KR20230141851A - 농축 하이브리도마 생성 - Google Patents

농축 하이브리도마 생성 Download PDF

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카렌 리치몬드
아그니에츠카 키엘체프스카
올레 올센
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암젠 인크
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Abstract

하이브리도마를 생성하는 방법 및 항원-특이적 항체를 생산하는 관련 방법이 본원에 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은, (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, (i) 농축 집단의 약 10% 이하가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나, (ii) 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 약 0.5 초과, 선택적으로, 약 1 초과 또는 약 2 초과인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; 및 (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 10% 또는 적어도 15%를 나타낸다.

Description

농축 하이브리도마 생성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 제63/146,135호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
배경
치료용 항체는 대다수 종류의 약물을 구성하며, 이들 중 다수는 인간 항체 유전자좌 트랜스제닉 동물을 포함하는 생체내 면역화 플랫폼으로부터 유도되고 항원 자극에 반응하여 활성화된 특정 B 세포 클론의 포획에 의존한다(Lu et al., Journal of Biomedical Science (2020) volume 27, Article number: 1). 설치류의 면역화에 대한 생체내 면역 반응에서 생성된 항체는 주로 비장과 림프절의 배중심(GC) 내에 위치하지만 골수에서도 발견되고 점막-관련 림프 조직(MALT)에 있고 혈액에서 순환하는 면역 조직에서 B 세포 집단의 불멸화를 통해 포획될 수 있다. 하이브리도마 생성으로 알려진 불멸화 과정은 막-결합 클론 B 세포 수용체(BCR)를 발현할 뿐만 아니라 동일한 항체 클론형의 분비형태를 생성하는 하이브리드 세포를 생성한다. 하이브리드가 지속적으로 분열하고 항체를 분비하기 때문에, 클론의 손실 또는 테스트용 항체 물질의 부족에 대한 우려 없이 필요한 특이성의 클론이 동정되고 특성화될 수 있다. 확립된 하이브리드는 전형적으로 견고하며, 선택 압력 하에 유지될 때 항체를 계속 분비한다. 하이브리드는 동결-해동 주기에 잘 반응하며, 액체 질소에서의 수십 년 보관에서 잘 생존할 수 있다. 1975년 Koehler와 Milstein의 하이브리도마 세대의 출현과 함께, 골수종 세포와의 융합을 통한 B 세포의 불멸화는 설치류 종, 가장 흔히는 마우스로부터의 항체 발견을 위해 널리 사용되는 방법이 되었다(G. Koehler & C. Milstein. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature (1975) 256, 495-497).
불멸화를 위한 항원-특이적 B 세포의 생체 내 생성 및 불멸화 시기는 모두 하이브리드 생성의 중요한 측면이다. 전형적으로, 설치류에서 몇 주 또는 몇 달에 걸쳐 반복적인 면역화를 통해 반응이 나타난다. 반복된 항원 노출에 대한 반응으로, 항원을 인식하는 BCR을 발현하는 B 세포는 자극을 받아 이소형 스위칭을 거쳐 IgG를 발현하고 2차 림프 기관 내에서 GC를 형성한다(Akkaya et al., Nat Rev Immunol (2020) 20, 229-238). GC 내에서, 항원 결정자의 체세포 과돌연변이(SMH) 주기와 더 높은 친화도 변이체에 대한 선택을 통해 B 세포가 성숙하고, 기억 세포 또는 형질 세포로 분화한다(Lau et al., Current Opinion in Immunology (2019); 63:29-34). 기억 세포는 표면에 높은 수준의 B220/CD45R 및 IgG를 발현하지만, 항체를 분비하지는 않는다. 완전히 분화되면 기억 세포는 작고 정지 상태에 있지만, 그의 동족 항원이나 다클론 활성화에 의한 자극에 반응하여 증식할 가능성이 크다. 기억 세포 풀의 클론 다양성이 높다. 대조적으로, 형질 세포는 고도로 활성화된 크고 발파하는 B 세포로, 많은 양의 항체를 분비한다. 표면 IgG와 B220/CD45R은 모두 하향 조절된다. CD138 및 TACI는 형질 세포의 표면에서 고도로 발현된다(Tellier et al., Eur J Immunol 47(8): 1276-1279 (2017)). 형질 세포가 최종적으로 분화됨에 따라, 분열 능력이 상실된다. 형질 세포는 고도로 특화된 장기 생존 틈새에 격리되지 않는 한, 며칠에서 몇 주 정도의 짧은 수명을 가지고 있다. 형질 세포 구획의 다양성은 낮으며; 항원에 대해 효과적이고 신속한 면역 반응을 일으키기 위해 상대적으로 적은 수의 고친화도 클론에 초점을 맞춘 생체 내 선택 과정이다.
하이브리도마 생성은 면역 레퍼토리를 샘플링할 수 있지만, 그 과정은 0.01%~0.001% 범위의 성공적인 불멸화 비율로 매우 비효율적이다. 이러한 융합의 비효율성은 더 큰 면역화 코호트를 사용하거나 랫트와 같은 더 큰 동물과 함께 작업하여 융합을 위한 세포의 수를 증가시킴으로써 대응할 수 있다. 전술한 관점에서, 농축 하이브리도마 생성을 위한 방법이 필요하다.
본 개시내용은 IgM-양성(IgM+) B 세포의 제거, 대규모, 고효율 및 생성된 하이브리도마의 레퍼토리의 특이성으로 인해 당업계에 공지된 것보다 더 큰 이점을 제공하는 농축 하이브리도마 생성(EHG) 방법을 제공한다. 유리하게는, 본원에 개시된 EHG 방법은 IgM+ B 세포의 효율적인 비드-기반 제거와 함께 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포에 대한 농축을 제공한다. IgM은 배양시에 IgG+ B 세포로 클래스-스위칭하고, 무관한 또는 저친화도 B 세포 클론을 갖는 IgG+ Ag+ 기억 B 세포 집단을 희석시킨다. IgM+ B 세포는 IgG+ B 세포 클론보다 빠르게 분열한다. 배양 전에 대부분의 IgM+ B 세포를 제거한 다음 IgG+ B 세포가 농축된 집단을 배양하여 (융합 전에 수백 개의 클론 복제본을 만들 수 있도록 함), 관심대상 클론의 상당 부분이 불멸화된다. 결과는 희귀한 Ag+ 클론의 동정을 용이하게 하는 대규모 하이브리도마 풀이다. 본원에 개시된 EHG 방법은 대규모 벌크 배양을 제공한다. 고도로 선별된 수십만 개의 IgG+ 기억 B 세포가 있는 리터의 벌크 배양으로 인해 더 많은 수의 동물에 대한 대규모 심층 레퍼토리 마이닝이 가능하다. 추가로, 선행 기술 방법에서, 매우 적은 수의 항원-결합 클론만이 동정되는 반면, 본 개시내용의 EHG는 일상적으로 수백 내지 수천개의 고유 결합제를 동정한다. 본 개시내용의 EHG 방법은 또한 항원 결합 클론의 동정 전에 B 세포 불멸화를 포함한다. 하이브리도마 상청액이 스크리닝된다. 이 순서는 선행 기술 방법 단계의 반대 순서를 나타내며(예를 들어, Steenbakkers et al., J Immunol Methods 152 (1): 69-77 (1992)), 여기서, B 세포가 불멸화되기 전에 항원-결합에 대해 스크리닝된다. 본 발명의 불멸화 순서에 이은 항원 결합 클론의 동정은 항원-결합 클론의 고효율 동정을 가능하게 한다. 본원에 개시된 방법에서, 융합 후 스크리닝 및 특성화를 위해 세포 상청액(SN)의 무제한 공급이 가능하다. SN 스크리닝 시 분석 감도는 제한되지 않는다. 하이브리드 배양은 고농도의 항체로 성장할 수 있다. 본원에 개시된 EHG 방법에서, 항원-결합 클론을 동정하는 능력은 B 세포 항체 분비율에 의해 제한되지 않으며, 희귀 결합제는 하이브리드 풀의 심층 마이닝에 의해 동정될 수 있다. 대규모 액체 취급 플레이팅 및 Ag+ FACS 선별에 의한 심층 마이닝도 수행될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 항체 발견에 유용한 농축 하이브리도마 생성 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 하이브리도마 생성 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단이 실질적으로 IgM+ B-세포가 없는, 단계; (b) 상기 농축 집단을 대규모로 벌크-배양하여, 확장된 집단을 얻는 단계; 및 (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, (i) 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나 (ii) 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율은 약 0.5 초과, 선택적으로, 약 1 초과 또는 약 2 초과이다. 특정 이론에 구애됨 없이, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 하이브리도마는 B 세포 항체 분비율 및/또는 적은 양의 희귀 B 세포에 의해 주어지는 제한 없이, 면역화된 비인간 동물의 면역 레퍼토리의 심층 마이닝을 가능하게 한다. 유리하게는, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 하이브리도마는 면역화된 비인간 동물의 면역 레퍼토리를 더 완전하게 나타낸다. 예시적인 양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 포획된 불멸화된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 백분율은 최대이며, 다양한 경우에, 면역화된 동물에 의해 생성된 레퍼토리의 적어도 약 15% (예를 들어, 적어도 약 20% 또는 적어도 약 25%)이다. 본원에 개시된 방법은 항원-특이적 항체에 대해 스크리닝될 수 있는 하이브리도마 상청액의 무제한 공급을 추가로 허용한다. 예시적인 양태에서, 본원에 개시된 방법은 일상적으로, 항원-특이적 항체를 생성하는 항원-특이적 하이브리도마를 수천 개까지는 아니더라도 수백 개 산출한다. 본원에 개시된 방법은 또한 하이브리도마 풀에서 B 세포 클론의 매우 효율적인 포획을 이끄는 더 높은 융합 효율을 초래한다.
따라서, 본 개시내용은 하이브리도마 생성 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 10% 미만, 선택적으로, 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; 및 (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 농축 집단의 세포의 2.5% 미만 또는 1% 미만이 IgM+ B 세포이다. 다양한 양태에서, 방법은 약 90% 초과(예를 들어, 95% 초과, 98% 초과, 99% 초과)의 IgM+ 세포를 제거하고/하거나 IgG+ 세포를 양성으로 선택하여 농축 집단을 얻는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, (i) 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나 (ii) 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율은 약 0.5 초과, 선택적으로, 약 1 초과 또는 약 2 초과이다. 예시적인 양태에서, 농축 집단의 IgM+ B 세포 수는 IgM+ B 세포 수보다 적으며, 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율은 1 초과 또는 2 초과이다. 다양한 양태에서, 방법은 mL 당 약 350개의 B220-양성 B 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 B 세포의 밀도로 농축 집단을 벌크-배양하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 농축 집단을 벌크-배양하는 것은 mL 당 약 350개의 B220-양성 B 세포 내지 약 700개의 B220-양성 B 세포, 선택적으로, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포의 시딩 밀도로 개시된다. 예시적인 예에서, 방법은 확장된 집단의 세포를 1:1 내지 1:4의 범위, 예를 들어, 1:1.0, 1:1.5, 1:2.0, 1:2.5, 1:3.0, 1:3.5, 또는 1:4.0 내의 골수종 세포에 대한 B 세포의 비율로 골수종 세포와 융합시키는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 확장된 집단의 모든 세포(및 따라서 확장된 집단의 모든 B-세포)는 골수종 세포와 결합된다. 예를 들어, 농축 집단 또는 확장된 집단의 B 세포는 항원에 결합하는 항체의 생산을 기반으로 골수종 세포와 융합하기 위해 선택되지 않는다. 또한, 예를 들어, 농축 집단 또는 확장된 집단의 B 세포는 골수종 세포와 융합하기 전에 항원-특이적 항체의 생산에 대해 분석되지 않는다. 다양한 예에서, 방법은 항체 생산을 위해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계 및, 선택적으로, 항원-특이적 항체 생산을 위해 면역화된 동물로부터 얻어진 혈청을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 예시적인 예에서, 면역화된 동물로부터 림프 기관을 채취한 후 발생하는 항원-특이적 항체 생산을 위한 유일한 스크리닝은 하이브리도마 스크리닝이다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용에 따라 하이브리도마를 생성하는 단계; 개별 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계; 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 항원-발현 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 다양한 양태에서, 하이브리도마의 약 1 내지 약 10 또는 약 1 내지 약 5개의 상이한 클론이 단일 웰에서 배양된다.
본 개시내용에 따라 하이브리도마를 생성하는 단계; 개별 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계; 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 동정하는 단계; 및 동정된 하이브리도마의 배양을 확장하여 항원-특이적 항체를 생성하는 단계를 포함하는, 항원-특이적 항체를 생성하는 방법이 추가로 제공된다.
도 1a는 본 개시내용의 예시적인 EHG 방법을 예시하고, 다음 텍스트는 EHG 방법을 상세히 설명한다.
도 1b는 RBC, 비-B 세포, 및 IgM+ 세포를 제거하고, 또한 표면 IgG+ 세포를 양성으로 선택하여 벌크 배양에서 사용될 수 있는 농축 집단을 얻는, 예시적인 농축 공정을 예시한다.
도 1c는 면역화된 동물의 비장으로부터 유래된 풀링된 단일 세포 현탁액으로부터 RBC를 제거한 다음, 면역화된 동물의 LN으로부터 유래된 SCS와 RBC-고갈된 SCS를 조합하는 예시적인 농축 공정을 예시한다. 비-B 세포 및 IgM+ 세포는 자석을 사용하여 상기 조합된 SCS에서 제거된다. 표면 IgG+ 세포는 IgG 마이크로비드를 사용하기 위해 양성으로 선택된다. 컬럼으로부터 표면 IgG+ 세포를 방출하면 농축 집단이 생성되며, 이는 이후에 벌크 배양에 사용될 수 있다.
도 2는 농축 하이브리도마 생성을 위한 예시적인 방법의 개략도이다.
도 3a는 B-세포 배양 및 융합 전에 IgG+ 기억 B 세포에 대한 농축을 평가하기 위한 B 세포 마커에 대한 일련의 FACS 분석 플롯이다.
도 3b는 농축 과정을 평가하기 위한 B 세포 표면 마커에 대한 일련의 FACS 분석 플롯이다. 이 농축 집단은 고친화도 IgG 분비 형질 세포 집단을 함유하며, 항원 결합 분비 분석을 위한 직접적인 B 세포 발견 기술에 적용된다.
본 개시내용은 트랜스제닉 동물에서 면역 레퍼토리 포획의 효율을 크게 향상시키는 농축 하이브리도마 생성(EHG) 방법을 제공한다. 이는 융합 전 4~6일 동안 벌크 배양에서 고도로 정제된 기억 B 세포를 확장함으로써 적어도 부분적으로 달성된다. 일부 구현예에서, 이는 융합 전 6일 동안 벌크 배양에서 고도로 정제된 기억 B 세포를 확장함으로써 적어도 부분적으로 달성된다. 융합전, 벌크 배양에서, 각 기억 B 세포 클론은 7~10회의 분할을 겪어(6일 동안 벌크 배양에서 B 세포를 확장할 때), 125~1000개의 클론 복제본을 생성하는 것으로 추정된다. 특정 이론에 구애됨 없이, 예를 들어, 6일 동안 B 세포 벌크 배양 후, 높은 B 세포 복제본 수, 활성화된 B 세포의 블라스팅(blasting) 표현형, 융합 동안 B 세포의 크기(융합 파트너의 크기에 근접하여, 융합을 용이하게 함), 및 B 세포 막이 더 유동적이어서 예를 들어, 6일 동안의 B 세포 배양 후 융합에 대해 더 수정할 수 있다는 사실은 모두 융합 이벤트의 비효율성을 극복하는 요인이다. 생체내 기억 B 세포 면역 레퍼토리의 약 25%가 본원에 개시된 EHG 공정에서 포획되어, 매우 다양한 하이브리드 풀을 제공하는 것으로 추정된다. 예시적인 양태에서, EHG 방법은 면역화된 트랜스제닉 동물로부터 면역 조직을 수확하는 단계 및 이러한 조직으로부터의 세포를 단일 세포 현탁액으로 처리하는 단계를 포함한다(도 1a). 다양한 양태에서, 비-B 세포 및 IgM-양성 B 세포는 표면 IgG-양성 기억 B 세포를 특이적으로 농축시키기 위해 제거되며, 다양한 예에서, 살아있는 세포의 약 99.9%가 면역 조직 제조물에서 제거되는 반면, IgG+ 기억 B 세포 집단의 25~50%가 보유된다. 고도로 농축된 기억 B 세포 분획은, 다양한 양태에서, 조사된 뮤린 T-세포주(EL4B5), 토끼 T-세포 상청액 (TSN) 및 항-IgG 항체에 부착된 마이크로비드(예를 들어, 항-인간 IgG 마이크로비드)의 존재하에 벌크 배양된다. 배양 중에, 정지 기억 B 세포는 고도로 활성화되고, 일부 양태에서 7~10회의 분할을 겪는다. 다양한 예에서, 약 6일의 배양 후, 세포가 수집되고, P3 골수종 세포주와 융합되어, 하이브리도마를 생산한다. 융합 효율의 계산은 하이브리드 풀의 분획으로부터의 저밀도 시딩에서 클론 성장을 측정하여 가능하다. 항원 특이적 클론의 동정은 전통적인 하이브리도마 생성에도 사용되는 방법을 사용하여 여기에서 시작된다.
특정 이론에 구애됨 없이, 본원에 기재된 EHG 방법은, 전통적인 하이브리도마 생성과 비교하여, 설치류에서의 생체내 생성된 면역 레퍼토리의 훨씬 더 많은 분획을 포획하는 고유한 능력을 제공하여, IgG+ 기억 B 세포 구획을 특이적으로 표적화하며, 이는 형질 세포 구획보다 훨씬 더 깊고 더 다양하다. 본원에 개시된 EHG 방법은 예를 들어, 불량한 융합 효율 및 약한 면역 반응을 포함하는 이전 방법의 한계를 유리하게 극복하여, 크고 다양한 항체 레퍼토리를 갖는 하이브리도마 풀의 생성을 유도한다. 본원에 개시된 EHG 방법은 임의의 트랜스제닉 마우스 및 랫트 모델 및 야생형 균주에 성공적으로 적용될 수 있다. 특히, 본원에 개시된 EHG 방법은 면역 반응이 덜 강력하고 항원-반응 B 세포가 더 희귀한 XenoMouse®와 같은 1세대 인간 항체 트랜스제닉 동물에서도 효과적이다. 본원에 개시된 EHG 방법은 구체적으로는 생체내 생성된 기억 B 세포 집단을 불멸화시키는 반면, 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497]에 기재된 바와 같은 전통적인 하이브리도마 생성은, 형질 세포 집단을 불멸화하도록 편행되어 있으며, 이는 항원 특이적 레퍼토리의 다른 아암(arm)을 나타낸다. EHG 방법을 IgG+ 기억 세포에 적용하는 경우에도, 형질 세포 집단은 EHG로 진행하기 전에 동일한 면역 조직에서 성공적으로 단리될 수 있으며, 직접 분자 구제와 조합된 다양한 단일 B 세포 기술에 의해 포획될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 본 개시내용의 EHG 방법은 기억 B 세포와 형질 세포 구획 모두의 조사를 가능하게 하여, 항원에 대한 생체내 면역 반응의 포획에 깊이를 더 한다.
본원에 기술된 전통적인 방법 대 EHG 방법의 결과를 고려할 때, 융합 이벤트 동안 포획된 B 세포 집단이 상이하다는 것을 이해해야 한다. 전통적인 하이브리도마 생성은 형질 세포 쪽으로 강하게 편향되어 있고, EHG는 기억 세포 쪽으로 강하게 편향되어 있다. 이것은 B 세포의 농축, 크기 및 활성화 상태에 의해 유발된다. 융합 이벤트는 동일한 크기의 세포 사이에서, 그리고 활성화된 세포에서 발견되는 더 유동적인 원형질막을 가진 세포에서 성공할 가능성이 더 높다(Rems et al., Sci Rep (2013)3, 3382). 융합 파트너(예를 들어, 골수종 세포)는크기가 형질 세포에 가깝고, 따라서 전통적인 하이브리드 생성에서 희귀 형질 세포는 더 많은 기억 세포에도 불구하고 작은 휴지 세포보다 하이브리드 풀에 기여할 가능성이 더 크다. 따라서, 전통적인 하이브리도마 생성 방법은 다양성이 제한된 비교적 작은 하이브리드 풀을 생성한다(Dubois et al. Hum Antibodies (2016) Jun 8; 24(1-2):1-15).
대조적으로, EHG에서 출발점은 IgM+ B 세포가 고갈된, 고도로 농축된 IgG+ 기억 세포 구획이다. 뮤린 IgG+ B 세포는 배양 6일 동안 7~9회의 분할을 거치는 반면, IgM+ B 세포는 전형적으로 배양에서 9~10회 이상의 분할을 거치며, 또한 이소형이 IgG+ B 세포로 전환되기 때문에 이러한 고갈은 중요하다. 함께 배양되는 경우, IgM+ B 세포는 풀에서 B 세포를 경험한 고친화도 IgG 유래 항원의 퍼센트를 극적으로 희석한다. 이는 이후에 융합된 집단이다. 결과는 전통적인 방법을 사용하여 관찰된 것과는 레퍼토리가 다르고 다양성이 큰 하이브리드 풀이다.
내재된 전기 세포 융합 비효율을 극복하기 위해 항원 특이적 B 세포의 다수의 복제본을 포함하는 미리-농축된 IgG+ 기억 B 세포 구획으로부터의 대체로 조사되지 않은 공급원 및 포괄적 풀의 불멸화는 EHG를 전통적인 하이브리도마 생성과 구별하는 첫 번째 중요한 차이점이다. 기억 B 세포 구획은 병원체에 대한 1차 반응에서 고친화도 결합을 위해 생체 내에서 선택되지 않지만, 더 큰 다양성을 보유할 수 있고 지배적인 항원 결정자에 대한 편향이 적어 생체 내에서 생성된 형질 세포에서 포획되지 않은 중요한 레퍼토리를 제공할 수 있다.
두 번째 중요한 차이점은 트랜스제닉 Xenomouse®와 같은 동물 모델에서 유래된 매우 희귀한 항원 반응 B 세포로부터 항체 발견을 가능하게 한다는 것이다. 트랜스제닉 플랫폼에서 낮은 면역 세포 수와 덜 강력한 면역 반응에도 불구하고, 융합 전에 기억 세포를 고도로 풍부하게 한 다음 활성화 및 확장하는 본원에 기재된 방법은 면역 레퍼토리의 고효율 포획 및 크고 다양한 하이브리드 풀의 생성을 가능하게 하며, 트랜스제닉 동물에서 전통적인 하이브리드 생성을 사용하여 항상 가능한 것은 아니다.
전술한 것과 일관되게, 본 개시내용은 하이브리도마, 예를 들어, 원하는 항원-특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, (i) 농축 집단 세포의 약 10% 미만(예를 들어, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만)이 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나, (ii) 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 약 0.5 초과, 선택적으로, 약 1 초과 또는 약 2 초과인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; 및 (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단 세포의 약 10% 미만(예를 들어, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만)이 IgM-양성(IgM+) B 세포인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; 및 (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계를 포함한다.
농축 집단 제조
다양한 예에서, 방법은 하나 이상의 면역화된 비인간 동물(들)의 2차 림프 기관으로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 하나 이상의 면역화된 비인간 동물(들)의 2차 림프 기관으로부터 해리된 단일 세포 현탁액으로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 2차 림프 기관은 비장, 림프절 파이어판, 점막 조직 (예를 들어, 비강 관련 림프 조직, 아데노이드, 및/또는 편도선이다. 선택적으로, 2차 림프 기관은 림프절(LN)(예를 들어, 배액 LN) 및/또는 비장이다. 다양한 양태에서, 2차 림프 기관은 면역화 후 약 3 내지 약 5(예를 들어, 약 3, 약 4, 또는 약 5)일 후 면역화된 비인간 동물(들)로부터 채취되거나, 채취되어 왔다. 선택적으로, 2차 림프 기관은 면역화 후 약 3 내지 약 5(예를 들어, 약 3, 약 4, 또는 약 5)일 후 적어도 1 내지 약 15(예를 들어, 약 1 내지 약 10)마리의 면역화된 비인간 동물(들)로부터 채취되었다. 예시적인 양태에서, 2차 림프 기관은 유일하게 선택 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관이며, 선택적으로, 선택 면역화된 비인간 동물은 면역화 후 혈청 항체 역가 수준을 기준으로 선택되었다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 방법은 동물을 면역화하는 단계로서 면역화된 동물들 중 일부만이 2차 림프 기관 채취를 위해 선택되는, 단계를 포함한다. 선택적으로, 선택된 동물은 역치 수준 이상인 면역화 후 혈청 항체 역가 수준을 나타내는 동물이다. 다양한 예에서, 방법은 동물을 면역화하고 모든 면역화된 동물의 혈청을 면역화 후 분석하는 단계, 및 2차 림프 기관 채취를 위해 면역화된 동물의 분획만을 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 선택은 면역화 후 혈청 항체 역가 수준을 기초로 한다. 다양한 예에서, 면역화 후 혈청 항체 역가 수준은 항원-특이적 항체의 면역화 후 혈청 역가 수준이다. 예시적인 양태에서, 방법은 면역화 후 약 3 내지 약 5 (예를 들어, 약 3, 약 4, 또는 약 5)일 후 면역화된 비인간 동물(들)로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계를 포함한다. 다양한 예에서, 방법은 면역화 후 약 3 내지 약 5(예를 들어, 약 3, 약 4, 또는 약 5)일 후에 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5마리의 면역화된 비인간 동물로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계를 포함한다. 면역화된 비인간 동물은 본원에 기재된 비인간 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 것일 수 있다. 다양한 양태에서, 비인간 동물은 마우스(예를 들어, XenoMouse®)이다. 선택적으로, 비인간 동물은 랫트, 예를 들어, 트랜스제닉 랫트 (예를 들어, UniRat®) 또는 야생형 랫트이다. 다양한 양태에서, 면역화된 비인간 동물은 당업계에 공지된 임의의 프로토콜에 따라 면역화되거나 면역화되어 왔다. 다양한 양태에서, 비인간 동물(들)은 본원에 기재된 임의의 면역화 프로토콜에 따라 면역화되거나 면역화되어 왔다. 예를 들어, 이하의 면역화 를 참조한다. 다양한 양태에서, 방법은 (a) 하나 이상의 비인간 동물(들)을 면역원으로 면역화하는 단계, (b) 선택적으로, 면역화 후 약 3 내지 약 5일 후에 면역화된 비인간 동물(들)로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계, (c) 각 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관으로부터 단일-세포 현탁액(SCS)을 제조하는 단계, 및/또는 (d) 한 마리 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 SCS를 조합시켜 풀링된 SCS를 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
예시적인 양태에서, 방법은 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관, 선택적으로, 선택 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 단일 세포 현탁액(SCS)을 제조하는 단계를 포함한다. 예시적인 예에서, 방법은 2차 림프 기관으로부터 얻은 혼합 면역 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액을 제조하는 단계를 포함한다. 단일 세포 현탁액은 슬라이드에서 기관들을 해리하거나, 당업계에 공지된 방법들에 따라 균질화기(예를 들어, Dounce 조직 분쇄기, 디스펜서, 마이크로비드 균질화기, 초음파 처리기, 블렌더) 및/또는 조직 해리기, 예를 들어, 조직 해리 키트(예를 들어, MACS® 조직 해리 키트(Miltenyi Biotec))를 포함하거나 포함하지 않는 gentleMACSTM(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, Reichard and Asosingh, Cytometry 95(2): 219-226 (2019), Scheuermann et al., Current Directions in Biomedical Engineering 5(1): 545-548 (2019)를 참조한다. 예시적인 양태에서, 방법은 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 비장으로부터 SCS를 제조하는 단계 및/또는 하나 이상의 면역화된 비인간 동물로부터의 배액 림프절로부터 SCS를 제조하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 2개의 개별 SCS가 제조된다: 면역화된 비인간 동물의 풀링된 비장으로부터의 SCS 및 면역화된 동물의 풀링된 LN으로부터의 SCS. 다양한 예에서, 풀링된 비장으로부터의 SCS는, RBC 고갈 단계, 및 그 후 풀링된 LN으로부터의 SCS와 조합하여 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액을 생산하는 것을 거친다. 선택적으로, RBC는 BD Pharm LyseTM(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 또는 Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM(Millipore Sigma, St. Louis, MO)와 같은 RBC 용해 완충액을 사용하여 제거된다.
다양한 양태에서, 방법은 (i) 비인간 동물을 면역원으로 면역화하는 단계, (ii) 선택적으로, 면역원으로 마지막 부스트 후 약 3 내지 약 5일후에 면역화된 비인간 동물로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계, (iii) 선택적으로, 슬라이드에서 장기를 해리시키거나 조직 해리 키트 유무에 관계없이 균질화기 및/또는 조직 해리기를 사용하여, 2차 림프 기관으로부터 단일 세포 현탁액을 준비하는 단계, 및 (iv) (예를 들어, 상이한 면역화된 비인간 동물로부터) 여러 개의 준비된 단일 세포 현탁액을 조합하여 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액을 생성하는 단계 중 하나 이상을 포함한다. 다양한 양태에서, IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단은 적혈구(RBC), 비-B 세포 및/또는 IgM-양성(IgM+) 세포를 제거하여, 단일 세포 현탁액 (예를 들어, 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액)으로부터 제조된다. 다양한 양태에서, RBC는 BD Pharm LyseTM (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 또는 Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-MaxTM (Millipore Sigma, St. Louis, MO)와 같은 RBC 용해 완충액을 사용하여 단일 세포 현탁액 (예를 들어, 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액)으로부터 제거된다. 다양한 예에서, 비-B-세포는 비-B 세포의 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체(예를 들어, 항체 칵테일)를 사용하여 단일 세포 현탁액 (예를 들어, 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액)으로부터 제거된다. 예시적인 양태에서, 비-B-세포는 T-세포, 단핵구, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, 과립구 및 RBC 중 하나 이상이다. 예시적인 예에서, 하나 이상의 항체는 비오틴에 연결된다. 다양한 양태에서, 방법은 단일 세포 현탁액으로부터 T 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포, RBC, 과립구, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함한다. 예시적인 예에서, 방법은 비오틴-표지된 항체 및 스트렙타비딘-표지된 비드, 선택적으로, 스트렙타비딘-표지된 자성 비드를 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 T 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포, RBC, 과립구, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 비-B 세포의 세포 표면 마커는 NK1.1(NK 세포에 의해 발현됨), CD90.2(T-세포에 의해 발현됨), Ly-6G GR.1(과립구 및/또는 대식세포에 의해 발현됨), CD3ε(T-세포에 의해 발현됨), CD4(T 세포에 의해 발현됨), CD8a(T-세포에 의해 발현됨), CD11b(과립구, 대식세포, 수지상 세포, 및/또는 NK 세포에 의해 발현됨) 및 TER119(적혈구에 의해 발현됨)이다.
예시적인 양태에서, IgM+ 세포는 비오티닐화된 항-IgM 항체(예를 들어, 항-인간 IgM 항체)를 첨가함으로써 단일 세포 현탁액 (예를 들어, 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액)으로부터 제거된다. 다양한 양태에서, 비오티닐화된 항체는 단일 세포 현탁액에 첨가되어, 항체가 비-B 세포 및/또는 IgM+ 세포 상의 세포 표면 마커에 결합하도록 한다. 그 후, 다양한 예에서, 스트렙타비딘에 연결된 자성 비드(예를 들어, 스트렙타비딘 자성 비드)가 첨가되어, 스트렙타비딘이 비오티닐화된 항체의 비오틴에 결합하도록 한다. 예시적인 양태에서, 자성 비드를 단리 및 제거하기 위해 자석이 사용되며, 이는 항체를 통해 비-B 세포 및/또는 IgM+ 세포에 연결된다. 다양한 예에서, 방법은 면역화된 비인간 동물로부터 비장을 채취하고 비장으로부터 SCS를 준비하는 단계, 면역화된 비인간 동물로부터 LN을 채취하고 LN로부터 SCS를 준비하는 단계, 비장으로부터의 SCS로부터 RBC를 제거하는 단계, LN으로부터의 SCS와 RBC-고갈된 비장-유래 SCS를 조합하여 풀링된 SCS를 얻는 단계, 비오티닐화된 항-IgM 항체를 추가함으로써 풀링된 SCS로부터 IgM+ 세포를 제거하는 단계 및 스트렙타비딘 자성 비드로 IgM+ 세포를 포획하는 단계를 포함한다.
선택적으로, 90% 초과의 IgM+ B 세포가 풀링된 SCS로부터 제거되어, 농축 집단을 얻는다. 다양한 예에서, 풀링된 SCS의 IgM+ B 세포의 95% 초과(예를 들어, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)가 제거되어, IgM+ 세포가 실질적으로 고갈된 농축 집단을 얻는다. 다양한 예에서, 방법은 IgM+ 세포를 제거하는 단계 및/또는 IgG+ 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 방법은 기억 B 세포를 단리하기 위해, IgM+ 세포가 실질적으로 고갈된 농축 집단에 항-IgG 항체-표지된 자성 비드(예를 들어, 항-인간 IgG 항체-표지된 자성 비드)를 추가하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 나머지 분획(예를 들어, RBC, 비-B 세포 및/또는 IgM+ 세포가 고갈됨)은 항-IgG 항체, 예를 들어, 항-인간 IgG 항체에 연결된 마이크로비드와 함께 인큐베이션된다. 특정 양태에서, 항-IgG 항체를 통해, 세포 표면에서 IgG를 발현하는 세포가 마이크로비드에 결합한다. 예시적인 양태에서, 마이크로비드-항체-세포 혼합물은 표면 IgG를 발현하는 세포에 결합된 마이크로비드를 보유하는 자성 컬럼에 첨가된다. 다양한 양태에서 통류 분획은 표면 IgG 발현에 대해 음성인 세포를 포함한다. 예시적인 예에서, 표면 IgG를 발현하는 세포는 컬럼으로부터 방출되어, IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 생성한다. 다양한 예에서, RBC, 비-B-세포 및/또는 IgM 세포가 단일 세포 현탁액(예를 들어, 풀링된 또는 벌크 단일 세포 현탁액)으로부터 제거됨에 따라 IgG+ 세포의 백분율은 증가한다. 다양한 양태에서, IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단은 단일 세포 현탁액의 백분율과 비교하여 더 높은 백분율의 IgG+ 세포를 포함한다. 예를 들어, 다양한 양태에서, (살아있는 총 세포 수에 비해) IgG+ 세포의 백분율은 농축 전 단일 세포 현탁액의 (살아있는 총 세포 수에 비해) IgG+ 세포의 백분율에 비해 적어도 5배 또는 10배 이상 증가한다. 다양한 양태에서, (농축 전) 단일 세포 현탁액의 1% 미만은 IgG+ 세포이며, (살아있는 총 세포 수에 비해) IgG+ 세포의 백분율은 농축 후 약 5%, 약 10%, 약 15%, 또는 그 이상까지 증가된다. 다양한 예에서, 농축 집단의 살아있는 세포의 5% 초과, 10% 초과, 또는 15% 초과는 IgG+ 세포이며/이거나 농축 집단의 20% 초과의 세포, 30% 초과, 40% 초과, 또는 50% 초과는 B220 발현에 대해 양성이다. B220은 B-세포 마커이다. 다양한 예에서, IgG+ 세포의 농축 집단 세포의 10% 미만은 IgM+ 세포이다. 다양한 양태에서, IgG+ 세포의 농축 집단 세포의 5% 미만은 IgM+ 세포이다. 선택적으로, 농축 집단 세포의 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만은 IgM+ 세포이다. 다양한 예에서, 농축 집단의 IgM+ 세포에 대한 IgG+ 세포의 비율은 단일 세포 현탁액의 IgM+ 세포에 대한 IgG+ 세포의 비율에 비해 또는 농축 전에 비해 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 또는 그 이상 증가된다. 특정 이론에 구애됨 없이, IgG+ 세포의 농축 집단의 IgG+ 세포의 감소된 백분율과 함께 IgM+ 세포의 감소된 백분율은 유리하게는 IgG+ 세포가 벌크 배양에서 확장되어 확장된 집단을 생성하도록 하며, 이는 골수종 세포로 융합되어 하이브리도마를 생성할 수 있다.
예시적인 양태에서, 농축 집단은 IgM+ 세포를 제거하고/하거나 IgG+ 세포를 선택함으로써 준비된다. 다양한 예에서, 농축 집단은 IgM+ 세포의 음성 선택 및/또는 IgG+ 세포의 양성 선택에 의해 준비된다. 선택적으로, IgM+ B 세포의 90% 초과는 음성 선택 및/또는 양성 선택 시 제거되며, 일부 예에서, IgM+ B 세포의 95% 초과는 음성 선택 및/또는 양성 선택 시 제거된다. 다양한 양태에서, IgM+ B 세포의 98% 초과는 음성 선택 시 제거되며, IgM+ B 세포의 99% 초과는 음성 선택 및 양성 선택 시 제거된다. 선택적으로, 단일 세포 현탁액에 존재하는 IgM+ 세포의 99% 초과는 음성 선택 및 양성 선택을 통해 제거된다. 다양한 예에서, IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율은 음성 선택 및 양성 선택 시 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 증가한다.
벌크-배양
본원에 개시된 EHG 방법의 예시적인 양태에서, 농축 집단은 토끼 T-세포 상청액을 포함하는 세포 배양 배지에서 항-IgG 항체-표지된 비드(예를 들어, 항-인간 IgG 항체-표지된 비드) 및 피더 세포와 함께 벌크-배양된다. “벌크-배양"이란 세포 배양이 클론 세포 집단이 아님을 의미한다. 다양한 양태에서 "벌크 배양"은 다수의 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관으로부터 기원하는 세포 혼합물이다. 다양한 예에서, 본원에서 사용된 바와 같은 "벌크 배양"은 표면 IgG-양성 B-세포를 활성화시키고 증식 및 분화를 유도할 조건 하에서 표면 IgG-양성 B-세포의 다클론 혼합물을 배양하는 것을 의미한다. 피더 세포는 CD40L을 발현하고/하거나 어떤 경우에는 감마-조사된다. 선택적으로, 피더 세포는 감마-조사된, CD40L-양성 EL4B5 피더 세포이다. 다양한 양태에서, 골수종 세포는 대수기 성장 단계에 있다. 특정 양태에서, 골수종 세포는 P3 골수종 세포이다. 예시적인 양태에서, IgG+ 세포의 농축 집단은 mL 당 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포의 밀도로 벌크-배양된다. 선택적으로, IgG+ 세포의 농축 집단은 mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 600개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 550개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 500개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 450개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 400개의 B220-양성 세포, mL 당 약 400개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 450개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 500개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 550개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 650개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포의 밀도로 벌크-배양된다. 선택적으로, IgG+ 세포의 농축 집단은 mL 당 약 550개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포, 선택적으로, mL 당 약 625개의 B220-양성 세포의 밀도로 벌크-배양된다. 다양한 예에서, 농축 집단을 벌크-배양하는 것은 mL 당 약 350개의 B220-양성 B 세포 내지 약 700개의 B220-양성 B 세포, 선택적으로, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포의 시딩 밀도로 개시된다. 다양한 양태에서, 시딩 밀도는 mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 600개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 550개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 500개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 450개의 B220-양성 세포, mL 당 약 350개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 400개의 B220-양성 세포, mL 당 약 400개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 450개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 500개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 550개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포, 또는 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 700개의 B220-양성 세포이다. 선택적으로, 시딩 밀도는 mL 당 약 550개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포, 선택적으로, mL 당 약 625개의 B220-양성 세포이다. 다양한 양태에서, 벌크 배양의 부피는 약 10 mL 이상, 약 20 mL 이상, 약 30 mL 이상, 약 40 mL 이상, 약 50 mL 이상이다. 다양한 예에서, 벌크 배양의 부피는 50 mL 초과, 60 mL 초과, 70 mL 초과, 80 mL 초과, 또는 90 mL 초과이다. 다양한 양태에서, 부피는 100 mL 초과, 250 mL 초과, 500 mL 초과, 750 mL 초과, 약 1.0 L, 약 1.1 L, 약 1.2 L, 약 1.3 L, 약 1.4 L, 약 1.5 L, 약 1.6 L, 약 1.7 L, 약 1.8 L, 약 1.9 L, 또는 약 2.0 L이다. 농축 집단은 예시적인 예에서 약 50 mL 내지 약 500 mL, 선택적으로, 약 100 mL 내지 약 300 mL의 부피로 벌크-배양된다. 선택적으로, 농축 집단은 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일 동안 벌크-배양된다. 예시적인 양태에서, IgG+ 세포의 농축 집단은 적어도 약 4일 동안 벌크-배양된다. 예시적인 양태에서, IgG+ 세포의 농축 집단은 적어도 약 5일 동안 벌크-배양된다. 예시적인 예에서, IgG+ 세포의 농축 집단은 약 6일 동안 벌크-배양된다. 다양한 예에서, 농축 집단의 세포는 적어도 또는 약 5회의 세포 분할 내지 약 12회의 세포 분할을 겪는다. 다양한 예에서, 농축 집단의 세포는 적어도 또는 약 6회의 세포 분할 내지 약 12회의 세포 분할(예를 들어, 적어도 또는 약 6회의 세포 분할 내지 약 11회의 세포 분할, 적어도 또는 약 6회의 세포 분할 내지 약 10회의 세포 분할), 선택적으로, 적어도 또는 약 7회의 세포 분할 내지 약 10회의 세포 분할, 예를 들어, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10회의 세포 분할을 겪어, 확장된 집단을 생성한다.
세포 융합
예시적인 양태에서, 확장된 집단의 세포는 전기 세포 융합(ECF)에 의해 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 얻으며, 선택적으로, 여기서 ECF는 SDF 융합 챔버를 사용하여 수행된다. 다양한 예에서, 확장된 집단의 모든 세포(모든 B 세포 포함)는 골수종 세포와의 융합에 사용된다. 다양한 양태에서, 확장된 집단의 모든 세포(모든 B 세포 포함)는 융합을 위해 골수종 세포와 조합된다. 예시적인 예에서, 방법은 골수종 세포와 융합하기 위해 B 세포를 선택하는 단계를 포함하지 않는다. 예시적인 예에서, 방법은 골수종 세포와 융합하기 위해 항원에 결합하는 항체(예를 들어, 항원-특이적 항체)의 생성에 기초하여 B 세포를 선택하는 단계를 포함하지 않는다. 예시적인 양태에서, 농축 집단 또는 확장된 집단의 B 세포는 항원에 결합하는 항체 (예를 들어, 항원-특이적 항체)의 생산에 대해 스크리닝되지 않는다.
다양한 예에서, B-세포는 약 1:1 내지 약 1:4(예를 들어, 1:1.5, 1:2.0, 1:2.5, 1:3.0, 1:3.5, 1:4.0)의 B-세포 대 골수종 세포 비로 ECF 동안 존재한다. 일부 양태에서, 상기 비는 약 1:2이다. 하이브리도마 생성을 위한 전기 세포 융합 방법은 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, Greenfield, Cold Spring Harbor Protocols; doi: 10.1101/pdb.prot103184 (2019)를 참조한다. 선택적으로, 확장된 집단의 세포는 융합 이벤트 당 10 mL보다 큰 부피로 골수종 세포와 융합된다. 다양한 양태에서, 방법은 융합되지 않은 세포로부터 하이브리도마를 분리 또는 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 다양한 예에서, 방법은 ECF 챔버로부터의 세포를 하이포크산틴 아자세린(HA)을 포함하는 배양 배지로 옮기는 단계는 포함하며, 이는 임의의 융합되지 않은 세포의 세포 사멸을 유도한다. 다양한 양태에서, 방법은 약 3일 이상 동안 ECF 챔버로부터의 세포를 HA를 포함하는 배양 배지로 옮기는 단계를 포함한다. 다양한 예에서 하이브리도마는 후속적으로 냉동 조건 하에서 저장된다. 선택적으로, 냉동 저장후, 하이브리도마는 다중-웰 플레이트에 플레이팅되거나, 또는 FACS에 의해 분류된 항원은 다중-웰 플레이트에 클론적으로 플레이팅된다. 예시적인 양태에서, 각 웰은 웰당 최대 5개의 하이브리도마 클론을 포함한다. 예시적인 예에서, 각 웰로부터의 상청액은 하나 이상의 스크리닝 분석에 사용되어, 웰에서 하이브리도마에 의해 생성된 항체를 검출하고 특성화한다. 다양한 양태에서, 상청액은 선택적으로, ELISA, FACS, 또는 다른 기술에 의해 항원-특이적 항체에 대해 검정된다.
다양한 양태에서, 방법은 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계 및/또는 멀티플레이트 웰에서 하이브리도마를 배양하고 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다. 선택적으로, 스크리닝은 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 면역분석법을 포함한다. 다양한 양태에서 면역분석법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석이다. 다양한 양태에서, 항원-특이적 항체를 생산하는 세포에 대한 스크리닝은 하이브리도마가 얻어지기 전이 아닌, 하이브리도마가 얻어진 후에만 일어난다. 선택적으로, 항원-특이적 항체에 대한 분석이 2차 림프 기관의 수확 후 발생하는 유일한 시간은 하이브리도마가 얻어진 후이다. 예시적인 예에서, 항원-특이적 항체에 대한 스크리닝은 2차 림프 기관이 채취되기 전과 하이브리도마가 얻어진 후에만 발생한다. 선택적으로, 2차 림프 기관이 채취되기 전에 발생하는 항원-특이적 항체에 대한 스크리닝은 면역화된 살아있는 동물로부터 얻은 혈청의 역가 분석을 포함한다.
예시적인 구현예에서, 항원-특이적 항체를 생성하는 하이브리도마를 생성하는 방법은, 하기를 포함한다:
a. 하나 이상의 비인간 동물(들)을 면역원으로 면역화하는 단계;
b. 면역화된 비인간 동물(들)로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계;
c. 각 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관으로부터 단일-세포 현탁액(SCS)을 제조하는 단계;
d. (c)에서 제조된 모든 SCS를 조합하여 풀링된 SCS를 제조하는 단계;
e. 풀링된 SCS로부터 95% 초과의 IgM+ 세포를 제거하고/하거나, 풀링된 SCS로부터 표면 IgG+ 세포를 양성으로 선택하여 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 얻는 단계로서:
i. 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나,
ii. 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 0.5 초과, 선택적으로, 1 초과 또는 2 초과인, 단계,
f. 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계;
g. 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계; 및
h. 각각의 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하고 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여, 항원-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정하는 단계.
항원-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하는, 본원에 개시된 방법의 예시적인 구현예에서, 얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 15%를 나타낸다. 다양한 예에서, 얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 20%를 나타낸다. 선택적으로, 얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 25%를 나타낸다.
본원에 개시된 EHG 방법의 예시적인 예에서, 생체내 레퍼토리로부터의 전체 IgG+ 기억 B 세포의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% 초과가 농축 후 회수되어 벌크 배양에 들어간다. 본원에 개시된 EHG 방법의 다른 예시적인 양태에서, 생체내 레퍼토리로부터의 전체 IgG+ 기억 B 세포의 10% 초과(예를 들어, 15% 초과, 20% 초과, 25% 초과 또는 그 이상)는 농축후 회수되고, 벌크 배양으로 들어간다. 본원에 개시된 EHG 방법의 예시적인 예에서, 면역화된 동물로부터 풀링된 B-세포의 기억 B 세포 레퍼토리의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% 초과가 포획된다. 본원에 개시된 EHG 방법의 다른 예시적인 예에서, 면역화된 동물로부터 풀링된 B-세포의 기억 B 세포 레퍼토리의 10% 초과, 예를 들어, 15% 초과가 포획된다. 다양한 양태에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 100,000개 초과의 고유한 하이브리도마가 생성된다. 특정 예에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 150,000개 초과 또는 200,000개 초과의 고유한 하이브리도마가 생성된다. 다양한 예에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 달성된 융합 효율은 적어도 0.10%이다. 다른 예에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 달성된 융합 효율은 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 또는 0.09% 초과이다. 다른 예에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 달성된 융합 효율은 0.10%, 0.11%, 0.12%, 0.13%, 0.14%, 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.18%, 0.19%, 또는 0.20% 초과이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 EHG 방법에 의해 달성된 융합 효율은 0.140% 초과이다.
항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마에 대한 스크리닝 방법이 본원에 추가로 제공된다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 하이브리도마를 생성하는 본원에 개시된 방법 중 임의의 하나에 따라 하이브리도마를 생성하는 단계, (b) 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계로서, 선택적으로, 각 웰이 최대 5개의 하이브리도마를 포함하는, 단계; 및 (c) 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝 또는 검정하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계; (d) 각 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계; 및 (e) 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서 스크리닝은 ELISA 또는 표적 항원에 의해 코팅된 스트렙타비딘 비드에 대한 결합, 표적에 의해 형질감염된 세포에 결합하는 항체의 FACS 검출, 또는 또다른 고처리량 현미경 기술을 포함한다.
본 개시내용은 또한 항체-특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 방법은 (a) 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 10% 미만, 예를 들어, 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계; (b) 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; (c) 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계; (d) 각 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계; (e) 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 동정하는 단계; 및 (f) (e)에서 동정된 하이브리도마를 확장시켜 항원-특이적 항체를 생산하는 단계를 포함한다.
면역화
본 개시내용의 다양한 양태에서, 방법은 비인간 동물을 면역원으로 면역화하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역화"는 상기 면역원에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 "면역화 캠페인" 또는 "면역화 프로토콜" 또는 "캠페인"을 수행하거나 실시하는 것을 지칭한다. 예시적인 양태에서, 면역 반응은 B-세포 면역 반응 및/또는 상기 면역원에 대한 체액성 면역 반응을 포함한다. 비인간 동물을 면역화하기 위한 적합한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd ed., Academic Press Limited, San Diego, CA, 1996]을 참조한다. 예를 들어, 문헌[Barry et al., Biotechniques. 16(4):616-8, 620 (1994)]; [Tang et al., Nature. 12; 356(6365):152-4 (1992)]; [Bergmann-Leitner and Leitner, Methods Mol Biol 1325: 289-302 (2015)]; [Aravindaram and Yang, Methods Mol Biol 542: 167-178 (2009)]; [Johnston and Tang, Methods Cell Biol 43 PtA: 353-365 (1994)]; 및 [Dileo et al., Human Gene Ther 14(1): 79-87 (2003)]에 기재된 유전자 건 방법은 또한, 비인간 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 또한, 본원에 예시된 바와 같이, 면역화는 항원을 발현하는 세포를 비인간 동물에게 투여하거나, 항원-로딩된 수지상 세포, 종양 세포 백신 또는 면역-세포 기반 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sabado et al., Cell Res 27(1): 74-95 (2017)], [Bot et al., "Cancer Vaccines" in Plotkin's Vaccines, 7th ed., Editors: Plotkin et al., Elsevier Inc., 2018], 및 [Lee and Dy, "The Current Status of Immunotherapy in Thoraic Malignancies" in Immune Checkpoint Inhibitors in Cancer, Editors: Ito and Ernstoff, Elsevier Inc., 2019]를 참조한다. 다양한 예에서, 면역화는 미세바늘 전달(예를 들어, 문헌[Song et al., Clin Vaccine Immunol 17(9): 1381-1389 (2010)] 참조); 바이러스-유사 입자(VLP)(예를 들어, 문헌[Temchura et al., Viruses 6(8): 3334-3347 (2014)] 참조); 또는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shakya et al., Vaccine 33(33): 4060-4064 (2015)] 및 문헌[Cai et al., Vaccine 31(9): 1353-1356 (2013)]을 참조한다. 예를 들어, T 세포 에피토프를 항원에 추가하는 것을 포함하는 면역화 및 면역원 준비를 위한 추가 전략은 문헌[Chen and Murawsky, Front Immunol 9: 460 (2018)]에 기재되어 있다.
다양한 양태에서, 방법은 비인간 동물을 면역원으로 면역화하는 단계를 포함하며, 상기 면역원은 비인간 동물에 1회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5회, 또는 그 이상) 투여된다. 다양한 양태에서, 면역원은 주사에 의해, 예를 들어, 복강내, 피하, 근육내, 피내, 또는 정맥내로 투여된다. 다양한 양태에서, 방법은 일련의 면역원 주사를 투여함으로써 비인간 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 예시적인 양태에서, 각각의 투여, 예를 들어, 주사는 약 10일 내지 약 18일 간격, 선택적으로, 약 12 내지 약 16일 간격, 또는 약 14일 간격으로 비인간 동물에게 제공된다. 예시적인 양태에서, 각각의 투여, 예를 들어, 주사는 약 10일 내지 약 18일 간격보다 더 자주 비인간 동물에 제공된다. 예를 들어, 예시적인 양태에서, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1 내지 약 9일 간격, 선택적으로, 약 1일 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1 day 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 9일, 약 8일 내지 약 9일, 약 4 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 8일, 또는 약 6일 내지 약 8일이다. 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 다양한 양태에서 더 길다. 예를 들어, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1 내지 약 20주 이상, 예를 들어, 약 1 내지 약 20개월일 수 있다. 선택적으로, 비인간 동물에 대한 면역원의 투여 사이의 타이밍은 약 1주 내지 약 19주, 약 1주 내지 약 18주, 약 1주 내지 약 17주, 약 1주 내지 약 16주, 약 1주 내지 약 15주, 약 1주 내지 약 14주, 약 1주 내지 약 13주, 약 1주 내지 약 12주, 약 1주 내지 약 11주, 약 1주 내지 약 10주, 약 1주 내지 약 9주, 약 1주 내지 약 8주, 약 1주 내지 약 7주, 약 1주 내지 약 6주, 약 1주 내지 약 5주, 약 1주 내지 약 4주, 약 1주 내지 약 3주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 20주, 약 3주 내지 약 20주, 약 4주 내지 약 20주, 약 5주 내지 약 20주, 약 6주 내지 약 20주, 약 7주 내지 약 20주, 약 8주 내지 약 20주, 약 9주 내지 약 20주, 약 10주 내지 약 20주, 약 11주 내지 약 20주, 약 12주 내지 약 20주, 약 13주 내지 약 20주, 약 14주 내지 약 20주, 약 15주 내지 약 20주, 약 16주 내지 약 20주, 약 17주 내지 약 20주, 약 18주 내지 약 20주, 또는 약 19주 내지 약 20주이다. 선택적으로, 이러한 타이밍은 약 1주 내지 약 8일, 약 1일 내지 약 7일, 약 1일 내지 약 6일, 약 1일 내지 약 5일, 약 1일 내지 약 4일, 약 1일 내지 약 3일, 약 1일 내지 약 2일, 약 2일 내지 약 9일, 약 3일 내지 약 9일, 약 4일 내지 약 9일, 약 5일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 9일, 약 8일 내지 약 9일, 약 4 내지 약 8일, 약 4일 내지 약 8일이다, 또는 약 6일 내지 약 8일. 다양한 예에서, 면역화 동안, 면역원의 각 투여(예를 들어, 주사)는 동일한 (A) 면역원, 아쥬반트, 면역조절제, 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 아쥬반트, 면역조절제, 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (D) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (E) 이들의 조합으로 수행된다. 대안적으로, 면역화 동안 면역원의 1회 이상의 투여(예를 들어, 주사)는 상이한 (A) 면역원, 아쥬반트, 면역조절제, 또는 이들의 조합, (B) 면역원, 아쥬반트, 면역조절제, 또는 이들의 조합의 양 또는 용량, (C) 면역원을 전달하는 투여 경로 또는 방법, (D) 비인간 동물 상의 투여 부위, 또는 (E) 이들의 조합으로 수행된다. 선택적으로, 면역원의 양은 후속 투여, 예를 들어, 주사에 따라 감소하거나 증가한다. 일부 양태에서, 투여, 예를 들어, 주사는 두 번마다 한 번씩 첫 번째 및 세 번째 주사에 비해 감소되거나 증가된 양의 면역원을 포함한다. 예시적인 면역화는 본원에 제공된 실시예에 기재되어 있다.
비인간 동물
유리하게는, 본원에 개시된 방법은 임의의 특정 비인간 동물에 제한되지 않는다. 예시적인 양태에서의 비인간 동물은 임의의 비인간 포유류이다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 마우스, 랫트, 기니어 피그, 저빌 및 햄스터와 같은 설치목의 포유류, 토끼와 같은 토끼목의 포유류, 고양이 및 개를 비롯한 식육목의 포유류, 소 및 돼지를 비롯한 우제목의 포유류, 또는 말을 비롯한 말목의 포유류를 포함하는(이에 한정되지 않음) 포유류이다. 일부 양태에서, 비인간 포유류는 영장목, 세보이드(Ceboid), 또는 시모이드(Simoid)(원숭이) 또는 유인원목(유인원)에 속한다. 다양한 양태에서, 비인간 동물은 염소, 라마, 알파카, 닭, 오리, 어류(예를 들어, 연어), 양, 또는 순양이다.
예시적인 예에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 비인간 동물(들)은 키메라 또는 완전 인간 항체를 생성하도록 변형, 예를 들어 유전적으로 변형된다. 이러한 비인간 동물은 트랜스제닉 동물이라고 한다. 트랜스제닉 동물에서의 인간 항체의 생성은 문헌[Bruggemann et al., Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 63(2): 101-108 (2015)]에 기재되어 있다. 트랜스제닉 닭(예를 들어, OmniChicken®), 트랜스제닉 랫트(예를 들어, OmniRat®), 트랜스제닉 라마, 및 트랜스제닉 소(예를 들어, Tc BovineTM)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 트랜스제닉 동물이 본 발명에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 비인간 동물은 XenoMouse®, Alloy 마우스, Trianni 마우스, OmniMouse®, 및 HuMAb-Mouse®와 같은 트랜스제닉 마우스이다. XenoMouse®는 완전-인간 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스의 계통이다. XenoMouse®의 개요는 문헌[Foltz et al., Immunol Rev 270(1): 51-64 (2016)] 및 미국 특허 제5,939,598호에 제공되어 있다. 예시적인 양태에서, 비인간 동물은 트랜스제닉 랫트이다. 다양한 양태에서 트랜스제닉 랫트는 Unirat® 또는 OmniFlic®이며, 이는 문헌[Clarke et al., Front Immunol 9:3037 (2019); doi: 10.3389/fimmu.2018.03037] 및 [Harris et al., Front Immunol 9:889 (2018): doi: 10.3389/fimmu.2018.00889]에 각각 기재되어 있다.
면역원
유리하게는, 본원에 개시된 방법은 임의의 특정 면역원에 제한되지 않는다. 다양한 양태에서 면역원은 임의의 항원, 선택적으로, 단백질, 또는 이의 단편, 융합체 또는 변이체일 수 있다. 다양한 예에서, 면역원은 사이토카인, 림포카인, 호르몬, 성장 인자, 세포외 기질 단백질, 종양 관련 항원, 종양 관련 항원, 관문 억제제 분자, 세포 표면 수용체, 또는 이의 리간드이다. 단지 예시적인 면역원을 예시할 목적으로, 비인간 동물을 면역화하는데 사용되는 면역원은 다음 항체들 중 임의의 하나가 결합하는 표적 또는 항원일 수 있다: 무로모납(Muromonab)-CD3(상표명 Orthoclone Okt3®으로 판매되는 제품), 압식시맙(상표명 Reopro®로 판매되는 제품),　리툭시맙(상표명 MabThera®, Rituxan®로 판매되는 제품), 바실릭시맙(상표명 Simulect®로 판매되는 제품), 다클리주맙(상표명 Zenapax®로 판매되는 제품), 팔리비주맙(상표명 Synagis®로 판매되는 제품), 인플릭시맙(상표명 Remicade®로 판매되는 제품),　트라스투주맙(상표명 Herceptin®로 판매되는 제품), 알렘투주맙(상표명 MabCampath®, Campath-1H®로 판매되는 제품),　아달리무맙(상표명 Humira®로 판매되는 제품), 토시투모맙-I131(상표명 Bexxar®로 판매되는 제품), 에팔리주맙(상표명 Raptiva®로 판매되는 제품), Cetuximab(상표명 Erbitux®로 판매되는 제품), 이브리투모맙 튜세탄(상표명 Zevalin®로 판매되는 제품), 오말리주맙(상표명 Xolair®로 판매되는 제품), 베바시주맙(상표명 Avastin®로 판매되는 제품), 나탈리주맙(상표명 Tysabri®로 판매되는 제품), 라니비주맙(상표명 Lucentis®로 판매되는 제품), 파니투무맙(상표명 Vectibix®로 판매되는 제품), 에쿨리주맙(상표명 Soliris®로 판매되는 제품), 세르톨리주맙 페골(상표명 Cimzia®로 판매되는 제품), 골리무맙(상표명 Simponi®로 판매되는 제품), 카나키누맙(상표명 Ilaris®로 판매되는 제품), 카투막소맙(상표명 Removab®로 판매되는 제품), 우스테키누맙(상표명 Stelara®로 판매되는 제품), 토실리주맙(상표명 RoActemra®, Actemra®로 판매되는 제품), 오파투무맙(상표명 Arzerra®로 판매되는 제품), 데노수맙(상표명 Prolia®로 판매되는 제품), 벨리무맙(상표명 Benlysta®로 판매되는 제품), 락시바쿠맙, 이필리무맙(상표명 Yervoy®로 판매되는 제품) 및 퍼투주맙(상표명 Perjeta®로 판매되는 제품). 예시적인 구현예에서, 항체는 항-TNF 알파 항체, 예컨대 아달리무맙, 인플릭시맙, 에타네르셉트, 골리무맙 및 세르톨리주맙 페골; 항-IL1β 항체, 예컨대 카나키누맙; 항-IL12/23(p40) 항체, 예컨대 우스테키누맙 및 브리아키누맙; 및 항-IL2R 항체, 예컨대 다클리주맙 중 하나이다.
면역화 단계에 사용하기 위한 면역원을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Fuller et al., Curr Protoc Mol Biol, Chapter 11, Unit 11.4, (2001)]; [Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, 2nd ed., Ossipow et al. (Eds.), Humana Press 2014]를 참조한다. 다양한 예에서, 면역원은 비인간 동물에 투여하기 전에 아쥬반트 또는 다른 용액과 혼합된다. 많은 아쥬반트가 당업계에 공지되어 있고, 예시적인 예에서, 오일, 명반, 알루미늄 염 또는 리포폴리사카라이드를 포함한다. 다양한 양태에서, 아쥬반트는 무기이다. 대안적인 양태에서, 아쥬반트는 유기이다. 다양한 양태에서, 아쥬반트는 하기를 포함한다: 명반, 알루미늄 염(예를 들어, 인산알루미늄, 수산화알루미늄), 프로인트 완전 아쥬반트, 프로인트 불완전 아쥬반트, RIBI 아쥬반트 시스템(RAS), 지질 A, Sigma Adjuvant System®, TiterMax® Classic, TiterMax® Gold, Montanide 백신 아쥬반트(예를 들어, Montanide 103, Montanide ISA 720, Montanide incomplete Seppic 아쥬반트, Montanide ISA51), AF03 아쥬반트, AS03 아쥬반트, Specol, SPT, 나노에멀젼, VSA3, 오일 또는 지질-기반 용액, (예를 들어, 스쿠알렌, MF59®, QS21, 사포닌, 모노포스포릴 지질 A(MPL)), 트레할로스 디코리노마이콜레이트(TDM), sTDM 아쥬반트, 바이로솜, 및 PRR 리간드. 예를 들어, https://www.invivogen.com/review-vaccine-adjuvants의 "Vaccine Adjuvants Review" 및 2016년 6월 2일에 https://Info.gbiosciences.com/blog/role-of-adjuvants-in-antibody-production에 포스팅된 "Role of Adjuvants in Antibody Production", The Protein Man's Blog: A Discussion of Protein Research를 참조한다. 다양한 예에서, 아쥬반트는 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀과 같은 표면-활성 물질을 포함한다. BCG(바실리 칼메테-구에린(bacilli Calmette-Guerin)) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum).
항체
항체 구조는 종마다 다르지만, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는, 일반적으로, 전형적으로 중쇄와 경쇄를 포함하고 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 통상적인 면역글로불린 형태를 갖는 단백질을 지칭한다. 본 방법에 의해 수득되거나 단리된 항체는 다양한 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 방법에 의해 수득된 항체는 치료제로 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득된 항체는 또한 비-치료용 항체로서 사용될 수 있으며, 예를 들어, 진단 분석, 예를 들어, 진단 이미징 분석 및 기타 시험관내 또는 생체내 면역분석, 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사면역분석, ELISA, EliSpot 분석 등에 사용되는 시약으로 사용될 수 있다. 다양한 양태에서, 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 예시적인 예에서, 항체는 포유류 항체, 예를 들어, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 말 항체, 닭 항체, 햄스터 항체, 돼지 항체, 인간 항체, 알파카 항체, 낙타 항체, 라마 항체 등이다. 일부 양태에서, 항체는 트랜스제닉 동물에 의해 임의로 생산되는 단일클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다. 이러한 구현예에서, 생산된 항체는 둘 이상의 종의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 다양한 예에서, 항체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍의 "Y형" 구조인 인간 IgG를 가지며, 각 쌍은 (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "경쇄" 및 (전형적으로 약 50~70 kDa의 분자량을 갖는) 하나의 "중쇄"를 갖는다. 인간 항체는 가변 영역 및 불변 영역을 갖는다. 인간 IgG 형태에서, 가변 영역은 일반적으로 약 100~110개 이상의 아미노산이며, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하고, 항원 인식을 주로 담당하고, 상이한 항원에 결합하는 다른 항체들 사이에서 실질적으로 다르다. 예를 들어, Janeway et al., "Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes", Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4th ed. Elsevier Science Ltd./Garland Publishing, (1999)를 참조한다. 간략하게 말하면, 인간 항체 스캐폴드에서, CDR은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 내에 포함되어 항원 결합 및 인식을 주로 담당하는 영역을 구성한다. 인간 항체 가변 영역은 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR(문헌[Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, Md.]; 또한 문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol.Biol.196:901-917]; 문헌[Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883] 참고)을 프레임워크 영역(문헌[Kabat et al., 1991]에 의하면, 프레임워크 영역 1~4, FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 표기됨; 또한 상기 문헌[Chothia and Lesk, 1987] 참고) 내에 포함한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 인간 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG에는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는(이에 한정되지 않음) 여러 서브클래스가 있다. IgM에는 IgM1 및 IgM2를 포함하는(이에 한정되지 않음) 서브클래스가 있다. 본 개시의 구현예는 인간 항체의 모든 이러한 클래스 또는 이소형을 포함한다. 인간 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파- 또는 람다-유형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-유형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 따라서, 예시적인 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중 어느 하나를 포함하는 이소형 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM의 항체이다.
항원-결합 단백질은 인간 항체의 구조와 다른 구조를 가질 수 있다. 예시적인 예에서, 항원-결합 단백질은 중쇄 단편, 예를 들어, 중쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역 CH2, 중쇄 불변 영역 CH3만을 포함한다. 다양한 예에서, 항원-결합 단백질은 단봉낙타, 라마 및 상어에 의해 만들어진 것과 같은 작은 항체 또는 나노바디의 구조를 포함한다. 예를 들어, 2018에 https://www.sciencemag.org/news/2018/05/mini-antibodies-discovered-sharks-and-camels-could-lead-drugs-cancer-and-other-diseases에 게재된 Leslie, Science의 "Mini-antibodies discovered in sharks and camels could lead to drugs for cancer and other diseases"를 참조한다.
예시적인 구현예
다음은 본 개시내용의 예시적인 구현예를 기재한다:
1. 하이브리도마를 생성하는 방법으로서,
a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 5% 미만이 IgM-양성(IgM+) B 세포인, 단계;
b. 농축 집단을 벌크-배양하여, 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단을 얻는 단계; 및
c. 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계
를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 2차 림프 기관이 (i) 면역화 후 약 3 내지 약 5일 후의 면역화된 비인간 동물(들) 및/또는 (ii) 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5마리의 면역화된 비인간 동물(들)로부터 채취된 2차 림프 기관인, 방법.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 2차 림프 기관으로부터 제조된 단일-세포 현탁액으로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 2차 림프 기관이 비장 및/또는 림프절인, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 비인간 동물이 마우스 또는 랫트인, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 2차 림프 기관으로부터 준비된 단일 세포 현탁액으로부터 비-B 세포, 적혈구(RBC), IgM-양성(IgM+) 세포, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함하고, 선택적으로, 비-B 세포, RBC, 또는 IgM+ 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하여 비-B 세포, RBC, IgM+ 세포, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
7. 구현예 6에 있어서, 세포 표면 마커가 인간 IgM, CD90.2, Ly-6G GR.1, NK-1.1, CD3엡실론, CD4, CD8a, CD11b, 및/또는 TER119인, 방법.
8. 구현예 6 또는 7에 있어서, 항체가 비오틴에 연결되고, 방법은 스트렙타비딘-표지된 비드, 선택적으로, 스트렙타비딘-표지된 자성 비드를 사용하여, 비-B 세포, RBC, 및/또는 IgM+ 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로, 항-IgG 항체-표지된 비드, 선택적으로, 항-인간 IgG 항체-표지된 자성 비드를 사용하여 표면 IgG+ 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단의 적어도 10% 세포가 IgG+ B 세포이고/이거나 농축 집단의 20% 초과의 세포가 B220 발현에 대해 양성인, 방법.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 토끼 T-세포 상청액을 포함하는 세포 배양 배지에서 IgG+ 세포의 농축 집단을 항-인간 IgG 항체-표지된 비드 및 피더 세포와 함께 벌크-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 피더 세포는 CD40L을 발현하고/하거나, 감마-조사되는, 방법.
13. 구현예 12에 있어서, 피더 세포는 감마-조사된, CD40L-양성 EL4B5 피더 세포인, 방법.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 골수종 세포가 대수기 성장 단계에 있는, 방법.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 골수종 세포가 P3 골수종 세포인, 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단은 mL 당 약 350개의 B220-양성 B 세포 내지 약 700개의 B220-양성 B 세포, 선택적으로, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포의 밀도로 벌크-배양되는, 방법.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단은 약 50 mL 이상의 부피로 벌크-배양되는, 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단은 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일, 선택적으로, 약 6일 동안 벌크-배양되는, 방법.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단의 세포가 적어도 약 7회의 세포 분할을 거쳐 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단을 생성하는, 방법.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단의 세포가 전기세포 융합(ECF)에 의해 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마를 수득하는, 방법.
21. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 하이브리도마 및 임의의 융합되지 않은 세포를 선택 배지로 옮기는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로, 선택 배지는 HA를 포함하는, 방법.
22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 냉동 조건 하에 하이브리도마를 저장하는 단계를 포함하는, 방법.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 멀티플레이트 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계 및 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
24. 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 방법으로서,
a. 구현예 1 내지 23의 방법 중 어느 하나에 따라 하이브리도마를 생성하는 단계;
b. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
c. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계
를 포함하는, 방법.
25. 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 스크리닝하는 방법으로서,
a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계;
b. 농축 집단을 벌크-배양하여, 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단을 얻는 단계;
c. 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계;
d. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
e. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계
를 포함하는, 방법.
26. 항원-특이적 항체를 생산하는 방법으로서,
a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계;
b. 농축 집단을 벌크-배양하여, 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단을 얻는 단계;
c. 확장된 IgG+ 기억 B 세포 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계;
d. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계;
e. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여, 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 동정하는 단계; 및
f. (e)에서 동정된 하이브리도마의 배양을 확장시켜 항원-특이적 항체를 생성하는 단계
를 포함하는, 방법.
27. 구현예 1 내지 1026 중 어느 하나에 있어서, 농축 집단의 세포의 약 3% 미만이 IgM+ B 세포인, 방법.
28. 구현예 27에 있어서, 농축 집단의 세포의 약 2% 미만이 IgM+ B 세포인, 방법.
29. 구현예 28에 있어서, 농축 집단의 세포의 약 1% 미만이 IgM+ B 세포인, 방법.
하기 실시예는 단순히 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 어떠한 방식으로든 그 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 본 개시내용의 하이브리도마를 생성하는 예시적인 방법을 기술한다.
면역화
7마리의 트랜스제닉 XenoMouse® G2-KL (XMG2-KL) 동물(카파 또는 람다 경쇄를 가진 인간 항체를 생산할 수 있음)의 코호트를 CHO 세포에서 안정적으로 발현된 천연 항원 Z로 면역화했다. 동물을 왼쪽 넓적다리(SQ/LT)에 피하 투여된 아쥬반트 Alum/CpG ODN과 함께 4x106개 세포로 초기에 면역화한 다음, 8주 동안 2x106개 세포로 매주 2회 부스팅하였다. 최종 부스트를 제공하고, 4일 후 동물을 수확하고, 비장 및 배액 림프절을 수집하였다.
단리 및 농축
기억 B 세포를 단리시키기 위해, 7마리의 면역화된 동물의 비장 및 림프절(LN)을 채취하고, 기관 유형당 단일 세포 현탁액(SCS)으로 가공하였다: 모든 동물의 비장으로부터 유래된 하나의 SCS 및 모든 동물의 LN으로부터 유래된 하나의 SCS. BD Pharm LyseTM(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)를 사용하여 비장으로부터 유래된 SCS에서 적혈구(RBC)를 제거하였다. 이후에 모든 SCS를 추가 처리를 위해 하나의 풀링된 SCS로 조합시켰다. B-세포를 4단계 농축 절차를 사용하여 농축시켰으며, 여기서 처음 두 단계에서는 여러 세포들 중에서도 특히 IgM-양성(IgM+) 세포를 제거하고, 마지막 두 단계에서는 표면 IgG-양성(IgG+) B 세포로부터 양성으로 선택하였다.
첫번째 단계에서, 세포를 비오티닐화된 항체 칵테일과 함께 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 항체 칵테일은 비-B 세포 (예를 들어, T-세포, 단핵구, 대식세포, 자연 살해(NK) 세포, 과립구 및 RBC) 및 인간 IgM-양성 B-세포 상의 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 비오티닐화된 항체를 포함하였다. 항체 칵테일은 NK1.1(NK 세포에 의해 발현됨), IgM(IgM-양성 B-세포에 의해 발현됨), CD90.2(T-세포에 의해 발현됨), Ly-6G GR.1(과립구 및/또는 대식세포에 의해 발현됨), CD3ε(T-세포에 의해 발현됨), CD4(T 세포에 의해 발현됨), CD8a(T-세포에 의해 발현됨), CD11b(과립구, 대식세포, 수지상 세포, 및/또는 NK 세포에 의해 발현됨) 및 TER119(적혈구에 의해 발현됨)에 특이적인 항체를 포함하였다. 칵테일과 함께 인큐베이션한 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 두번째 단계에서, 스트렙타비딘 자성 비드(예를 들어, 스트렙타비딘 Dynabeads (ThermoFisher Scientific, Pleasanton, Ca)를 세척된 세포와 함께 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 스트렙타비딘 자성 비드가 비오티닐화된 항체에 결합하도록 하였으며, 이는 비-B 세포 및 IgM-양성 B-세포에 결합되었다. 자석을 사용하여 자성 비드-표지된 비-B 세포 및 IgM-양성 B-세포를 단리하고 제거하였다. 자성 비드에 결합하지 않은 세포의 나머지 분획은 기억 B-세포 집단을 함유하였으며, 세번째 단계에서, 이 분획을 항-인간 IgG 항체 마이크로비드(Miltenyi, Bergisch Gladbach, Germany)와 함께 4℃에서 40분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 네번째 단계에서 마이크로비드에 결합된 세포를 자성 컬럼에 적용시켰다. 표면 IgG-양성 세포가 컬럼에 보유된 반면, 표면 IgG-음성 세포는 컬럼을 통과하여 추가 처리를 위해 수집되었다. 기억 세포를 나타내는 이러한 표면 IgG-양성 세포를 컬럼으로부터 배출 또는 용출시킨 다음, B220, IgG 및 IgM의 표면 발현에 대해 FACS로 분석하였다. 기억 세포는 표면에서 높은 수준의 B220 및 IgG를 발현한다.
FACS 분석으로부터의 예시적인 FACS 플롯이 도 3a에 도시되어 있다. 표 1은 IgG+ 기억 B 세포를 농축하기 위한 농축 절차 전, 도중 및 후의 FACS 분석의 요약을 제공한다. 표 1에 나타난 바와 같이, B220-양성 세포의 백분율은 4-단계 농축 절차 후 실질적으로 27.2%에서 55.9%로 증가하였다. B220은 B 세포의 세포 표면 마커이다(예를 들어, Khodadadi et al., Front Immunol 10: Article 721 (2019); doi:10.3389/Fimmu.2019.00721 참조). 표 1에 나타낸 바와 같이, 농축 후, B220-양성 세포의 8.8%만이 IgM-양성인 반면, B220-양성 세포의 33.4%가 IgG-양성이었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 전체 살아있는 세포 중 IgG+ 세포의 백분율은 1% 미만에서 15% 초과로 증가하였다. 또한, IgG+ B 세포의 상당한 분획(28.1%)이 이 과정에 의해 회수되었다(표 1). IgM+ 세포에 대한 IgG+ 세포의 비율은 약 0.006에서 약 3.8로 증가하였다(표 1). IgM+ B 세포의 99.96%가 이 농축 과정에 의해 제거되었기 때문에, 농축 과정은 이 비율을 600배 이상 증가시켰다.
[표 1]
CD138/TACI 이중 양성 형질 세포를 함유하는 표면 IgG-음성 세포를 함유하는 통류 분획을 직접적인 B 세포 발견 플랫폼을 통해 표면 IgG-양성 형질 세포가 아닌 IgG 분비를 구제하기 위해 별도의 절차로 농축하였다. IgM-음성 형질 세포의 농축을 평가하기 위해 FACS를 수행하여 B-세포 마커의 발현을 분석하였다. 이러한 세포의 FACS 분석으로부터의 예시적인 FACS 플롯이 도 3b에 도시되어 있다. 이 농축 분획은 고친화도 IgG 분비 형질 세포 집단을 함유하며, 항원 결합 분비 분석을 위한 직접적인 B 세포 발견 기술에 적용된다.
벌크 배양
4-단계 농축 과정을 통해 얻은 IgG+ 기억 B 세포를 포함하는 농축 집단을 T175 플라스크에서, FBS, 감마선 조사된 CD40L 발현 EL4B5 피더 세포주, 토끼 T 세포 상청액 및 인간 IgG 가교 마이크로비드가 보충된 RPMI 배지에서 625 B220-양성 B 세포/ml로 벌크 배양하였다. 벌크 배양의 부피는 일반적으로 약 200 mL이다. 배양물을 37℃및 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션하였다. 벌크 배양 후, 세포를 수집하고 계수하였다. 벌크 배양 후 세포 수를 입력 B 세포 수(벌크 배양을 접종하는 데 사용된 B-세포 수)와 비교하여 벌크 배양 중에 발생한 세포 분할 수를 계산하였다. 이러한 계수에 기초하여, B 세포는 벌크 배양에서 9.8회의 세포 분할을 거쳐 확장된 집단을 생산한 것으로 결정되었다.
세포 융합
융합 파트너 P3 골수종 세포를 확장시키고, 대수기 성장 단계에서 수집하였다. 확장된 집단을 약 1:2.6의 B-세포 대 P3 골수종 세포 비로 P3 골수종 세포와 조합하였다. 세포 혼합물을 저-삼투압 전기 세포 융합(ECF) 완충액에서 2회 세척하고, 2 x 106 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 전기 세포 융합은 고처리량 융합을 위해 융합 챔버를 사용하여 수행하였다. 본 실험에서, 150 x 106개의 B 세포를 18개의 융합 이벤트에서 391 x 106개의 P3 골수종과 융합시켰다. 각 융합은 40 sec 60v 사전정렬에 이어 각각 800V의 3 x 30 μsec 펄스로 구성된다.
융합후 배양 및 N2 아카이빙
세포 융합 후, 세포를 즉시 FBS를 갖는 270 ml DMEM 배지에 넣고, 1회 세척하고, 하이포크산틴 아자세린(HA)을 갖는 DMEM에서 3 x 200 ml T175 벌크 배양물에 넣어, 융합되지 않은 골수종 세포를 제거하였다. 융합 후 배양 3일 후, 하이브리드 풀을 수집하고, 세척하고, 동결 저장을 위해 90% 초생 송아지 혈청 (NCS) 및 10% DMSO에서 12개의 분취량으로 나누었다. -80℃에서 24시간 후, 바이알을 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮겼다. 하나의 바이알을 해동하고, 저밀도 96 웰 플레이트에 플레이팅하여 DMEM 선택 배지에서 클론 파생물을 평가했다. 여기에서 융합 효율과 풀의 복잡성을 계산하였다. 여기에서, 융합 후 총 복잡도는 205,882개의 고유한 하이브리드이었고 융합 효율은 0.140%로 계산되었다.
하이브리드 풀의 융합 효율 평가 및 복잡도 계산
하이브리드 풀에서의 고유한 클론의 최대 수를 나타내는 "복잡도"라는 신조어는 농축된 벌크 배양된 기억 B 세포 집단 중 얼마의 분획이 하이브리드 풀에서 불멸화되는지 추정하는 계산된 값이다. 농축 단계에서 기억 B 세포의 FACS 알려진 회수와 복잡도를 결합하면 EHG 이벤트에서 포획되는 생체 내 면역 레퍼토리의 근사화를 가능하게 한다. 이 실제 사례로의 축소에서는, 생체내 레퍼토리로부터의 총 IgG+ 기억 B 세포의 28%가 농축 후 회수되었고, 이들은 B 세포 배양 및 EHC에 입력되었다. 융합은 이 분획의 60%를 포획했다. 전체적으로, 7마리 동물의 풀링된 B 세포로부터의 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 17%(28% * 60%)가 이 과정에서 포획(불멸화)되었다.
복잡도 계산은 또한 하이브리드 풀의 조사 깊이를 가이드한다. 하이브리드 풀을 플레이팅할 때, 계산된 복잡도를 넘어서는 것은 클론 복제본의 반복적인 조사 가능성을 증가시키는 반면, 새로운 고유 클론을 동정할 가능성은 점점 낮아지기 때문에 일반적으로 피한다.
복잡도의 계산은 3가지 측정값과 4가지 가정을 기반으로 한다: 측정값/변수는 다음과 같다: (1) 배양물에 B 세포의 풍부한 입력 수; (2) 6일차 카운트에 기초한 융합전 배양물내 분할; 및 (3) 생성된 하이브리드 풀에서 알려진 부피의 저밀도 플레이팅내 생존 가능한 클론의 수. 가정은 다음과 같다: (1) 벌크 배양에 제출된 모든 농축된 B 세포는 고유한 클론이다; (2) 벌크 배양에 제출된 모든 농축된 B 세포는 6일의 배양 동안 생존한다; (3) 벌크 배양에 제출된 모든 농축된 B 세포는 동일한 속도로 분할한다; 및 (4) 융합된 세포의 50%가 하이브리도마 풀의 동결-해동에서 손실된다.
이들 가정으로부터의 임의의 편차는 복잡도를 감소 또는 증가시킬 수 있는 동결 해동을 제외하고는 하이브리드 풀의 복잡도를 감소시킨다.
하이브리드 풀의 복잡도는 B 세포 배양물에 투입되는 B 세포 수를 초과할 수 없다.
하이브리드 풀의 복잡도 = (동결 전 배양 후 융합 후 생존 가능한 클론)/(융합 후 배양물내 2^분할)
동결 전 융합 및 배양 후 생존 가능한 클론 = (저밀도 시딩에서 생존 가능한 클론의 #/동결 중 50% 손실)/파생물에 대해 평가된 전체 하이브리드 풀의 분획
융합 후 배양물내 분할 = 처음 24시간내에 1회 분할, 이후 16시간마다 1회 분할=1 + (융합후 배양의 #일 -1) * (24/16)
B 세포 배양액내 분할 = LOG(6일째 살아있는 세포/0일째 유입 B 세포)/LOG(2)
B 세포 배양후 클론 복제본 = 배양액내 2^Div
융합 후 클론 복제본 = 배양 6일째의 클론 B 세포 복제본 *% 융합 효율
% 융합 효율 = 복잡도/융합을 위한 6일째 B 세포
융합 후 클론 복제본의 수가 >1인 경우(모든 클론이 두 번 이상 표시됨), 융합 후 배양 후 동결된 클론 복제본에 대한 식은 형제를 고려하여 조정된다.
실시예 2
본 실시예는 본 개시내용의 방법을 사용하여 하이브리도마를 생성하는 또 다른 예를 설명한다.
6마리의 XenoMouse® 동물 (카파 경쇄를 갖는 인간 항체를 생산할 수 있는 4마리의 XenoMouse® G2-K (XMG2-K) 동물; 및 카파 또는 람다 경쇄를 갖는 인간 항체를 생산할 수 있는 2마리의 XenoMouse® G4-KL (XMG4-KL) 동물))의 코호트를 실시예 1의 항원 Z와 다른 항원인 항원 X로 면역화하였다. 동물은 복강내(IP) 투여된 CHO-S 세포에 의해 발현된 항원 X로 초기에 면역화된 다음, 6주 동안 매주 2회 부스팅되었다. 마우스를 2.5개월 동안 휴면시켰다. 최종 부스트를 제공하고, 4일 후 면역화된 마우스로부터 비장과 배액 림프절(LN)을 채취하였다. 실시예 1에서와 같이, 채취된 비장을 함께 풀링하고, SCS로 처리하고, 채취된 배액 LN을 함께 풀링하고 SCS로 처리했다. 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이, 비장으로부터 유래된 하나의 SCS로부터 RBC를 제거한 다음, LN으로부터 유래된 SCS와 조합하여 추가 가공을 위한 풀링된 SCS를 얻었다.
실시예 1에서, 4-단계 B-세포 농축 공정이 기술되어 있으며, 이어서 벌크 배양이 이루어졌다. B-세포 농축 공정의 제1 및 제2 단계는 IgM-양성(IgM+) 세포를 고갈시키는 데 목적이 있었고, 마지막 두 단계는 (항-인간 IgG 항체-표지된 자성 비드를 사용하여 표면 IgG+ 세포의 양성 선택을 통해) 표면 IgG+ 세포에 대한 농축을 목적으로 하였다. B-세포 농축 공정 단계의 중요성과 하이브리도마 생성에 대한 벌크 배양 단계의 중요성을 평가하기 위해, 풀링된 SCS를 5개 그룹(그룹 1~5)으로 나누었으며, 여기서 각 그룹은 고유한 프로토콜에 적용되었으며, IgG+ 농축을 포함하거나 배제시키고 벌크 배양을 포함하거나 배제시킴으로써, 변화되었다. 5개 그룹 각각의 치료에 대한 요약은 표 2에 제공된다.
[표 2]
표 2에 나타낸 바와 같이, 그룹 1 및 2에는 어떠한 벌크 배양도 결여되어 있었다. 그룹 1은 추가로 농축 공정의 어떤 단계도 거치지 않았고 "절단되지 않은" 것으로 간주된 반면, 그룹 2는 실시예 1에 설명된 대로 4단계 농축 과정 중 처음 두 단계만 겪었다. 그룹 3~5는 6일 동안 벌크 배양되었지만, 그룹 5만이 IgM+ 세포 고갈(실시예 1에 기술된 농축 공정의 처음 두 단계에 의해 달성됨) 및 표면 IgG+ 세포 농축(실시예 1에 기술된 농축 공정의 마지막 두 단계에 의해 달성됨)을 모두 포함한 반면, 그룹 3은 IgM+ 세포 고갈 및 표면 IgG+ 세포 농축을 모두 제외하고, 그룹 4는 표면 IgG+ 세포 농축을 제외했다. 그룹 2, 4, 및 5의 IgM+ 세포 고갈은 본질적으로 실시예 1에 기술된 대로 수행되었다. 그룹 5의 표면 IgG+ 세포 농축은 본질적으로 실시예 1에 기술된 대로 수행되었다. 각 그룹 1~5 (벌크-배양전)의 특징 요약은 표 3에 제공된다.
[표 3]
표 3에 나타난 바와 같이, 그룹 2, 4, 및 5 (4-단계 농축 공정의 적어도 일부를 거쳤음)의 경우, 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이다. 또한, 그룹 5 (농축 공정의 모든 단계를 거쳤음)의 경우, 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 더 크며, 이는 IgG+ 세포 수가 IgM+ 세포보다 많았음을 의미한다.
그룹 3~5의 세포를 실시예 1에 본질적으로 기술된 바와 같이 벌크 배양하여, 확장된 집단을 수득하였다. 그룹 1~5의 세포를 세포 융합에 사용하였고, 이는 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 융합 후, 세포를 HA가 포함된 DMEM에서 3일 동안 배양하였다. 융합후, FMAT 형광측정 마이크로볼륨 분석 기술(FMATTM 8100 HTS System)을 사용하여 살아있는 세포를 계수하고, 항원-X-특이적 항체의 분비에 대해 스크리닝하였다.
계수 및 특성화 결과를 표 4에 나타냈다.
[표 4]
표 4에 나타낸 바와 같이, (벌크 배양되지 않은) 그룹 1 및 2는 생성된 하이브리도마 클론의 수가 가장 낮고, 포획된 항원 + 레퍼토리의 %가 가장 낮았으며, 이는 벌크 배양의 중요성을 뒷받침하는 결과이다. 그룹 3~5 (벌크 배양됨) 중에서, % 히트 빈도는 그룹 4 및 5 (벌크 배양 전에 IgM이 고갈됨)에서 가장 높았다. IgM 고갈 및 표면 IgG 농축을 모두 수행하였을때 % 히트 빈도가 거의 두배 증가했다(그룹 4와 그룹 5 비교). 종합하면, 이러한 결과는 세포 융합 전에 B-세포 농축 집단을 벌크 배양하는 것의 이점을 입증하였다. 그룹 5에 의해 포획된 상대% 항원+ 레퍼토리는 31%로 계산되었다(표 4). 일부 B-세포가 정제 중에 필연적으로 손실되고 배 중심의 B-세포에 자매 및 중복 특이성이 포함되어 있다는 점을 감안할 때, 그룹 5에서 포획한 31% 레퍼토리는 우수하며 전체 구획을 나타낼 가능성이 높다. 추가로, (14.9% 히트 빈도에서) 전체 레퍼토리를 조사하는데 109개의 96-웰 플레이트만 필요하므로, 전체 레퍼토리의 조사가 가능하지만, 이는 그룹 3의 방법에는 해당되지 않는다.
실시예 3
본 실시예는 본 개시내용의 방법을 사용하여 하이브리도마를 생성하는 세번째 예를 설명한다.
하이브리도마를 생성하는 본원에 개시된 방법을 사용하여, 고친화도, 항원-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하였다. 본 실시예에서, 항원은 G-단백질 결합 수용체(GPCR)였다. GPCR은 항체를 이용한 표적화에 매우 어려운 치료 관련 표적 부류를 구성한다(Hutchings CJ, Expert Opin.Biol.Ther.2020, vol 20, No.8, 925-935). 이 GPCR에 대한 항체가 이전에 만들어졌지만, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 오솔로그 둘 다와 교차 반응할 수 있는 항체는 없으며, 각 오솔로그에 대해 적어도 1 nM의 친화도도 갖지 못했다. 따라서, 인간 및 사이노몰구스 원숭이 오솔로그 각각에 대해 적어도 1 nM의 항원에 대한 친화도를 나타내는 인간/사이노몰구스 교차반응성 GPCR-특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 생성하는 것이 목표였다.
GPCR DNA 면역화(유전자 총을 통해), GPCR의 세포외 영역에 걸친 펩타이드, GPCR 형질감염된 세포 및 인간 IgG-Fc 부분에 융합된 GPCR의 세포외 도메인을 포함하는 면역화 캠페인 후에 300마리 이상의 Xenomouse 동물(예를 들어, 카파 경쇄를 갖는 인간 항체를 생산할 수 있는 XenoMouse® G2-K (XMG2-K) 동물)을 GPCR 항원으로 면역화하였다. 면역화 후, 각각의 면역화된 동물로부터 혈청을 수집하고 표준 방법(예를 들어, 293T 세포에서 일시적으로 발현되는 GPCR에 대한 FACS 분석에 의한 다클론 항체 결합 평가)을 사용하여 GPCR-특이적 항체 역가에 대해 평가하였다. 항체 역가 분석 결과, 48마리의 동물(면역된 총 수의 15%)이 충분한 수준의 항원-특이적 항체 역가를 나타냈으며, 이는 모의 형질감염된 세포에 대한 GeoMean 신호에 비해 적어도 3배 더 높은, GPCR 형질감염된 세포에 대한 결합 GeoMean 신호에 의해 결정되었다.
본 실시예에서, 이들 48마리 동물 중 1마리의 2차 림프 기관으로부터 생성된 하이브리도마가 설명된다. 간략하게 하면, 마지막 면역화 부스트 4일 후, 동물의 비장 및 배액 LN을 채취하였다. SCS는 비장으로부터 제조되었고, 별도의 SCS는 LN으로부터 제조되었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 비장으로부터 제조된 SCS로부터 RBC를 고갈시킨 다음, RBC-고갈된 SCS를 LN으로부터 제조된 SCS와 조합시켰다. 이 조합된 SCS는 실시예 1에 기재된 4-단계 B-세포 농축 공정 중 처음 두 단계만 수행하였다. IgM+ 세포/비-B 세포 고갈은 살아있는 세포 수를 99.5%까지 감소시켰고, IgM+ B 세포를 99.8%까지 감소시켰다. IgG 대 IgM의 비율은 70배 증가하였다. 농축 집단의 % B220+ 세포는 IgM+ 세포/비-B-세포 고갈 후 46.2%로 증가하였다. 또한, B220+ 세포의 % IgG+ 세포는 IgM+ 세포/비-B-세포 고갈 후 7.5%로 증가하였다. IgM 및 비-B-세포 고갈 후, IgG+ 세포의 적어도 10%가 회수되었다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, 대략 40,000개의 B-세포가 벌크 배양되었으며, 벌크 배양 공정으로 약 11회의 세포 분할이 발생하였다. 벌크 배양 후, 세포를 실시예 1에서와 같이 세포 융합시켰다. B-세포 벌크 배양 및 융합 후, 배양된 B 세포의 약 40%가 불멸화되어 16,000개의 고유한 하이브리드의 복잡도를 갖는 하이브리드 풀을 생성하였다. 융합 후, 세포를 HA와 함께 DMEM에서 배양하여, 융합되지 않은 골수종 세포를 제거했다. 이어서, 하이브리도마 세포는, 관심 있는 GPCR의 특정 영역을 재현하는 가용성 항원 상의 384-웰 플레이트로 분류되거나, 웰당 5개의 하이브리도마 클론으로 96-웰 플레이트에 다클론적으로 플레이팅된 단일 세포였다. 하이브리도마 세포를 배양하여, FACS-기반 스크리닝에서 검출하기에 충분한 항체를 생산했다. GPCR로 일시적으로 형질감염된 293T 세포에 대한 배양 상청액에서의 항체 결합을 결정하거나, GPCR을 내인적으로 발현하는 암 세포주에 결합함으로써, FACS 분석에 의해 스크리닝을 수행하였다. 이는 실시예 1에서 사용된 것과 동일한 절차이다(여기서 GPCR 항원을 발현하는 293T 세포가 사용된 것을 제외함). 인간 및 사이노몰구스 오솔로그에 대한 결합의 특성화도 수행되었다. 최종 선택된 분자의 친화도는 세포상 KinExa에 의해 결정되었다.
수개월 내지 수년에 걸쳐, 항체 역가 분석에 기초하여 선택된 나머지 동물(나머지 47마리의 동물)의 2차 림프 기관을 사용하는 하이브리도마가 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 생성되었다. GPCR-특이적 항체를 생산하는 4000개 초과의 하이브리도마 클론이 면역화된 48개 개체에서 확인되었다. 그러나, 인간과 사이노 GPCR 오솔로그 둘 다에 대해 1 nM 초과의 친화도를 가진 것은 단 한 마리였다. 종합하면, 이들 결과는 본원에 개시된 EHG 방법의 놀라운 심층 레퍼토리 마이닝 능력을 입증한다. 표적 클래스로서 GPCR과 관련된 최고 과제와 인간 및 사이노 오솔로그 모두에 대해 1 nM 미만의 높은 난이도의 친화도 설계 목표를 고려할 때, 이 항체는 매우 드물 것으로 예상하였다. 이 방법을 사용하면 48마리의 항원-반응 동물의 면역 레퍼토리를 조사하고, 4000개 초과의 결합제를 회수하고, 설계 목표를 충족하는 단일 클론을 동정할 수 있다.
본원에서 언급되는 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 본원에 그 전문을 나타냄을 개별적으로 그리고 구체적으로 명시되고 그 전문이 본원에 기재된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명을 기술하는 문맥에서(특히 하기 청구범위의 문맥에서) 단수형 용어 및 유사한 언급의 사용은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 달리 명시되지 않는 한, 확장 가능한 용어(즉, "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미)로 해석되어야 한다.
본원에서 값의 범위의 언급은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 있는 각각의 개별 값 및 각각의 끝점을 개별적으로 지칭하는 약식 방법으로 사용되는 것이며, 각각의 개별 값 및 끝점은 마치 본원에 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다.
본원에 기재된 모든 방법은 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공되는 모든 예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것으로, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 용어도 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최선의 방식을 포함하여 본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 구현예의 변형예는 상기 설명을 접한 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 당업자가 이러한 변형예를 적절히 사용할 것을 예상하며, 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 다르게 실시되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은 관련 법률이 허용하는 바와 같이 여기에 첨부된 청구범위에 언급된 요지의 모든 변형예 및 균등물을 포함한다. 또한, 본원에서 달리 나타내지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 본 발명의 모든 가능한 변형예의 전술한 요소의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.

Claims (50)

  1. 하이브리도마를 생성하는 방법으로서,
    a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서,
    i. 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나,
    ii. 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 0.5 초과, 선택적으로, 1 초과 또는 2 초과인, 단계;
    b. 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계; 및
    c. 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (a) 하나 이상의 비인간 동물(들)을 면역원으로 면역화하는 단계; (b) 선택적으로, 약 3 내지 약 5일 면역화 후 면역화된 비인간 동물(들)로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계; (c) 각 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관으로부터 단일-세포 현탁액(SCS)을 제조하는 단계; 및/또는 (d) 한 마리 초과의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 SCS를 조합시켜 풀링된 SCS를 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    2차 림프 기관으로부터 얻은 세포의 단일-세포 현탁액으로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단이 제조되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 림프 기관은 약 3 내지 약 5일 면역화 후 면역화된 비인간 동물(들)로부터 채취된 2차 림프 기관인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 림프 기관은 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5마리의 면역화된 비인간 동물(들)로부터 채취된 2차 림프 기관인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 림프 기관이 비장 및/또는 림프절인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 림프 기관은 유일하게 선택 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관이며, 선택적으로, 선택 면역화된 비인간 동물은 면역화 후 혈청 항체 역가 수준을 기준으로 선택된, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    비인간 동물은 마우스 또는 랫트인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단은 IgM+ 세포를 제거하고/하거나 IgG+ 세포에 대해 선택함으로써 준비되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단은 IgM+ 세포의 음성 선택 및/또는 IgG+ 세포의 양성 선택에 의해 준비되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    IgM+ B 세포의 90% 초과는 음성 선택 및/또는 양성 선택 시 제거되며, 선택적으로, IgM+ B 세포의 95% 초과는 음성 선택 및/또는 양성 선택 시 제거되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    IgM+ B 세포의 98% 초과는 음성 선택 시 제거되며, 선택적으로, IgM+ B 세포의 99% 초과는 음성 선택 및 양성 선택 시 제거되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    2차 림프 기관으로부터 준비된 단일 세포 현탁액으로부터 비-B 세포, 적혈구(RBC), IgM+ 세포, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계에 의해 농축 집단이 준비되고, 선택적으로, 비-B 세포, RBC, 또는 IgM+ 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하여 비-B 세포, RBC, IgM+ 세포, 또는 이들의 조합을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    세포 표면 마커는 인간 IgM, CD90.2, Ly-6G GR.1, NK-1.1, CD3엡실론, CD4, CD8a, CD11b, 및/또는 TER119인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    항체는 비오틴에 연결되고, 방법은 스트렙타비딘-표지된 비드, 선택적으로, 스트렙타비딘-표지된 자성 비드를 사용하여, 비-B 세포, RBC, 및/또는 IgM+ 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    단일 세포 현탁액에 존재하는 IgM+ 세포의 98% 초과가 제거되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단은 선택적으로, 항-IgG 항체-표지된 비드, 선택적으로, 항-인간 IgG 항체-표지된 자성 비드를 사용하여 표면 IgG+ 세포를 선택함으로써 준비되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    단일 세포 현탁액에 존재하는 IgM+ 세포의 99% 초과가 제거되고/되거나, IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 적어도 약 50배 또는 적어도 약 100배 증가하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    토끼 T-세포 상청액을 포함하는 세포 배양 배지에서 IgG+ 세포의 농축 집단을 항-인간 IgG 항체-표지된 비드 및 피더 세포와 함께 벌크-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    피더 세포는 CD40L을 발현하고/하거나, 감마-조사되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    피더 세포는 감마-조사된, CD40L-양성 EL4B5 피더 세포인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    골수종 세포는 대수기 성장 단계에 있는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    골수종 세포는 P3 골수종 세포인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단을 벌크-배양하는 단계는 mL 당 약 350개의 B220-양성 B 세포 내지 약 700개의 B220-양성 B 세포, 선택적으로, mL 당 약 600개의 B220-양성 세포 내지 mL 당 약 650개의 B220-양성 세포의 시딩 밀도로 개시되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단은 적어도 약 25 mL 및 약 2 L 미만 또는 약 2 L의 부피로 벌크-배양되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    농축 집단은 약 50 mL 내지 약 500 mL, 선택적으로 약 100 mL 내지 약 300 mL의 부피로 벌크-배양되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 또는 적어도 약 6일 동안 농축 집단을 벌크-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    적어도 약 5일 동안 농축 집단을 벌크-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    약 6일 동안 농축 집단을 벌크-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    농축 집단 세포는 적어도 약 6회 또는 적어도 약 7회의 세포 분할을 거쳐, 확장된 집단을 생성하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장된 집단의 모든 B 세포는 골수종 세포와의 융합을 위해 사용되고/되거나 확장된 집단의 모든 세포가 골수종 세포와 결합되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    B 세포는 항원에 결합하는 항체의 생산에 기초하여 골수종 세포와 융합하기 위해 선택되지 않고/않거나, 농축 집단 또는 확장된 집단의 B 세포는 항원에 결합하는 항체의 생산에 대해 스크리닝되지 않는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    확장된 집단의 세포는 전기세포 융합(ECF)에 의해 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 수득하고, 선택적으로, 확장된 집단의 세포가 융합 이벤트 당 10 mL보다 큰 부피로 골수종 세포와 융합되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    하이브리도마 및 임의의 융합되지 않은 세포를 선택 배지로 옮기는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로, 선택 배지는 하이포크산틴 아자세린(HA)을 포함하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    냉동 조건 하에 하이브리도마를 저장하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원에 결합하는 항체의 생산에 대해 하이브리도마를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    멀티플레이트 웰에서 하이브리도마를 배양하는 단계 및 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    스크리닝은 항원에 대한 항체의 결합을 검출하는 면역분석을 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    면역분석법은 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-특이적 항체를 생산하는 세포에 대한 스크리닝은 하이브리도마가 얻어지기 전이 아닌, 하이브리도마가 얻어진 후에만 일어나는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-특이적 항체에 대한 스크리닝은 2차 림프 기관이 채취되기 전 및 하이브리도마가 얻어진 후에만 일어나는, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    2차 림프 기관이 채취되기 전에 발생하는 항원-특이적 항체에 대한 스크리닝은 면역화된 살아있는 동물로부터 얻은 혈청의 역가 분석을 포함하는, 방법.
  43. 항원-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하는 방법으로서,
    a. 하나 이상의 비인간 동물(들)을 면역원으로 면역화하는 단계;
    b. 면역화된 비인간 동물(들)로부터 2차 림프 기관을 채취하는 단계;
    c. 각 면역화된 비인간 동물로부터 채취된 2차 림프 기관으로부터 단일-세포 현탁액(SCS)을 제조하는 단계;
    d. (c)에서 제조된 모든 SCS를 조합하여 풀링된 SCS를 제조하는 단계;
    e. 풀링된 SCS로부터 95% 초과의 IgM+ 세포를 제거하고/하거나, 풀링된 SCS로부터 표면 IgG+ 세포를 양성으로 선택하여 IgG-양성(IgG+) 기억 B 세포의 농축 집단을 얻는 단계로서,
    i. 농축 집단의 약 10% 미만 또는 약 10%가 IgM-양성(IgM+) B 세포이고/이거나,
    ii. 농축 집단의 IgM+ B 세포 수에 대한 IgG+ 기억 B 세포 수의 비율이 0.5 초과, 선택적으로, 1 초과 또는 2 초과인, 단계,
    f. 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계;
    g. 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계; 및
    h. 각각의 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하고 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여, 항원-특이적 항체를 생산하는 하이브리도마를 동정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  44. 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마에 대해 스크리닝하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 따라 하이브리도마를 생성하는 단계;
    b. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
    c. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  45. 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마에 대해 스크리닝하는 방법으로서,
    a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계로서, 농축 집단의 세포의 약 5% 미만이 IgM+ B 세포인, 단계;
    b. 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계;
    c. 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계;
    d. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계; 및
    e. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  46. 항원-특이적 항체를 생산하는 방법으로서,
    a. 하나 이상의 면역화된 비인간 동물의 2차 림프 기관으로부터 얻은 세포로부터 IgG+ 기억 B 세포의 농축 집단을 제조하는 단계;
    b. 농축 집단을 벌크-배양하여 확장된 집단을 얻는 단계;
    c. 확장된 집단의 세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 얻는 단계;
    d. 개별 웰에서 단일 하이브리도마를 배양하는 단계;
    e. 항원-특이적 항체에 대해 각 웰의 상청액을 스크리닝하여, 항원-특이적 항체를 발현하는 하이브리도마를 동정하는 단계; 및
    f. (e)에서 동정된 하이브리도마의 배양을 확장시켜 항원-특이적 항체를 생성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 15%를 나타내는, 방법.
  48. 제44항에 있어서,
    얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 10%, 선택적으로, 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 15%를 나타내는, 방법.
  49. 제48항에 있어서,
    얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 20%를 나타내는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    얻어진 하이브리도마는 면역화된 동물에 의해 생산된 IgG+ 기억 B 세포 레퍼토리의 적어도 25%를 나타내는, 방법.
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