ₂ - logOD₁₀ ) / ( t₁₀ - t₂ )

吞噬指数:a=体重/（肝重+脾重）×³√K

实验数据用

表示，并采用SPSS18.0 for Windows统计软件进行分析。P＜0.05说明在统计学上呈显著差异，P＜0.01说明在统计学上呈极显著差异。

2.结果与分析

（1）各组小鼠的状态观察：实验组小鼠和对照组小鼠均生长良好，两组小鼠在饲养的前三天未见异常，之后开始给药。给药后，前两天未发现两组小鼠有明显的区别。第三天之后，实验组小鼠比较对照组小鼠出现活动多，觅食积极，被毛光泽的现象。

（2）器官免疫指数测定实验：从实验结果可以看出，在注射conA之前实验组和对照组的动物体重、脾指数和肝脏指数没有显著性差别，在注射conA之后，小鼠的脾指数上升，肝脏指数下降，推断是注射了conA的结果（表3）。

表3 红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响

注：与对照组相比，* P<0.05；** P<0.01

（3）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验：实验结果（表4）表明，实验组小鼠的吞噬率达到了72.8%，明显高于阴性对照组的51%（P＜0.01），说明实验组药物有增强小鼠非特异性免疫的作用。

（4）血清溶血素实验：实验结果（表4）表明，实验组溶血素水平达到了54.678，明显高于阴性对照组的37.532（P＜0.01），说明实验组有增强小鼠体液免疫的作用。

（5）ConA诱导小鼠脾脏淋巴细胞转化实验（体内法）：在ConA的诱导作用完成之后，采取外周血图片染色在显微镜下观察统计100个淋巴细胞并计算淋巴细胞的转化率，实验结果表明（表4），实验组淋巴细胞转化率高达55.333%，明显高于阴性对照组的35.501%（P＜0.01），说明红缘拟层孔菌的菌丝体具有增强小鼠细胞免疫的功能。

表4 红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠吞噬率，溶血素水平、淋巴细胞转化率和DTH的影响

注：与对照组相比，* P<0.05；** P<0.01

（6）小鼠碳廓清实验

在一定的范围内，小鼠体内碳颗粒被清除的数率与血碳浓度呈现指函数关系。本实验选用小鼠炭粒廓清实验, 观察红缘拟层孔菌菌丝体对正常小鼠非特异性免疫的影响。印度墨汁作为颗粒状异物静脉注射进入血循环, 能迅速被单核吞噬细胞清除。本实验结果表明（表5）,药物作用后小鼠的吞噬指数显著增加, 即单核吞噬细胞功能明显增强，发酵产物高剂量组和低剂量组的吞噬指数分别达到7.523和6.968，都与对照组有显著差异（P＜0.05），不存在明显的剂量关系，实验结果说明红缘拟层孔菌菌丝体能增强机体的非特异性免疫功能。

表5红缘拟层孔菌的发酵产物对小鼠吞噬指数影响

注：与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01

Claims

1.红缘拟层孔菌的发酵菌丝体在制备、抑制肿瘤和增强免疫力药物中的用途及其相关应用。所述的药物剂型是指药剂学上所说的任何剂型，如片剂、注射剂、胶囊剂、胶浆剂、涂膜剂、乳剂、混悬剂、合剂、散剂、颗粒剂等。

2.根据权利要求1所述，红缘拟层孔菌的发酵菌丝体的制备方法，其特征包括如下步骤：

（1）最适基础培养基为：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁1.5 g/L，维生素B1 0.4 g/L。

3.由权利要求2的制备得到红缘拟层孔菌的发酵菌丝体具有一定的抗肿瘤活性，对H₂₂荷瘤小鼠的抑制率达到极显著水平（p<0.01）。并具有明显的增强小鼠免疫水平的作用。