JP2801228B2 - キメラ性非ヒト動物及びそれらの使用 - Google Patents

キメラ性非ヒト動物及びそれらの使用

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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫無防備状態の宿主動物中における正常
な異種移植細胞の増殖に関する。特に、異種移植造血細
胞及びその造血システムに関連する器官が製造される。
〔発明の背景〕
遺伝子変性された動物の製造及び使用は、生物学的分
野においてひじょうに興味あるものであり、ここで胎児
細胞が変性され、モザイクが得られ、これらの両親から
種々の表現型の新生児が得られ、異種移植生成物が哺乳
類の体液、たとえば乳中に産生され、分化された動物の
相違を、生理学的過程、病気の罹感性及び伝染、生成物
の製造、及び目標のものを理解するために使用すること
ができる。
多くの場合、ヒトは、すべての哺乳類の中で独特であ
る。人の殺害は特に殺人の呼ばれ、そして法律は、他の
種と比べて、人間に影響を与える活動に関してより一層
厳重である。
薬剤及び他の治療処理を研究する場合、動物は、まず
初めにその薬剤又は処理が人間に対して安全かどうかを
決定するために試験される。ひじょうにまれではあるが
科学的調査のために人間が使用される。多くの場合、そ
の処理はまず下等動物で試験され、その後、人間に使用
される。従って、ヒト生成物の開発及び人間に独特であ
る疾病の評価がひじょうに難かしい。なぜならば、ヒト
以外のヒト生成物を得ること又は人間の実験について安
全に推定し得る動物のモデルを開発することはしばしば
難しいからである。多くの場合、動物、たとえばマウ
ス、ウサギ、ラット及び霊長類についての実験は、ヒト
による実験を予言するものとしては不十分であることが
知られている。
従って、ヒト生成物、たとえばヒト細胞又は組織の産
生を可能にするシステムを開発することが実質的な興味
の対象である。商業的に有意な量でこれらの生成物を産
生する能力は、ヒトのいとなみ、すなわち自然及び疾病
のいとなみ、並びに生理学的工程の診断及び処理におけ
るヒト生成物の使用を研究する能力に対して特別な刺激
効果を有するであろう。
〔関連文献〕
免疫不全宿主、特にCID又はSCID宿主に関する参考文
献として次のものを含む： McGuireなど.,Clin.Immunol.and Immunopath.（1975）
3:555〜566;Perryman and Torbeck,J.Am.Vet.Med.Asso
c.（1980）176:1250〜1251;Schultz and Sidman,Geneti
cally−determined Murine Models of Immunodeficienc
y,The Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME;Bosmaなど.,Nature （1983）301:527〜530;Custerなど.;Amer.J.Path. （1985）120:464〜477;Dorshkindなど.,J.
of Immunol.（1985）134:3798〜3801;Kerghtleyなど.,L
ancet,11月１日、1975,850〜853;Touraine,Immunologic
al Rev.（1983）71:103〜121;及びFulop and Phillyes,
J.of Immunology（1986）136:4438〜4443。
生存動物内で増殖する異種移植細胞に関する参考文献
として次のものを含む:Krnegerなど.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA（1983）80:1650〜1654;Krneger and Shelby,J.I
nv.Dermatol.（1981）76:506〜510;Wareなど.,J.Immuno
l.Meth.（1985）85:353〜361;Fordなど.,Nature（195
6）177:452〜454;Dovlsenなど.,Nature（1974）248:247
〜249;Mannhardtなど.,Thymus（1982）4:209〜220;Schu
lte−Wissermanなど.,Scand.J.Immunol.（1978）8:387
〜396。特に次のものを注目すること:McCuneなど.,Scie
nce（1988）241:1632〜1639及びその中の注釈;Yancopou
los and Alt,前記（1988）241:1581〜1583、及びその中
に引用された文献。
〔発明の要約〕
生存する異種移植動物中における機能的な正常の細胞
及び器官の増殖のための方法、組成物及び生物体が提供
される。正常な供与体哺乳類細胞を、特に欠損を補うた
めに免疫無防備状態の異種移植動物中に導入し、そして
キメラ性動物中において増殖させ、それによってその供
与体細胞がキメラ性動物において実質的に正常な態様で
機能し、分化し、増殖し、供与体動物にとって生来の価
値ある生成物を産生し、そして特に供与体哺乳類につい
ての調査又は使用のために、細胞及び生成物を提供する
ことができる。
〔特定の態様の記載〕 異種移植動物、通常哺乳類（ここで子孫細胞が異種移
植動物中において機能することができる）中において、
細胞、特に未分化（“幹”）細胞を分化し、そして増殖
せしめる方法が提供される。
それらの細胞を増殖させ、そしてそれらの細胞、たと
えば子孫細胞にとって生来の生成物を生成させ、そして
前記生成物は、研究、抗体の産生、移植物として生理学
的に活性な生成物の産生に、及び多くの他の用途に使用
し得る。その方法は、キメラ性動物を供給するために、
受容体動物中の適切な部位又は環境への細胞の導入を含
む。特に、１以上のタイプの細胞を、異種移植動物中に
導入でき、ここで、種々の細胞が相互作用し、細胞機能
の成熟、分化又は発現を提供する。
本発明が、主に複雑な免疫システムを有する異種移植
動物に関連する場合、その異種移植動物は哺乳類であろ
う。次の記載においては、その論議は哺乳類に向けられ
るであろう。しかしながら、多くの場合、哺乳類以外の
動物を使用し得ることが理解されるべきである。そのよ
うな他の動物は、より複雑でない免疫システムを有する
鳥類、魚類、動物を含む。
本発明は、免疫無防備状態の動物における欠損を補足
することができる哺乳類異種移植細胞、組織及び／又は
器官（“移植物”）を導入することに適用できる。所望
により、その移植物は幹細胞を含んで成る。免疫無防備
状態の動物は、移植物に対して同系又は同種である異種
移植免疫系を有する。
種々のシステム、たとえば幹細胞を、動物に使用し得
る。この免疫無防備状態の動物は、種々の異種移植細胞
及び生理学的システムのための容器として使用すること
ができ、前記細胞及びシステムが分化し、そして機能す
ることができる環境を提供する。
多くの場合、異なった細胞又は器官が相互作用するこ
とができる細胞の組合せを導入することが所望されるで
あろう。たとえば、造血幹細胞は、胚卵黄嚢、胎児肝
臓、胸腺、脾臓又はリンパ節組織、胎児又は成人骨髄組
織、脾臓組織、虫垂組織、扁桃組織及び同様のものと一
緒に動物中に導入され得る。他の幹細胞系も使用され得
る。造血システム以外においては、組合せは、中枢又は
末梢神経システム、たとえば胎児の中枢神経システム、
脊髄ニューロン及び脊髄のニューロン又はマトリックス
細胞、内分泌システムの器官、たとえば小島及び膵臓の
Ｂ−細胞及び他の細胞、副腎、胸腺及び視床下部下垂体
軸の幹細胞を含むことができる。これらの幹細胞は、そ
れらの個々が分化し、そして機能的になることを誘発さ
れる適切な器官と一緒に導入される。
欠損を補足する例は、造血細胞及び器官組織の使用で
あり、ここで幹細胞（種々のヒト造血系のための前駆体
細胞）及び処理器官を提供する細胞、たとえば胸腺の組
合せが、骨髄、脾臓及び／又はリンパ節と一緒に、哺乳
類の異種移植免疫無防備状態動物中に導入され、種々の
分化された細胞、たとえば単球、マクロファージ、Ｂ−
細胞、Ｔ−細胞、好中球、赤血球、好酸球、血小板及び
同様のものが産生され、そしてこれらの細胞が末梢血液
循環中に供給される。その分化された細胞は、特に末梢
血液器官、たとえば脾臓、膵臓、リンパ等、扁桃、等が
同系又は同種である場合、それらの器官に生存するであ
ろう。従って、適切な器官の組織と一緒に造血幹細胞
は、種々の中間及び成熟造血系へのその幹細胞の成熟化
（分化）を提供することができる。
多くの場合、移植された異種移植組織／器官は、それ
ぞれ自己免疫疾患を研究するための病因物質、たとえば
関節滑液及び／又は甲状腺組織、又はヒト造血及び心臓
栄養ウィルスを研究するための肝臓又は心臓組織のため
の標的を表わす。
所望する免疫無能性を有する免疫無防備状態の哺乳類
が存在し、又は創造され得る。たとえば、scid/scid宿
主として知られている、重症複合免疫不全の動物か利用
できる。ゲッ歯類、特にマウス、及び馬が、現在scid/s
cid宿主（この後SCID宿主として言及する）として使用
できる。そのSCID宿主は、Ｂ−細胞及び／又はＴ−細胞
機能を欠いている。SCIDマウスにおいては、遺伝的な欠
失は、非機能的なレコンビナーゼであるように思われ
る。というのは生殖系、DNAは機能的な表面免疫グロブ
リン及びＴ−細胞受容体を産生するために再配列されな
いからである。免疫無防備状態の宿主はまた、非機能的
な胸腺、幹細胞を破壊するための照射、幹細胞特異的細
胞毒性物質による処理、急速に分割する細胞に対して特
異的な細胞毒性物質、抗−アシアログリコプロテイン又
は同様のものの結果である。最少限度で、通常、免疫無
防備状態の異種移植宿主は、特にＢ−及び／又はＴ−細
胞生殖系の再配列中における遺伝的欠失として、機能的
なＢ−及びＴ−細胞を欠失するであろう。従って、多く
の場合、その免疫無防備状態の宿主は、免疫システム、
たとえば胸腺、脾臓、リンパ節、特に関連する機能的な
器官を有することができる。
免疫無防備状態の宿主は、免疫無防備状態の宿主と他
の対象の表現型を有する宿主との間での交配によりさら
に変性され得る。たとえば、C.B17scid/scid株は、低い
か又はまったくNK活性を有さない適切なネズミ株により
戻し交雑され得る。この場合、Ｔ−,B−、及びNK細胞を
欠くマウス株が産生される。そのような宿主は、より許
容され、そして異種移植組織及び細胞を保持するであろ
う。
他方、宿主は、宿主中に遺伝的欠損を導入するために
交配され、負のバックグラウンドにおける異種移植組織
の研究又はバックグラウンド欠失に対する異種移植組織
の効果の研究を可能にさせる。たとえば前記のような糖
尿病の特徴、造血系、たとえばＢ−サラセミア、鎌状細
胞、等の欠失、又は同様のものを宿主中に戻し交雑し得
る。
欠失は天然に存在しても良く又は誘発されても良い。
たとえば糖尿病を誘発するためには、免疫毒素をランゲ
ルハンス細胞に使用し得る。成熟ランゲルハンス細胞を
破壊することによって、異種移植ランゲルハンス細胞を
導入し、そして異種移植ランゲルハンス細胞についての
条件及び化合物に関する影響を研究をすることができ
る。パーキンソン症候群は、MMTAによる処理、実質的に
は宿主のドパミンニューロンを破壊することによって引
き起こし得る。脾臓を手術により除去し、そして異種移
植性膵臓組織を導入する。他方、化学物質を、宿主の膵
島のβ−細胞を選択的に破壊するために使用し得る。宿
主を照射し、そして異種移植性骨髄を導入し得る。
従って、広範囲の種類の細胞、組織及び器官、並びに
それらの生存率及び機能に対する種々の条件及び生理学
的に活性な化合物の影響を、生体内研究し得る。移植さ
れた免疫システム及び移植された他の細胞、組織及び器
官が類似上少なくとも同種である場合、その状態は、移
植された細胞、組織及び器官に関して天然の状態により
類似する。
異種移植器官を、特に免疫無防備状態の動物の生理学
的条件下でヒト生成物を産生することができる組織とし
て導入し得る。疾病経路に遺伝的にかかりやすく、又は
そのような応答が誘発され得る組織、たとえばタイプ１
糖尿病組織；ヒト免疫攻撃の標的物、たとえば滑組織；
又は微生物攻撃を受けやすい標的物、たとえばA,B又は
非Ａ、非Ｂ型肝炎、又はマラリヤ感染の肝臓組織；及び
同様のものが特に興味の対象である。
異種移植動物は、ヒト以外の免疫無防備状態の哺乳類
であり、ここで大部分、供与体細胞はヒト細胞であろ
う。異種移植動物と同じ種類のメンバー以外の源からの
細胞も使用され得る。免疫無防備状態の動物は種々の方
法で免疫無防備状態にされ得、そしてここでその結果
は、機能的なＴ−及びＢ−細胞の実質的な欠失であろ
う。異種移植動物は、種々のレベルで免疫無防備状態の
動物をもたらす欠失を有することができる。この欠失
は、機能的な抗体発現性リンパ球又は抗体非依存性リン
パ球、たとえばナチュラルキラー（NK）細胞、リンフォ
カイン活性化キラー（LAK）細胞、抗体依存性細胞毒性
（ADCC）細胞、腫瘍侵入性リンパ球（TIL）、マクロフ
ァージ、等の損失をもたらすことができる。
現在利用できるマウス及び馬以外のいづれの哺乳類で
も使用され得、そしてこれらの宿主として、羊類、牛
類、ウサギ類、霊長類（ヒト以外のもの）、豚類、犬
類、ネコ類、等、又は他の温血脊椎動物、たとえば鳥類
を挙げることができる。実験用動物、たとえばマウス、
ラット、テンジクネズミ、たとえばカピバラ（capybar
a）、及びウサギ、並びに家畜、たとえばヒト以外の霊
長類、牛類、羊類、豚類又は目標のものが特に興味の対
象である。異種移植動物は通常、その哺乳類の細胞源と
は異なる種類のものである。
導入されるべき細胞が固体器官を提供するため存在す
るいづれかに依存して、種々の部位が細胞の導入のため
に選択され得る。これらの部位は、導入されるべき組織
が固体器官をもたらし又は分散された細胞を提供するか
いづれかに依存して、変化するであろう。導入のための
部位は、脾臓被膜下、腹部壁、筋肉、腎被膜下、腹膜
下、腹膜の内層下、脳、皮下系、血管系、脾臓、脊髄、
血液、肝臓、種々の組織の膜サック又は被膜、腹膜後空
間、皮膚、生殖器官、等を含むことができる。通常、機
能的な器官中で増殖するであろう前駆組織が導入される
であろう。組織の導入は、注射、移植又は血管内カテー
テル、トロカール及び／又は手術による切開、又は同様
のものを用いて、供与体及び受容体の血管（及び必要な
ら他の管）の連結により達成し得る。対象の組織又は細
胞は、正常な組織又は細胞（悪性又は欠陥組織又は細胞
とは異なるような）であり、そして造血系、中枢神経
系、自律神経系、脳、肝臓、骨髄、骨、消化系、生殖
系、膀胱、胆ノウ、関節、膵臓、網膜、神経、脾臓、副
腎、等に関連される。造血システムに関連する器官又は
部分に関しては、リンパ節、肝臓、胸腺、リンパ管、静
脈、動脈、弁、毛細管、骨髄、皮膚、虫垂、扁桃、等が
特に興味の対象である。使用され得る他の器官として、
脳、たとえば大脳、小脳、延髄、皮質、脳橋、脳梁、大
脳脚、海馬、視床、神経節、等からの組織、及びそれら
の部分を含む。他の組織、たとえば胎盤組織、滑膜組
織、血管組織、食道組織、膜組織、平滑筋組織、筋組
織、骨組織、心筋組織、軟骨、粘膜、等も含まれる。
多くの場合、欠陥組織又は細胞は、遺伝的疾病を調
べ、欠陥DNAの源を拡張し、薬物効果及び処理法を研究
するために増殖し得る。対象の組織として、β−サラセ
ミア細胞、ハンチントン病又はダケニー症候群に関連す
る細胞、胎児奇形に関する細胞、たとえばトリソミー2
1、糖尿病性膵臓からの細胞、アルツハイマー病又は重
症筋無力症を有する患者からの細胞及び中枢神経系、等
の他の障害からの細胞を挙げることができる。
組織源は、組織又は器官の性質に依存して、胚の卵黄
膜から少なくとも約４週間、より普通には少なくとも約
６週間の妊娠期間までの胎児組織、及び成人の組織まで
変化することができる。好ましくは、その組織は、約３
才以下の子供、好ましくは約１才以下の子供及び新生児
又はそれ以下のもの、より好ましくは約７〜24週の胎児
のものである。
異なった器官からは、異なった年齢の組織が好まし
い。胎児組織のためには、所望により、約15週又はそれ
以上の妊娠期間妊娠週間，（g.w.）、好ましくは16〜20
週の妊娠期間の胎児からのヒトリンパ節であり；ヒト胸
腺のためには、約９〜24g.w.、好ましくは約20g.w.以下
の胎児からのものであり；骨髄組織のためには、約16〜
24g.w.までの胎児からのものであり；そしてヒト胎児肝
臓のためには、約10〜24g.w.、好ましくは約13〜22g.w.
の胎児からのものである。
組織は、死から約48時間以内で得られた新鮮な組織、
又は死から約12時間以内に凍結された組織であり、そし
て約−10℃以下、通常約液体窒素温度（−70℃）で維持
される。組織は、キメラ性動物に移植された器官からの
ものであり、ここで前記組織は、移植の後、２〜４週目
又はそれ以上で除去され得る。この場合、哺乳類源から
元来得られた組織は、ひじょうに増殖され、実質的に
は、得られるキメラ性動物の合計数を高めることができ
る。そのキメラ性動物から得られた組織は、元の組織源
から得られた組織に類似して処理され得る。組織は、付
着された基質要素から放たれた個々の細胞として、分散
物として、又は一般的に約0.5mm〜4mm、より普通には約
1mm〜2mmの大きさ及び約１〜2mmの範囲の厚さの小さな
組織片として提供され、その結果、その切片は、普通便
利には約15〜20ゲージの、移植のために使用されるトロ
カール中に容易に固定し得る。通常、細胞は、延長され
た期間、たとえば３日間又はそれ以上イン ビトロ培養
にゆだねられるべきでない；しかしながら、特定の目
的、たとえば移植前培養のためには、イン ビトロが所
望される。多くの場合、完全な器官の移植片は、供与体
及び宿主の血管、リンパ管及び他の管、たとえば尿管、
物を吻合することによって移植し得る。
適切な場合、分散された細胞を使用することができ、
ここで適切な器官が、懸濁液中に生存細胞を得るために
別々に処理されている。所望により、その懸濁細胞は、
特に対象の細胞のために富化し得る。たとえば、胎児の
肝臓細胞に関しては、その懸濁細胞はフィコール−ハイ
パーク密度勾配遠心分離により造血前駆体のために富化
し得る。細胞はまた、他の技法、たとえば螢光活性化細
胞分類法、パンニング法、磁気ビーズ分離法、遠心場内
での溶離法、又はロゼット法により富化し得る。
多くの場合、他の細胞を殺し又は除去することによっ
て細胞を富化することが所望される。これは、補体の存
在下で所望しない細胞に対して特異的なモノクローナル
抗体を使用することによって、又は細胞毒性物質、たと
えば毒素、たとえばリシン、アブリン、ジフテリア毒素
又は放射性ラベル、たとえば131I又は同様のものに結合
することによって達成し得る。混合物の性質に依存し
て、所望する又は所望しない細胞のいづれかの特異的な
分離を可能にするイムノアフィニティーカラムを使用し
得る。
受容体哺乳類は、種々の免疫欠損にゆだねることがで
きる。非機能的なＴ−及びＢ−細胞をもたらす欠失が特
に興味の対象である。そのような異常機能は、SCID（重
症複合免疫不全）動物により達成され得る。現在のscid
/scid種は、マウス及び馬を含む。将来においては、た
とえば遺伝子間細胞消耗技法を用いて、他の種のscid動
物を開発し得る。他の機能不全は、Ｔ−細胞及びＢ−細
胞機能に関連する表面膜タンパク質の欠乏、非機能的な
幹細胞、無能な受容体、たとえば無能なＴ−細胞受容体
及び表面免疫グロブリン受容体、Ｔ−細胞及びＢ−細胞
成熟の欠乏、ナチュラルキラー細胞の活性の欠乏、及び
非機能的な胸腺、リンパ節、脾臓又は骨髄支質を含むこ
とができる。
表現型欠乏の他に、さらに免疫適格性の減少は、宿主
の照射又は前に示されたような免疫細胞毒性ラベル、た
とえばリンパ球（たとえばナチュラルキラー細胞）又は
骨髄単球系の細胞に対して特異的な抗体の使用により達
成し得る。特に、免疫適格性が動物中に導入された組織
により提供される場合、生来の免疫適格性は、動物の特
定の表現型に天然に依存する低レベル以上に増強され得
る。
適切な場合、１又は複数の器官を特定の目的のために
除去し得る。たとえば脾摘出は、循環性赤血球細胞及び
他の造血細胞の長期再構成を提供するために行なうこと
ができる。他の器官もまた、異種移植器官の導入及び研
究のために除去し得る。骨髄を、異種移植骨髄の導入の
ために除去又は選択的照射により破壊することができ
る。基質細胞を除去し、異種移植幹細胞のためにより天
然の環境のための異種移植基質細胞を提供することがで
きる。
宿主は、普通免疫適格性宿主の正常な寿命の約20％以
下、通常正常な寿命の約１〜20％の年齢のものであろ
う。一般的に、宿主は、少なくとも約３週齢及び所望の
部位での哺乳類細胞の導入のために操作するために十分
な大きさであろう。たとえば、約２〜４年の寿命を有す
ると思われるマウスは、約３〜10、普通４〜８週の年齢
で使用される。動物内での組織の増殖は、器官により、
普通少なくとも５倍、より普通には少なくとも10倍異な
り、そして大きさ（体積）では100倍又はそれ以上であ
ろう。
動物中に導入される組織、宿主の性質及び使用される
組織の組合せに依存して、種々の結果を達成し得る。造
血システムにおいて、細胞、特にＴ−細胞及び／又はＢ
−細胞の群及び亜群の産生が興味の対象である。たとえ
ば、キメラ性動物において同じ種類（同種又は同系）か
らの胸腺と一緒に胎児肝臓幹細胞を用いることによっ
て、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞及び骨髄単球細胞（その宿主源
にとって生来である）を産生し得る。Ｔ−細胞及びいづ
れか他の宿主源細胞の産生は、組織宿主源からの種々の
リンフォカイン、サイトキン、成長因子を哺乳類宿主中
に導入することによって増強し得る。この場合、所望す
る細胞の増殖をさらに増強し得る。例示的な因子とし
て、インターロイキン１〜７、特にIL−1,−２、及び−
3;M−,G−、及びGM−コロニー刺激因子、インターフェ
ロン−α，β−、及び−γ、モノキン、成長因子、等の
それぞれを挙げることができる。添加し得る量は、用い
られた哺乳類の性質、細胞の性質及び因子の性質に依存
して変化するであろう。
Ｔ−及び／又はＢ−細胞の特定の亜群を増強するため
には、哺乳類が対象の抗原により感作され、特定の抗原
に結合するＴ−細胞及びＢ−細胞の群を拡張される。哺
乳類は、所望する群をさらに増強するために追加免疫化
され得る。この場合、抗原に対して特異的であるＢ−細
胞が産生され、そして従来の手段でハイブリドーマを産
生するために適切な融合パートナーとの融合のために脾
臓細胞、リンパ節リンパ球又は他の末梢リンパ球として
使用され又はEBVにより不死化され得る。種の骨髄細胞
は、アメリカ特許第4,574,116号；第4,594,325号；及び
第4,451,570号に報告されているように霊長類、特にヒ
ト細胞との融合のために存在する。他方、Ｔ−細胞は、
不死化され、Ｂ−細胞を刺激するために使用し得るＴ−
細胞を担持するＴ−細胞受容体、免疫優性配列を評価す
る混合されたリンパ球反応、Ｂ−細胞のためのアフィニ
ティーカラム（特に免疫優性配列と一緒に）、又は適切
な（たとえば悪性）標的細胞に対する細胞毒性又は炎症
反応が提供される。
さらに、単球、顆粒球、マクロファージ、好酸球、好
中球、骨髄細胞、幼若細胞、前駆体細胞及び同様のもの
の種々のコロニィーが産生され、そして単離される。
また、キメラ性の動物における外来性（異種）組織の
存在は、生存動物における外来性細胞の増殖、生存性、
分化、成熟化、トランスフォーメーション又は同様のも
のに対する種々の化合物の影響を研究するために使用さ
れ得る。従って、キメラ性動物を、疾病の徴候又は表示
についての条件を変化させたときの影響を研究するため
に使用し得る。“条件”とは、物理的、化学的又は生物
学的特性、たとえば温度、電位、イオン強度、薬物、ト
ランスフォーメーション、等を示す。
通常、組織は血管形成される。従って、種々の薬物を
キメラ性動物に投与し、そして特定の組織に対する影響
を非侵入又は侵入技法により決定し得る。非侵入技法と
して、NMR,CATスキャン、螢光顕微鏡、レントゲン写真
法、放射性核種スキャンニング、超音波検査法、心電
計、脳波計、誘発された電位、等を挙げることができ
る。侵入技法として、生検、剖検、開腹手術、腹腔鏡検
査、断続的な静脈血サンプリング又は静脈カテーテル、
等を挙げることができる。便利には、種々の装置、たと
えばカテーテル、電極、等の配置を連続的なモニターリ
ングのために行ない得る。従って、キメラ性動物は、種
々の外来性組織に対する種々の化合物の発癌性、種々の
外来性組織の増殖及び生存性に対する影響、化合物、た
とえば薬物の組合せの影響、又は同様のものを決定する
ために使用し得る。さらに、外来性組織の病原感染を提
供することによって、病原体から動物組織を保護するこ
とにおける種々の薬物の影響、及び組織環境における病
原体に対して細胞毒性であり又はその病原体を抑制する
種々の薬物の影響を決定し得る。
キメラ性動物はまた、外来性組織に対する種々の薬物
の細胞毒性を評価するために、たとえば調査用の新規薬
物適用のためにスクリーニングするためにも使用し得
る。さらに、キメラ性動物は、薬物の効力、安全性及び
生物利用性に関してそれらの薬物を評価するために使用
し得る。
供与体動物からの組織、特に同系組織又は同種組織が
キメラ性動物中で器官に増殖され、そして次にその器官
を受け入れることができる種である他の受容体に移植さ
れるように、器官は移植のために増殖させることができ
る。細胞は、新規の表現型を導き出し、欠陥表現型を正
すために、種々の操作、たとえばトランスフェクション
にゆだねられる。
哺乳類宿主は、従来の方法で増殖せしめられるであろ
う。哺乳類宿主の免疫無防備状態宿主の程度に依存し
て、哺乳類宿主は感染からの程度を変えるために保護さ
れ得る。従って、多くの場合、無菌環境又は予防抗体が
必要である。予防抗体は、25〜75mgのトリメトプリム及
び100〜300mgのサルファメトキサゾールの懸濁液5mlに
よりSCIDマウスのために達成され得る（週当り３日投与
される）。他方、帝王切開の後、無菌環境において他の
動物から可能性ある異種移植宿主を分離することが、適
切である。キメラ性動物の飼育及び維持は、大部分、従
来の技法に従がうであろう。
外来性細胞は、少なくとも２週間、通常少なくとも４
週間存在し、そして３ヵ月又はそれ以上にわたって連続
して存在することができる。多くの場合、正常な細胞、
組織及び／又は器官は、安定して維持され、そして少な
くとも３〜６ヵ月間、時々少なくとも10ヵ月間機能する
ことができる。
外来性細胞は、キメラ性免疫適格動物中に生存して残
存することができ、そして動物源中で機能することがで
き、そして時々、異種移植動物中で機能することができ
る。すなわち、正常な代謝過程を行なう他に、それらの
細胞は、リガンドに応答し、シグナルを変換し、適切な
生成物を分泌し、そしてそれらの野生型環境中において
同系又は同種細胞により行なわれるように正常な機能を
行なうであろう。さらに、器官が関与される場合、細胞
は、器官の機能のために適切な構造を有する組織集合体
として定義されるであろう。
キメラ性動物は、幹細胞が増殖し、そして分化するこ
とができる環境を提供するためにその能力に関連する種
々の態様で使用し得る。従って、受容体動物は、同種又
は異種であることができる。細胞組成物における幹細胞
の存在を検出するために使用し得る。細胞組成物、たと
えば骨髄は、たとえば螢光活性化細胞ソーター（“FAC
S"）を用いて画分に分離し得る。次に、それらの画分
は、受容体動物の血管中に注入し得る。細胞が分化する
ように十分な時間過ぎた後、末梢血液リンパ球又は他の
造血細胞、たとえば赤芽細胞、骨髄細胞及び血小板を得
るために受容体動物から組織又は血液が取り出される。
必要ならば、成熟細胞がその幹細胞から起源を発するこ
とを確かめるために、前記幹細胞は、受容体動物中に存
在することができる他の造血細胞からの種々のMHC抗原
を有する幹細胞について、MHCの型を検出される。種々
の造血系の成熟細胞の存在は、前駆体細胞の表示であ
り、そしてすべての系統の存在は幹細胞の表示である。
さらに、PACSは、細胞集団を決定するために都合良く使
用し得る。
本発明の例示のように、約６〜８週のSCIDマウスが使
用される。ヒト胸腺組織、脾臓、リンパ節組織及び肝臓
組織が腎被膜中に導入される。移植の後４週間で、胎児
の肝臓組織細胞を静脈中に注入する。移植の後９週間
で、マウスが、完全フロイントアジュバント中、生存す
るE.コリJ5生物の10個の細胞の溶液2mlにより感作され
る。前記突然変異による生物は、暴露されたコア脂質Ａ
を有する。移植の後11週間で、不完全フロイントアジュ
バント中、E.コリJ5の105個の細胞の溶液により２回目の
感作が行なわれる。３日後、マウスは採血され、ヒト起
源のPBL、及び／又はリンパ節及び／又は脾臓細胞が、
アメリカ特許第4,574,116号に記載される異種骨髄腫と
融合される。そのハイブリドーマを拡張し、限界希釈法
下でクローン化し、そしてそのクローンをコア脂質Ａに
対する抗体のためにスクリーンする。その得られたヒト
抗体は、菌血症及び過敏性ショックに対する保護のため
にスクリーンし得る。
もう１つの例は、疾病を研究するためにキメラ性動物
の使用である。たとえば、ヒト胎児の肝臓組織、胸腺組
織及びリンパ節組織が導入されたキメラ性マウスをHIV
の研究のために使用し得る。胎児の肝臓組織の導入の後
４週間でＴ−細胞のレベルがおよそ最大に達した後、マ
ウスは、HIVの104個の感染単位の投与量による静脈内注
射により感染される。１週間後、感染が起こったことを
確認するために生検が行なわれる。次に、マウスは、HI
Vに対する治療物質をスクリーンするために使用され得
る。たとえば、５〜50mg/kgの抗−CD4が、一連の生検に
よる感染の間、３日〜１週間にわたって毎日の投与量と
して添加される。次に、感染のレベルを減じる抗体が、
ヒトに使用する前、投与の経過を変えるために使用され
る。
次の例は例示的であって、制限するものではない。
〔実験〕
〔方法〕 1.マウス C.B17scid/scidマウスを、The Jackson Laboratory,B
ar Harbor MEのDr.Leonard D.Shultzから得た。そのマ
ウスを、通常の動物保持装置内の標準の隔離かごの中に
収容する。これらの条件下で、それらは、他の免疫適格
近交系の寿命よりも相当に短い寿命を有する（たとえば
１〜２年対３〜４年）。死の原因は通常、日和見感染
〔ほとんどプネウモシスチス カリニイ（Pneumocystis
carinii）による〕に関連する。マウスに予防抗体
（トリメトプリム／スルファメトキシアゾール）を投与
することによりそのような感染を防ぐための方法が、AI
DS又はARCを有する患者の予防のために開発された方法
をガイドラインとして用いて、使用される（上記を参照
のこと）。すべての他の観点（たとえば、ベッド、食
料、毎日の光の循環、等）において、マウスは毎日の動
物保持装置により処理される。
2.ヒト胎児の組織の採集及び調製 患者について既知である情報は、胎児のおおよその妊
娠期間及び流産のための一定の理由を含む；後者の場
合、羊水分析及び又は超音波検査により発見された遺伝
的又は形態的異常性（たとえば染色体欠失、無血液栄養
症、水症、等）の詳細が知られている。初期実験におい
ては、明らかに正常である胎児からの組織が使用され；
後期実験においては、遺伝的異常性を有する胎児からの
組織が使用される、特別に構成された状況が創造され
た。
選択的又は医学的に示図された流産（７〜24週の範囲
の妊娠期間）の後、組織を、胎児の一部として手術室で
直接得る。厳重な殺菌をほどこさないで、これらの部分
を即座に切開室に移した。所望する組織を同定し、切開
し、10％ウシ胎児血清を有するRPMI1640媒体中に移し、
そしてもう１つの実験室に直接的に移した。“完全な器
官”の移植（すなわち、その中に基質要素及び造血要素
の両者を含む組織）が行なわれる場合、適切な器官を、
およそ1mm×4mmの部分に切断する。（この大きさの組織
の断片は、移植のために使用される19−ゲージのトロカ
ール中に容易に固定する。）分散された細胞が注入され
る場合、適切な器官を、生存細胞の懸濁液を得るために
一部剥離する。胎児の肝臓の場合、その懸濁細胞は、フ
ィコール−ハイパーク密度勾配遠心分離により造血前駆
体のために富化され；次に所望する細胞を含む界面層
を、３度洗浄し、計数し、そしておよそ108細胞/mlにす
る。幹細胞前駆体のサブ分別のために、フィコール−ハ
イパーク密度勾配上で単離された胎児の肝臓細胞を続い
て、適切な細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗
体により染色し、そして磁気ビーズによる負の選択及び
FACS上での正の選択を含む技法により単離する。
供与体の胎児組織の遺伝的な起源をマークするため
に、HLA組織型決定を、共通のHLA対立遺伝子を認識する
モノクローナル抗体（下記を参照のこと）を用いて、胎
児の胸腺リンパ球に行なった。この場合、移植する前、
組織型決定された“フィンガープリント”は、導入され
た幹細胞のすべての続く子孫が、SCID−huマウス中で特
異的にあとを継ぐことによって得られる。
組織は、できるだけ新鮮な状態で導入される。従っ
て、組織採集、調製、組織型決定及び移植は、同じ日に
すべて行なわれる。しかしながら、凍結組織は、胎児の
肝臓細胞及び胎児の胸腺組織の場合、よく作用するよう
に思われる。従って、それぞれの検体からの残存する組
織のアリコート（10％DMSO/50％FCS）を、標準方法を用
いて、その日の終りに凍結せしめ、そして次に液体窒素
貯蔵フリーザーに保存する。
3.SCIDマウス中へのヒト組織の移植 前処理なしに、又は（ａ）抗−アシアログリコプロテ
インGM1又は（ｂ）少々の間の照射（１週間当り175ラッ
ドで４週間）のいづれかによる前処理の後、マウス（４
〜８週目の年齢）を一般的に用いた。後者の２つの前処
理法は、SCIDにおける内因性ナチュラルキラー細胞の活
性の除去が異種移植組織による良好な構成を可能にする
可能性を試験するために示された。
組織は多くのルートにより、すなわち静脈内、腎臓
内、脾臓内又は皮下内に注入された。後者の３種の場
合、マウスをまず、ハロタンにより麻酔をかける。腎臓
又は脾臓のいずれかを暴露するために1cmの切開を行な
い、そして19gのトロカールを用いて、いづれかの器官
の被膜の下にヒト組織を導入する。その後、その切開部
を、手術用縫合糸により縫合する。静脈内注入のために
は、30gの針を用いて、後眼窩静脈叢中に懸濁細胞を導
入する。これらのルートのうち、左の腎臓被膜への組織
の移植がいくつかの明確な利点を提供する。まず、それ
は容易に得やすく；第２に、腎臓は、移植された組織の
増殖を観察し、そして組織分析のためにそれから生検検
体を取るためにくり返して暴露され得る。
4.SCID−huマウスの分析 A.免疫表現型 ヒトリンパ球の種々の細胞表面マーカーに対する多く
のモノクローナル抗体を、SCID/Huマウス内に見出され
る細胞の分析のために調製した。これらは、成熟ヒト末
梢血液Ｔ−細胞のマーカー（OKT4,OKT8,OKT3,OKT11）、
ヒト末梢血液Ｂ−細胞（抗−IgM、抗−IgG、抗−Ｌ鎖）
及びヒトHLA複合体のマーカー（クラスＩ抗原の多型性
及び単型性決定基の両者を含む）を含む。これらのネズ
ミ抗体は、第２に螢光（FITC）抗−マウス抗体と反応さ
れる一次抗体として、又は第２にアビジン−FITCと反応
されるビオテニル化された抗体として、免疫螢光アッセ
イに使用された。多くの場合、直接的に螢光化される抗
体もまた、使用されて来た。移植の後、マウスは、尾の
静脈を切ることによって週ごとに採血される。約100μ
ｌの完全な血液を得る（通常、１〜２×105個の細胞を
含む）。核化細胞を、硫酸デキストランによる赤血球細
胞の沈殿により富化し、洗浄し、血小板を除去し、そし
て次に96−ウェルのマイクロタイタープレート内でモノ
クローナル抗体により染色する。アッセイが完結した
後、陽性細胞（すなわち、目立たない表面螢光を有する
もの）についての眼での観察を、免疫螢光顕微鏡下で行
なう。ヒト細胞が、末梢中の合計核細胞の１％よりも高
い場合、それらはこの方法により容易に検出され得、そ
してまた多重パラメータ−FACSにより統計的な有意さで
定量化され得る。従って、サンプルが直接的な観察によ
り陽性である場合、それらは、FACSにより分析される。
この分析においては、細胞をまず１％ホルマリンにより
固定し、そして次に、１μg/mlの沃化プロピジウム（P
I）（核細胞により取り込まれる）と共に10分間インキ
ュベートする。続くFACS分析においては、細胞をまずPI
のためにゲートを通し（すなわち、それらは核を有す
る）、そして次にFITCによる染色のために査定する。こ
の場合、合計の有核細胞の関数としてのFITC−陽性細胞
の百分率を、容易に得ることができる。
B.組織学 時々、移植の後、組織を、生検（たとえば左の腎被膜
の下で増殖する組織の）又は剖検のいづれかにより採取
し、そして薄い断片をパラフィン中に保存する。その
後、断片を上記モノクローナル抗体により染色し、そし
て第２アルカリホスファターゼによりラベルされた第２
抗体によりカウンター染色する。次に、マーカーに対し
て陽性の細胞の存在を、ジアミノベンジジンのアルカリ
ホスファターゼ反応生成物により検出し、そして光顕微
鏡下で見えるようにする。
C.DNA分析。
尾の静脈の採血により又は生検又は剖検の後、器官シ
ステムの再懸濁により取られた細胞を、全細胞のDNAの
抽出のために標準の方法により処理する。SCID−huマウ
スに由来する全細胞のDNAを、種々のプローブ及びアッ
セイシステムを用いて分析し、そして処理されていない
SCIDマウス又は正常なヒトから得られたDNAと平行して
比較する。そのプローブは次のものを含む:1）Aln反復
体（BLUR8）、すなわちヒトゲノム中に見出されるが、
しかしこれらの実験で使用される条件下で交差ハイブリ
ダイズするほどネズミの配列に対して相同的でない反複
配列、（２）ヒトＴ−細胞受容体（Ｂ鎖）プローブ、
（３）ヒトIg不変部プローブ、（４）ヒトMHCクラスＩ
及びクラスIIプローブ。ドットブロット及びサザン法
（標準の条件下で行なわれる）に使用するために、これ
らのプローブをまず、ヘキサマーラベル技法によって32
Pによりラベルする。
Ｔ−及び／又はＢ−細胞受容体遺伝子の再配列を、既
知の制限地図及び標準の条件を用いて、全細胞のDNAの
制限エンドヌクレアーゼ消化により捜し求める。ポリメ
ラーゼ鎖反応のために、熱安定性Tag1ポリメラーゼを用
いて、多くのオリゴヌクレチオド（Alu反復体及びクラ
スＩ及びクラスIIの単型配列のコピーを生成するための
ものを含む）を構成し、そして又は得た。
D.核型分析 核型分析のために、尾からの採血により得られた細胞
を、ヒト細胞の増殖を誘発するために植物凝集素と共に
培養せしめた。48時間で、中期の阻止を、コルヒチンの
添加により誘発し、そして光顕微鏡による分析のために
染色体を調製する。
結果 1.ヒト胎児の胸腺はSCIDマウス中で増殖する。
ヒト胎児の胸腺の増殖は、ヒト胎児の胸腺を移植され
たほとんどの（＞80％）SCIDマウス約18ヵ月間にわたっ
ての連続的な実験において＞300のマウスを含む）に観
察された。胸腺の増殖が観察されない場合、移植技法に
関係する問題が原因であるらしい。全体の構成体が、胸
腺の検体を移植するために初期行なわれた横側の切開部
を再び開き、そして腎臓を暴露することによって観察さ
れる。移植後４〜８週までに、大きさの著しい上昇が、
明らかに見られる。（２倍〜20〜30倍の上昇の範囲
で）。いくつかの場合、１つのマウス中に移植されたヒ
ト胎児の胸腺のフラグメントを取り、そして前もって処
理されていない第２のマウスに移した。これらの場合、
同様に、胸腺組織の著しい増殖が次いて観察された。そ
の胸腺組織は、色及び密度の両者において正常なヒト胎
児の胸腺の組織に類似する。十分に輪郭を明瞭にされた
血管システムが、低倍率で観察され得る。生検検体を、
組織断片のために調製し、そしてヒト又はネズミ細胞上
に存在する抗原に対するモノクローナル抗体により染色
する場合、移植された胸腺の細胞含有物はほとんどヒト
からのものであり（下記を参照のこと）、そしてその組
織の顕微鏡的解剖は一般的に維持されたことが見出され
る。従って、十分に輪郭を明瞭にされた骨髄及び皮質部
分が存在し、そしてそれぞれ抗体MDI及びCDR2による上
皮成分の特徴的な染色が存在する。ヒトクラスII決定基
に対して陽性の樹状突起のような細胞が髄質に及び皮質
（髄質よりも少ない）に見出される。ヒトＴ−細胞マー
カー、CD3,CD4,CD8及びCD2を染色する胸腺細胞がまた存
在する。二重レーザーFACSにより分析される場合、CD4
及びCD8に対して二重陽性、CD4又はCD8に対して単一陽
性、又は両マーカーに対して二重陰性である細胞の百分
率は、正常な年齢が同じ胎児の胸腺に見出される百分率
と類似する。上記発見は、ヒト胎児（９〜22週の妊娠期
間）からの胸腺組織を受け入れたマウスにより得られ
た。
SCID−hu胸腺の移植物と正常なヒト胎児胸腺の移植物
との間の注目される相違は、後者ではなく前者におい
て、ネズミクラスII決定基を発現する、皮質及び髄質
（皮質よりも少ない）における樹状突起のような細胞の
存在である。これらの細胞は、血管化されたSCID−hu胸
腺移植物中に移動するネズミ骨髄前駆体にたぶん由来す
るであろう。
多くの重要な結論が、上記観察から引き出され得る。
第１に、ヒト胎児の胸腺組織は、SCIDマウスにより拒絶
されない。事実、それは十分に血管化され、そして増殖
する。第２に、全体の形態学及び顕微鏡分析によれば、
移植されたヒト胸腺組織は、その正常なヒト相対物に密
接な類似点を担持する。従って、器官は、空間的に正し
い再生のために本質的な性質を維持するように思われ
る。
また、胸腺細胞の数及びその関連する亜群の分布は、
正常であるように思われる。最後に、ネズミクラスII決
定基を担持するネズミ樹状突起細胞が、SCID−hu胸腺に
見出される。これらの細胞は、ネズミMHC抗原に耐え、
そしてたぶんその抗原にMHC−制限されるべき開発中の
ヒト胸腺細胞を“教授すること”に関与され得る。それ
によって、移植片−対−宿主病を避けることができる。
2.表現型的に成熟したヒトＴ−細胞が、SCID/Huマウス
の末梢循環に見出される。
この現象は、300セット以上の実験に観察された。ヒ
トＴ−細胞マーカーに対するモノクローナル抗体を用い
てのFACS分析によれば、それはたぶん、時間依存性であ
り、そしてヒト胎児の胸腺により前もって（又は同時
に）移植されたSCIDマウス中へのヒト胎児肝臓細胞の静
脈内導入の後４〜12週で生じる。
特別には、数組のマウスがヒト胎児の胸腺移植物を受
けた。これらの組はグループに細分化された：いくらか
は同時に107個の胎児肝臓細胞（FLC）を静脈内に受け入
れ、いくらかは２週間後、胸腺内に107個の胎児肝臓細
胞を受け入れ、いくらかはまったく胎児肝臓細胞を受け
入れなかった。３週間で、それぞれの末梢血液を、ヒト
Ｔ−細胞マーカー、CD3,CD4,CD8,CD2のために染色する
細胞の存在について試験し；すべては陰性であった。し
かしながら、４〜12週までには、そのような細胞は、FA
CS上で眼に見えるようになった（全単核細胞集団の２〜
40％を構成する）。この間、SCID−hu末梢循環における
CD8+ヒトＴ−細胞に対するCD4+細胞の割合は、３〜４で
あり、（平均3.5,n＝85,S.D.＝0.86）、そしてそれは十
分に正常な範囲内で存在した。FLC移植後、12〜15週の
間に再び試験した。これらのマーカーを担持する細胞は
もはや存在しなかった。この一般的なパターンは、FLC
細胞が初期に投与されたルートに無関係であった。
この分析から、ヒトＴ−細胞のマーカーを担持する細
胞の有意な数がSCID−huマウスの末梢血液中に現われる
ためには４週間かかると思われる。この時より前には、
それらは存在せず;12週間後、それらは消滅する。免疫
表現型はたぶん正当であるという推論が存在する；すな
わち、使用された抗体は、単に時間依存性態様で反応
し、そしてネズミ細胞に無差別に結合するようには思わ
れない。もちろん、末梢におけるヒトＴ−細胞の一時的
な変動が観察され得、そしていずれにせよ胎児の肝臓細
胞が与えられる。これは、移植される時、胎児の胸腺内
に存在する細胞がまた、胸腺を出、そして末梢循環に入
ることができることを意味するように思われる。
ヒトマーカーを担持する末梢血液細胞がSCID−hu動物
に不在であることが決定された後、すべては再度、FLC
により再構成され；明白に、これらの動物のすべては、
元のヒト胎児の胸腺移植物を保持した。この第２回目の
再構成において、動物は再度グループに細分され；いく
らかはFLC細胞の等級化された投与量（５×106〜５×10
7の範囲）を静脈内に受け入れ；他は全胎児肝臓のフラ
グメントを皮下及び脾臓の両者に受け入れた。３週間後
末梢血液の分析は、ヒトマーカーを担持する細胞の完全
な不在を示した。他方、６週までに、すべての動物は再
度、ヒトマーカー、CD3,CD4,CD8およひCD2を担持する細
胞の有意な数の存在を示した（合計単核細胞の約４〜30
％）；明白には、これらの細胞の３〜15％がCD4マーカ
ーを発現した。２匹のマウスが１週間後（第７週目）、
剖検にゆだねられる場合、両者は、OKT4（Ｔヘルパー細
胞系のマーカー）又はOKT8（Ｔ細胞毒性／サプレッサー
細胞系のマーカー）のいづれかにより染色された、末梢
中における細胞を示し；それぞれ２種の亜集団の比は、
2.3:1であり、そしてこれはヒト末梢血液自体に見出さ
れる正常な割合の範囲であった。これらの細胞が実際に
ネズミの脾臓、胸腺又はリンパ節に帰するかいづれかを
確認するために、FACS分析をまた、これらの器官から得
られた細胞に対して行なった。これらの場合、ヒトＴ−
細胞マーカーを担持する細胞は観察されなかった。末梢
血液の続くFACS分析において、１組を除くすべてのマウ
スは、ヒトＴ−細胞の末梢集団を再度失うことが観察さ
れた。
SCIDマウスが全胎児の肝臓フラグメントを移植され、
そして次に胎児の肝臓細胞の静脈内注入を与えられる場
合、臨界的な差異を伴って、同じ観察が行なわれる。単
に12週間続く代わりに、末梢循環におけるヒトＴ−細胞
が少なくとも40週間続くことが見出される。再び、CD4/
CD8の割合は全体を通して正常である。
この第２回目の再構成は、多くの重要な結論を提供す
る。第１に、FLCを静脈内に与えられたSCID−huマウス
の末梢血液におけるヒト細胞の一時的な変動の現象が、
再現できる。第２番目に、PLCは静脈内に与えられ、そ
してそれらは続いて、成熟Ｔ−細胞のマーカーを示すの
で、それらは、実際、移植されたヒト胎児胸腺に帰する
らしい。第３番目に、末梢に見出される成熟Ｔ−細胞
は、CD4/CD8亜集団“生理学的”平衡を表わす。第４番
目に、これらの末梢ヒトＴ−細胞は実際、生来のネズミ
器官（脾臓、リンパ節、胸腺）に帰すものではないこと
が明らかである。従って、進行中の実験においては、ヒ
ト同等物が、SCID−huマウス中に移植されて来た。最後
に、全胎児の肝臓の導入は、末梢におけるヒト細胞の長
期の変動を生ぜしめることが見出される。この観察は、
胎児の肝臓の基質細胞の不在下で複製することができな
い、FLC内での自己回復する幹細胞集団の存在を包含す
る。
ヒト成熟Ｔ−細胞マーカーに対するモノクローナル抗
体の明白な特異性にもかかわらず（注；末梢血液におけ
る染色細胞の高い百分率を示すこれらのマウスにおいて
さえ、同時に分析された脾臓細胞集団は陰性であっ
た）、染色は不測の人工産物によるものであるという形
式的な可能性が残った。この可能性を調節するために、
末梢血液中に見出される細胞のDNA分析を、ヒト（但
し、ネズミではない）反復DNA配列（ALU反復体:BLUR−
８）に対して特異的なプローブを用いて行なった。この
分析によれば、SCID−huマウスに由来する末梢血液細胞
が、ヒトＴ−細胞の特性を示す表現型マーカーを担持す
るのみならず、またヒトALUプローブと強くハイブリダ
イズするDNAをも含むことが見出された。
SCIDマウスがヒト胎児胸腺及びリンパ節を移植され、
そして次にヒト胎児肝臓細胞の静脈注入を与えられる場
合、ヒトIgGがまた、血清中に検出され得る。通常見出
されるIgGの量は、５〜10％で変化する。IgGを産生する
プラズマ細胞は、移植されたヒトリンパ節に位置するこ
とができる。ヒトIgG産生は、SCIDマウス中へのヒト胎
児肝臓細胞及びヒトリンパ節の導入を少なくとも必要と
する。
特定の実験においては、SCIDマウスは、おおいかぶさ
れた隔離かごの中に維持され、そして週当り３日間、飲
水を通してTMS懸濁液を与えられた（懸濁液5ml当りトリ
メトプリム40mg及びスルファメトキサゾール200mg;1日
にマウス当り0.125mlの懸濁液/4mlの飲水）。飲水のボ
トルを向け、そして薬物が投与され；標準の飲水は、そ
れぞれの週、残る４日間与えられた。9g.w.のヒト胎児
胸腺葉（0.5×0.5×2mm）及びヒトリンパ節のセグメン
ト（0.5×0.5×2mm）を、左の腎臓被膜下に移植した。
これらの器官は、HLA-A2+，HLA-B7-供与体から得られ
た。同時に、マウスは、107個の肝臓細胞を静脈内に受
け入れ；これらの細胞は、対照的にHLA-A2-，HLA-B7+で
あった。
胎児肝臓細胞を細かく切ることによって得、そして10
％FCSを有するRPMI1640媒体中に懸濁された残る細胞
を、フィコール−ハイパーク遠心分離により単核画分に
分離し；次に界面細胞を、10％FCSを含むRPMI1640で３
回洗浄し、そして静脈内投与のために108個の細胞/mlの
濃度で再懸濁した。
組織の移植のために、マウスをまず、ハロタンにより
麻酔をかけた。左の腎臓を暴露するために、1cmの側腹
の切開を行なった。連続的に腹膜及び筋膜層を縫合し、
そして金属クリップにより、治療のために傷口を締めつ
けた。懸濁された胎児肝臓細胞を、30ゲージの針により
後眼窩の近くに静脈注射した。
移植の後、４週での胸腺の凍結された一連の固定断片
を、正常な年齢の胎児胸腺と比較した。顕微鏡分析によ
り、樹状突起形態を有するネズミクラスII−陽性細胞が
存在したことを除いては似ていることが分かった。特
に、すべての胸腺細胞はHLA-A2-，HLA-B7+であり；従っ
て、それらは、静脈投与されるFLC調製物内の幹細胞に
由来した。
SCID−huマウスからの末梢血液を分析する場合、3.5
のCD4/CD8の割合のヒトＴ−細胞が４〜12週間で見出さ
れた。これらの細胞は抗原HLA−B7（但し、HLA−A2では
ない）を発現し；従って、それらは、HLA-A2+，HLA-B7-
胸腺を通して初めに処理された、最初のFLC源からの十
分に分化された細胞であった。
種々のFLC亜集団のいずれが成熟ヒトＴ−細胞を実際
に生ぜしめるかをより良好に決定するために（たとえ
ば、どの亜集団が幹細胞活性を有したかを）、HLA-A
2-，HLA-B7+供与体からのFLCから、CD4+，CD8+，M1+，M
3+，Ig-，A+／B+細胞を枯渇させて、（T,B、骨髄単球、
赤血球及び顆粒球細胞を除去して）、“系統−マーカー
マイナス”（lin-）集団を産生させた。この集団は、ヒ
トThy1:lin-thy1-及びlin-thy1+に対する抗体を有する
２種の亜集団にFACSにより富化された。次に、これらの
集団は、HLA-A2+、HLA-B7-ヒト胸腺移植物をSCIDマウス
に静脈内導入された。lin-thy1+亜集団は、後でHLA-B7+
Ｔ−細胞を生ぜしめることが見出され；lin-thy1-亜集
団は不活性であった。従って、lin-thy1+亜集団は、ヒ
ト造血幹細胞活性を包含する傾向がある。
最後に、SCID−huマウスからの血清検体を分析する場
合、それらは、１〜10mg/mlのレベルでヒトIgGを含むこ
とが見出された。ヒトリンパ節生検は、免疫組織化学的
染色によりヒトIgG含有性血漿細胞の存在を示した。
他の研究において、ヒト特異的病原菌によるリンパ栄
養性感染を引き起こす能力を研究した。特に、HIV−１
単離物を感染のために使用し、ここでその単離物は、イ
ン ビボ（但し、イン ビトロでではない）で感染性で
あることが見出された。
HIV−１の分子クローン化された単離物を用いた。至
急性脳障害及びaposi肉腫を有する患者の、細胞を含ま
ない脳脊髄液に由来する場合、HIV−1JR-CSFは、植物凝
集素により刺激されたヒト末梢リンパ球を有する短期間
培養物中においてまずイン ビトロ増殖し、そして次に
分子クローン化された。この単離物は、マイトジェンに
より刺激されたヒトＴ−細胞幼若及びグリア細胞外植片
（但し、一次単球／マクロファージ培養物を除く）のた
めに感染性であることが見出された。それは、連続的な
ヒトＴ又は単球／マクロファージ細胞系において、継代
されず、そして増殖もしなかった。そのような親和性
（tropism）は、それと他の単離物（分子クローン化さ
れ、そしてイン ビトロで増殖を適合されている）（た
とえば、HXB2,HTLV−IIIB,ARV及びLAV）との間の潜在的
に重要な差異を示す。
麻酔をかけられたSCID−huマウスの増殖したヒト胸腺
又はリンパ節移植物を暴露するために、側復部の切開を
行なった。HIV−1JR-CSFの等級化された投与量を、直接
的な胸腺内又は結節内接種により導入した。次に、マウ
スを、グローブボックス内のマイクロー隔離カゴ内に維
持した。種々の時点で、感染されたリンパ球器官の生検
検体を調製し、４％パラホルムアルデヒドに固定し、そ
して急性感染の徴候についてアッセイを行なった。
HIV−1JR-CSFによるSCID−huマウスの感染は、ウィル
ス複製の容易に検出できる徴候をもたらした。最っとも
直接的に有益なアッセイは、RNAプローブpG4と感染され
た組織断片とのその場でのハイブリダイゼーションであ
る。このプローブは、ゲノムHIV−１転写物の３′末端
にハイブリダイズし；従って、すべてのウィルスメッセ
ージは、平等に検出される。このアッセイの条件下で、
ウィルスDNAは検出されない。この結果は、ヒト胸腺及
びリンパ節移植物の感染が時間依存性であることを指摘
する。直接的な胸腺内接種（400〜4000の感染単位）の
後１週間で、断片中の細胞は、pG4プローブとハイブリ
ダイズするように見うけられなかった。２′４及び８週
で、漸進的に増加する数の細胞は、ハイブリダイズする
ことが見出された（第１表を参照のこと）。これは、前
進する相当の感染がイン ビボで生じたことを示唆す
る。感染された細胞は、注入されたヒト胸腺の皮質及び
髄質を通して及び注入されたヒトリンパ節を通して分散
的に散在せしめられた。１以上の連続した細胞を含む、
感染の分離した細胞増殖巣がまれに観察された。たぶ
ん、一定の組織平面内で、連続した細胞は、感染に対し
て耐性であり又は検出できないレベルで感染され得る。
他方、感染された細胞は、断片に含まれない他の細胞増
殖巣から体全体に広がるかもしれない（たとえば、他の
場所で感染された移動性前駆細胞から）。
記載される出来事は、HIV−１感染に対して特異的で
ある。ウィルスの熱−不活性化の前（80℃、１時間）、
感染性を破壊した。感染された組織中の細胞は、“セン
ス”配向でpG4RANプローブとハイブリダイズすることが
見出されなかった。１回の感染による組織中の細胞は、
いづれの配向においてもpG4プローブにハイブリダイズ
することが見出されなかった。最終的に、その感染は、
時間依存性のみならずまた、投与量依存性である。従っ
て、HIV−1JR-CSFの10-1希釈度では、感染することが見
出されたが、しかし10-3〜10-5の希釈度ではそうではな
かった。イン ビトロアッセイにより決定されたウィル
ス力価の推定値を用いる場合、10-1の濃度は、400〜400
0の感染単位に相当する。
上記分析は、その場でのハイブリダイゼーションの
前、組織断片に免疫組織化学的染色を適用することによ
って拡張された。この場合、ウィルスタンパク質の存在
がウィルスRNA転写物を創造する細胞に検出され；さら
に感染された細胞の細胞表面表現型が決定された。この
場合、gag,pol及びenvエピトープに対して反応性のポリ
クローナル抗血清（GB）を用いて、HIV−1JR-CSFによる
感染の後、２週で、ヒト胸腺の断片を分析した。たとえ
それぞれの区画中にCD4+胸腺細胞の多くの代表物が存在
したとしても、細胞は、皮質においてよりも髄質におい
てより感染されることが見出された。類似する状況が、
観察の多重面を通して、感染後、４及び８週で見出され
た。従って、いづれか一定の時間で、いづれか一定の断
面内に、感染された細胞の70〜90％が髄質に位置した。
たぶん、融合細胞を示す感染された多核細胞はほとんど
見出されなかった。
胸腺の髄質及び皮質の両者において、及びリンパ節に
おいて、ウィルス複製の２つの明白な態様が、免疫組織
化学及びその場でのハイブリダイゼーションの組合せに
より明らかになった。１つの態様においては、細胞は、
ウィルスタンパク質及びRNAの量を検出可能にすること
が見出され；もう１つの態様においては、単にウィルス
RNAの転写物が見出された。後者の集団は、それぞれの
区画において全感染された細胞の大部分を示す（第１
表）。この観察のための基本は明確でない。それ自体の
方法に関係する人工物は、ありそうもなく、すなわち複
製のそれぞれの態様を表わす細胞は、ランダムに分散さ
れ、そして時々隣接する。むしろ、抗血清GBにより染色
されないこれらの細胞は、検出のための感受性のレベル
以下のレベルでウィルスタンパク質を産生することがで
き；他方、それらは種々のウィルスタンパク質（たとえ
ば血清中における種々の抗体により検出されないエピト
ープを有する）を産生することができる。
いづれかの場合、転写及び／又は翻訳を調製する後−
感染の異なったパターンが実施されるべきである。その
結果は、HIV−１の分子クローンによる感染から得られ
るので、独得の細胞環境が調整の差異を示す傾向があ
る。これらの種々の環境は、明白な細胞系及び一定の系
統内での活性化又は分化の連続的な段階を包含すること
ができる。この種類の複雑なパターンは、他のレンチウ
ィルス（たとえば、ビスナ、イヌ科関節炎−脳炎ウィル
ス）による感染後、イン ビボで提供されて来た。それ
らの存在は、イン ビトロでのHIV−１に対する最近の
実験と矛盾しない。調節機構（それによってそれらは存
在する）は、SCID−huマウス内でイン ビボでHIV−１
により調査され得る。
本発明は、異種移植哺乳類（ここで、個々の器官が増
殖されるのみならずまた、異なった器官からの細胞及び
組織も増殖され得、そしてここで前記細胞及び／又は器
官、たとえば造血系、内分泌系及び同様のものが相互作
用することができる）において組織を増殖する能力によ
り広い範囲の機会を提供することは、上記結果から明ら
かである。外来性組織を増殖する能力により、組織上の
種々の物質の効果及び異なった組織の相互作用が、組織
の正常な環境を有意な程度に近づける環境において決定
され得る。さらに、造血組織は、哺乳類受容体において
産生された細胞の不死化を可能にする。造血システムを
生ぜしめる幹細胞は、FACSにより単離され、そして活性
であることが知られている。次に、それらを、既知の増
殖因子によりイン ビトロで増殖し得る。他方、それら
を、それらの自己再生に関与する不明の因子の同定を助
けるために使用し得る。これまで得るのが困難であった
モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体が、
ヒトにおいて通常使用され得ない、種々の抗原により哺
乳類受容体を感作することによって容易に得られる。こ
の態様において、ヒトモノクローナル抗体の能力の範囲
は、種々の疾病、たとえば病原菌による感染、腫瘍状
態、及び同様のものの処置のために広く拡張され得る。
同様の態様において、分化され、抗原特異性の、MHC−
制限された又は制限されていないヒトＴ−細胞が、イン
ビトロでの拡張のために及び後での治療への使用のた
めに単離され得る。さらに、組織源の異質遺伝子型動物
中に移植され得る器官が使用され得る。
本明細書に言及されているすべての出版物及び特許出
願は、本発明の関与する同業者の技術のレベルを示すも
のである。すべての出版物及び特許出願は、引用により
本明細書中に組込まれている。
前述の発明は、明確に理解するために例示的及び例的
にいくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の
範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃｌｉｎ．ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｖｏｌ．64（1986）Ｐ．518−525 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A01K 67/027 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (38)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】キメラ性動物であって： 免疫システムの少なくとも一部を含み、 機能的な胸腺の欠失以外のために機能的な同系リンパ球
    を欠く、免疫欠損非ヒト動物；及び 異種移植幹細胞又はそれに由来する成熟細胞及び少なく
    とも１つの器官又はその前駆体を含んで成り、前記少な
    くとも１つの器官は前記幹細胞を成熟できるものであっ
    て、前記異種移植幹細胞及び器官又はその前駆体は前記
    動物が新生児またはそれより年長であるときに前記動物
    中に導入される、前記キメラ性動物。
  2. 【請求項２】前記動物がリンパ球の遺伝的欠失により免
    疫欠損している請求項１記載のキメラ性動物。
  3. 【請求項３】キメラ性動物であって： 免疫システムの少なくとも一部を含み、 機能的な胸腺の欠失以外のために機能的な同系リンパ球
    を欠く、免疫欠損非ヒト動物；及び 異種移植細胞及び少なくとも１つの器官又はその前駆体
    を、前記異種移植細胞及び器官又はその前駆体の、前記
    動物が新生児またはそれより年長であるときの前記動物
    への導入の結果として含んで成り、前記少なくとも１つ
    の器官は機能的な胸腺を含み、そして前記細胞は少なく
    とも１つの造血幹細胞、未成熟の分化された造血細胞又
    は成熟した分化造血細胞を含んで成るキメラ性動物。
  4. 【請求項４】前記少なくとも１つの器官が、少なくとも
    ３ヵ月間、前記動物への導入の時から機能することがで
    きる請求項３記載のキメラ性動物。
  5. 【請求項５】前記動物が哺乳類である請求項３記載のキ
    メラ性動物。
  6. 【請求項６】キメラ性哺乳類であって： 機能的な胸腺の欠失以外のために機能的な同系リンパ球
    を欠く、免疫欠損非ヒト哺乳類；及び 異種移植細胞及び少なくとも１つの器官又はその前駆体
    を、前記異種移植細胞及び器官又はその前駆体の、前記
    哺乳類が新生児またはそれより年長であるときの前記哺
    乳類への導入の結果として含んで成り、前記少なくとも
    １つの器官は機能的な胸腺を含み、そして前記細胞は少
    なくとも１つの造血幹細胞、未成熟の分化された造血細
    胞又は成熟した分化造血細胞を含んで成るキメラ性哺乳
    類。
  7. 【請求項７】前記少なくとも１つの器官が、少なくとも
    １つのリンパ節または肝臓組織をさらに含んで成る請求
    項６記載のキメラ性哺乳類。
  8. 【請求項８】前記異種移植細胞がヒト細胞であり、そし
    て前記器官がヒト細胞から成る請求項６記載のキメラ性
    哺乳類。
  9. 【請求項９】前記哺乳類が、前記哺乳類に導入された前
    記幹細胞の生体内成熟の結果として成熟した分化造血細
    胞を含んで成る請求項８記載のキメラ性哺乳類。
  10. 【請求項１０】前記幹細胞が新生児またはそれより年長
    のヒトからのものである請求項９記載のキメラ性哺乳
    類。
  11. 【請求項１１】前記異種移植細胞及び器官がヒト胎児か
    らのものである請求項６記載のキメラ性哺乳類。
  12. 【請求項１２】前記哺乳類が、前記哺乳類に導入された
    前記幹細胞の生体内成熟の結果としてヒト成熟末梢血液
    リンパ球を含んで成る請求項11記載のキメラ性哺乳類。
  13. 【請求項１３】前記異種移植細胞又は器官が病原体によ
    り感染される請求項12記載のキメラ性哺乳類。
  14. 【請求項１４】キメラ性マウスであって： 異種移植細胞及び少なくとも１つの器官又はその前駆体
    を、前記異種移植細胞及び器官又はその前駆体の、重症
    複合免疫不全マウスが新生児またはそれよりも年長であ
    るときの前記重症複合免疫不全マウスへの導入の結果と
    して含んで成り、前記少なくとも１つの器官は機能的な
    胸腺を含み、そして前記細胞は少なくとも１つの造血幹
    細胞、未成熟の分化された造血細胞又は成熟した分化造
    血細胞を含んで成るキメラ性マウス。
  15. 【請求項１５】前記少なくとも１つの器官が、少なくと
    も１つのリンパ節または肝臓組織をさらに含んで成る請
    求項14記載のキメラ性マウス。
  16. 【請求項１６】前記異種移植細胞がヒト細胞であり、そ
    して前記器官がヒト細胞から成る請求項14記載のキメラ
    性マウス。
  17. 【請求項１７】前記キメラ性マウスが、前記重症複合免
    疫不全マウスに導入された前記幹細胞の生体内成熟の結
    果として成熟した分化造血細胞を含んで成る請求項16記
    載のキメラ性マウス。
  18. 【請求項１８】前記分化された造血細胞が末梢血液リン
    パ球を含んで成る請求項17記載のキメラ性マウス。
  19. 【請求項１９】前記幹細胞が新生児またはそれよりも年
    長の哺乳類からのものである請求項14記載のキメラ性マ
    ウス。
  20. 【請求項２０】前記異種移植細胞及び器官が、前記重症
    複合免疫不全マウスに導入されるとき、胎児からのもの
    である請求項14記載のキメラ性マウス。
  21. 【請求項２１】前記キメラ性マウスが、前記重症複合免
    疫不全マウスに導入された前記幹細胞の生体内成熟の結
    果としてヒト成熟分化造血細胞を含んで成る請求項20記
    載のキメラ性マウス。
  22. 【請求項２２】前記異種移植細胞又は器官が病原体によ
    り感染される請求項21記載のキメラ性マウス。
  23. 【請求項２３】前記病原体がHIVである請求項22記載の
    キメラ性マウス。
  24. 【請求項２４】前記少なくとも１つの器官が、少なくと
    も１つのリンパ節をさらに含んで成り、そして前記キメ
    ラ性マウスがヒト抗体をさらに含んで成る請求項21記載
    のキメラ性マウス。
  25. 【請求項２５】ヒトプラズマ細胞を産生するための方法
    であって： ヒト細胞及び少なくとも２種の器官を前記細胞及び器官
    又はその前駆体を、重症複合免疫不全マウスが新生児ま
    たはそれより年長であるときの前記重症複合免疫不全マ
    ウスへの導入の結果として含み、前記少なくとも２種の
    器官は機能的な胸腺及び機能的なリンパ節を含み、そし
    て前記細胞は少なくとも１つの造血幹細胞、未成熟の分
    化された造血細胞又は成熟した分化造血細胞を含むもの
    であって、さらに前記分化された造血細胞により認識さ
    れ、これによりプラズマ細胞が産生される抗原を含んで
    成るキメラ性マウスを増殖することを含んで成る方法。
  26. 【請求項２６】ヒト免疫グロブリンを産生するための方
    法であって： 異種移植細胞及び少なくとも１つの器官を、重症免疫不
    全マウスの新生児またはそれより年長なときの前記重症
    免疫不全マウスへの前記異種移植細胞及び器官又はその
    前駆体の導入の結果として含み、前記少なくとも１つの
    器官は機能的な胸腺を含み、そして前記細胞は成熟した
    分化造血細胞を含むものであって、さらに前記成熟され
    た分化造血細胞により認識される抗原の存在の結果とし
    てのプラズマ細胞を含んで成るキメラ性マウスからプラ
    ズマ細胞又はその前駆体を単離し； 免疫グロブリンを分泌する不死化された細胞を提供する
    ために、前記単離されたプラズマ細胞又はその前駆体を
    不死化し；そして 免疫グロブリンの産生のために前記不死化された細胞を
    スクリーニングすることを含んで成る方法。
  27. 【請求項２７】哺乳類の疾病状態により引き起こされる
    症状又は指標に基づいて条件を変化させたときの影響を
    決定するための方法であって： 異種移植細胞及び少なくとも１つの器官を、重症複合免
    疫不全マウスの新生児またはそれより年長なときの前記
    重症複合免疫不全マウスへの前記異種移植細胞及び器官
    又はその前駆体の導入の結果として含み、前記少なくと
    も１つの器官は機能的な胸腺を含み、そして前記細胞は
    少なくとも１つの造血幹細胞、未成熟の分化された造血
    細胞又は成熟した分化造血細胞を含むものであって、さ
    らに前記病気の症状又は指標が前記第２器官に関連する
    場合は第２器官を含んで成るキメラ性マウスに疾病状態
    を引き起こし； 前記キメラ性マウスを前記変化にゆだね；そして 前記症状又は指標に基づいて条件を変化させたときの影
    響を決定することを含んで成る方法。
  28. 【請求項２８】前記条件の変化が薬物の投与である請求
    項27記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記条件の変化が、前記疾病状態に対し
    て特異的なリンパ球又は骨髄単球細胞の投与である請求
    項27記載の方法。
  30. 【請求項３０】異種移植幹細胞を成熟させることができ
    るキメラ性動物を産生するための方法であって： 重症複合免疫不全マウスの異種移植細胞が増殖できる部
    位に胎児の胸腺組織を、及びそれと同じ部位又は異なっ
    た部位に異種移植幹細胞を、導入することを含んで成る
    方法。
  31. 【請求項３１】異種移植リンパ節組織又は肝臓組織の少
    なくとも１つを導入する追加の段階を含む請求項30記載
    の方法。
  32. 【請求項３２】前記異種移植細胞及び組織がヒト細胞及
    びヒト組織である請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記胎児胸腺組織が約９〜24週の妊娠で
    の胎児からのものであり、そして前記リンパ節組織が約
    15週以上の妊娠での胎児からのものである請求項31記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】前記異種移植細胞及び組織がヒト細胞及
    びヒト組織である請求項33記載の方法。
  35. 【請求項３５】前記胸腺組織のための部位が腎臓の被膜
    である請求項30記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記マウスが造血システム以外の生理学
    的システムに欠陥がある請求項30記載の方法。
  37. 【請求項３７】細胞の混合物を含んで成る組成物におけ
    る幹細胞の存在を検出するための方法であって： 表面膜タンパク質マーカーに基づいて前記細胞を画分に
    分け； 少なくとも１つの前記細胞画分をキメラ性マウスに導入
    し、前記キメラ性マウスは異種移植細胞及び少なくとも
    １つの器官またはその前駆体を、重症複合免疫不全マウ
    スの新生児またはそれよりも年長の前記重症複合免疫不
    全マウスへの前記異種移植細胞及び器官またはその前駆
    体の導入の結果として含むものであって、前記少なくと
    も１つの器官は機能的な胸腺を含み、前記細胞は少なく
    とも１つの造血幹細胞、未成熟の分化された造血細胞又
    は成熟した分化造血細胞を含むものであり、 前記幹細胞を前記キメラ性マウス中で成熟せしめ； 前記キメラ性マウスから末梢血液リンパ球を取り出し；
    そして 前記画分中における前記幹細胞の存在を示すものとして
    前記幹細胞からの分化細胞の存在を決定することを含ん
    で成る方法。
  38. 【請求項３８】ヒト造血細胞の亜群を産生するための方
    法であって： ヒト造血幹細胞を、少なくとも１種の造血系中への分化
    を引き起こすために少なくとも１種のリンフォカインを
    有するキメラ性マウスに導入し、前記キメラ性マウスは
    異種移植細胞及び少なくとも１つの器官またはその前駆
    体を、重症複合免疫不全マウスの新生児またはそれより
    も年長なときの前記重症複合免疫不全マウスへの前記異
    種移植細胞及び器官またはその前駆体の導入の結果とし
    て含むものであって、前記少なくとも１つの器官は機能
    的な胸腺を含み、前記細胞は少なくとも１つの造血幹細
    胞、未成熟の分化された造血細胞又は成熟した分化造血
    細胞を含むものであり、 前記キメラ性マウスを前記幹細胞が分化し、増殖して前
    記亜群の細胞を産生するのに十分な時間維持し、そして 前記ヒト造血細胞の亜群を収穫することを含んで成る方
    法。
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