KR20050120863A - Ｈ-라스 과발현 마우스를 이용한 항암제의 항암활성검정방법 - Google Patents
Ｈ-라스 과발현 마우스를 이용한 항암제의 항암활성검정방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형질전환 마우스를 이용한 항암제의 항암활성을 검정하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 H-라스(Ras) 과발현 마우스를 이용하여 항암제 투여후 항암제의 감응성 여부를 통한 항암제의 항암활성을 검정하거나 간암 발생의 지연효과를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 간암을 포함한 H-라스 유래 암을 일으키는 H-라스 과발현 마우스에 항암활성을 나타내는 약물의 투여시 종양발생을 유의성 있게 억제시키는 바, 항암제의 항암활성의 평가 및 신규한 발암억제 또는 지연효과를 보이는 물질의 평가에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 형질전환 마우스를 이용한 항암제의 항암활성을 검정하거나 간암 발생의 지연효과를 측정하는 방법에 관한 것이다.
간암은 전 세계적으로 가장 흔한 암으로, 일반적으로 크게 두 가지로 분류할 수 있다. 간 자체에서 발생한 암으로, 일반적으로 말하는 간암인 원발성 간암과, 다른 장기로부터 전이되어 발생하는 간암이 있는데, 악성 간종양의 대부분을 차지한다. 간암은 전체 암등록 환자의 11.6%를 차지하며, 암으로 인한 사망자중 간암으로 인한 사망자는 17.3%를 차지한다. 특히 미국이나 서구와 달리 아시아와 아프리카 지역에서 많이 발생하는 간암은 심각한 보건 문제를 야기하고 있다. 특히 간암은 남자에서 2번째로 많은 암이며, 여자보다 남자에서 발생율이 4배 높으며, 간경변이 선행되는 경우가 흔하다. 서구에서는 40대와 50대에서 주로 발생하나 아시아, 아프리카에서는 30대와 40대의 연령에서 주로 발생한다.
상당수의 환자들이 간경변을 앓고 있어 간경변으로 인한 증상으로 알고 지나치는 경우가 많고 특별한 증상없이 피로등 평상시 쉽게 지나치는 증상밖에 없어 조기진단이 어렵다. 간암은 간경화가 동반되는 경우는 80%가 넘고, 간경화에 간암이 동반되는 경우는 20-40% 정도이다. 간경화의 원인이 무엇이든, 간경화에서 간암이 잘 생기는 것으로 알려져 있는데, 특히 바이러스의 감염에 의한 간경화의 경우에는 그 정도가 더 심하다. 우리 나라에서의 간경화는 바이러스성 간염(B형 및 C형)에 의한 경우가 대부분이고 그외 알코올이나 약물, 대사성, 영양실조등이 관련되어 있다. 간염 바이러스에 의한 간암 발생외에도 여러 발암물질이 간암의 발생 원인이 되고 있는데, 그중 곰팡이에서 생기는 아플라톡신(aflatoxin)은 발암억제 유전자를 비활성화(非活性化)시켜 간암을 유발한다고 알려져 있다. 그외 여러 가지 발암 위험인자로써 술, 피임약, 스테로이드제제 등을 들 수 있으며, 선천성 간질환과 연관되어 나타나기도 한다.
간암이 의심되는 환자에서 초음파 검사, 복부 CT 촬영, MRI (자기공명촬영), 간동맥 혈관촬영등의 검사를 통하여 진단하게 된다. 혈액내의 AFP라는 검사치가 간암환자에서 많이 올라 갈 수가 있으며 그 수치가 500 ㎍/L 이상이면 간암이 강력히 의심된다. 그러나 확실한 진단은 초음파 검사나 CT검사, 복강경 검사를 이용하여 직접 간 조직을 일부 떼어 내 현미경으로 검사하여 이루어진다. 간암은 매우 빨리 진행되어 특별한 치료를 하지 않으면 진단 후 3-6개월에 사망하게 된다. 그러나 간암발생 가능성이 큰 경우, 미리 초음파검사 등의 조기검진을 통해 일찍 발견하게 되면 1-2년 생존이 가능하고 일부 환자에서는 장기간의 생존도 가능하다. 수술로 암을 모두 제거함으로써 완치를 얻을 수 있으나, 이미 진단시에 암이 진행되어 있어 수술이 불가능한 환자가 많고 간경변으로 간기능이 나빠 수술을 못하는 경우도 있다. 따라서 간암 발생 위험이 큰 환자 (B형 간염 바이러스의 보균자, 여러 원인으로 간경변이 발생한 환자 등)는 증상이 없어도 복부 초음파 검사와 혈청 AFP 검사등의 정기검진이 중요하며, 초기에 간암을 진단을 가능하게 한다. 가능한 작은 크기의 간암은 수술로 제거하는 것이 가장 좋다. 수술이 불가능하면 혈관색전술과 항암제 투여, 피부를 통해 가는 바늘을 이용하여 간암에 알코올을 주사하는 치료, 초음파를 통하여 간암조직을 냉동시키는 치료, 동위원소를 간암에 주사하는 치료, 면역치료, 유전자치료 등이 다양하게 시도되고 있다. 여러 가지 치료가 불가능한 환자는 간이식을 시도해 볼 수도 있으나 재발의 문제점이 있다.
한편 간암 치료에 대한 연구의 문제점은 간암 실험모형 체계가 없고 종양생물학에 대한 이해가 부족하며, 간암에만 선택적으로 작용할 수 있는 이용 가능한 치료 약제가 부족다는 것이다. 향후 간암 치료 방법 개발의 관건은 정상 조직에 손상없이 간종양을 치료할 수 있는 효과적인 신기술의 개발이다.
H-라스(H-Ras)는 간암 등의 조직에 활성형으로 고빈도로 존재하는 암유전자이다. 따라서, H-라스 유전자를 이용하여 암을 유발하는 형질전환 마우스를 개발하려는 노력이 있었으나(Sandgren et al., Oncogene, 4, 715-724, 1989; Tremblay et al., Mol. cell Biol., 9, 854-859, 1989; Gilbert et al., Int. J. Cancer, 73, 749-756, 1997; Toxicol. Pathol., 26(4), 556-561, 1998), 조기 사망, 불임 또는 간암유발 능력의 저조함 등의 문제점으로 인하여 신약후보 물질의 약효검정을 위한 동물모델로는 적합하지 않았다. 본 발명자들은 적당한 시기에 간암을 유발하고 다른 장기에 병변을 유발하지 않으며 번식을 잘 하는 형질전환 마우스로, H-라스 과발현 마우스를 발명하여 특허출원 (대한민국 특허출원 제10-2002-0067876호)한 바 있다.
이에 본 발명자들은 H-라스 과발현 마우스에 항암제로 알려진 계피성분의 HCA (2'-Hydroxy-Cinnamaldehyde) 또는 그의 유도체인 BCA (2'-Benzoyl-oxycinnamaldehyde)의 투여한 결과, 유의성 있게 간암 발생 지연효과를 나타내는 바, 본 발명의 검정방법이 항암제의 항암활성을 평가하거나 간암 발생의 지연효과를 측정할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항암제 개발에 필요한 재료로서 H-라스 과발현 마우스의 신규한 용도를 제공하는데 있는 바, H-라스 과발현 마우스를 이용하여 항암제 투여후 항암제의 감응성 여부를 통한 항암제의 항암활성을 검정하거나 간암 발생의 지연효과를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 H-라스 과발현 마우스(수탁번호 KCTC 10318 BP)를 이용하여 항암제 투여후 항암제의 감응성 여부를 통한 항암제의 항암활성을 검정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
H-라스 과발현 마우스는 본 발명자에 의해 기탁된 마우스(수탁번호 KCTC 10318 BP)로서, 생후 6개월 이후에 자연 발생적인 간암이 유발된다. 따라서, 본 발명은 상기 H-라스 과발현 마우스를 이용하여 항암제 투여후 항암제의 감응성 여부를 통한 항암제의 항암활성을 검정하거나 간암 발생의 지연효과를 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 암의 종류에는 이에 한정하는 것은 아니나 간암, 뇌종양, 폐암, 유방암, 자궁암 또는 위암인 것이 바람직하며, 간암인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 항암제의 투여는 생후 3 내지 5개월령의 H-라스 과발현 마우스에 30 내지 100 ㎎/㎏의 투여량으로 8 내지 12주의 투여기간동안 투여할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 예를 들면 생후 3.5개월령의 H-라스 과발현 마우스에 대하여 항암제로 알려진 계피성분의 BCA(2'-Benzoyl-oxycinnamaldehyde)와 HCA(2'-Hydroxy-Cinnamaldehyde)의 투여를 시작한다. 구체적으로 각각을 50 ㎎/㎏으로 이틀에 한번씩 10주간 투여한 후, 항암제의 감응성 여부를 생후 6 내지 8개월령 H-라스 과발현 마우스의 조직세포에서, 바람직하게는 6개월 경과후 마우스의 간조직을 채취하여 헤마톡실린/에오신(Hematoxylin/Eosin) 염색법으로 간조직을 염색한다. 항암물질을 투여되지 않은 H-라스 과발현 마우스와 항암물질이 투여된 H-라스 과발현 마우스의 간조직에서 암세포의 증식 또는 발생여부를 비교한 결과, 항암물질인 BCA 또는 HCA 투여군에서 간암의 생성이 지연되고 면역세포가 증가되는 바, 본 발명의 검정방법을 이용하여 항암제의 항암활성을 검정하거나 간암 발생의 지연효과의 측정이 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HCA의 H-라스 과발현 마우스의 간암발생에 대한 효과
생후 4개월령의 H-라스12V 과발현 마우스(KCTC 10318 BP)에 계피 성분중 항암효과를 보인다고 공지된 HCA(2'-Hydroxy-Cinnamaldehyde)를 한국생명공학연구원 세포기능조절 연구실의 권병목 박사님으로부터 공급받아 50 mg/kg을 이틀에 한번씩 10주간 복강투여하였다. 생후 6개월 이후 마우스의 간조직을 무균적으로 적출, 채취하여 포름알데히드 고정액에 고정후, 파라핀 블록을 만든후, 마이크로톰(Rotary microtome)(LEICA 사)을 이용하여 4 ㎛ 두께로 조직을 절단하여 절단된 절편을 슬라이드위에 부착하였다. 헤마톡실린/에오신(Hematoxylin/Eosin) 염색법을 이용하여 조직을 염색하고 그 결과를 역상 현미경(Bx 50, Olympus 사)하에서 관찰하였다(도 1 및 2 참조).
그 결과, HCA를 투여하지 않은 마우스에서는 생후 6개월 이후에 자연 발생적인 간암이 유발되었으나, HCA를 투여한 마우스에서는 도 2에서 볼 수 있듯이 간암의 생성이 지연되었고 면역세포가 일부 증가해 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 H-라스 과발현 마우스를 항간암 또는 H-라스 유래암에 대한 약물평가와 발암저해 또는 지연효과를 보이는 물질의 평가에 응용 가능하다.
실시예 2. BCA의 H-라스 과발현 마우스의 간암발생에 대한 효과
생후 4개월령의 H-라스12V 과발현 마우스(KCTC 10318 BP)에 HCA의 유도체인 BCA를 한국생명공학연구원 세포기능조절 연구실의 권병목 박사님으로부터 공급받아 50 mg/kg을 이틀에 한번씩 10주간 복강투여하였다. 생후 6개월 이후 마우스의 간조직을 무균적으로 적출, 채취하여 포름알데히드 고정액에 고정후, 파라핀 블록을 만든후, 마이크로톰(LEICA 사)을 이용하여 4 ㎛ 두께로 조직을 절단하여 절단된 절편을 슬라이드위에 부착하였다. 헤마톡실린/에오신(Hematoxylin/Eosin) 염색법을 이용하여 조직을 염색하고 그 결과를 역상 현미경(Bx 50, Olympus 사)하에서 관찰하였다(도 3 참조).
그 결과, BCA를 투여하지 않은 마우스에서는 생후 6개월 이후에 자연 발생적인 간암이 유발되었으나, BCA를 투여한 마우스에서는 도 3에서 볼 수 있듯이 간암의 생성이 지연되었고 면역세포가 일부 증가해 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 H-라스 과발현 마우스를 항간암 또는 H-라스 유래암에 대한 약물평가와 발암저해 또는 지연효과를 보이는 물질의 평가에 응용 가능하다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 H-라스 과발현 마우스를 이용한 검정방법은 항암활성을 나타내는 약물의 투여시 종양발생을 유의성 있게 억제시키는 바, 항암제의 항암활성의 평가 및 신규한 발암억제 또는 지연효과를 보이는 물질의 평가에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 6개월령의 H-라스12V 과발현 마우스에서 발생한 간암(A)과 혈관침투되는 암(Vascular Invasion)(B)을 나타낸 간 조직사진이며,
도 2는 H-라스12V 과발현 마우스에 발생한 간암이 HCA(2'-Hydroxy-Cinnamaldehyde) 투여에 의해 암발생이 지연된 결과(A)와 화살표로 표시된 면역세포의 일부증가(B)를 나타낸 간 조직사진이고,
도 3은 H-라스12V 과발현 마우스에 발생한 간암이 BCA(2'-Benzoyl-oxycinnamaldehyde) 투여에 의해 암발생이 지연된 결과(A)와 화살표로 표시된 면역세포의 증가(B)를 나타낸 간 조직사진이다.
Claims (5)
- H-라스 과발현 마우스(수탁번호 KCTC 10318 BP)를 이용하여 항암제 투여후 항암제의 감응성 여부를 통한 항암제의 항암활성을 검정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 암은 간암, 뇌종양, 폐암, 유방암, 자궁암 또는 위암임을 특징으로 하는 검정하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 검정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항암제의 투여는 생후 3 내지 5개월령의 H-라스 과발현 마우스에 30 내지 100 ㎎/㎏/2일의 투여량으로 8 내지 12주의 투여기간동안 투여됨을 특징으로 하는 검정하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 항암제의 감응성 여부는 생후 6 내지 8개월령의 H-라스 과발현 마우스의 조직세포에서 암세포의 증식 또는 발생여부를 통하여 판단됨을 특징으로 하는 검정하는 방법.
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| KR (1) | KR20050120863A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102613264B1 (ko) | 2023-03-28 | 2023-12-13 | (주)씨앤에스알 | 인간 줄기세포 이식 및 면역 부스팅에 기반한 인간면역화 마우스 및 그의 제조방법 |
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2004
- 2004-06-21 KR KR1020040045972A patent/KR20050120863A/ko not_active Application Discontinuation
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