JP2024507457A - ハイブリドーマ生成の増強 - Google Patents

Abstract

本願で提供されるのは、ハイブリドーマを生成する方法、及び抗原特異的抗体を製造する関連方法である。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、（ｉ）この富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、及び／又は（ｉｉ）この富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、０．５超であり、任意選択的に約１超若しくは約２超である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；並びに（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることを含む。例示的な態様では、得られるハイブリドーマは、免疫化動物により産生されるＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも１０％又は少なくとも１５％を占める。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年２月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４６，１３５号明細書に対する優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

治療用抗体は、薬物の主要なクラスを構成しており、これらの多くは、ヒト抗体遺伝子座トランスジェニック動物等のインビボ免疫化プラットフォームに由来しており、抗原刺激に反応して活性化される特異的Ｂ細胞クローンの捕捉に依存する（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１）。齧歯類での免疫化に対するインビボ免疫反応で生成される抗体は、免疫組織からのＢ細胞集団の不死化により捕捉され得、この免疫組織は、脾臓及びリンパ節の胚中心（ＧＣ）内に主に位置しているが、骨髄、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）でも見出されており、且つ血液で循環している。ハイブリドーマ生成として既知の不死化のプロセスにより、膜結合クローンＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現するハイブリッド細胞が作られ、さらには同一の抗体クローン型の分泌型も作られる。ハイブリッドは、継続的に分裂して抗体を分泌していることから、試験用のクローンの喪失又は抗体材料の欠如を気にすることなく、必要な特異性を有するクローンを同定してキャラクタライズし得る。確立されたハイブリッドは、典型的には頑強であり、選択圧下で保持される場合には、抗体を分泌し続ける。ハイブリッドは、凍結－解凍のサイクルによく反応し、且つ液体窒素中での数十年の保存で生存し得る。１９７５年でのＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ生成の出現により、骨髄腫細胞との融合によるＢ細胞の不死化が、齧歯類種（ほとんどの場合にはマウス）からの抗体発見に広く使用される方法となった（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５－４９７）．

不死化のための抗原特異的Ｂ細胞のインビボでの生成、及び不死化のタイミングは両方とも、ハイブリッド生成の重要な側面である。典型的には、齧歯類では、免疫化の反復により、数週間又は数ヶ月にわたり反応が起こる。抗原暴露の反復に反応して、抗原を認識するＢＣＲを発現するＢ細胞が刺激されてアイソタイプスイッチングを受けてＩｇＧを発現し、二次リンパ器官内でＧＣを形成する（Ａｋｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０２０）２０，２２９－２３８）。ＧＣ内では、抗原決定基の体細胞超変異（ＳＭＨ）及びより高い親和性バリアントの選択のサイクルを通じて、Ｂ細胞が成熟し、メモリー細胞又は形質細胞へと分化する（Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１９）；６３：２９－３４）。メモリー細胞は、表面上で高レベルのＢ２２０／ＣＤ４５Ｒ及びＩｇＧを発現するが、抗体を分泌しない。完全に分化した場合には、メモリー細胞は小さく且つ静止状態であるが、同族抗原又はポリクローナル活性化による刺激に反応して増殖する大きな可能性を有する。メモリー細胞プール中でのクローンの多様性は、高い。対照的に、形質細胞は、高度に活性化された大型で爆発性のＢ細胞であり、多量の抗体を分泌する。表面ＩｇＧ及びＢ２２０／ＣＤ４５Ｒは両方とも、下方制御される。ＣＤ１３８及びＴＡＣＩは、形質細胞の表面上で高度に発現されるようになる（Ｔｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４７（８）：１２７６－１２７９（２０１７））。形質細胞が最終分化すると、分裂能力は失われる。形質細胞は、高度に特殊化された長期生存ニッチに隔離されない限り、寿命が数日～数週間と短い。形質細胞コンパートメントの多様性は低く、インビボでの選択プロセスは、抗原に対する効果的で迅速な免疫反応を開始するために、比較的少数の高親和性クローンに焦点を当てている。

Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０２０）ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１ Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５－４９７ Ａｋｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０２０）２０，２２９－２３８ Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１９）；６３：２９－３４ Ｔｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４７（８）：１２７６－１２７９（２０１７）

ハイブリドーマ生成は、免疫レパトアをサンプリング可能であるが、このプロセスは非常に非効率であり、不死化の成功率は、０．０１％～０．００１％の範囲である。より大きな免疫化コホートを使用して融合用の細胞の数を増加させることにより、又はラット等のより大きな動物で作業することにより、この融合の非効率性を打ち消し得る。上記を考慮して、ハイブリドーマ生成が増強された方法が必要とされている。

本開示は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞の除去、大規模、高効率、及び製造されるハイブリドーマのレパートリーの特異性により、当該技術分野で既知のものを超える利点を提供する増強ハイブリドーマ生成（ＥＨＧ）法を提供する。有利には、本開示のＥＨＧ法は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞の効率的なビーズベースの除去によるＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化を提供する。ＩｇＭは、培養中にＩｇＧ＋Ｂ細胞へとクラススイッチし、ＩｇＧ＋Ａｇ＋メモリーＢ細胞集団を、無関係な又は低親和性のＢ細胞クローンで希釈する。ＩｇＭ＋Ｂ細胞は、ＩｇＧ＋Ｂ細胞クローンと比べて速く分裂する。培養前にＩｇＭ＋Ｂ細胞の大部分を除去し、次いで、ＩｇＧ＋Ｂ細胞が富化された集団を培養する（これにより、融合前に、この集団が数百のクローンコピーを作ることを可能にする）ことにより、目的のクローンの大部分が不死化される。その結果、希少なＡｇ＋クローンの同定を容易にする大規模なハイブリドーマプールが得られる。本開示のＥＨＧ法は、大規模バルク培養を提供する。数十万個の高度に選択されたＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を含む数リットルのバルク培養物により、より多数の動物の大規模なディープレパトアマイニングが可能となる。従って、先行技術の方法では、ごく少数の抗原結合クローンのみが同定されているが、本開示のＥＨＧは、数百種から数千種の固有の結合体が日続的に同定される。本開示のＥＨＧ法はまた、抗原結合クローンの同定前でのＢ細胞の不死化も含む。ハイブリドーマ上清がスクリーニングされる。この順序は、Ｂ細胞が、不死化される前に抗原結合に関してスクリーニングされる、先行技術の方法（例えば、Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２（１）：６９－７７（１９９２）を参照されたい）の工程の逆の順序を示す。本発明の不死化、及びその後の抗原結合クローンの同定の順序により、抗原結合クローンの高効率の同定が可能となる。本開示の方法では、細胞上清（ＳＮ）の無制限の供給が、融合後のスクリーニング及びキャラクタリゼーションに利用可能である。ＳＮスクリーニング時のアッセイ感度は、制限されない。ハイブリドーマ培養物を増殖させて抗体を高濃度にし得る。本開示のＥＨＧ法では、抗原結合クローンを同定する能力は、Ｂ細胞抗体分泌率により制限されず、ハイブリッドプールをディープマイニングすることにより、希少な結合体を同定し得る。大規模液体ハンドリングプレーティング及びＡｇ＋ＦＡＣＳ選別によるディープマイニングを実行し得る。

従って、本開示は、抗体発見で有用な増強ハイブリドーマ生成法を提供する。例示的な実施形態では、このハイブリドーマを生成する方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、この富化集団は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞を実質的に含まない、調製すること、（ｂ）この富化集団を大規模にバルク培養して、増大集団を得ること、及び（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることを含む。例示的な態様では、（ｉ）富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、及び／又は（ｉｉ）富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、０．５超であり、任意選択的に約１超若しくは約２超である。特定の理論に拘束されることなく、本開示の方法により製造されたハイブリドーマは、Ｂ細胞抗体分泌率及び／又は希少なＢ細胞の低存在度により課せられる制限を受けることなく、免疫化非ヒト動物の免疫レパトアのディープマイニングが可能となる。有利には、本開示の方法により製造されたハイブリドーマは、免疫化非ヒト動物の免疫レパトアをより完全に表す。例示的な態様では、本開示の方法により捕捉された不死化ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの割合は、最大化されており、様々な事例では、免疫化動物により産生されたレパトアの少なくとも約１５％（例えば、少なくとも約２０％又は少なくとも約２５％）である。本開示の方法により、さらに、抗原特異的抗体に関してスクリーニングされ得るハイブリドーマ上清の無制限の供給が可能となる。例示的な態様では、本開示の方法は、抗原特異的抗体を産生する抗原特異的ハイブリドーマが、数千種とはいかないまでも数百種で日常的に得られる。本開示の方法により、さらに、より高い融合効率がもたらされ、ハイブリドーマプール中のＢ細胞クローンがより高い効率で捕捉される。

従って、本開示は、さらに、ハイブリドーマを生成する方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、この富化集団の細胞の約１０％未満（任意選択的に、約５％未満）は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；及び（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることを含む。例示的な態様では、富化集団の細胞の２．５％未満又は１％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である。様々な態様では、この方法は、約９０％超（例えば、９５％超、９８％超、９９％超）のＩｇＭ＋細胞を除去して、及び／又はＩｇＧ＋細胞を正に選択して、富化集団を得ることを含む。例示的な態様では、（ｉ）富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、及び／又は（ｉｉ）富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、約０．５超であり、任意選択的に約１超又は約２超である。例示的な態様では、富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞数と比べて少なく、富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、１超又は２超である。様々な態様では、この方法は、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞～１ｍＬ当たり約７７０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞の密度で富化集団をバルク培養することを含む。例示的な態様では、富化集団をバルク培養することを、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞～約７００個のＢ２２０陽性Ｂ細胞、任意選択的に、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞の播種密度で開始する。例示的な事例では、この方法は、増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを、１：１～１：４（例えば、１：１．０、１：１．５、１：２．０、１：２．５、１：３．０、１：３．５、又は１：４．０）の範囲内のＢ細胞対骨髄腫細胞の比で融合させることを含む。例示的な態様では、増大集団の全細胞（そのため、増大集団の全Ｂ細胞）を、骨髄腫細胞と組み合わせる。例えば、富化集団又は増大集団のＢ細胞は、抗原に結合する抗体の産生に基づいて、骨髄腫細胞との融合に選択されない。同様に、例えば、富化集団又は増大集団のＢ細胞は、骨髄腫細胞との融合前に、抗原特異的抗体の産生に関してアッセイされない。様々な事例では、この方法は、抗体の産生に関してハイブリドーマをスクリーニングすること、及び任意選択的に、抗原特異的抗体の産生に関して、免疫化動物から得られる血清をスクリーニングすることを含む。例示的な事例では、免疫化動物からリンパ器官を摘出した後に起こる抗原特異的抗体の産生に関する唯一のスクリーニングは、ハイブリドーマのスクリーニングである。

本開示はまた、抗原発現抗体を発現するハイブリドーマのスクリーニング方法であって、本開示に従ってハイブリドーマを生成すること、個々のウェル中でハイブリドーマを培養すること、及び抗原特異的抗体に関して各ウェルの上清をスクリーニングすることを含む方法も提供する。様々な態様では、ハイブリドーマの約１～約１０個又は約１～約５個の異なるクローンを、単一ウェル中で培養する。

さらに提供されるのは、抗原特異的抗体を製造する方法であって、本開示に従ってハイブリドーマを生成すること、個々のウェル中でハイブリドーマを培養すること、抗原特異的抗体に関して各ウェルの上清をスクリーニングして、抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマを同定すること、及び同定されたハイブリドーマの培養物を増大させて、抗原特異的抗体を産生させることを含む方法である。

本開示の例示的なＥＨＧ法を示しており、下記の文章は、このＥＨＧ法を詳述している。 ＲＢＣ、非Ｂ細胞、及びＩｇＭ＋細胞を除去し、さらに表面ＩｇＧ＋細胞を正に選択して、バルク培養に使用され得る富化集団を得る、例示的な富化プロセスを示す。 免疫化動物の脾臓由来のプールされた単一細胞懸濁液からＲＢＣを除去し、続いて、ＲＢＣ枯渇ＳＣＳと、免疫化動物のＬＮ由来のＳＣＳとを組み合わせる、例示的な富化プロセスを示す。非Ｂ細胞及びＩｇＭ＋細胞を、磁石を使用して、組み合わされたＳＣＳから除去する。表面ＩｇＧ＋細胞を、ＩｇＧマイクロビーズを使用して正に選択する。カラムからの表面ＩｇＧ＋細胞の放出により、富化集団が得られ、次いで、この富化集団をバルク培養にし得る。 ハイブリドーマ生成の増強の例示的な方法の概略である。 Ｂ細胞の培養及び融合の前のＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化を評価するための、Ｂ細胞マーカーの一連のＦＡＣＳ分析プロットである。 Ｂ細胞の培養及び融合の前のＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化を評価するための、Ｂ細胞マーカーの一連のＦＡＣＳ分析プロットである。 富化プロセスを評価するためのＢ細胞表面マーカーの一連のＦＡＣＳ分析プロットである。この富化集団は、高親和性ＩｇＧ分泌形質細胞集団を含み、抗原結合分泌アッセイ用の直接的Ｂ細胞発見技術に適用される。 富化プロセスを評価するためのＢ細胞表面マーカーの一連のＦＡＣＳ分析プロットである。この富化集団は、高親和性ＩｇＧ分泌形質細胞集団を含み、抗原結合分泌アッセイ用の直接的Ｂ細胞発見技術に適用される。

本開示は、トランスジェニック動物での免疫レパトアの捕捉効率を大幅に増強する増強ハイブリドーマ生成（ＥＨＧ）法を提供する。これは、融合前に４～６日にわたり、バルク培養で、高度に精製されたメモリーＢ細胞を増大させることにより、少なくとも部分的に達成される。いくつかの実施形態では、これは、融合前に６日にわたり、バルク培養で、高度に精製されたメモリーＢ細胞を増大させることにより、少なくとも部分的に達成される。融合前のバルク培養では、それぞれのメモリーＢ細胞クローンは、７～１０回分裂し（６日にわたりバルク培養でＢ細胞を増大させる場合）、１２５～１０００個のクローンコピーが生成されると推定される。特定の理論に拘束されることなく、例えば６日にわたるＢ細胞バルク培養後での、高いＢ細胞コピー数、活性化Ｂ細胞のブラスティング表現型（ｂｌａｓｔｉｎｇ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）、融合中のＢ細胞のサイズ（融合パートナーのサイズに近似しており、それにより融合が促進される）、及びＢ細胞膜は流動的であり、そのため、例えば６日間のＢ細胞培養後であっても融合が修正されやすいという事実は全て、融合事象の非効率性を克服する要因である。本開示のＥＨＧプロセスでは、インビボでのメモリーＢ細胞免疫レパトアの約２５％が捕捉される推定され、それにより、多様性が深いハイブリッドプールが得られる。例示的な態様では、本ＥＨＧ法は、免疫化トランスジェニック動物から免疫組織を摘出すること、及びそのような組織由来の細胞を処理して単一細胞懸濁液にすることを含む（図１Ａ）。様々な態様では、非Ｂ細胞及びＩｇＭ陽性Ｂ細胞を除去して、表面ＩｇＧ陽性メモリーＢ細胞を特異的に富化させており、様々な事例では、生細胞の約９９．９％が免疫組織調製物から除去されているが、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団の２５～５０％は保持されている。高度に富化されたメモリーＢ細胞画分を、様々な態様では、放射線照射されたマウスＴ細胞株（ＥＬ４Ｂ５）、ウサギＴ細胞上清（ＴＳＮ）、及び抗ＩｇＧ抗体が付着したマイクロビーズ（例えば、抗ヒトＩｇＧマイクロビーズ）の存在下でバルク培養する。培養中に、静止メモリーＢ細胞は高度に活性化され、いくつかの態様では、７～１０回分裂する。様々な事例では、約６日間の培養後、細胞を回収し、Ｐ３骨髄腫細胞株と融合させてハイブリドーマを製造する。融合効率の算出は、ハイブリドーマプールの一部からの低密度播種におけるクローン増殖の測定により可能となる。抗原特異的クローンの同定は、従来のハイブリドーマ生成にも採用されている方法を使用して、ここから始まる。

特定の理論に拘束されることなく、本明細書で説明されているＥＨＧ法は、従来のハイブリドーマ生成と比較して、齧歯類においてインビボで生成された免疫レパトアのはるかに大きい割合を捕捉する固有の能力を提供し、特に、形質細胞コンパートメントと比べて大幅に深くて多様なＩｇＧ＋メモリーＢ細胞コンパートメントを標的とする。本明細書で説明されているＥＨＧ法は、従来の方法の限界（例えば、不十分な融合効率及び弱い免疫反応等）を有利に克服しており、大規模で多様な抗体レパトアを有するハイブリドーマプールの製造につながる。本明細書で開示されているＥＨＧ法を、あらゆるトランスジェニックマウス及びラットモデル並びに野生型株に成功利に適用し得る。特に、本明細書で開示されているＥＨＧ法はまた、免疫反応があまり頑強ではなく且つ抗原反応性Ｂ細胞が希であるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）等の第一世代のヒト抗体トランスジェニック動物でも有効である。本開示のＥＨＧ法は、インビボで生成されたメモリーＢ細胞集団を特異的に不死化するが、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５－４９７で説明されているような従来のハイブリドーマ生成は、抗原特異的レパトアの異なるアームを表す形質細胞集団の不死化に偏っている。本ＥＨＧ法をＩｇＧ＋メモリー細胞に適用する場合であっても、形質細胞集団を、ＥＨＧに進む前に同一の免疫組織から成功利に単離して、直接的分子救出と組み合わされた様々な単一Ｂ細胞技術により捕捉し得ることに留意すべきである。本開示のＥＨＧ法は、メモリーＢ細胞と形質細胞コンパートメントの両方の調査を可能にし、抗原に対するインビボ免疫反応の捕捉に深みを加える。

従来のＥＨＧ法の結果と、本明細書で説明されているＥＨＧ法の結果とを考慮すると、融合事象中に捕捉されるＢ細胞集団が異なることを理解しなければならない。従来のハイブリドーマ生成は、形質細胞に強く偏っており、ＥＨＧは、メモリー細胞に強く偏っている。これは、Ｂ細胞の富化、サイズ、及び活性化状態により決定される。融合事象は、同じサイズの細胞間で、及び活性化細胞で見られるようなより流動性の形質膜を有する細胞で、成功する可能性が高い（Ｒｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１３）３，３３８２）。融合パートナー（例えば、骨髄腫細胞）は、形質細胞とサイズが近いことから、従来のハイブリッド生成では、稀な形質細胞は、メモリー細胞の数がより多いにもかかわらず休息している小さいものよりも、ハイブリッドプールに寄与する可能性が高い。従って、従来のハイブリドーマ生成法では、多様性が制限されている比較的小さいハイブリッドプールが製造される（Ｄｕｂｏｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（２０１６）Ｊｕｎ ８；２４（１－２）：１－１５）。

対照的に、ＥＨＧでは、開始点は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞が枯渇した。高度に富化されたＩｇＧ＋メモリー細胞コンパートメントである。この枯渇は重要であり、なぜならば、マウスＩｇＧ＋Ｂ細胞は、６日間の培養で７～９回分裂するが、ＩｇＭ＋Ｂ細胞は、典型的には、培養中に９～１０回以上分裂し、また、アイソタイプスイッチしてＩｇＧ＋Ｂ細胞となるからである。一緒に培養した場合には、ＩｇＭ＋Ｂ細胞は、プール中の高親和性ＩｇＧ由来抗原発現Ｂ細胞の割合を劇的に低下させる。これは、その後に融合する集団である。その結果、大きな多様性、及び従来の方法を使用して観察されたものと異なるレパトアを有するハイブリッドプールが得られる。

本来の電気細胞融合の非効率性を克服するための、ほとんど調査されていない供給源、及び抗原特異的Ｂ細胞の複数のコピーを含む、事前に富化されたＩｇＧ＋メモリーＢ細胞コンパートメントからの包括的プールの不死化は、ＥＨＧを従来のハイブリドーマ生成と区別する最初の重要な特徴である。メモリーＢ細胞コンパートメントは、病原体に対する第一選択反応における高親和性結合のためにインビボでは選択されないが、より大きな多様性、及び主な抗原決定基への小さい偏りを保持し得、インビボで生成された形質細胞からは捕捉されない重要なレパトアを提供する。

２番目の重要な特徴は、トランスジェニックＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）等の動物モデルに由来する非常に稀な抗原反応性Ｂ細胞からの抗体発見が可能なことである。トランスジェニックプラットフォームでは免疫細胞数が少なく且つ免疫反応の頑強さが低いにもかかわらず、融合前にメモリー細胞を高度に富化し、次いで活性化して増大させる本明細書で説明されている方法により、免疫レパトアの高効率の捕捉と、大きくて多様なハイブリッドプールの生成とが可能となり、これは、トランスジェニック動物における従来のハイブリッド生成の使用が常に可能であるとは限らない。

上述と一致して、本開示は、さらに、ハイブリドーマ（例えば、所望の抗原特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマ）を生成する方法を提供する。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、（ｉ）この富化集団の細胞の約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満）は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、及び／又は（ｉｉ）この富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、約０．５超であり、任意選択的に約１超又は約２超である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；並びに（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることを含む。様々な態様では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、この富化集団の細胞の約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満）は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；並びに（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることを含む。

富化集団の調製
様々な事例では、本方法は、１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することを含む。様々な態様では、この方法は、１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から分離した単一細胞懸濁液からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することを含む。様々な事例では、二次リンパ器官は、脾臓、リンパ節パイエル板、粘膜組織（例えば、鼻関連リンパ組織、アデノイド、及び／又は扁桃腺）である。任意選択的に、二次リンパ器官は、リンパ節（ＬＮ）（例えば、流入領域ＬＮ）、及び／又は脾臓である。様々な態様では、二次リンパ器官を、免疫化後約３～約５（例えば、約３、約４、又は約５）日で免疫化非ヒト動物から摘出するか、又は摘出している。任意選択的に、二次リンパ器官を、免疫化後約３～約５（例えば、約３、約４、又は約５）日で少なくとも１～約１５（例えば、約１～約１０）匹の免疫化非ヒト動物から摘出した。例示的な態様では、二次リンパ器官は、選択された免疫化非ヒト動物のみから摘出された二次リンパ器官であり、任意選択的に、選択された免疫化非ヒト動物を、免疫化後血清抗体価レベルに基づいて選択した。例えば、例示的な態様では、この方法は、動物を免疫化することを含み、免疫化動物の一部のみを、二次リンパ器官摘出用に選択する。任意選択的に、選択された動物は、閾値レベル以上の免疫化後血清抗体価レベルを示すものである。様々な事例では、この方法は、動物を免疫化すること、及び全免疫化動物の血清を免疫化後にアッセイすること、及び免疫化動物の一部のみを、二次リンパ器官摘出用に選択することを含み、この選択は、免疫化後血清抗体価レベルに基づく。様々な事例では、免疫化後血清抗体価レベルは、抗原特異的抗体の免疫化後血清力価レベルである。例示的な態様では、この方法は、免疫化後約３～約５（例えば、約３、約４、又は約５）日で免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出することを含む。様々な事例では、この方法は、免疫化後約３～約５（例えば、約３、約４、又は約５）日で少なくとも１、２、３、４、又は５匹の免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出することを含む。免疫化非ヒト動物は、当該技術分野で既知のものの内のいずれかであり得、本明細書で説明されている非ヒト動物の内のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。様々な態様では、非ヒト動物は、マウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））である。任意選択的に、非ヒト動物は、ラットであり、例えば、トランスジェニックラット（例えば、ＵｎｉＲａｔ（登録商標））又は野生型ラットである。様々な態様では、免疫化非ヒト動物を、当該技術分野で既知の任意のプロトコルに従って免疫化するか、又は免疫化している。様々な態様では、非ヒト動物を、本明細書で説明されている免疫化プロトコルの内のいずれか従って免疫化するか、又は免疫化している。例えば、下記の免疫化を参照されたい。様々な態様では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の非ヒト動物を免疫原で免疫化すること、（ｂ）任意選択的に免疫化後約３～約５日で、この免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出すること、（ｃ）それぞれの免疫化非ヒト動物から摘出した二次リンパ器官から単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）を調製すること、及び／又は（ｄ）複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官からのＳＣＳを組み合わせて、プールされたＳＣＳを調製することをさらに含む。

例示的な態様では、本方法は、免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官（任意選択的に、選択された免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官）から単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）を調製することを含む。例示的な事例では、この方法は、二次リンパ器官から得られた混合免疫細胞を含む単一細胞懸濁液を調製することを含む。この単一細胞懸濁液を、当該技術分野で既知の方法に従って、スライド上で臓器を解離させて調製し得るか、又は組織解離キット（例えば、ＭＡＣＳ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））を使用するか若しくは使用することなく、ホモジナイザ（例えば、Ｄｏｕｎｃｅ組織グラインダ、ディスパーサ、マイクロビーズホモジナイザ、超音波プロセッサ、ブレンダー）、及び／若しくは組織解離器（例えば、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して調製し得る。例えば、Ｒｅｉｃｈａｒｄ ａｎｄ Ａｓｏｓｉｎｇｈ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ９５（２）：２１９－２２６（２０１９）、Ｓｃｈｅｕｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５（１）：５４５－５４８（２０１９）を参照されたい。例示的な態様では、この方法は、１匹若しくは複数匹の免疫化非ヒト動物の脾臓からＳＣＳを調製すること、及び／又は１匹若しくは複数匹の免疫化非ヒト動物由来の流入領域リンパ節からＳＣＳを調節することを含む。任意選択的に、下記の２つの別々のＳＣＳを調節する：免疫化非ヒト動物のプールされた脾臓由来の１つ、及び免疫化動物のプールされたＬＭ由来の１つ。様々な事例では、プールされた脾臓由来のＳＣＳをＲＢＣ枯渇工程に供し、続いて、プールされたＬＮ由来のＳＣＳを組み合わせて、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液を得る。任意選択的に、ＲＢＣを、ＲＢＣ溶解緩衝液、例えば、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）又はＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して除去する。

様々な態様では、本方法は、（ｉ）非ヒト動物を免疫原で免疫化すること、（ｉｉ）任意選択的に免疫原による最後のブースト後約３～約５日で、免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出すること、（ｉｉｉ）任意選択的に、スライド上で器官を解離させることにより、又は組織解離キットを使用するか若しくは使用することなくホモジナイザ及び／若しくは組織解離器を使用することにより、二次リンパ器官から単一細胞懸濁液を調製すること、並びに（ｉｖ）（例えば、異なる免疫化非ヒト動物由来の）複数の調製された単一細胞懸濁液を組み合わせて、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液を得ることの内の１つ又は複数を含む。様々な態様では、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を、赤血球（ＲＢＣ）、非Ｂ細胞、及び／又はＩｇＭ陽性（ＩＧＭ＋）細胞を除去することにより、単一細胞懸濁液（例えば、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液）から調製する。様々な態様では、ＲＢＣ溶解緩衝液（例えば、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）又はＲｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用することにより、単一細胞懸濁液（例えば、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液）からＲＢＣを除去する。様々な事例では、非Ｂ細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する１種又は複数種の抗体（例えば、抗体カクテル）を使用することにより、単一細胞懸濁液（例えば、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液）から非Ｂ細胞を除去する。例示的な態様では、非Ｂ細胞は、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、及びＲＢＣの内の１つ又は複数である。例示的な事例では、１種又は複数種の抗体は、ビオチンに連結されている。様々な態様では、本方法は、単一細胞懸濁液から、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＲＢＣ、顆粒球、又はこれらの組み合わせを除去することを含む。例示的な事例では、この方法は、ビオチン標識抗体及びストレプトアビジン標識ビーズ（任意選択的に、ストレプトアビジン標識磁気ビーズ）を使用して、単一細胞懸濁液から、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＲＢＣ、顆粒球、又はこれらの組み合わせを除去することを含む。様々な態様では、非Ｂ細胞の細胞表面マーカーは、ＮＫ１．１（ＮＫ細胞により発現される）、ＣＤ９０．２（Ｔ細胞により発現される）、Ｌｙ－６Ｇ ＧＲ．１（顆粒球及び／又はマクロファージにより発現される）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ４（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ８ａ（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ１１ｂ（顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、及び／又はＮＫ細胞により発現される）、並びにＴＥＲ１１９（赤血球細胞により発現される）である。

例示的な態様では、ビオチン化抗ＩｇＭ抗体（例えば、抗ヒトＩｇＭ抗体）を添加することにより、単一細胞懸濁液（例えば、プールされた単一細胞懸濁液、又はバルク単一細胞懸濁液）からＩｇＭ＋細胞を除去する。様々な態様では、ビオチン化抗体を単一細胞懸濁液に添加して、この抗体が非Ｂ細胞及び／又はＩｇＭ＋細胞上の細胞表面マーカーに結合するのを可能にする。その後、様々な事例では、ストレプトアビジンに連結された磁気ビーズ（例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズ）を添加して、ストレプトアビジンがビオチン化抗体のビオチンに結合するのを可能にする。例示的な態様では、磁石を使用して、抗体を介して非Ｂ細胞及び／又はＩｇＭ＋細胞に連結されている磁気ビーズを単離して除去する。様々な事例では、本方法は、免疫化非ヒト動物から脾臓を摘出してこの脾臓からＳＣＳを調製すること、免疫化非ヒト動物からＬＮを摘出してこのＬＮからＳＣＳを調製すること、脾臓由来のＳＣＳからＲＢＣを除去すること、ＬＮ由来のＳＣＳと、ＲＢＣが枯渇した脾臓由来ＳＣＳとを組み合わせて、プールされたＳＣＳを得ること、ビオチン化抗ＩｇＭ抗体を添加することにより、このプールされたＳＣＳからＩｇＭ＋細胞を除去すること、及びストレプトアビジン磁気ビーズでＩｇＭ＋細胞を捕捉することを含む。

任意選択的に、プールされたＳＣＳから９０％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞を除去して、富化集団を得る。様々な事例では、プールされたＳＣＳのＩｇＭ＋Ｂ細胞の９５％超（例えば、９６％超、９７％超、９８％超、又は９９％超）を除去して、ＩｇＭ＋細胞が実質的に枯渇している富化集団を得る。様々な事例では、本方法は、ＩｇＭ＋細胞を除去すること、及び／又はＩｇＧ＋細胞を選択することを含む。様々な態様では、この方法は、メモリーＢ細胞を単離するために、ＩｇＭ＋細胞が実質的に枯渇した富化集団に、抗ＩｇＧ抗体標識磁気ビーズ（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体標識磁気ビーズ）を添加することを含む。様々な態様では、残りの部分（例えば、ＲＢＣ、非Ｂ細胞、及び／又はＩｇＭ＋細胞が枯渇したもの）を、抗ＩｇＧ抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体）に連結されたマイクロビーズと共にインキュベートする。ある特定の態様では、抗ＩｇＧ抗体を介して、細胞表面上でＩｇＧを発現する細胞は、マイクロビーズに結合する。例示的な態様では、マイクロビーズ－抗体－細胞混合物を、表面ＩｇＧを発現する細胞に結合したマイクロビーズを保持する磁気カラムに加える。フロースルー画分は、様々な態様では、表面ＩｇＧの発現に関して陰性の細胞を含む。例示的な事例では、表面ＩｇＧを発現する細胞をカラムから放出させて、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を得る。様々な事例では、ＩｇＧ＋細胞の割合は、ＲＢＣ、非Ｂ細胞、及び／又はＩｇＭ細胞が単一細胞懸濁液（例えば、プールされた単一細胞懸濁液又はバルク単一細胞懸濁液）から除去されるにつれて増加する。様々な態様では、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団は、単一細胞懸濁液の場合と比較して高い割合のＩｇＧ＋細胞を含む。例えば、様々な態様では、富化前の単一細胞懸濁液の（全生細胞数に対する）ＩｇＧ＋細胞の割合に対して、（全生細胞数に対する）ＩｇＧ＋細胞の割合は、少なくとも５倍又は１０倍又はより多く増加する。様々な態様では、（富化前の）単一細胞懸濁液の１％未満は、ＩｇＧ＋細胞であり、（全生細胞数に対する）ＩｇＧ＋細胞の割合は、富化後に約５％、約１０％、約１５％、又はより多くまで増加する。様々な事例では、富化集団の生細胞の５％超、１０％超、若しくは１５％超は、ＩｇＧ＋細胞であり、及び／又は富化集団の２０％超の細胞、３０％超、４０％超、若しくは５０％超は、Ｂ２２０発現に関して陽性である。Ｂ２２０は、Ｂ細胞マーカーである。様々な事例では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団の細胞の１０％未満は、ＩｇＭ＋細胞である。様々な態様では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団の細胞の５％未満は、ＩｇＭ＋細胞である。任意選択的に、富化集団の細胞の約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満は、ＩｇＭ＋細胞である。様々な事例では、富化集団のＩｇＭ＋細胞に対するＩｇＧ＋細胞の比は、富化前の単一細胞懸濁液のＩｇＭ＋細胞に対するＩｇＧ＋細胞の比に対して、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、又はより多く増加する。特定の理論に拘束されることなく、ＩｇＧ＋細胞の富化集団のＩｇＭ＋細胞の割合の減少及びＩｇＧ＋細胞の割合の増加により、有利には、ＩｇＧ＋細胞をバルク培養で増大させて、後に骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得ることができる増大集団を得ることが可能となる。

例示的な態様では、富化集団を、ＩｇＭ＋細胞を除去すること、及び／又はＩｇＧ＋細胞を選択することにより調製する。様々な事例では、富化集団を、ＩｇＭ＋細胞の負の選択、及び／又はＩｇＧ＋細胞の正の選択により調製する。任意選択的に、負の選択及び／又は正の選択時に９０％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去され、いくつかの事例では、負の選択及び／又は正の選択時に９５％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去される。様々な態様では、負の選択時に９８％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去され、負の選択及び正の選択時に９９％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去される。任意選択的に、負の選択及び正の選択により、単一細胞懸濁液中に存在するＩｇＭ＋細胞の９９％超が除去される。様々な事例では、ＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、負の選択及び正の選択時に、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍増加する。

バルク培養
本開示のＥＨＧ法の例示的な態様では、富化集団を、ウサギＴ細胞上清を含む細胞培養培地中において、抗ＩｇＧ抗体標識ビーズ（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体標識ビーズ）及びフィーダー細胞と共にバルク培養する。「バルク培養物」は、細胞培養物がクローン細胞集団ではないことを意味する。様々な態様における「バルク培養物」は、複数の免疫化非ヒト動物から摘出された二次リンパ器官に由来する細胞の混合物である。様々な事例では、「バルク培養する」は、本明細書で使用される場合、表面ＩｇＧ陽性Ｂ細胞のポリクローナル混合物を、これを活性化し且つ増殖及び分化を誘導する条件下で培養することを指す。いくつかの事例では、フィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現し、及び／又はガンマ線照射されている。任意選択的に、フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたＣＤ４０Ｌ陽性ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞である。様々な態様では、骨髄腫細胞は、対数増殖期段階である。ある特定の態様では、骨髄腫細胞は、Ｐ３骨髄腫細胞である。例示的な態様では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、１ｍＬ当たり３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞の密度でバルク培養する。任意選択的にＩｇＧ＋細胞の富化集団を、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約５００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約４５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約４００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約４００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約４５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約５００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞の密度でバルク培養する。任意選択的に、ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞、任意選択的に１ｍＬ当たり約６２５個のＢ２２０陽性細胞の密度でバルク培養する。様々な事例では、富化集団をバルク培養することを、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞～約７００個のＢ２２０陽性細胞、任意選択的に、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞の播種密度で開始する。様々な態様では、播種密度は、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約５００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約４５０個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約４００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約４００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約４５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約５００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞、又は１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約７００個のＢ２２０陽性細胞である。任意選択的に、播種密度は、１ｍＬ当たり約５５０個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞、任意選択的に、１ｍＬ当たり約６２５個のＢ２２０陽性細胞である。様々な態様では、バルク培養物の量は、約１０ｍＬ以上、約２０ｍＬ以上、約３０ｍＬ以上、約４０ｍＬ以上、約５０ｍＬ以上である。様々な態様では、バルク培養物の量は、５０ｍＬ超、６０ｍＬ超、７０ｍＬ超、８０ｍＬ超、又は９０ｍＬ超である。様々な態様では、この量は、１００ｍＬ超、２５０ｍＬ超、５００ｍＬ超、７５０ｍＬ超、１．０Ｌ超、約１．１Ｌ、約１．２Ｌ、約１．３Ｌ、約１．４Ｌ、約１．５Ｌ、約１．６Ｌ、約１．７Ｌ、約１．８Ｌ、約１．９Ｌ、又は約２．０Ｌである。富化集団を、例示的な事例では約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、任意選択的に約１００ｍＬ～約３００ｍＬの量でバルク培養する。任意選択的に、富化集団を、少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約６日にわたり、バルク培養する。例示的な態様では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、少なくとも約４日にわたりバルク培養する。例示的な態様では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、少なくとも約５日にわたりバルク培養する。例示的な態様では、ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、少なくとも約６日にわたりバルク培養する。様々な事例では、富化集団の細胞は、少なくとも又は約５回の細胞分裂～約１２回の細胞分裂を受ける。様々な事例では、富化集団の細胞は、少なくとも又は約６回の細胞分裂～約１２回の細胞分裂（例えば、少なくとも又は約６回の細胞分裂～約１１回の細胞分裂、少なくとも又は約６回の細胞分裂～約１０回の細胞分裂）、任意選択的に、少なくとも又は約７回の細胞分裂～約１０回の細胞分裂、例えば、約７、約８、約９、又は約１０回の細胞分裂を受けて、増大集団が得られる。

細胞融合
例示的な態様では、増大集団の細胞を、電気細胞融合（ＥＣＦ）により骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを得、任意選択的に、ＥＣＦを、ＳＤＦ融合チャンバーを使用して実行する。様々な事例では、増大集団の全細胞（全Ｂ細胞を含む）を、骨髄腫細胞との融合に使用する。様々な態様では、増大集団の全細胞（全Ｂ細胞を含む）と骨髄腫細胞とを組み合わせて融合させる。例示的な事例では、本方法は、骨髄腫細胞との融合のためにＢ細胞を選択することを含まない。例示的な事例では、本方法は、骨髄腫細胞との融合のために、抗原に結合する抗体（例えば、抗原特異的抗体）の産生に基づいてＢ細胞を選択することを含まない。例示的な態様では、富化集団又は増大集団のＢ細胞を、抗原に結合する抗体（例えば、抗原特異的抗体）の産生に関してスクリーニングしない。

様々な事例では、Ｂ細胞は、ＥＣＦ中に、約１：１～約１：４（例えば、１：１．５、１：２．０、１：２．５、１：３．０、１：３．５、１：４．０）のＢ細胞対骨髄腫細胞の比で存在する。いくつかの態様では、この比は、約１：２である。ハイブリドーマ製造のための電気細胞融合の方法は、当該技術分野で説明されている。例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ１０３１８４（２０１９）を参照されたい。任意選択的に、増大集団の細胞を、１回の融合事象当たり１０ｍＬを超える量で、骨髄腫細胞と融合させる。様々な態様では、本方法は、ハイブリドーマを非融合細胞から分離するか又は単離することをさらに含む。様々な事例では、この方法は、細胞を、ＥＣＦチャンバーから、あらゆる非融合細胞を細胞死させるヒポキサンチンアザセリン（ＨＡ）を含む培養培地に移すことを含む。様々な態様では、この方法は、細胞を、ＥＣＦチャンバーから、約３日超にわたり、ＨＡを含む培養培地に移すことを含む。様々な事例でのハイブリドーマを、その後、凍結条件下で保存する。任意選択的に、凍結保存後、ハイブリドーマを、マルチウェルプレートに蒔くか、又はＦＡＣＳによりマルチウェルプレート中にクローン的に抗原選別する。例示的な態様では、それぞれのウェルは、１つのウェル当たり最大５つのハイブリドーマクローンを含む。例示的な事例では、それぞれのウェルからの上清を、１つ又は複数のスクリーニングアッセイで使用して、ウェル中のハイブリドーマにより産生される抗体を検出してキャラクタライズする。様々な態様では、上清を、任意選択的に、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、又は他の技術により、抗原特異的抗体に関してアッセイする。

様々な態様では、本方法は、抗原に結合する抗体の産生に関してハイブリドーマをスクリーニングすること、及び／又はハイブリドーマをマルチプレートウェル中で培養し、それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることをさらに含む。任意選択的に、スクリーニングすることは、抗原への抗体の結合を検出するイムノアッセイを含む。このイムノアッセイは、様々な態様では、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析である。様々な態様では、抗原特異的抗体を産生する細胞に関するスクリーニングを、ハイブリドーマを得た後にのみ行ない、ハイブリドーマを得る前には行なわない。任意選択的に、抗原特異的抗体に関してアッセイすることは、二次リンパ器官を摘出した後、及びハイブリドーマを得た後のみである。例示的な事例では、二次リンパ器官を摘出する前にのみ行なう抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることを、ハイブリドーマ－得た後のみで行なう。任意選択的に、二次リンパ器官を摘出する前に行なう抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることは、生存している免疫化動物から得られる血清の力価分析を含む。

例示的な実施形態では、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを生成する方法は、
ａ．１匹又は複数匹の非ヒト動物を免疫原で免疫化すること；
ｂ．この免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出すること；
ｃ．それぞれの免疫化非ヒト動物から摘出した二次リンパ器官から単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）を調製すること；
ｄ．（ｃ）で調製された全ＳＣＳを組み合わせることにより、プールされたＳＣＳを調製すること；
ｅ．このプールされたＳＣＳから９５％超のＩｇＭ＋細胞を除去して、及び／又はこのプールされたＳＣＳから表面ＩｇＧ＋細胞を正に選択して、ＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を得ることであって、
ｉ．この富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、
及び／又は
ｉｉ．この富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、０．５超であり、任意選択的に１超又は２超である、
得ること；
ｆ．この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；
ｇ．この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること；
並びに
ｈ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養し、それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることにより、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを同定すること
を含む。

抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを生成する本開示の方法の例示的な実施形態では、得られるハイブリドーマは、免疫化動物により産生されるＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも１５％を占める。様々な事例では、得られるハイブリドーマは、免疫化動物により産生されるＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも２０％を占める。任意選択的に、得られるハイブリドーマは、免疫化動物により産生されるＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも２５％を占める。

本開示のＥＨＧ法の例示的な事例では、インビボレパトアからの全ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％超を、富化後に回収してバルク培養する。本開示のＥＨＧ法の他の例示的な態様では、インビボレパトアからの全ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の１０％超（例えば、１５％超、２０％超、２５％超）を、富化後に回収してバルク培養する。本開示のＥＨＧ法の例示的な事例では、免疫化動物からプールされたＢ細胞のメモリーＢ細胞レパトアの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％超が捕捉される。本開示のＥＨＧ法の他の例示的な事例では、免疫化動物からプールされたＢ細胞のメモリーＢ細胞レパトアの１０％超（例えば、１５％超）が捕捉される。様々な態様では、本開示のＥＨＧ法により、１００，０００個超の固有のハイブリドーマが生成される。ある特定の事例では、本開示のＥＨＧ法により、１５０，０００個超又は２００，０００個超の固有のハイブリドーマが生成される。様々な事例では、本開示のＥＨＧ法により達成される融合効率は、少なくとも０．１０％である。他の事例では、本開示のＥＨＧ法により達成される融合効率は、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、又は０．０９％超である。他の事例では、本開示のＥＨＧ法により達成される融合効率は、０．１０％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、又は０．２０％超である。特定の実施形態では、本開示のＥＨＧ法により達成される融合効率は、０．１４０％超である。

本明細書では、抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマに関してスクリーニングする方法がさらに提供される。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）ハイブリドーマを生成する本開示の方法の内のいずれか１つに従ってハイブリドーマを生成すること、（ｂ）ハイブリドーマをウェル中で培養することであって、任意選択的に、それぞれのウェルは、最大５つのハイブリドーマを含む、培養すること、及び（ｃ）それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングするか又はアッセイすることを含む。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られた細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、この富化集団の細胞の約５％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること；（ｄ）ウェル中でハイブリドーマを培養すること；及び（ｅ）それぞれのウェルの上清を、抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることを含む。スクリーニングすることは、様々な態様では、ＥＬＩＳＡ、又は標的抗原でコーティングされたストレプトアビジンビーズへの結合、標的でトランスフェクトされた細胞への抗体結合のＦＡＣＳ検出、又は別のハイスループット顕微鏡技術を含む。

本開示はまた、抗原特異的抗体を製造する方法も提供する。例示的な実施形態では、この方法は、（ａ）１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られた細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであって、この富化集団の細胞の約１０％未満（例えば、約５％未満）は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、調製すること；（ｂ）この富化集団をバルク培養して、増大集団を得ること；（ｃ）この増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること；（ｄ）ハイブリドーマをウェル中で培養すること；（ｅ）それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングして、抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマを同定すること；及び（ｆ）（ｅ）で同定されたハイブリドーマを増大させて、抗原特異的抗体を産生させることを含む。

免疫化
本開示の様々な態様では、本開示は、非ヒト動物を免疫原で免疫化することを含む。本明細書で使用される場合、「免疫化する」という用語は、前記免疫原に対する免疫反応を開始するために「免疫化キャンペーン」又は「免疫化プロトコル」又は「キャンペーン」を実施するか又は実行することを指す。例示的な態様では、免疫反応は、前記免疫原に対するＢ細胞免疫反応及び液性免疫反応を含む。非ヒト動物の免疫化に好適な技術は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３^ｒｄｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６を参照されたい。非ヒト動物の免疫化に、例えば、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１６（４）：６１６－８，６２０（１９９４）；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２；３５６（６３６５）：１５２－４（１９９２）；Ｂｅｒｇｍａｎｎ－Ｌｅｉｔｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２５：２８９－３０２（２０１５）；Ａｒａｖｉｎｄａｒａｍ ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５４２：１６７－１７８（２００９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｔａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４３ ＰｔＡ：３５３－３６５（１９９４）；及びＤｉｌｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４（１）：７９－８７（２００３）で説明されている遺伝子銃法も使用し得る。さらに、本明細書で例示されているように、免疫化することは、抗原を発現する細胞を非ヒト動物に投与すること、又は抗原負荷樹状細胞、腫瘍細胞ワクチン、若しくは免疫細胞ベースのワクチンを投与することを含み得る。例えば、Ｓａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７（１）：７４－９５（２０１７），Ｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ｉｎ Ｐｌｏｔｋｉｎ’ｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，７^ｔｈｅｄ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，２０１８、及びＬｅｅ ａｎｄ Ｄｙ，“Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｔｈｏｒａｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｉｔｏ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔｏｆｆ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，２０１９を参照されたい。様々な事例では、免疫化することを、マイクロニードル送達により実行し得るか（例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７（９）：１３８１－１３８９（２０１０））；ウイルス様粒子（ＶＬＰ）により実行し得るか（例えば、Ｔｅｍｃｈｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ６（８）：３３３４－３３４７（２０１４）を参照されたい）；又は当該技術分野で既知の任意の手段により実行し得る。例えば、Ｓｈａｋｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３３（３３）：４０６０－４０６４（２０１５）及びＣａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３１（９）：１３５３－１３５６（２０１３）を参照されたい。例えば抗原にＴ細胞エピトープを追加することを含む免疫化及び免疫原調製のためのさらなる戦略が、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｕｒａｗｓｋｙ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４６０（２０１８）で説明されている。

様々な態様では、本方法は、非ヒト動物を免疫原で免疫化することを含み、前記免疫原を、非ヒト動物に１回又は複数回（例えば、２、３、４、５回、又はより多く）投与する。様々な態様では、免疫源を、注射により投与し、例えば、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、又は静脈内注射により投与する。様々な態様では、本方法は、免疫原の一連の注射を投与することにより、非ヒト動物を免疫化することを含む。例示的な態様では、それぞれの投与（例えば、注射）を、約１０日～約１８日間隔、任意選択的に、約１２～約１６日間隔、又は約１４日間隔で、非ヒト動物に行なう。例示的な態様では、それぞれの投与（例えば、注射）を、約１０日～約１８日間隔よりも多い頻度で、非ヒト動物に行なう。例えば、例示的な態様では、非ヒト動物への免疫原の投与間のタイミングは、約１～約９日間隔であり、任意選択的に、約１日～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約９日、約３日～約９日、約４日～約９日、約５日～約９日、約６日～約９日、約７日～約９日、約８日～約９日、約４日～約８日、約４日～約８日、又は約６日～約８日である。非ヒト動物への免疫原の投与間のタイミングは、様々な態様で、より長くなる。例えば、非ヒト動物への免疫原の投与間のタイミングは、約１～約２０週間又はより長くあり得、例えば、約１～約２０ヶ月であり得る。任意選択的に、非ヒト動物への免疫原の投与間のタイミングは、約１週～約１９週、約１週～約１８週、約１週～約１７週、約１週～約１６週、約１週～約１５週、約１週～約１４週、約１週～約１３週、約１週～約１２週、約１週～約１１週、約１週～約１０週、約１週～約９週、約１週～約８週、約１週～約７週、約１週～約６週、約１週～約５週、約１週～約４週、約１週～約３週、約１週～約２週、約２週～約２０週、約３週～約２０週、約４週～約２０週、約５週～約２０週、約６週～約２０週、約７週～約２０週、約８週～約２０週、約９週～約２０週、約１０週～約２０週、約１１週～約２０週、約１２週～約２０週、約１３週～約２０週、約１４週～約２０週、約１５週～約２０週、約１６週～約２０週、約１７週～約２０週、約１８週～約２０週、又は約１９週～約２０週である。任意選択的に、約１週～約８日、約１日～約７日、約１日～約６日、約１日～約５日、約１日～約４日、約１日～約３日、約１日～約２日、約２日～約９日、約３日～約９日、約４日～約９日、約５日～約９日、約６日～約９日、約７日～約９日、約８日～約９日、約４日～約８日、約５日～約８日、又は約６日～約８日。様々な事例では、免疫化中に、免疫原のそれぞれの投与（例えば、注射）を、同一の（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫原の投与経路若しくは送達方法、（Ｄ）非ヒト動物での投与部位、又は（Ｅ）これらの組み合わせで実行する。或いは、免疫化中での免疫原の１回又は複数回の投与（例えば、注射）を、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫原の投与経路若しくは送達方法、（Ｄ）非ヒト動物での投与部位、又は（Ｅ）これらの組み合わせで実行する。任意選択的に、免疫原の量は、後続の投与（例えば、注射）と共に減少するか、又は増加する。いくつかの態様では、１回おきの投与（例えば、注射）は、１回目及び３回目の注射と比較して、免疫原の量が減少するか、又は増加する。例示的な免疫化は、本明細書に記載されている実施例で説明されている。

非ヒト動物
有利には、本開示の方法は、任意の特定の非ヒト動物に限定されない。非ヒト動物は、例示的な態様では、あらゆる非ヒト動物である。例示的な態様では、非ヒト動物は、哺乳動物であり、例えば、限定されないが、マウス、ラット、モルモット、スナネズミ、及びハムスター等のげっ歯目（ｏｒｄｅｒ Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の哺乳動物、並びにウサギ等の兎形目（ｏｒｄｅｒ Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目（ｏｒｄｅｒ Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）の哺乳動物、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目（ｏｒｄｅｒ Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物、又はウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（ｏｒｄｅｒ Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物である。いくつかの態様では、非ヒト哺乳動物は、霊長目（ｏｒｄｅｒ Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）目、若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル）、又は類人猿科（類人猿）である。様々な態様では、非ヒト動物は、ヤギ、ラマ、アルパカ、ニワトリ、アヒル、魚（例えば、サケ）、ヒツジ、又はラムである。

例示的な事例では、本開示の方法で使用される非ヒト動物は、キメラ抗体又は完全ヒト抗体を産生するように改変されている（例えば、遺伝子改変されている）。そのような非ヒト動物は、トランスジェニック動物と称される。トランスジェニック動物中でのヒト抗体の産生は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）６３（２）：１０１－１０８（２０１５）で説明されている。本発明では、トランスジェニックニワトリ（例えば、ＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎ（登録商標））、トランスジェニックラット（例えば、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））、トランスジェニックラマ、及びトランスジェニックウシ（例えば、Ｔｃ Ｂｏｖｉｎｅ（商標））が挙げられるがこれらに限定されない任意のトランスジェニック動物を使用し得る。特定の実施形態では、非ヒト動物は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）、Ａｌｌｏｙマウス、Ｔｒｉａｎｎｉマウス、ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ（登録商標）、及びＨｕＭＡｂ‐Ｍｏｕｓｅ（登録商標）等のトランスジェニックマウスである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、完全ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの株である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の概要は、Ｆｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２７０（１）：５１－６４（２０１６）及び米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されている。例示的な態様では、非ヒト動物は、トランスジェニックラットである。トランスジェニックラットは、様々な態様では、Ｕｎｉｒａｔ（登録商標）又はＯｍｎｉＦｌｉｃ（登録商標）（それぞれ、Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：３０３７（２０１９）；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０３０３７、及びＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：８８９（２０１８）：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００８８９で説明されている）である。

免疫原
有利には、本開示の方法は、任意の特定の免疫原に限定されない。免疫原は、様々な態様では、任意の抗原（任意選択的に、タンパク質）又はその断片、融合体、若しくはバリアントであり得る。様々な事例では、免疫原は、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、腫瘍関連抗原、チェックポイント阻害剤分子、細胞表面受容体、又はこれらのリガンドである。単に例示的な免疫源を例示する目的のために、非ヒト動物の免疫化で使用される免疫原は、下記の抗体の内のいずれか１つが結合する標的又は抗原であり得る：ムロモナブ－ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ Ｏｋｔ３（登録商標）で市販の製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販の製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販の製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販の製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販の製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販の製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販の製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標）で市販の製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシツモマブ－Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販の製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販の製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販の製品）、イブリツモマブチウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販の製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販の製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販の製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販の製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販の製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、セルトリズマブペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販の製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販の製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販の製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販の製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販の製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販の製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販の製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販の製品）、及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販の製品）。例示的な実施形態では、抗体は、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴル等の抗ＴＮＦアルファ抗体；カナキヌマブ等の抗ＩＬ１β抗体；ウステキヌマブ及びブリアキヌマブ等の抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体；並びにダクリズマブ等の抗ＩＬ２Ｒ抗体の内の１つである。

免疫化工程で使用される免疫源を調製する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，Ｕｎｉｔ １１．４，（２００１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２^ｎｄｅｄ．，Ｏｓｓｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２０１４を参照されたい。様々な事例では、非ヒト動物への投与前に、免疫源を、アジュバント又は他の溶液と混合する。多くのアジュバントが当該技術分野で既知であり、例示的な事例では、油、ミョウバン、アルミニウム塩、又はリポ多糖を含む。様々な態様では、アジュバントは、無機である。代替態様では、アジュバントは、有機である。様々な態様では、アジュバントは、下記を含む：ミョウバン、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）、フロイント完全アジュバン、フロイント不完全アジュバン、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ）、脂質Ａ、シグマアジュバント系（登録商標）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃ、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅワクチンアジュバント（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ １０３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１）、ＡＦ０３アジュバント、ＡＳ０３アジュバント、Ｓｐｅｃｏｌ、ＳＰＴ、ナノエマルジョン、ＶＳＡ３、油又は脂質ベースの溶液（例えば、スクアレン、ＭＦ５９（登録商標）、ＱＳ２１、サポニン、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ））、トレハロースジコリノミコラート（ＴＤＭ）、ｓＴＤＭアジュバント、ビロソーム、及びＰＲＰリガンド。例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｅｖｉｅｗ－ｖａｃｃｉｎｅ－ａｄｊｕｖａｎｔｓでの“Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｒｅｖｉｅｗ”、及びｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｆｏ．ｇｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ｒｏｌｅ－ｏｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｓ－ｉｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎでの“Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｎ’ｓ Ｂｌｏｇ：Ａ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｏｓｔｅｄ ｏｎ Ｊｕｎｅ ２，２０１６を参照されたい。様々な事例では、アジュバントは、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノール、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、及びコリネバクテリウム・パルバムを含む。

抗体
抗体の構造は種間で異なるが、本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、一般に、典型的には重鎖及び軽鎖を含み且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。本方法により得られるか又は単離される抗体は、様々な用途を有し得る。例えば、本方法により得られる抗体を、治療薬として使用し得る。本方法による得られる抗体をまた、例えば、診断アッセイ、例えば、診断撮像アッセイ、及び他のインビトロ又はインビボイムノアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥｌｉＳｐｏｔアッセイ、及び同類のもので使用される試薬として、非治療用抗体としても使用し得る。様々な態様では、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。例示的な事例では、抗体は、哺乳動物抗体であり、例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ブタ抗体、ヒト抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、及び同類のものである。いくつかの態様では、抗体は、任意選択的にトランスジェニック動物により産生されるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。そのような実施形態では、産生される抗体は、２つ以上の種の配列を含むキメラ抗体である。様々な事例では、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるヒトＩｇＧを有しており、各ペアは、１本の「軽」鎖（典型的には分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（典型的には分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。ヒト抗体は、可変領域と定常領域とを有する。ヒトＩｇＧ形式では、可変領域は、一般に、約１００～１１０個以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に異なる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。簡潔に説明すると、ヒト抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成する。ヒト抗体可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、これらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照されたい）内にある。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。ヒト重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプを、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとそれぞれ定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるがこれらに限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態は、ヒト抗体の全てのこのようなクラス又はアイソタイプを含む。ヒト軽鎖定常領域は、例えば、カッパ又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミュー型の重鎖定常領域であり得る。従って、例示的な実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭの抗体であり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含む。

抗原結合タンパク質は、ヒト抗体のものとは異なる構造を有し得る。例示的な事例では、抗原結合タンパク質は、重鎖断片（例えば、重鎖可変領域、重鎖定常領域ＣＨ２、重鎖定常領域ＣＨ３）のみを含む。様々な事例では、抗原結合タンパク質は、ヒトコブラクダ、ラマ、及びサメにより作られるもの等の小さい抗体又はナノボディの構造を含む。例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／２０１８／０５／ｍｉｎｉ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ－ｓｈａｒｋｓ－ａｎｄ－ｃａｍｅｌｓ－ｃｏｕｌｄ－ｌｅａｄ－ｄｒｕｇｓ－ｃａｎｃｅｒ－ａｎｄ－ｏｔｈｅｒ－ｄｉｓｅａｓｅｓでのＬｅｓｌｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，“Ｍｉｎｉ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｉｎ ｓｈａｒｋｓ ａｎｄ ｃａｍｅｌｓ ｃｏｕｌｄ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ”，２０１８を参照されたい。

例示的な実施形態
下記で、本開示の例示的な実施形態を説明する。

１． ハイブリドーマを生成する方法であって、
ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであり、前記富化集団の細胞の約５％未満は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞である、調製すること；
ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団を得ること；
及び
ｃ．前記増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること
を含む方法。

２． 前記二次リンパ器官は、（ｉ）免疫化後約３～約５日での前記免疫化非ヒト動物、及び／又は（ｉｉ）少なくとも１、２、３、４、又は５匹の免疫化非ヒト動物から摘出された二次リンパ器官である、実施形態１に記載の方法。

３． 前記二次リンパ器官から調製された単一細胞懸濁液からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することを含む実施形態１又は２に記載の方法。

４． 前記二次リンパ器官は、脾臓及び／又はリンパ節である、実施形態１～３のいずれか一つに記載の方法。

５． 前記非ヒト動物は、マウス又はラットである、実施形態１～４のいずれか一つに記載の方法。

６． 任意選択的に、非Ｂ細胞、赤血球（ＲＢＣ）、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）細胞により発現される１種又は複数種の細胞表面マーカーに特異的な抗体を使用して、前記非Ｂ細胞、ＲＢＣ、ＩｇＭ＋細胞、又はこれらの組み合わせを除去することを含む、前記二次リンパ器官から調製された単一細胞懸濁液から、非Ｂ細胞、ＲＢＣ、ＩｇＭ＋細胞、又はこれらの組み合わせを除去することを含む実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。

７． 前記細胞表面マーカーは、ヒトＩｇＭ、ＣＤ９０．２、Ｌｙ－６Ｇ ＧＲ．１、ＮＫ－１．１、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＥＲ１１９である、実施形態６に記載の方法。

８． 前記抗体は、ビオチンに連結されており、前記方法は、ストレプトアビジン標識ビーズ、任意選択的にストレプトアビジン標識磁気ビーズを使用して、前記非Ｂ細胞、ＲＢＣ、及び／又はＩｇＭ＋細胞を除去することを含む、実施形態６又は７に記載の方法。

９． 任意選択的に、抗ＩｇＧ抗体標識ビーズ、任意選択的に抗ヒトＩｇＧ抗体標識磁気ビーズを使用することにより、表面ＩｇＧ＋細胞を選択することを含む実施形態１～８のいずれか一つに記載の方法。

１０． 前記富化集団の少なくとも１０％の細胞は、ＩｇＧ＋Ｂ細胞であり、及び／又は前記富化集団の２０％超の細胞は、Ｂ２２０発現に関して陽性である、実施形態１～９のいずれか一つに記載の方法。

１１． 前記ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、ウサギＴ細胞上清を含む細胞培養培地中において、抗ヒトＩｇＧ抗体標識ビーズ及びフィーダー細胞と共にバルク培養することを含む実施形態１～１０のいずれか一つに記載の方法。

１２． 前記フィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現し、及び／又はガンマ線照射されている、実施形態１１に記載の方法。

１３． 前記フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたＣＤ４０Ｌ陽性ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞である、実施形態１２に記載の方法。

１４． 前記骨髄腫細胞は、対数増殖期段階である、実施形態１～１３のいずれか一つに記載の方法。

１５． 前記骨髄腫細胞は、Ｐ３骨髄腫細胞である、実施形態１～１４のいずれか一つに記載の方法。

１６． 前記富化集団を、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞～約７００個のＢ２２０陽性Ｂ細胞、任意選択的に、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞の密度でバルク培養する、実施形態１～１５のいずれか一つに記載の方法。

１７． 前記富化集団を、約５０ｍＬ以上の量でバルク培養する、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の方法。

１８． 前記富化集団を、少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約６日、任意選択的に約６日にわたりバルク培養する、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。

１９． 前記富化集団の細胞を少なくとも約７回細胞分裂させて、前記増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団を得る、実施形態１～１８のいずれか一つに記載の方法。

２０． 前記増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団の細胞を、電気細胞融合（ＥＣＦ）により骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを得る、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

２１． 前記ハイブリドーマ及びあらゆる非融合細胞を選択培地に移すことをさらに含み、任意選択的に、前記選択培地は、ＨＡを含む、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。

２２． 凍結条件下でハイブリドーマを保存することを含む実施形態１～２１のいずれか一つに記載の方法。

２３． ハイブリドーマをマルチプレートウェル中で培養すること、及びそれぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることをさらに含む実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。

２４． 抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマに関してスクリーニングする方法であって、
ａ．実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法に従ってハイブリドーマを生成すること；
ｂ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養すること；
及び
ｃ．それぞれのウェルの上清を抗原特異的に抗体に関してスクリーニングすること
を含む方法。

２５． 抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマに関してスクリーニングする方法であって、
ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであり、前記富化集団の細胞の約５％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、調製すること；
ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団を得ること；
ｃ．前記増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること；
ｄ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養すること；
及び
ｅ．抗原特異的抗体に関してそれぞれのウェルの上清をスクリーニングすること
を含む方法。

２６． 抗原特異的抗体を製造する方法であって、
ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製することであり、前記富化集団の細胞の約５％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、調製すること；
ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団を得ること；
ｃ．前記増大ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ること；
ｄ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養すること；
ｅ．それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングして、抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマを同定すること；
及び
ｆ．（ｅ）で同定されたハイブリドーマの培養物を増大させて、抗原特異的抗体を製造すること
を含む方法。

２７． 前記富化集団の細胞の約３％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、実施形態１～２６のいずれか一つに記載の方法。

２８． 前記富化集団の細胞の約２％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、実施形態２７に記載の方法。

２９． 前記富化集団の細胞の約１％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、実施形態２８に記載の方法。

下記の実施例は、本発明を単に例証するために示されており、決して本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１
この実施例は、本開示のハイブリドーマを生成する例示的な方法を説明する。

免疫化
７匹のトランスジェニックＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）Ｇ２－ＫＬ（ＸＭＧ２－ＫＬ）動物（カッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかを有するヒト抗体を産生可能である）のコホートを、ＣＨＯ細胞上で安定して発現される天然抗原Ｚで免疫化した。動物を、最初に、左大腿に皮下投与した（ＳＱ／ＬＴ）４×１０^６個の細胞及びアジュバントＡｌｕｍ／ＣｐＧ ＯＤＮで免疫化し、次いで、８週間にわたり、２×１０^６個の細胞で週２回ブーストした。最後のブーストを、動物の回収並びに脾臓及び流入領域リンパ節の摘出の４日前に行なった。

単離＆富化
メモリーＢ細胞を単離するために、７匹の免疫化動物の脾臓及びリンパ節（ＬＮ）を摘出し、下記の臓器タイプ毎に処理して単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）にした：全動物の脾臓由来の１つのＳＣＳ、及び全動物のＬＮ由来の１つのＳＣＳ。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、脾臓由来のＳＣＳから赤血球（ＲＢＣ）を除去した。その後、全てのＳＣＳを１つのプールされたＳＣＳへとまとめてさらに処理した。Ｂ細胞を、４工程富化手順を使用して富化し、最初の２つの工程で、数ある細胞の中でもＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）細胞を除去し、最後の２つの工程で、表面ＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）Ｂ細胞から正の選択を行なった。

最初の工程では、細胞を、４℃で２０分にわたり、ビオチン化抗体カクテルと共にインキュベートした。抗体カクテルは、非Ｂ細胞（例えば、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、及びＲＢＣ）並びにヒトＩｇＭ陽性Ｂ細胞上の細胞表面マーカーに特異的に結合するビオチン化抗体を含んでいた。この抗体カクテルには、ＮＫ１．１に特異的な抗体（ＮＫ細胞により発現される）、ＩｇＭに特異的な抗体（ＩｇＭ陽性Ｂ細胞により発現される）、ＣＤ９０．２に特異的な抗体（Ｔ細胞により発現される）、Ｌｙ－６Ｇ ＧＲ．１に特異的な抗体（顆粒球及び／又はマクロファージにより発現される）、ＣＤ３εに特異的な抗体（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ４に特異的な抗体（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ８ａに特異的な抗体（Ｔ細胞により発現される）、ＣＤ１１ｂに特異的な抗体（顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、及び／又はＮＫ細胞により発現される）、並びにＴＥＲ１１９に特異的な抗体（赤血球細胞により発現される）が含まれていた。このカクテルとのインキュベーション後、細胞を洗浄して非結合抗体を除去した。第２の工程では、この洗浄細胞を、４℃で１０分にわたり、ストレプトアビジン磁気ビーズ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ））と共にインキュベートして、このストレプトアビジン磁気ビーズを、非Ｂ細胞及びＩｇＭ陽性Ｂ細胞に結合したビオチン化抗体と結合させた。磁石を使用して、磁気ジーズで標識された非Ｂ細胞及びＩｇＭ陽性Ｂ細胞を単離して除去した。磁気ビーズに結合していない細胞の残存する画分には、メモリーＢ細胞集団が含まれており、第３の工程では、この画分を、４℃で４０分にわたり、抗ヒトＩｇＧ抗体マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートした。最後に、第４の工程では、マイクロビーズに結合した細胞を、磁気カラムにアプライした。表面ＩｇＧ陽性細胞は、カラム中に保持されるが、表面ＩｇＧ陰性細胞は、カラムを通過し、さらなる処理のために集めた。メモリー細胞を表すこの表面ＩｇＧ陽性細胞を、カラムから排出させるか又は溶出させ、次いで、Ｂ２２０、ＩｇＧ、及びＩｇＭの表面発現に関してＦＡＣＳで分析した。メモリー細胞は、表面上で高レベルのＢ２２０及びＩｇＧを発現する。

ＦＡＣＳ分析からの例示的なＦＡＣＳプロットを、図３Ａに示す。表１は、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を富化させるための富化手順の前、最中、及び後でのＦＡＣＳ分析の概要を示す。表１に示されるように、Ｂ２２０陽性細胞の割合は、４工程富化手順後に、２７．２％から５５．９％へと大幅に増加した。Ｂ２２０は、Ｂ細胞の細胞表面マーカーである（例えば、Ｋｈｏｄａｄａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：Ａｒｔｉｃｌｅ ７２１（２０１９）；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１９．００７２１を参照されたい）。富化後、表１に示すように、Ｂ２２０陽性細胞のわずか８．８％がＩｇＭ陽性であったのに対して、Ｂ２２０陽性細胞の３３．４％がＩｇＧ陽性であった。表１に示すように、全生細胞のＩｇＧ＋細胞の割合は、１％未満から１５％超へと増加した。同様に、ＩｇＧ＋Ｂ細胞の相当な割合（２８．１％）を、このプロセスで回収した（表１）。ＩｇＭ＋細胞に対するＩｇＧ＋細胞の比は、約０．００６から約３．８へと増加した（表１）。この富化プロセスによりＩｇＭ＋Ｂ細胞の９９．９６％が除去されたことから、この富化プロセスにより、この比は６００倍超増加した。

ＣＤ１３８／ＴＡＣＩ二重陽性形質細胞を含む表面ＩｇＧ陰性細胞を含むフロースルー画分を、分離手順で富化して、直接的Ｂ細胞発見プラットフォームにより、ＩｇＧ分泌するが表面ＩｇＧ陽性ではない形質細胞を救出した。ＦＡＣＳを実行してＢ細胞マーカーの発現を分析し、ＩｇＭ陰性形質細胞の富化を評価した。この細胞のＦＡＣＳ分析からの例示的なＦＡＣＳプロットを、図３Ｂに示す。この富化画分は、高親和性ＩｇＧ分泌形質細胞集団を含み、抗原結合分泌アッセイ用の直接的Ｂ細胞発見技術に適用する。

バルク培養
４工程富化プロセスにより得られたＩｇＧ＋メモリーＢ細胞を含む富化集団を、ＦＢＳ、ガンマ線照射されたＣＤ４０Ｌ発現ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞株、ウサギＴ細胞上清、及びヒトＩｇＧ架橋連結マイクロビーズが補充されたＥＰＭＩ培地中において、６２５個のＢ２２０陽性Ｂ細胞／ｍｌにて、Ｔ１７５フラスコ中でバルク培養した。バルク培養物の量は、概して約２００ｍＬである。培養物を、３７℃及び５％ＣＯ_２で６日にわたりインキュベートした。バルク培養後、細胞を回収して計数した。バルク培養後の数を、インプットＢ細胞の数（バルク培養物を播種するために使用されるＢ細胞の数）と比較して、バルク培養中に起こった細胞分裂の数を算出した。この計数に基づいて、Ｂ細胞はバルク培養物中で９．８回細胞分裂して増大集団が得られたと決定した。

細胞融合
融合パートナーであるＰ３骨髄腫細胞を増大させ、対数増殖期段階で回収した。この増大集団を、約１：２．６のＢ細胞対Ｐ３骨髄腫細胞比にて、Ｐ３骨髄腫細胞と組み合わせた。この細胞混合物を、低浸透圧Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ（ＥＣＦ）緩衝液で２回洗浄し、２×１０^６個の細胞／ｍｌの密度まで再懸濁させた。電気細胞融合を、高スループット融合のために融合チャンバーを使用して実施した。この実験では、１５０×１０^６個のＢ細胞を、１８回の融合事象で３９１×１０^６個のＰ３骨髄腫と融合させた。各融合は、４０秒間の６０ｖプレアラインメント及びその後のそれぞれ８００Ｖの３×３０μ秒パルスからなる。

融合後培養及びＮ２保存
細胞融合後、細胞を、ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地 ２７０ｍｌ中に直ちに沈め、１回洗浄し、ヒポキサンチンアザセリン（ＨＡ）を含むＤＭＥＭ中のＴ１７５バルク培養物 ３×２００ｍｌに入れて、非融合骨髄腫細胞を除去した。３日間の融合後培養の後、ハイブリドーマプールを回収し、洗浄し、９０％ウシ新生仔血清（ＮＣＳ）＆１０％ＤＭＳＯで１２アリコートに分割して冷凍保存した。－８０℃での２４時間後、バイアルを液体窒素中に移して長期保存した。１つのバイアルを解凍し、低密度９６ウェルプレートに蒔いて、ＤＭＥＭ選択培地中でのクローン増殖を評価した。ここから、融合効率及びプールの複雑度を算出した。ここで、融合後に、総複雑度は、２０５，８８２の固有ハイブリッドであり、融合効率を、０．１４０％であると算出した。

ハイブリッドプールでの融合効率の評価＆複雑度の算出
ハイブリッドプール中の固有クローンの最大数（「複雑度」という造語）は、富化バルク培養されたメモリーＢ細胞集団のどれくらいの割合がハイブリッドプール中で不死化されるかを推定する算出値である。複雑度と、富化工程におけるメモリーＢ細胞のＦＳＣＳ情報による回収とを組み合わせることにより、ＥＮＧ事象で捕捉されるインビボ免疫レパトアの近似が可能となる。この実践例では、インビボレパトアからの総ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の２８％が富化後に回収されており、これらを、Ｂ細胞培養物及びＥＨＣに入れた。この融合により、この画分の６０％が捕捉された。全体として、このプロセスでは、７匹の動物のプールされたＢ細胞からのＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの１７％（２８％＊６０％）が捕捉された（不死化された）。

複雑度の算出も、ハイブリッドプールの調査の深さの指針になる。ハイブリッドプールを蒔く場合には、算出された複雑度を超えることは一般に避けられており、なぜならば、これは、クローンコピーの反復調査の可能性を高めるが、新規の固有クローンを同定する可能性がますます低くなるからである。

複雑度の算出は、下記の３つの測定値及び４つの仮定に基づく：測定値／変数は、（１）培養物へのＢ細胞のインプット数の増加；（２）６日目の計数に基づく融合前培養での分裂；及び（３）得られたハイブリッドプールからの既知量の低密度プレーティングで生存可能なクローンの数であった。仮定は、（１）バルク培養に供されるそれぞれの富化Ｂ細胞は、固有クローンである；（２）バルク培養に供されるそれぞれの富化Ｂ細胞は、６日間の培養で生存する；（３）バルク培養に供される富化Ｂ細胞は全て、同一速度で分裂する；及び（４）融合細胞の５０％は、ハイブリドーマプールの凍結－解凍中に失われる。

これらの仮定から逸脱すると、ハイブリッドプールの複雑度は低下するが、凍結解凍は例外であり、複雑度が低下し得るか、又は増加し得る。

ハイブリッドプールの複雑度は、Ｂ細胞培養物中へのＢ細胞のインプット数を超え得ない。

ハイブリッドプールの複雑度＝（培養後凍結前の融合後に生存可能なクローン）／（融合後培養での２＾分裂）

融合及び培養後、凍結前の生存可能なクローン＝（低密度播種での生存可能なクローンの数／凍結中の５０％喪失）／増殖に関して評価した総ハイブリッドプールの割合

融合後の培養での分裂＝最初の２４時間での１回の分裂、その後の１６時間毎の１回の分裂＝１＋（融合後培養での日数－１）＊（２４／１６）

Ｂ細胞培養での分裂＝ＬＯＧ（６日目の生細胞／０日目のインプットＢ細胞）／ＬＯＧ（２）

Ｂ細胞培養後のクローンコピー＝培養での２＾分裂

融合後のクローンコピー＝培養６日目でのクローン性Ｂ細胞コピー＊融合効率％

融合効率％＝複雑度／融合６日目のＢ細胞

融合後のクローンコピー数が１超（全てのクローンが複数回表される）の場合には、融合後培養の後に凍結されたクローンコピーの式を、同胞を考慮して調整する。

実施例２
この実施例は、本開示の方法を使用してハイブリドーマを生成する別の例を説明する。

６匹のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）動物（カッパ軽鎖を有するヒト抗体を産生可能な４匹のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）Ｇ２－Ｋ（ＸＭＧ２－Ｋ）動物；及びカッパ軽鎖又はラムダ軽鎖のいずれかを有するヒト抗体を産生可能な２匹のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）Ｇ４－ＫＬ（ＸＭＧ４－ＫＬ）動物）を、実施例１の抗原Ｚとは異なる抗原である抗原Ｘで免疫化した。動物を、最初に、腹腔内投与した（ＩＰ）ＣＨＯ－Ｓ細胞で発現された抗原Ｘで免疫化し、次いで、６週間にわたり週２回ブーストした。マウスを、２．５ヶ月にわたり休眠させた。最後のブーストを行ない、４日後に、免疫化マウスから脾臓及び流入領域リンパ節（ＬＮ）を摘出した。実施例１と同様に、摘出した脾臓を、まとめてプールしてＳＣＳへと処理し、摘出した流入領域ＬＮを、まとめてプールしてＳＣＳへと処理した。本質的には実施例１で説明されているように、脾臓由来の１つのＳＣＳからＲＢＣを除去し、次いでＬＮ由来のＳＣＳを組み合わせて、さらに処理するためにプールされたＳＣＳを得た。

実施例１では、４工程Ｂ細胞富化プロセスが説明されており、その後にバルク培養した。Ｂ細胞富化プロセスの第１及び第２の工程は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）細胞の枯渇を目的としており、最後の２つの工程は、（抗ヒトＩｇＧ抗体標識磁気ビーズを移用する表面ＩｇＧ＋細胞の正の選択による）表面ＩｇＧ＋細胞の富化を目的としていた。ハイブリドーマ生成でのＢ細胞富化プロセス及びバルク培養の工程の重要性を評価するために、プールされたＳＣＳを５つの群（群１～５）に分割し、各群に独自のプロコトルを適用し、ＩｇＧ＋富化を含むか又は除外することにより、及びバルク培養を含むか又は除外することにより変化させた。５つの群のそれぞれの処置の概要を、表２に示す。

表２に示すように、群１及び２ではバルク培養を全く行なわなかった。群１では、さらに、富化プロセスのいかなる工程も行なわず、「カットなし」と見なし、群２では、実施例１で説明されている４工程富化プロセスの最初の２つの工程のみを行なった。群３～５を、６日にわたりバルク培養したが、群５のみは、ＩｇＭ＋細胞枯渇（実施例１で説明されている富化プロセスの最初の２つの工程により達成される）と、表面ＩｇＧ＋細胞富化（実施例１で説明されている富化プロセスの最後の２つの工程により達成される）との両方を含み、群３では、ＩｇＭ＋細胞枯渇と表面ＩｇＧ＋細胞富化との両方が除外され、群４では、表面ＩｇＧ＋細胞富化が除外された。群２、４、及び５のＩｇＭ＋細胞枯渇を、本質的には実施例１で説明されているように実行した。群５の表面ＩｇＧ＋細胞富化を、本質的には実施例１で説明されているように実行した。群１～５（バルク培養前）のそれぞれの特徴の概要を、表３に示す。

表３に示すように、群２、４、及び５（４工程富化プロセスの少なくとも一部を行なった）の場合には、富化集団の約１０％以下がＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞である。同様に、群５（富化プロセスの全工程を行なった）の場合には、富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対するＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、４を超えており、このことは、ＩｇＧ＋細胞の数がＩｇＭ＋細胞を上回っていたことを意味する。

群３～５の細胞を、本質的には実施例１で説明しているようにバルク培養して、増大集団を得た。群１～５の細胞を細胞融合に使用し、このことを、実施例１で説明されているように実行した。融合後、細胞を、ＨＡを含むＤＭＥＭ中で３日にわたり培養した。融合後、生細胞を計数し、ＦＭＡＴ蛍光分析微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ（商標）８１００ ＨＴＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、抗原Ｘ特異的抗体の分泌に関してスクリーニングした。

計数及びキャラクタリゼーションの結果を、表４に示す。

表４に示すように、群１及び２（バルク培養しなかった）では、生成されたハイブリドーマクローンの数が最低となり、且つ抗原＋レパトアの捕捉％が最低となり、これらの結果から、バルク培養の重要性が裏付けられる。群３～５（バルク培養した）の中では、群４及び５（バルク培養前にＩｇＭを枯渇させた）でヒット頻度％が最高であった。ＩｇＭ枯渇と表面ＩｇＧ富化との両方を実行した場合には、ヒット頻度％は、ほぼ２倍となった（群４と群５との比較）。まとめると、これらの結果から、細胞融合前にＢ細胞富化集団をバルク培養することに利点が実証される。群５により捕捉された抗原＋レパトアの相対％を、３１％と算出した（表４）。いくつかのＢ細胞が精製中に失われることが避けられないこと、及び胚中心のＢ細胞が姉妹及び重複特異性を含むことを考えると、群５による３１％のレパトアの捕捉は優秀であり、完全なコンパートメントを表す可能性が高い。加えて、（１４．９％のヒット頻度で）全レパトアを調べるのに１０９枚の９６ウェルプレートしか必要とせず、全レパトアの調査は実行可能であるが、このことは、群３の方法には当てはまらない。

実施例３
この実施例は、本開示の方法を使用してハイブリドーマを生成する第３の例を説明する。

本開示のハイブリドーマを生成する方法を使用して、高親和性抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを生成する。この実施例では、抗原は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であった。ＧＰＣＲは、抗体による標的化が困難であることで悪名高い治療上関連する標的クラスを構成する（Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ ＣＪ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０２０，ｖｏｌ ２０，Ｎｏ．８，９２５－９３５）。このＧＰＣＲに対する抗体はこれまでも作られてきたが、ヒト及びカニクイザルの両方のオルソログと交差反応し得るものはなく、ましてや、それぞれのオルソログに対して少なくとも１ｎＭの親和性を有するものはない。そのため、ヒト／カニクイザルのオルソログのそれぞれに対して少なくとも１ｎＭの抗原親和性を示すヒト／カニクイザル交差反応性ＧＰＣＲ特異的抗体を分泌するハイブリドーマを生成することが目標であった。

３００匹超のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ動物（例えば、カッパ軽鎖を有するヒト抗体を産生可能なＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）Ｇ２－Ｋ（ＸＭＧ２－Ｋ）動物）を、（遺伝子銃による）ＧＰＣＲ ＤＮＡ免疫化、ＧＰＣＲの細胞外領域にまたがるペプチド、ＧＰＣＲトランスフェクト細胞、及びヒトＩｇＧ－Ｆｃ部分に融合したＧＰＣＲの細胞外ドメインを含む免疫化キャンペーン後に、ＧＰＣＲ抗原で免疫化した。免疫化後、免疫化動物のそれぞれから血清を採取し、標準的な方法（例えば、２９３Ｔ細胞上で一過性に発現したＧＰＣＲに対するＦＡＣＳ分析によるポリクローナル抗体結合の評価）を使用して、ＧＰＣＲ特異的抗体価を評価した。抗体価分析の結果から、モックトランスフェクト細胞上のＧｅｏＭｅａｎシグナルと比較して少なくとも３倍高いＧＰＣＲトランスフェクト細胞上の結合ＧｅｏＭｅａｎシグナルにより決定されるように、４８匹の動物（免疫化された総数の１５％）が、十分なレベルの抗原特異的抗体価を示すことが明らかとなった。

この実施例では、これらの４８匹に動物の内の１匹の二次リンパ器官から生成されたハイブリドーマが説明されている。簡潔に説明すると、最後の免疫化ブーストの４日後、動物の脾臓及び流入領域ＬＮを摘出した。この脾臓からＳＣＳを調製し、このＬＮから別のＳＣＳを調製した。実施例１で説明したように、脾臓から調製したＳＣＳからＲＢＣを枯渇させ、次いで、ＲＢＣ枯渇ＳＣＳを、ＬＮから調製したＳＣＳと組み合わせた。この組み合わされたＳＣＳを、実施例１で説明されている４工程Ｂ細胞富化プロセスの最初の２つの工程のみに供した。ＩｇＭ＋細胞／非Ｂ細胞枯渇により、生細胞数が９９．５％減少し、且つＩｇＭ＋Ｂ細胞が９９．８％減少した。ＩｇＭに対するＩｇＧの比は、７０倍増加した。ＩｇＭ＋細胞／非Ｂ細胞枯渇後に、富化集団のＢ２２０＋細胞の％は、４６．２％まで増加した。同様に、ＩｇＭ＋細胞／非Ｂ細胞枯渇後に、Ｂ２２０＋細胞のＩｇＧ＋細胞の％は、７．５％まで増加した。ＩｇＭ及び非Ｂ細胞枯渇後、ＩｇＧ＋細胞の少なくとも１０％が回収された。

約４０，０００個のＢ細胞を、実施例１で説明したようにバルク培養し、このバルク培養プロセスにより、約１１回細胞分裂した。バルク培養後、細胞を、実施例１と同様の細胞融合に供した。Ｂ細胞のバルク培養及び融合の後、培養されたＢ細胞の推定４０％が不死化されており、１６，０００の固有のハイブリッドの複雑度を有するハイブリッドプールが生成された。融合後、細胞を、ＨＡを含むＤＭＥＭ中で培養して、非融合骨髄腫細胞を除去した。その後、ハイブリドーマ細胞を、目的のＧＰＣＲの特定領域を再現する可溶性抗原により３８４ウェルプレート中に単一細胞選別したか、又は１つのウェル当たり５個のハイブリドーマクローンで９６ウェルプレートにポリクローナルで蒔いた。ハイブリドーマ細胞を、ＦＡＣＳベースのスクリーニングで検出するのに十分な抗体を産生するように培養した。スクリーニングを、ＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に対する培養上清中での抗体結合を決定するか、又はＧＰＣＲを内因的に発現する癌細胞株への結合により、ＦＡＣＳ分析により実行した。これは、実施例１で使用されたものと同一の手順である（但し、この実施例では、ＧＰＣＲ抗原を発現する２９３Ｔ細胞を使用した）。ヒト及びカニクイザルのオルソログへの結合のキャラクタリゼーションも実行した。最終的に選択された分子の親和性を、オンセルＫｉｎＥｘａにより決定した。

数ヶ月から数年かけて、抗体価分析に基づいて選択された残りの動物（残り４７匹の動物）の二次リンパ器官を使用するハイブリドーマを、上記で説明したのと同様の方法で生成した。ＧＰＣＲ特異的抗体を産生する４０００個超のハイブリドーマクローンを、免疫化した４８匹全体で同定した。しかしながら、１つのみが、ヒト及びカニクイザル両方のＧＰＣＲオルソログに対して１ｎＭ超の親和性を示した。まとめると、これらの結果から、本開示のＥＨＧ法の優れたディープレパトアマイニング力が実証される。標的クラスとしてのＧＰＣＲに関する最大の課題と、ヒト及びカニクイザル両方のオルソログに関する１ｎＭ未満の非常に困難な親和性設計目標とを考えると、この抗体は非常に稀であろうことが予想された。この方法により、４８匹の抗原反応動物の免疫レパトアの調査、４０００種超のバインダーの回収、及び設計目標を満たす単一クローンの同定が可能となった。

本明細書で引用される全ての参考文献（例えば、刊行物、特許出願、及び特許）は、それぞれの参考文献が、あたかも個々に及び具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されており、且つ本明細書においてその全体が記載されているかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の説明に関する（とりわけ下記の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」、及び「１つの（ａｎ）」、及び「その」という用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」、及び「含有する」という用語は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されなければならない。

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、単にその範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

本明細書で説明されている方法の全ては、本明細書で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は代表的な言語（例えば、「等」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を、本開示を実施するのに必要不可欠なものとして示すものと解釈されるべきではない。

本明細書では、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば、本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の説明を読むことで当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、本発明者らは、本明細書中で具体的に説明されている形態以外で本開示が実施されることを意図する。従って、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。

Claims (50)

1. ハイブリドーマを生成する方法であって、
   ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を調製するステップと、ここで、
   ｉ．前記富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、
   及び／又は
   ｉｉ．前記富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対する前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、０．５超であり、任意選択的に１超若しくは２超である、
   ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大集団を得るステップと、
   ｃ．前記増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得るステップと
   を含む方法。
2. （ａ）１匹若しくは複数匹の非ヒト動物を免疫原で免疫化するステップ、
   （ｂ）前記免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を、任意選択的に免疫化後約３～約５日で、摘出するステップ、
   （ｃ）各免疫化非ヒト動物から摘出した前記二次リンパ器官から、単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）を調製するステップ、及び／又は
   （ｄ）複数匹の免疫化非ヒト動物の前記二次リンパ器官からの前記ＳＣＳを組み合わせることにより、プールされたＳＣＳを調製するステップ
   をさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩｇＧ＋Ｂ細胞の富化集団が、前記二次リンパ器官から得られた細胞の単一細胞懸濁液から調製される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記二次リンパ器官は、免疫化後約３～約５日で前記免疫化非ヒト動物から摘出された二次リンパ器官である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記二次リンパ器官は、少なくとも１、２、３、４、又は５匹の免疫化非ヒト動物から摘出された二次リンパ器官である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記二次リンパ器官は、脾臓及び／又はリンパ節である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記二次リンパ器官は、選択された免疫化非ヒト動物のみから摘出された二次リンパ器官であり、任意選択的に、前記選択された免疫化非ヒト動物は、免疫化後の血清抗体価レベルに基づいて選択された、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記非ヒト動物は、マウス又はラットである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記富化集団が、ＩｇＭ＋細胞を除去し、及び／又はＩｇＧ＋細胞を選択することにより調製される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記富化集団が、ＩｇＭ＋細胞の負の選択、及び／又はＩｇＧ＋細胞の正の選択により調製される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記負の選択及び／又は前記正の選択時に、９０％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去されており、任意選択的に、前記負の選択及び／又は前記正の選択時に、９５％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去されている、請求項１０に記載の方法。
12. 前記負の選択時に、９８％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去されており、任意選択的に、前記負の選択及び前記正の選択時に、９９％超のＩｇＭ＋Ｂ細胞が除去されている、請求項１１に記載の方法。
13. 前記富化集団が、前記二次リンパ器官から調製された単一細胞懸濁液から、前記非Ｂ細胞、ＲＢＣ、ＩｇＭ＋細胞、又はこれらの組み合わせを除去することにより、任意選択的に、非Ｂ細胞、赤血球（ＲＢＣ）、又はＩｇＭ＋細胞により発現される１種又は複数種の細胞表面マーカーに特異的な抗体を使用して、前記非Ｂ細胞、ＲＢＣ、ＩｇＭ＋細胞、又はこれらの組み合わせを除去することにより、調整される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細胞表面マーカーは、ヒトＩｇＭ、ＣＤ９０．２、Ｌｙ－６Ｇ ＧＲ．１、ＮＫ－１．１、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、及び／又はＴＥＲ１１９である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記抗体は、ビオチンに連結されており、前記方法は、ストレプトアビジン標識ビーズ、任意選択的にストレプトアビジン標識磁気ビーズを使用して、前記非Ｂ細胞、ＲＢＣ、及び／又はＩｇＭ＋細胞を除去するステップを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 前記単一細胞懸濁液中に存在する前記ＩｇＭ＋細胞の９８％超は、除去されている、請求項１５に記載の方法。
17. 前記富化集団を、任意選択的に、抗ＩｇＧ抗体標識ビーズ、任意選択的に抗ヒトＩｇＧ抗体標識磁気ビーズを使用して、表面ＩｇＧ＋細胞を選択することにより調製する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記単一細胞懸濁液中に存在する前記ＩｇＭ＋細胞の９９％超は、除去されており、及び／又はＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対する前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、少なくとも約５０倍若しくは少なくとも約１００倍増加している、請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＩｇＧ＋細胞の富化集団を、ウサギＴ細胞上清を含む細胞培養培地中において、抗ヒトＩｇＧ抗体標識ビーズ及びフィーダー細胞と共にバルク培養することを含む請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記フィーダー細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現し、及び／又はガンマ線照射されている、請求項１９に記載の方法。
21. 前記フィーダー細胞は、ガンマ線照射されたＣＤ４０Ｌ陽性ＥＬ４Ｂ５フィーダー細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記骨髄腫細胞は、対数増殖期段階である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記骨髄腫細胞は、Ｐ３骨髄腫細胞である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記富化集団をバルク培養するステップが、１ｍＬ当たり約３５０個のＢ２２０陽性Ｂ細胞～約７００個のＢ２２０陽性Ｂ細胞、任意選択的に、１ｍＬ当たり約６００個のＢ２２０陽性細胞～１ｍＬ当たり約６５０個のＢ２２０陽性細胞の播種密度で開始される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記富化集団が、少なくとも約２５ｍＬ及び約２Ｌ以下の量でバルク培養される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記富化集団が、約５０ｍＬ～約５００ｍＬ、任意選択的に約１００ｍＬ～約３００ｍＬの量でバルク培養される、請求項２５に記載の方法。
27. 少なくとも約４日、少なくとも約５日、又は少なくとも約６日にわたり前記富化集団をバルク培養するステップを含む請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 少なくとも約５日にわたり前記富化集団をバルク培養するステップを含む請求項２７に記載の方法。
29. 約６日にわたり前記富化集団をバルク培養するステップを含む請求項２８に記載の方法。
30. 前記富化集団の前記細胞を少なくとも約６回又は少なくとも約７回細胞分裂して、前記増大集団を生じる、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記増大集団の全てのＢ細胞が、骨髄腫細胞との融合に使用され、及び／又は前記増大集団の全ての細胞が、骨髄腫細胞と組み合わせられる、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. Ｂ細胞は、抗原に結合する抗体の産生に基づいて骨髄腫細胞との融合のために選択されず、及び／又は前記富化集団若しくは前記増大集団のＢ細胞は、抗原に結合する抗体の産生に関してスクリーニングされない、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記増大集団の前記細胞は、電気細胞融合（ＥＣＦ）により骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマを得、任意選択的に、前記増大集団の細胞は、１回の融合事象当たり１０ｍＬ超の量で骨髄腫細胞と融合される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記ハイブリドーマ及びあらゆる非融合細胞を選択培地に移すステップをさらに含み、任意選択的に、前記選択培地は、ヒポキサンチンアザセリン（ＨＡ）を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 凍結条件下でハイブリドーマを保存するステップをさらに含む請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 抗原に結合する抗体の産生に関してハイブリドーマをスクリーニングするステップをさらに含む請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. ハイブリドーマをマルチプレートウェル中で培養するステップと、それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングするステップをさらに含む請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記スクリーニングするステップは、前記抗原に対する抗体の結合を検出するイムノアッセイを含む、請求項３６又は３７に記載の方法。
39. 前記イムノアッセイは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析である、請求項３８に記載の方法。
40. 抗原特異的抗体を産生する細胞に関してスクリーニングするステップが、ハイブリドーマが得られた後にのみ行われ、ハイブリドーマが得られる前には行われない、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 抗原特異的抗体に関してスクリーニングするステップが、二次リンパ器官を摘出する前及びハイブリドーマが得られた後にのみ行なわれる、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 二次リンパ器官を摘出する前に行なう抗原特異的抗体に関してスクリーニングするステップは、生存している免疫化動物から得られる血清の力価分析を含む、請求項４１に記載の方法。
43. 抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを生成する方法であって、
    ａ．１匹又は複数匹の非ヒト動物を免疫原で免疫化するステップと、
    ｂ．前記免疫化非ヒト動物から二次リンパ器官を摘出するステップと、
    ｃ．それぞれの免疫化非ヒト動物から摘出した前記二次リンパ器官から単一細胞懸濁液（ＳＣＳ）を調製するステップと、
    ｄ．（ｃ）で調製された全ＳＣＳを組み合わせることにより、プールされたＳＣＳを調節するステップと、
    ｅ．前記プールされたＳＣＳから９５％超のＩｇＭ＋細胞を除去して、及び／又は前記プールされたＳＣＳから表面ＩｇＧ＋細胞を正に選択して、ＩｇＧ陽性（ＩｇＧ＋）メモリーＢ細胞の富化集団を得るステップと、ここで、
    ｉ．前記富化集団の約１０％以下は、ＩｇＭ陽性（ＩｇＭ＋）Ｂ細胞であり、
    及び／又は
    ｉｉ．前記富化集団のＩｇＭ＋Ｂ細胞数に対する前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞数の比は、０．５超であり、任意選択的に１超又は２超である、
    ｆ．前記富化集団をバルク培養して、増大集団を得るステップと、
    ｇ．前記増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得るステップと、
    ｈ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養し、それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングすることにより、抗原特異的抗体を産生するハイブリドーマを同定するステップと
    を含む方法。
44. 抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマに関してスクリーニングする方法であって、
    ａ．請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法に従ってハイブリドーマを生成するステップと、
    ｂ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養するステップと、
    ｃ．それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングするステップと
    を含む方法。
45. 抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマに関してスクリーニングする方法であって、
    ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製するステップと、ここで、前記富化集団の前記細胞の約５％未満は、ＩｇＭ＋Ｂ細胞である、
    ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大集団を得るステップと、
    ｃ．前記増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得るステップと、
    ｄ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養するステップと、
    ｅ．それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングするステップと
    を含む方法。
46. 抗原特異的抗体を製造する方法であって、
    ａ．１匹又は複数匹の免疫化非ヒト動物の二次リンパ器官から得られる細胞からＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の富化集団を調製するステップと、
    ｂ．前記富化集団をバルク培養して、増大集団を得るステップと、
    ｃ．前記増大集団の細胞と骨髄腫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得るステップと、
    ｄ．個々のウェル中で単一のハイブリドーマを培養するステップと、
    ｅ．それぞれのウェルの上清を抗原特異的抗体に関してスクリーニングして、抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマを同定するステップと、
    ｆ．（ｅ）で同定された前記ハイブリドーマの培養物を増大させて、抗原特異的抗体を製造するステップと
    を含む方法。
47. 得られる前記ハイブリドーマは、前記免疫化動物により産生される前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも１５％を占める、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 得られる前記ハイブリドーマは、前記免疫化動物により産生される前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも１０％を占めており、任意選択的に、前記免疫化動物により産生される前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも１５％を占める、請求項４４に記載の方法。
49. 得られる前記ハイブリドーマは、前記免疫化動物により産生される前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも２０％を占める、請求項４８に記載の方法。
50. 得られる前記ハイブリドーマは、前記免疫化動物により産生される前記ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞レパトアの少なくとも２５％を占める、請求項４９に記載の方法。

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