KR20200060591A

KR20200060591A - Ｈｌａ 분자에 제한적인 항원 특이 ｔ 세포 반응 측정 및 예측 방법

Info

Publication number: KR20200060591A
Application number: KR1020180144638A
Authority: KR
Inventors: 김태규; 손현정; 현승주
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-06-01
Also published as: KR102251584B1

Abstract

본 발명은 HLA 분자에 제한적인 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측 방법에 관한 것으로, 특정 항원과 공여자에 존재하는 각 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 모두 발현하는 인공항원제시세포를 사용하여 특정 클래스 I 또는 II 대립유전자가 특정 항원에 대한 CD8+T 세포 면역 반응 또는 CD4+T 세포 반응에 우선적으로 사용되며 클래스 I 또는 II 대립유전자 사이의 계층 구조가 개인에게 존재함을 확인함으로써 알려진 HLA 유전자형을 가진 개체에서 T 세포 반응을 예측할 수 있으며 부분적으로 일치하는 수혜자를 위한 백신 개발 및 제3자 CTL 치료에 유용한 정보를 제공할 수 있다.

Description

ＨＬＡ 분자에 제한적인 항원 특이 Ｔ 세포 반응 측정 및 예측 방법{Method for measuring and predicting antigen-specific T cell response restricted by HLA molecules}

본 발명은 HLA 분자에 제한적인 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측 방법에 관한 것이다.

사이토메갈로바이러스(CMV)에 감염된 인구의 비율은 인구 집단의 사회 경제적 지위에 달려 있다. 선진국에서는 CMV의 유병율이 60-70%인 반면 신흥 국가에서는 거의 100%이다. 초기 소아기에서 자주 발생하는 1차 감염 후 CMV는 여러 수준에서 숙주 면역 반응을 방해하는 수많은 바이러스 회피 전략으로 인해 면역계의 통제하에 평생 잠복기를 구축한다. 인간 백혈구 항원(HLA)에 제한된 세포 독성 T 림프구(CTL)는 초기 면역 반응에 관여하며 CMV 감염에서 중요한 방어 기작이다. 동종 이형성 T 세포 결핍 줄기세포 이식 후 CMV-seropositive 환자의 이식 관련 이환율과 사망률은 CMV 질환의 매우 효과적인 예방에도 불구하고 증가하고 있다. CMV는 신생아에서 심한 질병을 일으킬 수 있는 선천적으로 전염되는 바이러스 중 하나이다. 면역 손상된 숙주에서의 CMV 질환으로부터의 보호는 숙주 바이러스-특이 CD8+T 세포 반응의 회복과 관련이 있다. 방어 면역은 공여자에서 유래한 CMV-특이 CD8+ CTL 클론을 주입함으로써 성공적으로 전이될 수 있다. 면역 억제 우울증 환자에서 이환율의 주요 원인인 인간 CMV에 대한 T 세포 반응의 클론 다양성 평가는 T 세포 면역 치료의 분자적 기초에 대한 중요한 통찰력을 제공하며 CMV 감염의 면역 모니터링 및 면역 요법에 임상적 의미를 갖는다.

CMV에서 유래된 CTL 에피토프의 동정은 적응 면역 요법(Adaptive immunotherapy)에서의 가능한 적용을 위해 항바이러스성 면역 및 항바이러스성 CTL의 생체외 생성에 대한 모니터링에 유용하다. CMV 감염에 내내 풍부한 구조 단백질인 하부 기질 단백질 65(pp65)는 CMV 연구의 중요한 대상이다. CMV에 대한 CD8+T 세포 반응의 면역-우세의 표적으로 널리 받아들여지고 있다. pp65 특이 CTL의 미세 특이성을 분석한 결과 일부 공여자는 단일 펩티드만을 인식하는 반면, 다른 공여자는 pp65 유전자 산물 전체에 걸쳐 여러 펩타이드를 인식하는 것으로 나타났다. 그러나 이전에 확인된 pp65 단백질에서 유래된 CTL 에피토프는 HLA-B*07과 같이 전통적으로 잘 연구된 HLA 클래스 I 대립유전자로 제한되었다. 따라서 드물게 관찰된 대립유전자에 제시된 에피토프는 상대적으로 거의 알려지지 않았다.

HLA 영역 내의 높은 수준의 다형성은 T 세포에 의해 매개되는 병원균에 대한 숙주 방어에 이점을 제공할 수 있다. HLA 대립유전자에 의해 제시된 에피토프 중에서 면역력이 있는 것으로 알려진 특정 펩타이드가 다른 것보다 더 빈번히 인식되며, 이는 크기, 친화성 및 면역원성이 다른 펩타이드 결합 레파토리와 관련이 있다고 제안된다. HLA 대립유전자에 따른 면역우세성(immunodominance)은 시험 대상자 중 가장 빈번하게 검출 가능한 반응 또는 단일 개체 내에서 가장 강한 반응을 기술하기 위해 다양하게 사용된다. 면역 요법에 영향을 미치는 인자가 연구되었지만, CMV에 대한 HLA 대립유전자의 면역우세성은 아직 밝혀지지 않았다.

인간에서 CMV 특이 CD8+T 세포 집단은 주요 조직 적합성 복합체 I 형 4량체 및 ELISPOT(interferon-γ(IFN-γ)-based enzyme-linked immunospot) 분석법과 같은 생체외 도구를 사용하여 연구되었다. 상이한 HLA 대립유전자상에 존재하는 다수의 에피토프에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 검출하는 개선된 효율 및 실행 가능성을 갖는 새로운 전략이 필요하다. pp65로 형질전환된 CD40-활성화 B 세포를 사용하는 ELISPOT은 다양한 HLA 대립유전자에 의해 제시된 CTL 에피토프를 확인하는데 사용되었다. Epstein-Barr 바이러스(EBV) 특이 CD8+T 세포 반응은 EBV 잠재성 막 단백질 1과 잠재성 막 단백질 2A mRNA로 형질감염된 자가 수지상세포를 사용하여 평가할 수 있다.

단일 HLA 클래스 I 대립유전자에 의해 제한된 CMV pp65 항원에 대한 CD8+T 세포 반응을 종합적으로 분석하기 위해, 본 발명자들은 pp65 항원과 공여자에 존재하는 각 HLA 클래스 I 대립유전자를 모두 발현하는 인공항원제시세포(aAPC)를 사용하여 ELISPOT 분석을 실시한 결과, 각 HLA 대립유전자에 대해 CD8+T 세포 반응이 달랐고, 특정 HLA 대립유전자는 개인의 다른 HLA 대립유전자와 비교하여 우세한 반응을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. Chiu YL et al. Sci Rep (2016) 6:1 2. Quinnan GV Jr et alRev Infect Dis (1984) 6(2):156-63 3. Heine A et al. Mol Ther (2006) 13(2):280-8 4. Li CR, et al. Blood (1994) 83(7):1971-9 5. Kondo E et al.Blood (2004) 103(2):630-8 6. Wills MR et al. J Virol (1996) 70(11):7569-79 7. Lacey SF et al. Hum Immunol (2003) 64(4):440-52 8. Yewdell JW et al. Annu Rev Immunol (1999) 17(1):51-88 9. Sohn DH et al. PLoS One (2015) 10(5):e0127899

본 발명의 목적은 단일 클래스 I 또는 II 대립유전자에 의해 제한된 외래 항원에 대한 항원 특이 T 세포 반응을 분석하여 알려진 HLA 유전자형을 가진 대상체에서 T 세포 반응을 예측하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 외래 항원과 공여자에 존재하는 각 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하는 인공항원제시세포를 사용하여 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 측정 및 예측하는 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단일 또는 복수의 HLA(human leukocyte antigen) 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell)를 제조하는 단계;

상기 인공항원제시세포를 사용하여 외래 항원에 대한 클래스 I 또는 II 대립유전자의 항원 특이 T 세포 반응을 측정하여 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 분석하는 단계;

외래 항원별로 상기 제1단계 및 제2단계를 반복 수행하여 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 제작하는 단계; 및

상기 플랫폼에 수집된 특정 외래 항원에 대한 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 참고하여 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형이 알려진 대상체의 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 단계를 포함하는 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 단일 또는 복수의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포; 및

외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 포함하는 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트를 제공한다.

본 발명은 CMV pp65 항원과 공여자에 존재하는 각 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 모두 발현하는 인공항원제시세포를 사용하여 특정 클래스 I 또는 II 대립유전자가 pp65에 대한 CD8+T 또는 CD4+T 세포 면역 반응에 우선적으로 사용되며 클래스 I 또는 II 대립유전자 사이의 계층 구조가 개인에게 존재함을 확인함으로써 알려진 HLA 유전자형을 가진 개체에서 T 세포 반응을 예측할 수 있으며 부분적으로 일치하는 수혜자를 위한 백신 개발 및 제3자 CTL 치료에 유용한 정보를 제공한다.

도 1은 GFP 및 GFP-pp65 간의 면역 반응의 차이를 도시한 것이다.
도 2는 단일 HLA 클래스 I 대립유전자에 의해 제한된 CMV pp65-특이 CD8+T 세포 반응을 검출하기 위한 인공항원제시세포(aAPC) 시스템의 확립을 도시한 것으로, (A)는 CD83, 4-1BBL 및 CD80을 발현하는 aAPC 및 K562 세포주에서 CMV pp65를 발현하는 aAPC-pp65를 플로우 사이토메트리에 의해 평가한 결과이고, (B)는 CD8+T 세포 반응을 검출하기 위한 HLA 클래스 I 유전자 형질감염의 최적화 조건을 나타낸 것이며, (C)는 CD8+T 세포 자극에서 4 ㎍의 플라스미드 DNA의 일시적인 형질감염(T) 및 HLA-A*02:01의 렌티 바이러스 벡터(S)를 이용한 안정한 발현의 비교 결과를 나타낸 것이다. 상기 결과는 SD(막대)를 사용한 3번의 독립적인 실험에서 얻은 발현의 평균 백분율을 나타낸다. P 값은 1-way ANOVA(* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001; N.S., 유의하지 않음)로 계산하였다.
도 3은 32개의 HLA 클래스 I 대립유전자(7개의 HLA-A, 14개의 HLA-B 및 11개의 HLA-C)에 따른 대표적인 발현 수준을 나타낸 것으로, 발현 수준은 aAPC-pp65(■)에 HLA 대립유전자(▒)을 3일간 형질 도입한 후 측정한 것이다.
도 4는 ELISPOT에 의한 개인의 6가지 HLA 클래스 I 대립유전자 각각에 의해 제시되는 CMV pp65 항원 특이 CD8+T 세포 반응의 동시 측정 결과를 나타낸 것으로, (A)는 대표적인 ELISPOT 분석 결과이고, (B)는 HD30 공여자에서 특정 HLA 대립유전자(HLA-A*24:02 및 -B*15:01)을 발현하는 aAPC에서의 비특이적 반응을 보여주는 대표적인 사례를 나타낸 것이다.
도 5는 pp65 없는 HLA-특이 CD8+T 세포 반응을 도시한 것이다.
도 6은 개별 HLA 클래스 I 유전자좌 및 대립유전자에 따른 CMV pp65 특이 CD8+T 세포 분포, 즉, 건강한 한국인 공여자(n=50)에서 전체 HLA 클래스 I, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자좌에 의해 제한된 pp65-특이 CD8+T 세포 반응의 분포(A) 및 HLA-A(B), HLA-B(C) 및 HLA-C(C) 유전자좌의 각 대립유전자에 의한 것들의 분포를 나타낸 것이다. IFN-γ ELISPOT 분석에 의한 CD8+T 세포의 빈도(상단); HLA 클래스 I 및 HLA-A, -B 또는 -C 유전자좌에 의한 CD8+T 세포 빈도는 개체에 존재하는 6개의 대립유전자에 의한 것 및 각각의 유전자좌에 존재하는 2개의 대립유전자에 의한 것의 합이다; CD8+T 세포 반응의 강도에 따른 공여자의 상대적인 비율(하단). 하단 도면의 괄호는 공여자의 수를 나타낸다. P 값은 one-way ANOVA(* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001)에 의해 계산되었다. 수평 막대는 평균 및 수직 막대는 SD를 나타낸다. 음수는 대수 Y 축에 표시할 수 없으므로 0 또는 음수 값 및 일부 아래쪽 세로 막대는 표시되지 않는다.
도 7은 한국인에서 알려진 HLA 클래스 I 대립유전자의 빈도와 각 HLA 대립유전자에서 양성 pp65 특이 CD8+T 세포 반응을 나타내는 비율의 상관관계 분석 결과이다. 이 실험에 포함된 50명의 공여자들(표 1)에서 HLA 클래스 I(7 HLA-A, 14 HLA-B 및 11 HLA-C)의 총 32개의 대립유전자가 발견되었고, 특정 대립유전자를 가진 공여자에서 양성 CD8+T 세포 반응을 나타내는 비율이 도 3에 제시되며, 한국인의 HLA 대립유전자 빈도가 인용되었다(Hwang SH 등, Korean J Lab Med (2004) 24(6):396-404). P 및 R 값은 Pearson 상관 분석에 의해 계산된다.
도 8은 HLA 클래스 I 대립유전자의 개체 내 우세 및 각 HLA 클래스 I 대립유전자의 개체 내 우세 확률에 따른 CD8+T 세포 반응의 분포를 나타낸 것으로, (A)에서 50명의 공여자의 개인별 우세 패턴은 X축 상에서 개인에서 5×10⁵ CD8+T 세포 당 100개 이상의 IFN-γ 양성 스팟을 나타내는 대립유전자의 수에 의해 4 그룹으로 분류될 수 있고, y축은 ELISPOT에 의한 pp65 항원 특이 CD8+T 세포의 빈도, z축은 HLA 클래스 I 대립유전자다. (B)는 ELISPOT으로 각 개인의 HLA 클래스 I 대립유전자에 의한 CD8+T 세포 반응을 측정한 결과를 나타낸 것이고, 제1, 제2, 제3 및 제4 개인별 우세가 가장 높은 반응의 순서로 정의되었다. 50명의 공여자의 CD8+T 세포 분포의 분포를 개인별 우세에 따라 분석하였다. (C)는 각 HLA 클래스 I에서의 개체 내 우세 확률을 나타낸 것으로, IFN-γ가 5×10⁵ CD8+T 세포 당 100개 이상의 양성 스팟을 나타내는 50명의 공여자에서 정의되었다. P 값은 one-way ANOVA(* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001)에 의해 계산되었다. 수평 막대는 평균 및 수직 막대는 SD를 나타낸다. 음수는 대수 Y축에 표시할 수 없으므로 0 또는 음수 값 및 일부 아래쪽 세로 막대는 표시되지 않는다.
도 9는 각 HLA 클래스 I 대립유전자에서 pp65 특이 CD8+T 세포 반응의 데이터베이스에 기초한 특정 개인에서 pp65 특이 CD8+T 세포 반응의 예측 결과이다. 50명의 건강한 공여자로부터 얻은 각 HLA 클래스 I 대립유전자의 pp65 특이 CD8+T 세포의 평균 빈도에 기초하여, 개체에 존재하는 각 HLA 클래스 I 대립유전자의 CD8+T 세포 반응의 합은 예측된 CD8+T 세포 반응으로 계산되고, 이는 관찰된 CD8+T 세포 반응과 비교되었다. 예측된 CD8+T 세포 반응은 반응이 600 미만일 때 가장 유의했다. P 및 R 값은 Pearson 상관 분석에 의해 계산되었다.

본 발명자들은 개인의 클래스 I 또는 II 대립유전자가 인간 바이러스 특이 CTL 반응에서 우선적으로 또는 동등하게 사용되는지를 측정하기 위해, K652 기반 aAPC를 사용하여 다양한 HLA 대립유전자에 본질적으로 pp65 펩타이드를 제시함으로써 CD8+T 세포 반응을 측정하기 위한 플랫폼을 확립하였다(도 1). 50명의 건강한 한국인 공여자에서 관찰된 32개의 HLA 클래스 I 대립유전자(HLA-A 7개, HLA-B 14개 및 HLA-C 11개)의 범위는 10,000명 이상의 공여자의 실험실 자료에서 HLA-A 유전자좌의 경우 85.82%, HLA-B 유전자좌의 경우 75.69% 한국인의 HLA-C 유전자좌의 경우 83.04%로 분석되었다. pp65 특이 CD8+T 세포의 평균 빈도는 0.11%였다. 건강한 CMV-seropositive 개체의 CTL 빈도는 모든 CD8+T 세포의 약 0.1 ~ 3.3%였다. HLA-A, -B 및 -C 대립유전자의 상대 기여도를 평가할 때, HLA-C 대립유전자의 pp65에 대한 면역 반응은 HLA-A 및 -B 유전자좌의 응답보다 낮았다(도 3A). 그러나, HLA-A와 -B 사이의 차이는 없었다. HLA-A*02:01, -B*07:02 및 -C*08:01은 각 유전자좌에서 pp65에 대해 가장 큰 크기 및 빈도로 면역 반응을 보이나(도 3B-D), HLA-A*02:07, -B*59:01, -B*58:01, -B*15:11, -C*03:02 및 -C*02:02는 pp65에 대해 면역 반응을 나타내지 않았다.

한 개인이 6가지의 HLA 대립유전자를 가지고 있지만, 모든 공여자의 46%는 1개의 우세 대립유전자를 가지고 있으며, 24%는 2개의 우세 대립유전자가 있었고, 2%는 CD65+ T 세포를 활성화하기 위해 pp65를 제시하는 3개의 우세 대립유전자가 있었다(도 5A). 또한, 한 개인에서 다중 면역우세 대립유전자가 존재함에도 불구하고 1개 또는 2개의 대립유전자가 면역우세를 나타냈다. HLA-B*07에 의한 제한된 CMV-특이 세포 면역 반응은 면역력이 있는 개체와 면역계가 손상된 개체 둘 다에서 HLA-A*02에 의해 제한되는 것들을 압도한다. 공여자 HD10과 HD16에서도 유사한 결과가 관찰된다. HD10은 HLA-B*07:02에 대해서만 면역 반응을 보였으나, HD16은 HLA-B*07:02에서 HLA-A*02:01보다 5.24배 높은 면역 반응을 보인다. HLA-B*15:01은 HLA-A*02:01이 존재할 때 우세한 반응을 나타내지 않았다. 특정 HLA 대립유전자는 일차 감염시 전체 바이러스 특이 CD8+T 세포 반응에 지속적으로 기여했으며, 면역력과 일치하는 동일한 개체에서 동시 발현될 경우 다른 대립유전자에 의해 제한되는 반응의 절대 크기를 감소시켰다.

흥미롭게도 HLA-A 대립유전자의 빈도는 특정 대립유전자의 양성과 유의한 상관관계가 있었다(도 4). HLA 대립유전자에 따른 우세의 존재를 보여주는 본 발명의 기본 데이터에 기초하여, 공여자 HLA 대립유전자에 따라 pp65에 대한 면역 반응을 예측하였다. 그 결과, HLA-A*02:01 및/또는 -B*07:02와 같이 하나 이상의 우세 대립유전자를 가진 공여자에서 pp65에 대한 낮은 응답은 가장 높은 예측 반응을 보였으나 예측된 응답의 광범위한 분포 때문에 예측력이 감소하였다. 그러나 HLA-A*02:07, -B*59:01, -B*58:01, -B*15:11, -C*03:02 및/또는 -C*02:02는 예측된 응답의 분포가 좁기 때문에 더욱 정확한 예측을 나타낸다. 결과적으로, 총 600 카운트 미만인 피험자에서 더 많은 유의성이 얻어졌다(도 6). 따라서 본 결과는 CMV에 대한 T 세포 반응의 직접 측정뿐만 아니라 HLA 대립유전자가 CMV에 대한 면역 반응을 예측하는 데 도움이 될 수 있음을 시사한다.

결론적으로 상기 결과는 특정 HLA 클래스 I 대립유전자가 pp65에 대한 CD8+T 세포 면역 반응에 우선적으로 사용되며 HLA 클래스 I 대립유전자 사이의 계층 구조가 개인에게 존재함을 보여준다. 이러한 면역 증진은 CMV 감염과 HLA 다양성 간의 공-진화에 대한 이해를 향상시킨다. 단일 HLA 대립유전자에 의해 제한된 면역 반응을 측정하는 본 발명자들의 전략은 알려진 HLA 유전자형을 가진 개체에서 T 세포 반응성을 예측할 수 있으며 부분적으로 일치하는 수혜자를 위한 백신 개발 및 제3자 CTL 치료에 유용한 정보를 제공한다.

따라서, 본 발명은 단일 또는 복수의 HLA(human leukocyte antigen) 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell)를 제조하는 단계;

본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법은 자기조직 유래의 항원제시세포의 기능을 수행하면서, 항원 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있도록 제작된 인공항원제시세포를 사용하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법의 제1단계는 단일 또는 복수의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포를 제조하는 것이다.

본 명세서에서, 용어 "인공항원제시세포(artificial antigen presenting cell, 또는 aAPC)"는 인공적으로 제작된 항원제시세포를 의미하며, 면역분자를 발현하도록 개질된 비면역세포이다. MHC 클래스 I (MHC I) 또는 II (MHC II) 분자를 단독으로 또는 다른 부속분자(보조자극분자 및/또는 접착 분자)와 함께 발현하는 aAPC는 생체 내에서 종양세포 또는 섬유아세포 세포주와 같은 쉽게 배양될 수 있는 T 세포 활성화 세포의 다양한 측면을 연구하는데 사용된다. 본 발명의 목적상, HLA 클래스 I 또는 II 분자를 발현하지 않는 세포에 HLA 클래스 I 또는 II 분자를 코딩하는 핵산이 주입된 세포를 의미한다. 바람직하게는, HLA-null 타입 세포에 단일 또는 복수의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 코딩하는 유전자를 형질 도입하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 인공항원제시세포는 보조자극분자군을 추가로 발현할 수 있다. 이를 위해, CD83, 4-1BBL 및 CD80을 포함하는 보조자극분자군을 코딩하는 핵산이 추가로 주입될 수 있다. 상기 HLA-null 타입 세포는 K562-기반 세포주 또는 HLA-null 293T 세포주를 포함할 수 있다. 상기 HLA-null 293 T 세포주는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLA-A, -B, 및 -C 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLA-A, -B 또는 C 유전자가 유전체 상에서 제거된 HLA 결핍 293T 세포주이다. 상기에서 확립된 HLA 결핍 293T 세포주는 공지의 형질전환 기술을 이용하여 T 세포를 자극할 수 있는 인공항원제시세포의 기반 세포로 사용될 수 있는 것이다.

용어, "보조자극분자(costimulatory molecule)"는 항원제시세포의 표면에 발현된 수용체-리간드 쌍과 T 세포 간의 상호작용에 참여하는 물질로, 사이토카인 유전자 발현과 증식 유도를 위해서는 휴지기 T 세포에 2 이상의 신호가 필요하며, 한 가지 신호는 특이성을 부여하는 신호로 MHC/펩타이드 복합체와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의해 생성되며, 두 번째 신호는 항원 비특이적이고, "보조자극성" 신호라 한다. 이 신호는 대식세포 및 수지상세포 등 골수 유래 보조 세포에 의해 제공되는 활성으로 알려져 있다. 보조자극분자는 정상적인 생리 조건하에서 필요한 보조자극 신호를 매개하여 CD8+T 세포의 완전한 활성화를 수행한다. 본 발명에서는 이러한 보조자극분자로 CD83, 4-1BBL 및 CD80의 조합을 사용한다.

형질 도입은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 클래스 I 또는 II 대립유전자 및 보조자극분자를 코딩하는 핵산은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일가닥(ss) DNA, 이중가닥(ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다. 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.

바람직하게는, 상기 HLA는 사람 유래의 핵산 서열일 수 있다.

상기 CD83, 4-1BBL 및 CD80은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 클래스 I 또는 II 대립유전자 및 보조자극분자를 코딩하는 핵산으로 DNA를 선택하는 경우 발현 벡터에 삽입된 형태로 사용할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

본 명세서에서, "인공항원제시세포를 외래 항원으로 감작(感作)시킨다"는 것은, 인공항원제시세포를 외래 항원과 반응시키는 것을 말하며, 바람직하게는, 상기 외래 항원을 인공항원제시세포의 표면상에 직접적, 또는 간접적으로 제시시키는 것을 말한다. 본 명세서에서, "외래 항원"은 세포 자체가 보유하지 않은 항원으로, 이러한 항원을 세포 내로 전달 내지는 접촉을 통해 감작될 수 있다. 상기 전달은 펄스(pulse) 에너지에 의한 전기천공, 트랜스펙션 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 접촉은 항원과 인공항원제시세포를 일정시간 배양하는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항원"은 당업계에서 잘 공지되어 있으며, 항체에 결합할 수 있는 모든 분자뿐만 아니라 에피토프, MHC 분자에 결합할 수 있는 항원의 펩타이드 단편, 및 면역원을 포함한다. 본 발명에서는 항원으로 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체(정상 또는 질환성), 바이오신약, 또는 변종 항원 등을 사용하나, 이에 제한하는 것은 아니다.

상기 종양 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen, TAA)으로 종양과 관련 있는 항원을 의미한다. 잘 알려진 TAA의 예로 오브알부민(Ovalalbumin), 서바이빈(survivin), gp75, gp1OO, MDM2, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, 티로시나제, 텔로머라제, her-2/neu, α-1 페토단백질(fetoprotein), G250, NY-ESO-1 등을 포함한다. MHC 분자에 결합하는 TAA의 일부 펩타이드 단편의 서열은 Ova₂₅₇(SIINFEKL), tyrosinase-related protein 1₄₅₅(Trp1₄₅₅; TAPDNLGYA), Trp2₁₈₀(SVYDFFVWL), 및 gp100₂₅(gp100₂₅; EGSRNQDWL), MAGE 1 노나펩타이드(EADPTGHSY), MART-APL 펩타이드(LAGIGILTV), 천연 펩타이드(AAGIGILTV) 또는 PSA-1 펩타이드(FLTPKKLQCV)등을 포함한다. 추가적인 종양 관련 펩타이드 및 항원의 서열은 당업자들에게 공지되어 있다.

상기 종양 항원과 관련된 종양의 예로, 고형암, 액형 종양(liquid tumor), 혈액 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 고환암, 방광암, 난소암, 경부암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경모세포종(neuroblastoma), 신경교모세포종(glioblastoma), 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간암, 선암, 육종, 악성 종양(carcinoma), 모세포종(blastoma) 등이 있다.

상기 병원체 항원은 질환을 초래하는 유기체 또는 바이러스뿐만 아니라 이들의 약독화된 유도체를 의미한다. 용어 병원체는 질환의 발생에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체, 및 그의 약독화된 유도체를 의미한다. 이러한 병원체로는 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 바이러스 병원체, 예컨대 헬리코박터, 예컨대 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 균(Salmonella sp.), 시겔라 균(Shigella sp.), 엔터로박터 균(Enterobacter sp.), 캄필로박터 균(Campylobacter sp.), 다양한 마이코박테리아, 예컨대 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 균(Brucella sp.), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스 균(Staphylococcus sp.), 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 균(Streptococcus sp.), 클로스트리디움 균(Clostridum sp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 플라스모디움 균(Plasmodium sp.), 레쉬마니아 균(Leishmania sp.), 트리파노조마 균(Trypanosoma sp.), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), C형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 CMV-pp65, Epstein-Barr 바이러스(EBV) 또는 EBV-LMP1 또는 EBV-LMP2a, HTLV, 헤르페스 바이러스(예, 1형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 2형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 코로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 또는 루벨라 바이러스 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

상기 자가-항체는 항핵항체, 항γ글로불린 항체, 자기혈구성분에 대한 항체 또는 자기장기에 대한 항체 등이 있으나 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 항원에 감작된 인공항원제시세포는 항원 특이적인 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포의 증식을 유도할 수 있다. 본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법은 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 CD8+T 세포 반응 또는 CD4+T 세포 반응일 수 있다.

본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법에서 제2단계 및 제3단계는 상기 인공항원제시세포를 사용하여 외래 항원에 대한 클래스 I 또는 II 대립유전자의 항원 특이 T 세포 반응을 측정하여 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 분석하고, 외래 항원별로 상기 제1단계 및 제2단계를 반복 수행하여 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 제작하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, CMV pp65 항원과 공여자에 존재하는 각 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 모두 발현하는 인공항원제시세포를 사용하여 특정 클래스 I 또는 II 대립유전자가 pp65에 대한 CD8+T 세포 면역 반응 또는 CD4+T 세포 반응에 사용되며 클래스 I 또는 II 대립유전자 사이의 계층 구조가 개인에게 존재하였다.

따라서, 외래 항원 별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석하고, 이들 결과를 수집하여 외래 항원 별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자의 플랫폼을 제작할 수 있다.

본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법 또는 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 방법에서 제4단계는 상기 플랫폼에 수집된 특정 외래 항원에 대한 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 참고하여 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형이 알려진 대상체의 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 것이다.

상기 예측은 대상체의 외래 항원에 대한 비반응성을 예측하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법은 부분적으로 일치하는 공여자-수혜자를 위한 백신 제조 시 어떤 종류의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 갖는 대상체가 면역 반응에 유리한지에 대한 정보를 제공하거나, 제3자 간 입양면역치료를 위한 정보를 제공하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 단일 또는 복수의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포; 및 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 포함하는 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 대상체의 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 CD8+T 세포 반응 또는 CD4+T 세포 반응을 측정하고, 대상체의 항원 특이 T 세포 반응 측정치와 상기 플랫폼의 예측치를 비교하여 백신 제조 시 우세한 면역 반응 또는 비반응성 면역 반응을 예측하기 위한 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 키트는 대상체 시료로부터 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형을 분석하고, 시료의 CD8+T 세포 또는 CD4+T 세포와 인공항원제시세포를 반응시켜 항원 특이 T 세포 반응을 측정하고, 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 참고하여 대상체의 항원 특이 T 세포 반응 측정치와 플랫폼의 예측치를 비교하여 백신 제조 시 우세한 면역 반응 또는 비반응성 면역 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

상기 시료는 림프구가 포함되어 있을 가능성이 있으면 어느 것이어도 되고, 예를 들면 혈액 등의 대상 유래 시료, 세포 배양액 등을 들 수 있다.

항원 특이 T 세포 반응은 FACS, MACS 등 당업자에게 이미 알려진 방법을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 인공항원제시세포 및 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼에 관한 설명은 상술한 바와 같다.

본 발명의 키트는, 상기 인공항원제시세포 이외에, 예를 들면 혈액, 특히, 말초혈단핵구의 취득 수단, 보조제, 반응 용기 등을 포함하고 있을 수 있다. 일반적으로는, 키트에는 취급 설명서를 첨부한다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 인공항원제시세포의 제조 및 이를 이용한 항원 특이 T 세포 반응 측정과 면역우세성 평가

(공여자 및 세포)

인간 재료의 사용은 가톨릭대학교의 기관 검토위원회 (MC16SNSI0001)에 의해 검토되고 승인되었다. 정보 제공 동의는 가톨릭대학교(Katholic University of Korea)에 따라 이루어졌다. 이 연구에 참여한 모든 참가자로부터 서면 동의를 얻었다. Ficoll-Hypaque (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 50명의 건강한 한국인 공여자로부터 말초혈액단핵구를 채취했다. 참가자의 평균 연령은 29.56±3.83세였고 5명의 여성과 45명의 남성으로 구성되었다. 자성 마이크로 비드(MACS, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 CD8+T 세포를 양성으로 단리하고 사용하기 전까지 냉동 보존하였다. HLA 타이핑은 가톨릭 조혈 줄기세포은행(서울, 표 1)에서 수행되었다.

(aAPCs의 확립)

보조자극분자(CD83, 4-1BBL 및 CD80)의 cDNA를 pCDH 렌티 바이러스 벡터(# CD523A-1, SBI, Palo Alto, CA, USA)에 개별적으로 클로닝하고 CMV pp65-GFP를 PiggyBac 벡터(# PB511B-1, SBI, Palo Alto, CA, USA)에 클로닝하였다. 렌티 바이러스의 생산을 위해, 복제된 pCDH 플라스미드 및 렌티 바이러스 패키징 플라스미드(5 ㎍ pMD2.G 및 5 ㎍ psPAX2, cat nos. #12259, #12260; Addgene, Cambridge, MA, USA) 10 ㎍을 lipofectamine 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 HEK293 세포에 동시 형질감염시켰다. 연속 희석에 의해 렌티 바이러스의 적정을 측정하고 최종적으로 형질전환은 MOI=1로 수행하였다. K562를 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(100 U/mL), L-글루타민(2 mM, 모두 스위스 바젤 소재의 Lonza) 및 10% 소태아혈청(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 RPMI에서 배양하였다. 보조자극분자의 형질도입을 위해, 5×10⁵ K562 세포/mL를 24-웰 플레이트에 씨딩하였다. 24시간 후, 500 ㎕의 렌티 바이러스 상층액 및 8 ㎍/mL의 폴리브렌을 K562 세포 배양물에 첨가하였다. 48시간 후, K562 세포를 플로우 사이토메트리(FACS Canto II, BD Biosciences, San Diego, CA, USA)로 분석하였다. 이어서, 제조업체의 지침에 따라 Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit V(프로그램 번호 T-16)를 사용하여 Amaxa Nucleofector™ I(Lonza, Basel, Switzerland)에 의해 aAPC-pp65를 생산하기 위해 PiggyBac-CMV pp65-GFP로 aAPC를 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 K562 세포를 대조군으로 사용하였다. 안정한 형질감염체는 항체 염색법을 사용하여 MoFlo Astrios flow cytometer(Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) 상에서 소팅하여 양성으로 선별하였다.

(aAPC에서 HLA 클래스 I의 일시적인 발현 확립)

HLA 클래스 I(HLA-A; 7, -B, 14, -C; 11) cDNA를 pcDNA3.1 벡터(# V79020; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 개별적으로 클로닝하고 제조업체의 지침에 따라 aAPC 및 aAPC-pp65를 Amaxa® Cell Line Nucleofector® Kit V(program number T-16)를 사용하여 형질감염시켰다. HLA 유전자 발현 효율을 높이기 위해 0.1-8 ㎍ 범위의 DNA 농도를 시험했다. HLA 클래스 I 발현은 3일 동안 유지되었고 플로우 사이토메트리에 의해 확인되었다. aAPC 및 aAPC-pp65를 공여자 HLA 유형에 상응하는 6가지 HLA 클래스 I 대립유전자로 형질감염시키고 IFN-γ ELISPOT 분석에 의해 면역원성을 조사하였다.

(플로우 사이토메트리에 의한 aAPCs 표현형의 분석)

aAPCs 및 aAPC-pp65에 대한 HLA 클래스 I, 보조자극분자 및 CMV pp65-GFP의 발현을 플로우 사이토메트리로 분석하였다. 다음의 항체들을 본 실험에 사용하였다: BD Biosciences에서 구입한 항-HLA 클래스 I(APC; G46-2.6), 항-CD83(PE; HB15e) 및 항-CD80(PE; L307.4), 및 BioLegend에서 구입한 4-1BBL(PE; 5F4). 대략 10,000개 이상의 세포를 획득하고 FLOWJO 소프트웨어(Tree Star, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

(IFN-γELISPOT 분석)

IFN-γELISPOT 분석은 수정과 함께 문헌에 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(Sohn DH 등, PLoS One (2015) 10(5):e0127899). 간단히 말하자면, 자가 CD8+T 세포(10⁶ 세포)를 완전 RPMI에서 연속 희석시킨 다음, 각 세포 현탁액 100 ㎕를 웰에 옮기고 200 ㎕의 aAPC 및 aAPC-pp65 (10⁵ 세포)를 개별 HLA-일치된 단일 HLA 대립유전자로 형질감염시키거나 그렇지 않았다. 모든 검사에서 FACS로 HLA 대립유전자의 발현이 확인되었고 K562 대조군에서는 50% 이상의 양성 비율을 보인 경우에만 실험을 수행하였다. 스팟 수는 AID ELISPOT 리더 시스템(AID Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)을 사용하여 계수하였다.

(통계 분석)

데이터 분석 및 시각화를 위해 Prism 7.0 소프트웨어(GraphPad, San Diego, CA, USA)를 사용하였다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과 피어슨 상관 분석(Pearson 's correlation analysis)에 의해 결정되었다. 결과는 50명의 공여자에 대한 단일 실험에서 얻은 것이다. P 값 ≤ 0.05는 도면의 설명에 기재된 바와 같이 유의한 것으로 간주된다.

<실험예 1> 단일 HLA 클래스 I에 의해 제한된 pp65-특이 CD8+T 세포 반응을 검출하기 위한 최적 조건 확립

CMV pp65-특이 CD8+T 세포 반응을 검출하기 위해 CMV pp65 및 GFP를 발현하는 PiggyBac 벡터로 형질감염시킴으로써 CMV pp65(aAPC-pp65)를 발현하는 K562 유래 aAPC를 확립하였다.

또한, 면역 반응이 GFP에 의해 유발된 것인지를 확인하기 위해 GFP와 GFP-표지된 pp65를 사용하였고, 면역 반응을 측정하기 위해, HLA-A*02:01 대립유전자를 확립된 aAPC에서 일시적으로 발현시킨 다음 GFP 및 GFP-표지된 pp65를 추가로 발현시켰다. ELISPOT 분석으로 면역 반응을 측정하고 3가지 독립적인 실험을 수행하였다. P 값은 1-way ANOVA(* P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001; **** P <0.0001)에 의해 계산되었다.

도 1에 나타난 바와 같이, pp65에 의한 면역 반응을 확인하였다.

또한, 보조자극분자 CD80, CD83 및 4-1BBL은 aAPC와 pp65 및 GFP를 동시에 발현하는 aAPC-pp65(도 2A) 사이에서 유사한 수준으로 발현되었다. 다양한 HLA 클래스 I 대립유전자 중에서 단일 대립유전자로 제한된 CD8+T 세포 반응을 측정하기 위해, 안정된 세포주를 확립하기보다는 단일 HLA 유전자를 일시적으로 aAPC에서 발현하는 것이 더 효율적이라고 간주된다.

aAPC-pp65에 형질전환시키기 위한 HLA-A*02:01 플라스미드 DNA의 최적 농도는 HLA 클래스 I 분자의 발현에 기초하여 10⁶ aAPC-pp65 당 4 ㎍ 플라스미드 DNA로서 결정되었고, HLA-A*02:01 양성 공여자 HD01로부터 분리된 CD8+ T 세포를 사용한 IFN-γ ELISPOT 분석에서 pp65에 대한 강한 반응을 보였다(도 2B). 이 최적화된 형질감염 조건은 HLA-A*02:01을 안정하게 발현하는 aAPC-pp65와 유사한 T 세포 자극 효율을 보였다(도 2C).

다양한 HLA 클래스 I 유전자의 후속 분석은 일시적인 발현에 적절한 조건을 사용하여 유사하게 수행되었다(도 3).

도 4는 개인의 6가지 HLA 클래스 I 대립유전자에 의해 제시된 pp65- 특이 CD8+T 세포 반응을 측정하기 위한 대표적인 ELISPOT 결과를 보여준다. 단일 HLA 대립유전자(aAPC-HLA)을 발현하고 pp65를 발현하지 않는 aAPC를 백그라운드 값을 얻기 위한 대조군으로 사용하였다. 대부분의 결과는 웰당 1×10⁵ CD8+T 세포로 얻어졌으며, 낮은 반응을 위해 웰당 5×10⁵ 세포가 사용되었다. HD50의 경우, IFN-γ를 분비하는 CMV pp65 특이 CD8+T 세포의 빈도는 HLA-B*07:02에서만 높았으며 다른 대립유전자는 대조군과 차이가 없었다(도 4A). HD30에서 HLA-A*24:02 및 -B*15:01은 aAPC-pp65 및 aAPC 모두에서 5×10⁵ CD8+T 세포 당 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 갖는 양성 반응을 보였다. 일반적으로 이들 HLA-제한 반응은 pp65 존재 하에서만 관찰되었지만 일부 HLA 대립유전자는 pp65 항원(aAPC)이 없는 경우에도 양성 반응을 보였다(도 4B). 따라서 각자가 HLA 대립유전자에 의해 제한되는 pp65 특이 T 세포의 빈도는 [(aAPC-pp65-HLA) - (aAPC-pp65)] - [(aAPCHLA) - (aAPC)]로 결정되었다. HLA-A*24:02에 비해 HLAC*01:02 및 -C*04:01에 의한 pp65 특이 반응이 각각 자체-HLA 대립유전자에 의한 백그라운드 반응 보상 후에 나타났다.

또한, pp65가 없는 경우 자체-HLA 대립유전자에 대한 비특이적 반응은 특정 대립유전자에서 자주 관찰되었다. 즉, 7개의 대립유전자는 100개 이상의 스팟/5×10⁵ CD8+T 세포, 그 중에서 HLA-B의 3개의 대립유전자, HLA-A 및 -C의 2개의 대립유전자가 각각 강한 면역 반응을 보였다. HLA-B*15:01은 35% 이상의 강한 양성 CD8+T 세포 반응을 보였다. 이는 K562 마이너 항원에 대한 반응으로 생각된다(도 5).

<실험예 2> HLA 클래스 I 대립유전자에 따른 우세

50명의 건강한 공여자에 대한 ELISPOT 분석 결과는 IFN-γ를 분비하는 CMV pp65 특이 CD8+T 세포의 빈도와 반응 강도(IFN-γ 스팟 수/5×10⁵ = 0, 1-50, 51-100 및> 100)의 HLA 클래스 I의 모든 대립유전자와 각 HLA 클래스 I 유전자좌의 대립유전자를 기반으로 한다(도 6A). 한 개인에서 HLA 클래스 I의 모든 대립유전자에 대한 총 응답의 분포는 각각 564.0과 559.9의 평균과 SD를 나타냈다. 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 보여주는 양성 반응의 비율은 78%였고, 특이 반응(스팟 = 0)의 부재는 6%였다. 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 보이는 양성 반응의 HLA-A는 38% 였고, 특이 반응의 부재는 24%였다. HLA-B 대립유전자는 평균 193.1(SD 275.7)이었다. 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 보여주는 양성 반응의 비율은 46%였고, 특이 반응의 부재는 36%였다. HLA-C 대립유전자는 평균 32.68(SD 43.37)이었다. 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 보여주는 양성 반응의 비율은 12%였고, 특이 반응의 부재는 36%였다. 각 HLA 클래스 I 유전자좌에 기초한 분석에서, HLA-A 및 -B 대립유전자의 IFN-γ 스팟 수는 HLA-C 대립유전자에 비해 현저히 높았다. 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟에서의 양성 반응의 비율은 HLA-A보다 HLA-B에서 높았다.

HLA-A 유전자좌의 각 대립유전자에 기초한 분석에서, IFN-γ 스팟 수는 HLA-A*02:01> -A*02:06> -A*33:03> -A*24:02> -A*11:01의 순서로 높았다(도 6B). HLA-A*24:02, -A*11:01, -A*31:01 및 -A*02:07에 비해 유의적으로 더 높은 HLAA*02:01 대립유전자는 평균 486.5(SD 479.8)을 보여주었다. HLA-A*02:01, -A*02:06 및 -A*33:03는 각각 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 갖는 66.7, 50.0 및 23.5%의 양성 반응을 보였다. HLA-B 유전자좌 내의 각 대립유전자에 기초한 분석에서, IFN-γ 스팟 수는 HLA-B*07:02 > -B*40:06 > -B*51:01> -B*35:01> -B*44:03 > -B*27:05 > -B*15:01 > -B*40:01의 순서로 높았다(도 6C). HLA-B*07:02는 평균 521.9(SD 358.3)로 HLA-B*54:01 및 -B*46:01보다 유의하게 높았다. HLA-B*07:02, -B*40:06, -B*51:01, -B*35:01, -B* 및 -B*40:01은 각각 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 가진 87.5, 60.0, 44.4, 42.9, 21.4, 20.0, 14.3 및 14.3%의 양성 반응을 보였다. 특히 HLA-B*07:02는 모든 대립유전자에서 공여자의 양성 반응의 비율이 가장 높았으며(7/8, 87.5 %) 모든 양성 반응에서 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 나타냈다. HLA-C 유전자좌의 각 대립유전자에 기초한 분석에서, IFN-γ 스팟 수는 HLA-C*08:01 > -C*01:02 > -C*14:03 > -C*14:02의 순서로 높았다(도 6D). HLA-C*08:01, -C*14:03 및 -C*01:02는 각각 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟을 가진 18.2, 9.1 및 5%의 양성 반응을 보였다. 6가지 대립유전자(HLA-A*02:07, -B*59:01, -B*58:01, -B*15:11, -C*03:02 및 -C*02:02)은 긍정적인 반응을 보이지 않았다.

<실험예 3> 특이 HLA 클래스 I 대립유전자의 양성 반응 및 대립유전자 빈도 사이의 상관관계

HLA 대립유전자는 감염성 질병에 대한 반응으로 다양성이 증가했으며, 특정 감염성 인자에 반응하는 대립유전자를 가진 사람들은 더 나은 생존율을 가지며 진화론적으로 선택될 가능성이 있다. 따라서 CMV의 주요 항원인 pp65에 대한 CD8+T 세포 반응성을 제한하는 대립유전자가 그 대립유전자의 빈도와 관련이 있는지를 분석하였다(도 7).

흥미롭게도, 특정 항원 유형에서 양성 CD8+T 세포 반응의 비율은 HLA-A 대립유전자의 빈도와 유의한 상관관계가 있었다(P = 0.0459, R = 0.7632). 그러나, HLA-B와 HLA-C는 유의한 상관관계를 보이지 않았다. 대립유전자 빈도는 HLA-B 대립유전자에 비교적 균등하게 분포하고 있으며 pp65에 대한 반응성은 HLA-C 대립유전자에서는 낮은 것으로 사료된다.

<실험예 4> 개인 내 우세 및 HLA 대립유전자 계층 구조

HLA 대립유전자에 따른 pp65 항원에 대한 CD8+T 세포의 반응이 집단에서 다르게 관찰되었기 때문에, 개인 내에서 CD8+T 세포 반응에 대한 각 HLA 대립유전자의 영향을 비교 분석하여 개체 내 우세 및 HLA 대립유전자 계층 구조에 대한 개체군 결과를 더 자세히 해석하였다.

50명의 공여자는 개개인의 웰당 100개 이상의 IFN-γ 스팟이 있는 양성 반응을 나타내는 우세 대립유전자의 수에 따라 4그룹으로 분류되었다(도 8A). 3개 우세 대립유전자 그룹(2%)에서 1명의 공여자, 2개의 우세 대립유전자 그룹에서 12명의 공여자(24%), 1개의 우세 대립유전자 그룹에서 23명의 공여자(46%) 및 우세 대립유전자가 없는 그룹에서 14명의 공여자(28%)가 있었다. 1개의 우세 대립유전자 그룹은 11개의 대립유전자(HLA-B*07:02, -A*02:01, -B*40:06, -A*02:06, -B*51:01, -B*35:01, -A*33:03, -B*15:01, -B*27:05, -C*08:01 및 -B*44:03)에 의해 제한된 특이 반응을 나타냈다. 2개의 우세 대립유전자 그룹은 13개의 대립유전자(HLA-B*07:02, -A*02:01, -B*40:06, -A*02:06, -B*51:01, -B*35:01, -A*33:03, -B*15:01, -C*08:01, -B*40:01, -C*14:03, -C*01:02 및 -A*24:02)에 의해 제한된 특이 반응을 나타냈다. 3개의 우세 대립유전자 그룹은 3개의 대립유전자(HLA-A*02:01, -B*35:01 및 -A*33:03)에 의해 제한된 특이 반응을 나타냈다.

개인에서 pp65 특이 CD8+T 세포 반응의 순서로 1 ~ 4의 그룹으로 HLA 대립유전자의 우세를 분류하고 50명의 공여자에서 우세에 따라 pp65 특이 CD8+T 세포 반응의 분포를 분석하였다(도 8B). 첫 번째 우세 그룹(평균 435.5, SD 420.6)은 세 번째 그룹( 평균 18.78, SD 29.22, P <0.0001) 및 네 번째 우세 그룹(평균 5.36, SD 11.1, P <0.0001)과 비교하여 유의적으로 더 높은 두 번째 우세 그룹(평균 103.7, SD 214.3, P = 0.0010)에 비해 강한 유의성을 보였다.

HLA 클래스 I 대립유전자 사이의 계층 구조를 정의하기 위해, 특정 대립유전자를 가진 공여자에서 첫 번째 또는 두 번째 우세를 보이는 사람들을 계수하여 개체 내 우세의 확률을 추정하였다(도 8C). HLA-B*07:02, -A*02:01, -B*51:01, -B*40:06 및 -A*02:06은 각각 87.5, 57.1, 44.4, 40.0 및 33.3%에서 첫 번째 우세를 나타냈다. HLA-B*40:06, -A*02:06, -B*35:01, -B*40:01 및 -A*33:03는 각각 20.0, 16.7, 14.3, 14.3 및 11.8%에서 두 번째 우세를 나타냈다.

<실험예 5> HLA 클래스 I 유전자형에 의한 pp65에 대한 낮은 응답자 예측

공여자에서 CMV에 대한 낮은 면역 반응은 조혈 모세포 이식에서의 CMV 감염의 개시와 관련되기 때문에, CMV에 대한 면역 반응, 특히 낮은 면역 반응을 예측하는 것은 적절한 공여자를 선택하는데 도움이 될 수 있다. 따라서 각 HLA 대립유전자에 정의된 pp65 특이 CD8+T 세포 반응의 평균 빈도를 사용하여 개인의 예상 CD8+T 세포 반응을 예측하고 이 값을 관찰된 CD8+T 세포 반응과 비교하였다(도 9).

모든 50명의 개체에 대한 관찰된 반응과 예측된 반응 사이의 상관관계는 명확한 정량적 선형 관계를 보였다(P = 0.0130, R = 0.3491). 일부 우세 대립유전자가 있었기 때문에 모든 50명의 개인으로부터 예측된 응답은 관찰된 반응과 덜 중요한 상관관계를 보여 주었고, 따라서 다양한 낮은 예측된 반응을 보이는 그룹에서 더 중요한 상관관계가 있는지 분석하였다. 결과적으로, 600점/5×10⁵ 미만의 예측값을 가진 그룹에서 더 유의한 상관관계를 발견하였다(P = 0.0002, R = 0.6257; 표 2). 이러한 결과는 CMVpp65 특이 CD8+T 세포 반응이 낮은 공여자는 HLA 유형만으로 예측할 수 있음을 시사한다.

Claims

단일 또는 복수의 HLA(human leukocyte antigen) 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell)를 제조하는 단계;
상기 인공항원제시세포를 사용하여 외래 항원에 대한 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자의 항원 특이 T 세포 반응을 측정하여 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 분석하는 단계;
외래 항원별로 상기 제1단계 및 제2단계를 반복 수행하여 외래 항원별로 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 제작하는 단계; 및
상기 플랫폼에 수집된 특정 외래 항원에 대한 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 참고하여 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형이 알려진 대상체의 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 단계를 포함하는 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
인공항원제시세포는 단일 또는 복수의 HLA(human leukocyte antigen) 클래스 I 또는 II 대립유전자를 코딩하는 유전자를 형질 도입하여 제조한 것인, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제2항에 있어서,
인공항원제시세포는 CD83, 4-1BBL 및 CD80을 포함하는 보조자극분자군을 코딩하는 유전자를 추가로 형질 도입하여 제조한 것인, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제2항에 있어서,
HLA-null 타입 세포는 K562-기반 세포주 또는 HLA-null 293 T 세포주를 포함하는, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
외래 항원은 병원체 항원, 종양 항원, 자가-항체, 바이오신약, 또는 변종 항원 중 어느 하나인, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제5항에 있어서,
외래 항원은 CMV-pp65, EBV-LMP1 및 EBV-LMP2a로 이루어진 군에서 선택되는, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
항원 특이 T 세포 반응은 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 CD8+T 세포 반응 또는 CD4+T 세포 반응을 포함하는, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 플랫폼에 수집된 특정 외래 항원에 대한 면역우세성을 보이는 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 참고하여 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형이 알려진 대상체의 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 항원 특이 T 세포 반응을 예측하는 단계는 HLA 클래스 I 또는 II의 유전자형이 알려진 대상체의 외래 항원에 대한 비반응성을 예측하는 것을 포함하는, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 부분적으로 일치하는 공여자-수혜자를 위한 백신 제조 또는 제3자간 입양면역치료를 위한 정보를 제공하는 것인, 대상체에서 항원 특이 T 세포 반응을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법.
단일 또는 복수의 HLA 클래스 I 또는 II 대립유전자를 발현하고, 단일 외래 항원이 감작된 인공항원제시세포; 및
외래 항원별로 면역우세성을 보이는 클래스 I 또는 II 대립유전자 분석 결과가 수집된 플랫폼을 포함하는 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제10항에 있어서,
인공항원제시세포는 HLA-null 타입 세포에 단일 또는 복수의 HLA(human leukocyte antigen) 클래스 I 또는 II 대립유전자를 코딩하는 유전자를 형질 도입하여 제조한 것인, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제11항에 있어서,
인공항원제시세포는 CD83, 4-1BBL 및 CD80을 포함하는 보조자극분자군을 코딩하는 유전자를 추가로 형질 도입하여 제조한 것인, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제10항에 있어서,
HLA-null 타입 세포는 K562-기반 세포주 또는 HLA-null 293 T 세포주를 포함하는, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제10항에 있어서,
외래 항원은 병원체 항원, 종양 항원, 자가-항체, 바이오신약, 또는 변종 항원 중 어느 하나인, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제10항에 있어서,
상기 키트는 대상체의 혈액과 인공항원제시세포를 반응시켜 HLA 클래스 I 또는 II 제한된 CD8+T 세포 반응 또는 CD4+T 세포 반응을 측정하기 위한 것인, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.
제10항에 있어서,
상기 키트는 대상체의 항원 특이 T 세포 반응 측정치와 플랫폼의 예측치를 비교하여 백신 제조 시 우세한 면역 반응 또는 비반응성 면역 반응을 예측하기 위한 것인, 항원 특이 T 세포 반응 측정 및 예측용 키트.