CN107375923A - 抗s100a4抗体在抗cd137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用 - Google Patents
抗s100a4抗体在抗cd137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抗S100A4抗体在抗CD137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用，该应用在使用CD137抗体治疗肿瘤的同时采用S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质以及能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质中的至少一种可以避免或大大减轻由抗CD137共刺激抗体带来的严重的肝脏毒性。
Description
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，具体涉及到抗S100A4抗体在抗CD137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用。
背景技术
近年来癌症免疫治疗已经得到广泛关注和快速发展，它们不同于传统的放化疗和手术治疗，是以激发患者的免疫系统为目的，借助免疫系统来杀死肿瘤。然而免疫力的提升可能会造成不同程度的副作用，即，造成免疫损伤。这些免疫损伤有时候是严重甚至是致命的。例如体现在(1)皮疹和粘膜的刺激：对皮肤的毒性，出现皮疹和皮肤瘙痒；(2)腹泻和结肠炎；(3)肝毒性；(4)脑垂体、肾上腺和甲状腺的功能减退症。
共刺激分子CD137(又名4-1BB和TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的诱导型共刺激信号传导受体，可诱导表达于激活的T细胞和自然杀伤细胞的表面，也可表达于激活的树突状细胞、肿瘤内皮细胞表面。其中，内皮细胞表达的CD137可在胞内黏附分子ICAM-1和VCAM-1的帮助下，促进激活的T细胞浸润到肿瘤位点。共刺激分子CD137的配体CD137L(又名4-1BBL和TNFSF9)可诱导表达于多种激活的APC表面，例如，树突状细胞、B细胞和巨噬细胞。二者结合后不仅为T细胞(或NK细胞)激活提供共刺激信号，诱导T细胞增殖和产生干扰素-γ并增强其效应功能，还可通过NF-κB信号通路促进抗凋亡基因Bcl-XL和Bfl-1的表达，抑制激活诱导的细胞死亡。
激动性抗CD137抗体诱导各种动物模型中建立的肿瘤的消退，并防止黑素瘤模型中的肿瘤复发。CD137的信号结构域已融合到第二代CAR-T细胞的细胞质结构域，使其可以获得最佳的存活和减少耗尽。与其它共激受体如CD28和OX40不同，抗原刺激对CD137表达的调节使其可用于分离肿瘤反应性T细胞。CD137分子功能的多效性使其成为一个非常具有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点。但是激动性CD137抗体可能通过诱导B细胞或辅助性T细胞凋亡，在广泛的小鼠模型中显示出抗自身免疫性疾病如狼疮，实验性自身免疫性脑脊髓炎和关节炎的抗炎特性。
S100A4蛋白是一种分布具有细胞和组织特异性的蛋白，其在小鼠的肝、脾、骨髓、平滑肌细胞及角化上皮等细胞中均有表达，在人类发现单核细胞、巨噬细胞、多形核粒细胞、角化细胞、郎罕氏细胞及汗腺细胞中有S100A4蛋白不同程度的表达,但在正常肺、肾脏、乳腺、甲状腺、胰腺及结肠的组织细胞中均没有表达。S100A4是S100钙结合蛋白家族的成员，其中，S100A4蛋白是以非共价结合二聚体存在于细胞内，而以共价结合二聚体分泌到细胞外，其在体内发挥多种生物学作用,参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动等过程。在肿瘤发生的情况下，会有多个S100成员在肿瘤中表达异常,并与肿瘤的浸润和转移密切相关，其中S100A4就是其中一员,又称为p9Ka、calvasculin、CAPL等。肿瘤和基质细胞分泌的S100A4被认为是在癌细胞转移或影响血管生成中起关键作用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
由于目前仅仅有单独的抗CD137抗体以及抗S100A4抗体等单独的报道，但却没有对抗S100A4抗体是否能够减轻抗CD137抗体所引起的免疫损伤的报道，因此抗CD137抗体结合抗S100A4抗体可能成为有希望的癌症免疫治疗策略。
本发明的目的在于提供一种抗S100A4抗体在抗CD137抗体介导抗肿瘤免疫损伤中的应用，在应用抗CD137抗体治疗肿瘤的同时采用抗S100A4抗体治疗可以避免或大大减轻由抗CD137抗体带来的严重的肝脏毒性、肝脏胶原纤维沉积、肝纤维化、狼疮、自身免疫性脑脊髓炎和关节炎等症状。
为实现上述目的，本发明提供了一种抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质以及能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质中的至少一种在制备治疗受试者施用抗CD137抗体引起的免疫损伤的药物中的应用。
上述应用在另一种实施方式中，所述免疫损伤包括肝脏毒性、狼疮、自身免疫性脑脊髓炎和关节炎。
上述应用在另一种实施方式中，所述肝脏毒性包括肝脏胶原纤维沉积和肝纤维化。
上述应用在另一种实施方式中，所述抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质以及能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质不影响抗CD137抗体的抗肿瘤的作用。
本发明还提供了一种用于癌症免疫治疗的组合物，所述组合物包括：
抗CD137抗体，
以及抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质和能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质中的至少一种。
上述应用或用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，所述抗CD137抗体为抗CD137单克隆抗体，可选的为抗小鼠CD137单克隆抗体(克隆号2A，大鼠IgG2a)。
上述应用或用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，所述抗S100A4抗体为抗S100A4单克隆抗体，可选的抗小鼠S100A4单克隆抗体。
上述应用或用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，所述抗小鼠S100A4单克隆抗体是通过用S100A4蛋白免疫BALB/c小鼠制备得出的，具体地，运用免疫脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞系作为融合伴侣，根据单克隆抗体技术制备和选择杂交瘤细胞。
上述用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，将抗CD137抗体和抗S100A4抗体依次给小鼠进行注射。
上述用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，抗CD137抗体的注射剂量为90-110μg/次，可选的，抗CD137抗体的注射剂量为100μg/次。
上述应用或用于癌症免疫治疗的组合物在另一种实施方式中，抗S100A4抗体的注射剂量为3-5mg/kg，可选的，抗S100A4抗体的注射剂量为4mg/kg。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在应用抗CD137抗体治疗肿瘤的同时采用抗S100A4抗体治疗可以避免或大大减轻由抗CD137抗体带来的严重的肝脏毒性；
(2)抗S100A4抗体选择性地减轻了肝脏异常，但不影响抗CD137抗体治疗诱导的抗肿瘤免疫；
(3)本发明提出了由免疫刺激抗体诱导的肝脏病理学的新型分子机制，并提出靶向这些途径的组合免疫治疗可潜在地引起最佳的抗肿瘤免疫，具有最小的副作用。
附图说明
图1是根据本发明的抗CD137单克隆抗体(2A)表现出抗肿瘤活性，并引起严重的肝损伤。
其中，图1A：肿瘤体积生长体积检测；图1B：肿瘤接种后第21天对肿瘤和肝切片染色；图1C：小鼠血清ALT(小鼠血清谷丙转氨酶)水平检测；图1D：对肝切片进行进一步Gr-1和F4/80染色；图1E：肝脏中Gr-1+细胞和F4/80+细胞的数量；图1F：肝切片用H&E和天狼星红染色；图1G：实验组(荷瘤)和对照组(非荷瘤)C57BL/6小鼠有或没有进行抗CD137单克隆抗体(2A)处理，小鼠血清ALT水平。
图2是根据本发明的抗CD137单克隆抗体(2A)治疗诱导大量S100A4+巨噬细胞的浸润。
其中，图2A：抗CD137单克隆抗体(2A)诱导的慢性肝脏损伤的示意图模型；图2B：肝纤维化和S100A4+细胞积累的组织学特征；图2C：肝切片中天狼星红色区域的定量；图2D：肝脏S100A4+细胞浸润检测；图2E：肝组织双重免疫组织化学染色；图2F-2G：小鼠肝脏S100A4+细胞表型的流式细胞术分析；图2H：细胞培养上清液中S100A4浓度检测。
图3是根据本发明的S100A4+细胞的选择性删除减弱抗CD137单克隆抗体诱导的肝损伤和肝纤维化。
其中，图3A：S100A4-TK+小鼠肝脏中增殖的S100A4免疫荧光染色；图3B：S100A4-TK+小鼠肝切片S100A4免疫组化染色；图3C：S100A4阳性细胞的百分比；图3D：S100A4-TK+小鼠血清ALT水平；图3E：S100A4-TK+小鼠肝匀浆中S100A4，MCP-1和TNF-α蛋白的含量；图3F：S100A4-TK+小鼠肝切片天狼星红染色；图3G：肝切片中天狼星红色区域的定量。
图4是根据本发明的S100A4缺乏减轻抗CD137单克隆抗体的长期肝脏病理作用。
其中，图4A：抗CD137单克隆抗体(2A)/HCC模型的示意图；图4B：小鼠血清ALT水平；图4C：两组代表性肝脏图像，肝肿瘤结节用箭头表示；图4D-图4F：显示肝肿瘤数，最大肿瘤大小和肝脏重量；图4G：肝组织切片H&E染色，抗S100A4抗体或天狼星红染色；图4H：S100A4-TK转基因小鼠抗CD137单克隆抗体(2A)/HCC模型的示意图；图4I：肝脏图像；图4J：肝肿瘤数量；图4K：最大肿瘤大小；图4L：肝脏重量的代表性照片。
图5是根据本发明的S100A4增强CD8+T细胞存活。
其中，图5A：FACS代表性数据；图5B：FACS定量检测肝脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞；图5C：小鼠肝组织中CD4+和CD8+的IHC染色；图5D：CFSE标记小鼠脾脏的CD4+T和CD8+T细胞，通过CFSE稀释法分析T细胞增殖；图5E-图5F：小鼠脾脏CD4+T和CD8+T细胞7-AAD和Annexin V染色，FACS检测细胞凋亡。
图6是根据本发明的S100A4通过Akt信号通路抑制CD8+T细胞凋亡。其中，图6A：FACS分析CD8+T细胞凋亡；图6B：Western印迹检测半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9的表达；图6C：Western印迹分析显示的信号通路；图6D：FACS分析凋亡细胞的百分比。
图7是根据本发明的靶向小鼠的CD137和S100A4通路均降低肝毒性，但保留抗肿瘤免疫。
其中，图7A：显示这三组(抗CD137单克隆抗体(2A)组，RatIg组，抗CD137单克隆抗体(2A)+抗S100A4组)肿瘤生长动力学；图7B：显示这三组血清ALT水平；图7C：肝组织H&E和天狼星红染色；图7D：FACS检测肝组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例和CD8+T的统计分析；图7E：FACS检测肿瘤组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞比例的统计分析；图7F：来自不同组的肿瘤切片中CD8+的代表性IHC染色。
图8是根据本发明的S100A4在抗CD137诱导的肝毒性中的作用机制。其中，CD8+T细胞，主要是记忆T细胞，被肝脏中的抗CD137抗体激活，并分泌大量的IFN-g，导致巨噬细胞的活化和肝毒性。在此过程中，大量的S100A4特异性地产生在肝脏内部，增强了CD8+T细胞的存活，进一步扩大了肝损伤。用靶向S100A4的S100A4阻断抗体会影响CD8+T细胞存活并引起最小的肝毒性。通过S100A4缺乏或S100A4阳性巨噬细胞的删除也可以获得类似的效果。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1：抗CD137单克隆抗体的抗肿瘤作用同时引起严重的肝损伤
实施方案：(1)荷瘤小鼠肿瘤模型建立和抗CD137单克隆抗体治疗：在第0天，将6～8周龄C57BL/6小鼠分成3组(每组n＝5)皮下注射5×105个MC38鼠结肠腺癌细胞系(中国科学院杨新甫提供)，然后在第8，11，14，18天每组分别用100μg抗CD137单克隆抗体，RatIg和PBS腹腔注射。(2)肿瘤生长体积监测(图1A)：荷瘤小鼠经抗CD137抗体(克隆号2A，大鼠IgG2a)、RatIg(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)及PBS治疗后，肿瘤生长体积每2-3天用电子卡尺测量一次，并通过垂直直径相乘来确定，通过图1A可以看出在第30天时，经过抗CD137单克隆抗体(2A)治疗后的肿瘤体积的增长量仅仅为经过RatIg及PBS治疗后的肿瘤体积的增长量的1/3。(3)肿瘤和肝切片染色(图1B)：制备冷冻的肝切片，与抗CD8+，抗CD4+抗体(BDPharMingen，San Diego，CA)，分别孵育，然后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体孵育，进行染色。将肝切片在显微镜(DP71，OLYMPUS)下评估监测CD8+T细胞在肿瘤和肝切片中的浸润程度，通过图1B可以看出，在经过抗CD137单克隆抗体(2A)治疗后的肿瘤和肝切片中的CD8+T细胞浸润程度远远高于经过RatIg治疗后的肿瘤和肝切片中的CD8+T细胞浸润程度。(4)血清ALT(血清谷丙转氨酶)水平监测(图1C)：实验组(荷瘤小鼠)和对照组(非荷瘤小鼠)经抗CD137抗体(2A)和RatIg及PBS处理后使用商业试剂盒(Biosino，北京)测量血清ALT水平，通过图1C可以看出，经过抗CD137单克隆抗体(2A)处理后的血清ALT水平至少是经RatIg或PBS处理后的5倍。(5)肝切片进一步染色(图1D和1E)：制备冷冻的肝切片，分别与抗F4/80，抗Gr-1抗体(BD PharMingen，San Diego，CA)进行孵育，然后用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体孵育，进行染色。将肝切片在显微镜(DP71，OLYMPUS)下评估监测Gr-1和F4/80阳性巨噬细胞在肝切片中的浸润数量，通过图1D-1E可以看出，经过抗CD137单克隆抗体(2A)处理后的Gr-1和F4/80阳性巨噬细胞在肝切片中的浸润数量至少是经RatIg或PBS处理后的24倍。(6)肝连续切片用H&E和天狼星红染色(图1F)：制备7μm厚肝组织切片，在常规处理后，用H&E染色或用含有0.1％天狼星红和0.1％Fast Green的饱和苦味酸用于胶原沉积检测，将肝切片在显微镜(DP71，OLYMPUS)下评估监测肝胶原纤维沉积和肝纤维化，通过图1F可以看出，经过抗CD137单克隆抗体处理后的肝脏胶原纤维沉积和肝纤维化要远远高于经过RatIg处理后的肝切片的胶原纤维沉积和纤维化。(7)实验组(荷瘤)和对照组(非荷瘤)C57BL/6小鼠有或没有进行抗CD137单克隆抗体(2A)处理，检测小鼠血清ALT水平(图1G)，从图1G可以看出，经过抗CD137单克隆抗体(2A)处理的实验组(荷瘤)C57BL/6小鼠血清的ALT水平与进行抗CD137单克隆抗体(2A)处理的对照组(非荷瘤)C57BL/6小鼠血清的ALT水平相当，并且至少是通过RatIg处理的对照组(非荷瘤)C57BL/6小鼠血清的ALT水平的12倍。通过图1A-1G的数据可以得知，虽然抗CD137单克隆抗体具有一定的抗肿瘤作用，具体体现在肿瘤体积减小(图1A),但是其对肝脏会造成一定的损伤，具体体现在肝脏切片中CD8+T细胞浸润程度的显著增加(图1B)，具有Gr-1和F4/80细胞标志物的阳性巨噬细胞在肝切片中浸润数量的显著增加(图1D-1E)，血清ALT(血清谷丙转氨酶)水平的显著增加(图1C)。
实施例2：抗CD137单克隆抗体治疗诱导大量S100A4+巨噬细胞的浸润(图2)
实施方案：(1)抗CD137单克隆抗体和RatIg处理小鼠(图2A)：将6周龄雄性野生型C57BL/6小鼠，每周一次用100μg抗CD137单克隆抗体或RatIg腹腔注射，重复5周。在第1，3，5周指定的时间点收获肝组织进行进一步观察。(2)肝脏切片染色和胶原沉积及S100A4+细胞定量分析(图2B-2D)：制备7μm厚的冷冻肝组织切片，在常规处理后，肝切片用H&E染色或用含有0.1％天狼星红和0.1％Fast Green的饱和苦味酸染色用于胶原沉积检测；将冷冻的肝切片与抗S100A4(Abcam，Cambridge，UK)抗体孵育，随后用AlexaFluor 488或555偶联的第二抗体(Invitrogen，Grand Island，NY)进行染色，将肝切片在显微镜(DP71，OLYMPUS)下评估，通过图2B可以看出，在RatIg处理的肝脏中只能检测到少量的S100A4+细胞，然而抗CD137单克隆抗体(2A)治疗后导致S100A4+细胞随着肝脏中胶原沉积的动态增加而迅速增加，通过图2C可以看出，在用抗CD137单克隆抗体(2A)处理5周后，天狼星红区域至少是对照RatIg组天狼星红区域的10倍，通过图2D可以看出，在用抗CD137单克隆抗体(2A)处理5周后，小鼠肝脏中的S100A4+细胞数量至少是对照RatIg组肝脏中的S100A4+细胞数量的10倍。(3)肝组织双重免疫免疫荧光染色(图2E)：将冷冻的肝切片与抗S100A4(Abcam，Cambridge，UK)，抗CD11b(BD PharMingen，San Diego，CA)，抗F4/80(BD PharMingen，San Diego，CA)，抗α-SMA(Abcam，Cambridge，UK)抗体孵育，随后用Alexa Fluor 488或555偶联的第二抗体(Invitrogen，Grand Island，NY)进行染色。将肝切片在显微镜(DP71，OLYMPUS)下评估，通过图2E可以看出，大多数S100A4+细胞表达巨噬细胞标志物CD11b、F4/80但不表达活化的成纤维细胞标志物α-SMA。(4)肝脏浸润S100A4+细胞表型流式定量分析(图2F和2G)：抗CD137单克隆抗体处理S100A4+/+GFP小鼠(S100A4+/+GFP小鼠购自杰克逊实验室，Bar Harbor，ME，美国)。肝脏非实质细胞(NPC)的分离：使用两阶段胶原酶灌注技术从肝脏中分离细胞。将过滤的细胞以50g离心2分钟以除去肝细胞。收集剩余的非实质细胞，洗涤和分离用40％和70％非线性Percoll(GE Healthcare biosciences，Pittsburgh，PA)梯度系统。肝脏NPC单细胞悬液，染色使用以下直接标记的小鼠特异性单克隆抗体：Percp/Cy5.5标记的抗CD11b(克隆M1/70)，AP标记的抗Ly6C(克隆HK1.4)，PE标记的抗F4/80(克隆BM8)，这些抗体均购自Biolegend，使用的浓度0.2μg/mL。在FACS Calibur(BD Biosciences，San Diego，CA)上收集细胞，并通过FlowJo软件进行分析(TreeStar，Ashland，OR)，通过图2F可以看出，S100A4-GFP+CD11b+、S100A4-GFP+Ly6C+、S100A4-GFP+F4/80+细胞比例相当；通过图2G可以看出，S100A4-GFP+细胞中CD11b、Ly6C和F4/80均高表达。(5)S100A4分子检测分析(图2H)：S100A4+CD11b+和S100A4-CD11b+细胞培养上清液中S100A4浓度用ELISA法检测，从图2H可以发现，S100A4+CD11b+细胞培养上清液中的S100A4+水平至少为S100A4-CD11b+细胞培养上清液中的S100A4+水平的4倍。通过图2A-图2H的数据可以得知，抗CD137单克隆抗体治疗诱导大量S100A4+巨噬细胞的浸润。
实施例3：S100A4+细胞选择性删除减弱了抗CD137单克隆抗体诱导的肝损伤和肝纤维化(图3)
实施方案：(1)小鼠模型的建立：将选择性删除S100A4+细胞的S100A4-TK小鼠(埃里克G.尼尔森，西北大学，费恩贝格学院医学)在每周第1天给予100μg抗CD137单克隆抗体腹腔注射，在每周的第1，3，4，6和7日给予50mg/kg GCV(ganciclovir，更昔洛韦)(湖北科益药业股份有限公司，中国)或PBS腹腔注射，重复治疗4周。(2)小鼠肝切片染色：S100A4-TK小鼠经抗CD137单克隆抗体处理的肝脏切片用S100A4(Abcam，Cambridge，UK)和Ki67(增殖细胞相关的核抗原，标记处于增殖周期中的细胞)抗体进行染色(图3A)，通过图3A可以看出，S100A4+细胞中Ki67抗原的表达表明这些S100A4+细胞是增殖的。S100A4-TK小鼠经抗CD137单克隆抗体和GCV或PBS处理的肝脏切片用S100A4抗体进行染色(图3B)和定量分析(图3C)，通过图3B可以看出，在GCV处理4周后，S100A4-TK小鼠肝脏中浸润的S100A4+细胞数量急剧下降，而PBS处理的S100A4-TK小鼠则没有发生这种情况；通过图3C可以看出，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的肝脏切片中的S100A4+细胞的数量至少为经过抗CD137单克隆抗体和GCV处理的肝脏切片中的S100A4+细胞的4倍。S100A4-TK+小鼠经抗CD137单克隆抗体和GCV或PBS处理的肝切片用Sirius Red染色(图3F)，并对肝切片中天狼星红色区域进行定量检测(图3G)，通过图3F可以看出，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的肝脏胶原纤维沉积远远高于经过抗CD137单克隆抗体(2A)和GCV处理的肝脏胶原纤维沉积(天狼星红染色)，从图3G可以看出经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的天狼星红区域至少为经过抗CD137单克隆抗体和GCV处理的天狼星红区域的3倍。(3)小鼠血清ALT和肝脏MCP-1、TNF-α及S100A4检测(图3D和3E)：使用商业试剂盒(Biosino，北京)测量血清ALT水平；肝脏裂解液MCP-1和TNF-α检测：在冰浴TE缓冲液中均匀化肝脏，将匀浆物以12,000g离心15分钟,收集上清液，MCP-1，TNF-α水平用小鼠炎症细胞计数珠粒阵列(CBA)试剂盒(BDPharMingen)检测。使用FCAP阵列分析数据软件(BD PharMingen)对资料进行分析。目标分子的相对数量：一个样品中的细胞因子的相对数量＝CBA分析的浓度/样品的重量。肝裂解液中S100A4通过夹心ELISA检测，通过图3D可以看出，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的血清中的ALT水平至少是经过抗CD137单克隆抗体(2A)和GCV处理的血清中的ALT水平的1.5倍，通过图3E可以看出，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的肝脏中的S100A4含量至少是经过抗CD137单克隆抗体(2A)和GCV处理的肝脏中的S100A4含量的2倍，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的肝脏中的MCP1含量至少是经过抗CD137单克隆抗体(2A)和GCV处理的肝脏中的MCP1含量的2倍，经抗CD137单克隆抗体(2A)和PBS处理的肝脏中的TNF-α含量至少是经过抗CD137单克隆抗体(2A)和GCV处理的肝脏中的TNF-α含量的1.5倍。从图3A-3G的数据可以得知，S100A4+细胞选择性删除减弱了抗CD137单克隆抗体诱导的肝损伤和肝纤维化。
实施例4：S100A4缺乏减轻抗CD137单克隆抗体的长期肝脏致病作用(图4)
实施方案：(1)二乙基亚硝胺(DEN)/抗CD137单克隆抗体诱导的S100A4-/-小鼠和WT雄性C57BL/6小鼠的肝细胞癌模型(图4A)：15日龄的S100A4-/-小鼠(S100A4-/-小鼠购自杰克逊实验室Bar Harbor，ME，美国)或WT雄性C57BL/6小鼠，将DEN(Sigma-Aldrich)按50μg/g体重溶在0.1mL PBS,第1天单次腹腔注射，在DEN注射一个月后，小鼠接受每周一次100μg抗CD137单克隆抗体或RatIg腹腔注射，连续重复两个月。所有小鼠在DEN治疗后8个月处死进行进一步分析。(2)小鼠的血清ALT水平监测(图4B)，通过图4B可以看出，WT雄性C57BL/6小鼠的ALT水平至少为S100A4-/-小鼠的ALT水平的2倍。(3)小鼠的肝脏肿瘤结节监测(图4C)，肿瘤数量(图4D)，肿瘤最大直径(图4E)和肿瘤重量(图4F)，通过图4C-4F可以看出WT雄性C57BL/6小鼠要比S100A4-/-小鼠的肝脏肿瘤结节大、肿瘤数量多、肿瘤最大直径更大以及肿瘤重量更重。(4)小鼠肝癌组织S100A4+细胞浸润监测(图4G)：收集两组肝组织，用H&E，抗S100A4抗体或天狼星红染色。通过图4G可以看出，大量的S100A4+细胞已渗入肝脏肝癌组织并且在胶原蛋白水平方面，WT也要比S100A4-/-小鼠高得多。(5)DEN/抗CD137单克隆抗体诱导的S100A4-TK和对照小鼠肝细胞癌模型(图4H)：DEN/抗CD137单克隆抗体处理S100A4-TK小鼠和对照小鼠WT，然后给予注射GCV或PBS作为对照达2个月。DEN治疗后8个月，处死小鼠。肝脏肿瘤结节(图4I)，肝肿瘤数量(图4J)，最大肿瘤大小(图4K)和肝脏重量(图4L)。通过图4I-4L可以看出，与对照组WT相比，S100A4-TK小鼠中的GCV治疗后肝细胞癌(HCC)肿瘤数量、大小均约为对照组的1/3，肝脏重量约为对照组的7/10。
实施例5：S100A4增强CD8+T细胞存活(图5)
实施方案：(1)小鼠肝内CD4+和CD8+T细胞浸润分析：S100A4-/-和WT小鼠经抗CD137单克隆抗体治疗4周后，用流式细胞仪检测肝脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞含量(图5A和5B)，通过图5A和5B可以发现，WT小鼠肝脏中的CD4+T细胞含量至少为S100A4-/-小鼠肝脏中的CD4+T细胞含量的1.5倍，WT小鼠肝脏中的CD8+T细胞含量至少为S100A4-/-小鼠肝脏中的CD8+T细胞含量的2.5倍。肝脏NPC单细胞悬液,染色使用以下直接标记的小鼠特异性单克隆抗体：Percp标记的抗CD4+(克隆GK1.5)和APC标记的抗CD8+(克隆53-6.7)。这些抗体购自Biolegend，使用的浓度0.2μg/mL。在FACS Calibur(BD Biosciences，San Diego，CA)上收集细胞，并通过FlowJo软件进行分析(TreeStar，Ashland，OR)。小鼠肝组织中CD4+和CD8+的IHC染色(图5C)。冷冻的肝切片与抗CD8+、抗CD4+抗体(BD PharMingen，San Diego，CA)，分别孵育，然后与Alexa染料标记或辣根过氧化物酶(HRP)偶联的第二抗体孵育。染色后的切片显微镜下评估(DP71，OLYMPUS)检测分析，通过图5C可以观察到，S100A4-/-组较WT组小鼠肝脏中CD4+T和CD8+T细胞总数明显降低。(2)体外可溶性S100A4对CD4+T和CD8+T增殖的影响：在有或无可溶性S100A4的情况下，用抗CD3抗体刺激CFSE标记的脾CD4+和CD8+T细胞，并通过FACS和CFSE稀释法分析T细胞增殖(图5D)，通过图5D可以看出，S100A4对CD4+T和CD8+T细胞的增殖没有影响。(3)体外可溶性S100A4对脾CD4+T和CD8+T细胞凋亡的影响：用FACS和7-AAD及Annexin V双重染色，检测细胞凋亡(图5E和5F)，通过图5E和图5F可以看出，S100A4显著降低了CD8+T细胞的凋亡，但对CD4+T细胞的凋亡无大影响。
实施例6：S100A4通过Akt信号通路抑制CD8+T细胞凋亡
实施方案：(1)S100A4对CD8+T细胞凋亡的影响(图6A)：CTLL-2细胞(由中国科学院院士吴培军)在有或无S100A4(1μg/mL)及S100A4+抗S100A4单克隆抗体(6μg/mL)联合培养3天，FACS分析细胞凋亡。具体：CTLL-2细胞被剥夺IL-2，然后用或不用S100A4和S100A4+抗S100A4抗体一起处理。三天后，收集各组细胞，用PI和Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)染色。在FACS Calibur(BD Biosciences，San Diego，CA)上测试细胞，并通过FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)进行分析，通过图6A可以看出，S100A4显著降低了CD8+T细胞凋亡，凋亡细胞比例约为对照组和S100A4+抗S100A4抗体组的1/2。(2)S100A4对CD8+T细胞caspase-3和caspase-9表达的影响(图6B)：用1μg/mL S100A4刺激CD8+CTLL-2细胞，并在不同时间点分别收集样品进行Western Blotting以检测主要存活相关信号通路。具体：CTLL-2细胞在剥夺IL-2和在有或没有S100A4和抗S100A4单克隆抗体的培养基中培养48小时或72小时。然后收集细胞，用PBS洗涤，裂解。使用的是抗半胱天冬酶-9，抗半胱天冬酶-3(均来自Cell Signaling，Danvers，MA)。使用HRP偶联的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG作为二抗。通过图6B可以看出，S100A4处理后CTLL-2细胞中caspase-3和caspase-9的表达明显降低。(3)S100A4影响CD8+T细胞凋亡的信号通路(图6C)：用1μg/mL S100A4刺激CD8+CTLL-2细胞，并在不同时间点分别收集样品进行Western Blotting以检测主要存活相关信号通路。具体：CTLL-2细胞在剥夺IL-2的情况下在无血清培养基中培养6小时，然后加入S100A4作用5分钟，15分钟，30分钟，45分钟或60分钟，收集细胞，在PBS中洗涤，并裂解。使用的是抗Erk，抗p-Erk，抗Akt，抗p-Akt，抗STAT3，抗p-STAT3，以及抗P65和antip-P65一抗(均来自CellSignaling，Danvers，MA)。使用HRP偶联的山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG作为二抗。通过图6C可以看出，p-Erk和p-Akt表达早在刺激后5分钟就显著上调，表明S100A4可直接激活CD8+T细胞中的Erk和Akt信号通路。(4)Erk或Akt抑制剂对S100A4刺激的CD8+T细胞的影响(图6D)：将Erk或Akt抑制剂加入到S100A4处理的CTLL-2体系中，3天后通过FACS分析凋亡细胞的百分比。具体：CTLL-2细胞被剥夺IL-2，然后用S100A4单独或与抗S100A4抗体，Erk抑制剂或Akt抑制剂一起处理。三天后，收集各组细胞，用PI和Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)染色。在FACS Calibur(BD Biosciences，San Diego，CA)上测试细胞，并通过FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)进行分析，通过图6D可以看出，Erk抑制剂几乎没有什么影响，但Akt抑制剂可以逆转S100A4对T细胞凋亡的抑制作用，因此可以证明S100A4通过Akt通路抑制CD8+T细胞的凋亡。
实施例7：靶向小鼠CD137和S100A4通路均降低肝毒性，但保留抗肿瘤免疫(图7)
实施方案：(1)小鼠模型的建立：我们给WT小鼠注射MC38肿瘤细胞，然后将3组荷瘤C57BL/6只小鼠(每组n＝5)在第8，11，14和18天，分别用RatIg，抗CD137单克隆抗体(2A)或抗CD137单克隆抗体(2A)加抗S100A4单克隆抗体进行腹腔注射；(2)肿瘤生长动力学检测(图7A)，方法如前所述，通过图7A可以看出，通过使用抗CD137单克隆抗体(2A)加抗S100A4单克隆抗体进行腹腔注射，显著降低了肿瘤体积，引起与抗CD137单克隆抗体(2A)单独治疗相当的强抗肿瘤反应；(3)血清ALT水平检测(图7B)，方法如前所述，通过图7B可以看出，通过使用抗CD137单克隆抗体(2A)加抗S100A4单克隆抗体进行腹腔注射，显著降低了ALT水平，较单独使用抗CD137单克隆抗体(2A)治疗肝损伤显著降低；(4)肝脏胶原沉积监测：在第一次注射抗CD137单克隆抗体(2A)后7或14天收集的肝组织用H&E和天狼星红染色监测肝胶原沉积(图7C)，通过图7C可以看出，通过使用抗CD137单克隆抗体(2A)加抗S100A4单克隆抗体进行腹腔注射，大大降低了肝脏胶原沉积；(5)肝脏和肿瘤中T细胞浸润监测：肝脏和肿瘤中CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润比例用FACS分析(图7D和7E)，方法如前所述，通过图7D和图7E可以看出，通过使用抗CD137单克隆抗体(2A)加抗S100A4单克隆抗体进行腹腔注射，较单独应用抗CD137单克隆抗体(2A)治疗，CD8+T细胞在肝脏中的含量降低了约50％，但联合治疗较单独治疗对肿瘤中CD8+T细胞含量影响不大；肿瘤切片中CD8+细胞用免疫组化染色(图7F)，通过图7F可以看出，抗CD137抗体引起的CD8+T细胞浸润到肿瘤中不受添加抗S100A4抗体的影响。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质以及能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质中的至少一种在制备治疗受试者施用抗CD137抗体引起的免疫损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫损伤包括肝脏毒性、狼疮、自身免疫性脑脊髓炎和关节炎。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肝脏毒性包括肝脏胶原纤维沉积和肝纤维化。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质以及能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质不影响抗CD137抗体的抗肿瘤的作用。
5.一种用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
抗CD137抗体，
以及抗S100A4抗体、致机体缺乏S100A4的物质和能删除机体S100A4阳性巨噬细胞的物质中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的应用或权利要求5所述的用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，所述抗CD137抗体为抗CD137单克隆抗体，可选的为抗小鼠CD137单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的应用或权利要求5所述的用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，所述抗S100A4抗体为抗S100A4单克隆抗体，可选的抗小鼠S100A4单克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的应用或权利要求5所述的用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，所述抗小鼠S100A4单克隆抗体是通过用S100A4蛋白免疫BALB/c小鼠制备得出的。
9.根据权利要求5所述的用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，抗CD137抗体的注射剂量为90-110μg/次，可选的，抗CD137抗体的注射剂量为100μg/次。
10.根据权利要求5所述的用于癌症免疫治疗的组合物，其特征在于，抗S100A4抗体的注射剂量为3-5mg/kg，可选的，抗S100A4抗体的注射剂量为4mg/kg。
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