ES2790725T3 - Procedimiento de detección de nuevos epítopos de células T inmunogénicas y aislamiento de nuevos receptores de células T específicas de antígeno mediante una biblioteca de células de MHC - Google Patents

Abstract

Procedimiento para preparar uno o dos ácidos nucleicos que codifican la construcción de la cadena alfa (TRA) del receptor de células T (TCR) y la construcción de la cadena beta de TCR (TRB) de una construcción de TCR específica para un epítopo de un antígeno definido presentado en un MHC humano, que comprende (a) estimular células T aisladas de un donante humano con células presentadoras de antígeno profesionales humanas que presentan epítopos de dicho antígeno definido, para enriquecer células T específicas de antígeno; y (b) poner en contacto dichas células T enriquecidas en células T específicas de antígeno de la etapa (a) con una biblioteca de células, en la que cada célula expresa un único alelo de MHC humano, en el que la biblioteca comprende células que expresan todos los alelos de MHC I o MHC II presentes en el donante, y en la que las células de dicha biblioteca presentan epítopos de dicho antígeno definido; y (c) seleccionar células T activadas por dicho contacto; y (d) aislar los ácidos nucleicos que codifican las cadenas alfa de TCR y beta de TCR del TCR de dichas células T.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de detección de nuevos epítopos de células T inmunogénicas y aislamiento de nuevos receptores de células T específicas de antígeno mediante una biblioteca de células de MHC

[0001] La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia, en particular, a la terapia adoptiva con células T, la terapia génica con receptores de células T (TCR) y la vacunación. La invención proporciona un procedimiento para preparar un ácido nucleico que codifica la construcción de la cadena alfa de TCR (TRA) y la construcción de la cadena beta de TCR (TRB) de una construcción de TCR específica para un epítopo de un antígeno presentado en el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), que comprende poner en contacto células T aisladas de un donante con una biblioteca de células presentadoras de antígeno (APC) artificiales que comprende células que expresan todos los alelos de MHC I o MHC II presentes en el donante, preferiblemente, en células K562, tal como se define adicionalmente en la reivindicación 1. La construcción de TCR puede expresarse en una célula T, que es útil para la terapia adoptiva con células T, por ejemplo, de cáncer, infecciones virales o enfermedades autoinmunes. La invención proporciona además un procedimiento para identificar el epítopo reconocido por dicho TCR. Los epítopos inmunogénicos reconocidos por dichos TCR pueden usarse para desarrollar formulaciones de vacunas para inducir inmunidad de células T específicas de antígeno en pacientes. La invención proporciona además pares de construcciones de TCR y epítopos inmunogénicos respectivos obtenidos mediante el procedimiento de la invención, en el que los epítopos son de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano (VPH) 16 (también designado virus del papiloma alfa 9).

[0002] La terapia génica con receptors de células T (TCR) es una prometedora estrategia inmunoterapéutica para tratar una variedad de indicaciones relacionadas con virus y cáncer. Un obstáculo clave es la falta de disponibilidad de TCR potentes a analizar en entornos preclínicos y clínicos. Los procedimientos actuales para detectar y aislar TCR específicos de antígeno tienen limitaciones técnicas, están restringidos a ciertos MHC o requieren conocimiento previo del epítopo antigénico. La elección del antígeno diana es otro factor clave para el éxito de las inmunoterapias. El reconocimiento de antígenos, que se expresan específicamente en tejido tumoral pero no en tejido normal, son de particular interés.

[0003] Las terapias adoptivas con células T se basan en la activación ex vivo y expansión de células T para generar células T efectoras específicas de antígeno para la reinfusión en el paciente (1). Este proceso puede ir acompañado de modificación genética de células T con nuevos receptores de antígeno. Los rápidos protocolos de expansión ex vivo permiten la generación de grandes cantidades de células T para romper las barreras inmunosupresoras del microambiente tumoral para eliminar las células diana. La superación de barreras inmunosupresoras puede conducir a la captación de células tumorales lisadas por APC y la presentación de más antígenos, un proceso llamado propagación del epítopo. Esto puede ir seguido por el cebado de novo de células T autólogas y la reactivación de células T anérgicas que amplifican la respuesta inmunitaria antitumoral, que era inducida por la terapia adoptiva con células T. Las terapias adoptivas con células T que utilizan células T genéticamente no modificadas y modificadas por el receptor de antígeno se han utilizado con éxito para tratar el cáncer y las enfermedades asociadas a los virus, refractarias a otros tratamientos (2).

[0004] Una segunda estrategia para proporcionar inmunidad de células T a un paciente es la aplicación de una vacuna. Las vacunas proporcionan inmunidad adquirida a patógenos o cánceres particulares y la introducción en el mercado de muchas vacunas ha llevado a una disminución impresionante en la morbilidad y mortalidad causada por numerosas enfermedades potencialmente mortales. Para el desarrollo de nuevas vacunas profilácticas y terapéuticas, es un requisito previo identificar antígenos, epítopos y elementos de restricción de MHC, que inducen respuestas de células T que pueden proporcionar protección frente a y eliminación de células patógenas que expresan dichos antígenos. La identificación de epítopos antigénicos, que son procesados endógenamente y presentados por células patógenas y que son reconocidos por los TCR específicos de antígeno, permite el desarrollo de nuevas formulaciones de vacunas para inducir inmunidad específica de antígeno.

[0005] A continuación, se revisan procedimientos actuales para identificar y aislar TCR específicos de antígeno y para identificar epítopos antigénicos, que inducen respuestas de células T.

[0006] Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) son la fuente primaria de las células T para el análisis in vitro. Para el cribado, se pueden aislar fácilmente grandes cantidades de células T de PBMC de sangre de pacientes o donantes sanos. En comparación, las células T aisladas de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) están disponibles en cantidades limitadas de biopsias tumorales. Las biopsias solo pueden obtenerse de tumores sólidos (3,4). El análisis de secuencia directa de ^tC^r de PBMC o TIL puede generar datos masivos sobre las secuencias de TCR. La predicción de la especificidad de TCR y el reconocimiento de antígeno de estos conjuntos de datos sigue siendo imposible (5). Para aislar los TCR con la especificidad deseada de las muestras de células T, es necesario introducir un paso de enriquecimiento específico de antígeno antes de analizar las secuencias de TCR. Además, es útil realizar ensayos funcionales para confirmar la especificidad de antígeno de las células T antes del aislamiento de TCR (6). Los enfoques estándar para enriquecer las células T se basan en la estimulación in vitro específica de antígeno para expandir células T específicas en cultivo. Una estrategia de estimulación in vitro de células T específicas de antígeno es la adición de péptidos al cultivo de células T, que se unen a las moléculas MHC I. Las células en cultivo presentan los péptidos entre sí y las células T CD8+ específicas de antígeno crecen. Sin embargo, las estimulaciones de péptidos, que a menudo se realizan a concentraciones no fisiológicas, pueden conducir a la sobreestimulación y la muerte celular inducida por la activación de las células T que albergan TCR de alta afinidad a péptido/MHC (pMHC) I (7). Además, se requiere el conocimiento de la secuencia del epítopo, procesando propiedades y restricción de unión a MHC I. Además, es necesaria la presencia de células T específicas de péptido dentro de muestras de PBMC o TIL. Por lo tanto, el cribado de células T específicas de péptidos con baja frecuencia de precursores puede ser limitado e impide la identificación de nuevas combinaciones de antígeno inmunogénico-MHC I. Las pruebas funcionales de células T para la especificidad del antígeno y la restricción de MHC generalmente se llevan a cabo con clones de células T individuales. Después de la expansión y el enriquecimiento, los clones de células T individuales se pueden cultivar en cantidades suficientes. Un factor, que debe tenerse en cuenta al aplicar cultivos de células T, es la influencia de las condiciones de cultivo a largo plazo en células T resultantes (8). La capacidad de crecimiento de las células T con un fenotipo más diferenciado (Tem y Teff) es limitada y restringe la expansión in vitro. El cultivo a largo plazo podría conducir a la pérdida de potentes TCR de clones de células T, que ya han encontrado pMHC I in vivo y se han expandido y diferenciado en el donante.

[0007] Por lo tanto, los cultivos de células T a largo plazo pueden introducir una preferencia a favor del crecimiento de células T no diferenciadas con alta capacidad de expansión.

[0008] La detección y clasificación de células T específicas de antígeno es una etapa crítica para el aislamiento de nuevos TCR específicos de antígeno. El enorme repertorio de TCR con especificidades distintas para pMHC condujo al desarrollo de multímeros de MHC solubles como reactivos para teñir células T específicas para un pMHC conocido (9-11). Los multímeros se usan para clasificar las células T específicas de antígeno. Los multímeros permiten la tinción directa de células T específicas para el pMHC deseado (12,13). Sin embargo, se requiere un conocimiento previo de la restricción a MHC y la especificidad del péptido para cribar células T específicas de antígeno dentro de una muestra. El uso de multímeros puede depender de la predicción in silico de epítopos de células T y, por lo tanto, alberga el riesgo de aislar TCR específicos para epítopos que no se procesan ni presentan de manera endógena. Además, las células T se seleccionan según su capacidad para unirse al multímero, pero no necesariamente para unirse a un complejo pMHC en la superficie celular. Los multímeros son reactivos hechos a medida que no están fácilmente disponibles para cribar conjuntos de diferentes pMHC.

[0009] En 1997, los grupos de Lemonnier y Perarnau informaron de la generación de un ratón transgénico que expresaba de forma estable una construcción de una sola cadena de la molécula HLA-A*2:01 humana fusionada con P-2 microglobulina (b-2m) (HHD). Además, a los ratones se les eliminaron los genes de MHC I murinos. Por lo tanto, la inmunización da como resultado células T específicas de antígeno restringidas exclusivamente a HHD (14). Desde entonces, los ratones transgénicos con HLA han proporcionado una nueva fuente de células T específicas de antígeno (15). Los antígenos y epítopos humanos, que no son similares en su secuencia a los homólogos murinos, pueden usarse para la vacunación de ratones transgénicos con HLA para obtener respuestas de células T específicas de antígeno en el repertorio no tolerante, ya que las células T de ratón no se eliminaron en el timo y reconocen antígenos humanos como extraños. Los ratones transgénicos con HLA proporcionan una fuente de TCR de alta afinidad que reconocen antígenos propios o similares a los propios, que se han eliminado en el repertorio humano debido a la selección tímica. Se hicieron avances tecnológicos, cuando basado en el modelo de ratón de HHD, se generó el primer ratón transgénico que incluía el repertorio de TCR humano, mientras que, en paralelo, se eliminó el locus de TCR murino (16). Sin embargo, pueden surgir problemas potenciales con el uso de ratones transgénicos de MHC y/o transgénicos del locus de TCR, por ejemplo, es difícil predecir si la selección de timo humano y de ratón sigue o no las mismas reglas. Las moléculas de MHC transgénicas son construcciones artificiales de una cadena que pueden introducir un sesgo para seleccionar TCR funcionalmente restringidos a MHC de cadena única, pero no al complejo MHC I nativo. La inmunización de ratones transgénicos de MHC individuales no refleja una respuesta inmunitaria natural con una selección de seis complejos MHC:I afines. Es probable que existan antígenos, que no contengan, por ejemplo, epítopos HLA-A*02:01. Además, los ratones que llevan el locus de TCR humano carecen de algunas cadenas de TCR, lo que puede ser crucial para reconocer ciertos pMHC I (16). En cambio, la inmunización de ratones que llevan el locus de TCR murino dará como resultado el aislamiento de secuencias de TCR murinas, que pueden ser propensas al rechazo cuando se transfieren a humanos (17,18). Un factor económico importante es la infraestructura necesaria para trabajar con modelos murinos, lo que requiere muchos recursos en cuanto a costes, requisitos reglamentarios y mano de obra.

[0010] El documento WO 2004/011650 A2, Chen et al., 2004, Journal of Virology, 78 (3): 1333-1343 y US 7026443 B1 enseñan péptidos E5 del virus del papiloma humano 16. El documento WO 2016/138122 A1 describe secuencias de TCR en el contexto de un procedimiento para diagnosticar enfermedades infecciosas y determinar el estado de HLA usando la secuenciación del receptor inmunitario.

[0011] La terapia génica con TCR exitosa depende de la disponibilidad de nuevos TCR con perfiles de especificidad exquisita. A la luz de esto, los presentes inventores abordaron la necesidad de proporcionar un procedimiento novedoso para identificar y aislar nuevos TCR específicos de antígeno, y definir la especificidad del epítopo y la restricción de MHC de estos TCR. Para el desarrollo de nuevas vacunas, que inducen respuestas de células T específicas de antígeno, existe la necesidad de definir nuevos epítopos inmunogénicos, que pueden ser reconocidos por células T.

[0012] Este problema se resuelve por la presente invención, en particular, mediante la materia de las reivindicaciones.

[0013] La presente invención proporciona un procedimiento para preparar uno o dos ácidos nucleicos que codifican la construcción de la cadena alfa de TCR (TRA) y la construcción de la cadena beta de TCR (TRB) de una construcción de TCR específica para un epítopo de un antígeno definido presentado en un MHC, que comprende: (a) estimular células T aisladas de un donante humano con células presentadoras de antígeno (APC) profesionales que presentan epítopos de dicho antígeno definido, para enriquecer células T específicas de antígeno; y

(b) poner en contacto dichas células T enriquecidas de células T específicas de antígeno de la etapa (a) con una biblioteca de células, en la que cada célula expresa un único alelo de MHC, en el que la biblioteca comprende células que expresan todos los alelos de MHC I o MHC II presentes en el donante, y en el que las células de dicha biblioteca presentan epítopos de dicho antígeno definido; y

(c) seleccionar células T activadas por dicho contacto, preferiblemente, en base a un marcador de activación expresado por dichas células T activadas; y

(d) aislar los ácidos nucleicos que codifican la cadena alfa de TCR y la cadena beta de TCR de dichas células T.

[0014] En el contexto de la presente invención "un/una" no se refiere exclusivamente a "uno/a", sino que también abarca "dos o más". Por ejemplo, el procedimiento de la presente invención puede usarse para preparar uno o más, por ejemplo, dos ácidos nucleicos separados que codifican la TRA y TRB de una construcción de TCR.

[0015] El término "capaz de unirse específicamente" o "reconocer" o "específico para" un antígeno dado, tal como se usa en el presente documento significa que la construcción de TCR pueden unirse específicamente a y reconocen inmunológicamente dicho epítopo, preferentemente con alta afinidad. La afinidad se puede analizar mediante procedimientos bien conocidos por la persona experta, por ejemplo, por BiaCore.

[0016] Una de las ventajas de la presente invención es que no se requiere que los epítopos inmunogénicos del antígeno presentado en un alelo de MHC específico sean conocidos. Con el procedimiento de la invención, es posible analizar las respuestas de las células T a los antígenos, donde los epítopos se procesan naturalmente y la presentación puede tener lugar a través de cada MHC posible. Por lo tanto, el procedimiento de la invención puede usarse para identificar un TCR específico para un antígeno definido sin conocimiento previo del epítopo. El antígeno definido puede ser incluso uno de una pluralidad de antígenos, por ejemplo, una pluralidad de antígenos de un virus específico, o todos los antígenos de un virus específico, si las células presentadoras de antígeno en la etapa a y la biblioteca en la etapa b presentan epítopos de dichos antígenos.

[0017] Una ventaja adicional es que el procedimiento de la invención hace posible la identificación de TCR específicos para epítopos peptídicos inmunodominantes, y proporcionar dichos epítopos peptídicos. Se ha observado que ciertas combinaciones de péptido-MHC (pMHC) inducen una respuesta dominante de células T sobre otras combinaciones de pMHC derivadas del mismo antígeno, aunque se predice que ambas combinaciones tienen altas afinidades de unión. Además, este procedimiento también puede permitir el aislamiento de TCR que reconocen epítopos subdominantes, si el número de PBMC cribadas aumenta ampliamente.

[0018] Como la terapia de los seres humanos es de mayor interés, se prefiere que el procedimiento se lleve a cabo en el sistema humano, es decir, el donante es humano, y, por consiguiente, se utilizan MHC I o MHC II humano, en particular, moléculas de MHC I, y APC. Por supuesto, también es posible usar células T de un donante murino, que esté restringido a moléculas m Hc humanas (14,15) o células T murinas que expresen receptores de células T humanas (16). Alternativamente, se pueden usar otros sistemas, por ejemplo, sistemas completamente murinos, de rata, cabra, conejo, conejillo de indias, si se desea la provisión de un ^tC^r de esa especie.

[0019] Preferiblemente, las células T estimuladas en la etapa a están en forma de PBMC, es decir, no están separadas de otras células mononucleares. Esto puede ser beneficioso porque proporciona un entorno más natural y excluye la necesidad de etapas de purificación adicionales. También se pueden usar TIL aislados de un donante. Alternativamente, se pueden usar células T purificadas, o células CD4+ purificadas o, preferiblemente, células T CD8+.

[0020] Las APCs profesionales son preferiblemente APCs autólogas, es decir, que están aisladas del mismo donante que las PBMC. Sin embargo, también pueden ser APC heterólogas, siempre que compartan al menos un alelo de MHC, preferiblemente, todos los alelos de MHC I o II (preferiblemente m Hc I) con el donante. Más preferiblemente, las APC profesionales son células dendríticas, en particular, células dendríticas maduras. Las APC profesionales presentan epítopos del antígeno definido en el MHC después del procesamiento endógeno del antígeno. El antígeno se proporciona preferiblemente al interior de las APC profesionales como ARN, ADN, proteína o polipéptido para permitir el procesamiento endógeno y la presentación por las APC. Por lo tanto, no se requiere un conocimiento previo del epítopo. Por ejemplo, es posible la expresión estable o transitoria después de la transfección.

[0021] La estimulación de células T en la etapa a se lleva a cabo durante 7-42 días, más preferiblemente durante 14-28 días. La proporción de PBMC a APC profesionales es preferiblemente de aproximadamente 5:1 a 20:1, lo más preferiblemente, de aproximadamente 10:1. Las células T se estimulan en un medio que contiene citoquinas que favorecen la proliferación de células T; preferiblemente bajas concentraciones de IL-2 (por ejemplo, 15-25 U/ml, preferiblemente, aproximadamente 20 U/ml), IL-7 (por ejemplo, 2,5-7,5 U/ml, preferiblemente, aproximadamente 5 U/ml) o IL-15 para prevenir la proliferación de células T no específicas de antígeno en entornos de cultivo específicos. Las PBMC proliferantes pueden dividirse en proporciones de aproximadamente 1:2 a 3:4. Es posible una segunda estimulación con APC profesionales que presenten un epítopo del antígeno después del procesamiento endógeno.

[0022] Las células enriquecidas para células T específicas de antígeno en la etapa a se ponen en contacto adicionalmente con una biblioteca de células en la etapa b, en la que cada célula expresa un único alelo de MHC, en la que la biblioteca comrpende células que expresan todos los alelos de MHC I o II presentes en el donante, y en la que las células de dicha biblioteca presentan epítopos de dicho antígeno definido.

[0023] Se prefiere en toda la invención que el MHC sea MHC I. Las células T estimuladas por estas células, que expresan MHC I, serán células T CD8+, y, típicamente, se presentarán epítopos de proteínas intracelulares.

[0024] En una realización preferida, la biblioteca consiste en células K562 que expresan de manera estable un alelo de MHC I cada una. Las bibliotecas de K562 ejemplo se describen a continuación o se describen por Zeng et al. (19) Las células de la biblioteca pueden ser de otro origen que el de las células K562, que comprenden cualquier APC humano o no humano, por ejemplo, líneas celulares linfoblastoides (LCL) o células NIH/3T3.

[0025] La biblioteca de células MHC usada en el presente documento se generó mediante transducción estable de la línea celular humana K562 (20,21) con alelos de MHC I humanos individuales (HLA-A, -B y -C). Las células K562 son de origen eritroleucémico humano y carecen de expresión de alelos endógenos de ^m H^c I y MHC II (22). Sin embargo, expresan la microglobulina p-2 y, tras la expresión transgénica de una cadena a de MHC I, poseen una maquinaria de procesamiento de antígeno y presentación completamente funcional (19, 23, 24). Las células K562 expresan ICAM-1 y LFA-3, que son necesarias para formar una sinapsis inmunitaria efectiva (24). Además, fue posible modificar genéticamente estas células, por ejemplo, mediante transducción retroviral para expresar de forma estable alelos de MHC I individuales e introducir secuencias antigénicas, por ejemplo, mediante transfección con ARN transcrito in vitro (ivt).

[0026] En una realización, de este modo, la presente invención también proporciona una biblioteca de células MHC basadas en K562, las células de la cual se pueden emplear en el procedimiento de la invención. Dicha biblioteca comprende células K562, expresando cada célula uno de los siguientes alelos de MHC I:

Biblioteca de células MHC basadas en K562

HLA-A* HLA-B* HLA-C*

01:01 07:02 01:02

02:01 07:04 02:02

03:01 08:01 03:03

03:05 15:01 03:04

11:01 18:01 04:01

23:01 27:05 05:01

24:02 35:01 06:02

26:01 35:08 07:01

29:02 38:01 07:02

31:01 40:01 12:03

33:01 41:02 15:02

66:01 44:02 16:01

68:02 44:03 16:02

68:24 47:01 17:01

49:01

51:01

56:01

57:01

57:03

58:01

[0027] El uso de células K562 como armazón de APC artificiales tiene varias ventajas. En comparación con los LCL, las células K562 carecen de secuencias virales del virus del herpes como el EBV (25,26). Esta es una característica importante del sistema de APC basado en K562 para evitar la activación de células T específicas de EBV durante el análisis de muestras en volumen de células T, que naturalmente pueden contener células T específicas de EBV. En comparación con las APC artificiales acelulares, en un sistema de APC celular, la presentación de pMHC se produce a niveles fisiológicos en la superficie celular de una membrana celular intacta, que se asemeja al entorno más nativo para la unión a TCR. La expresión dominante de un MHC minimiza el alo-reconocimiento de los TCR. La capacidad de K562 transducida por MHC para presentar pMHC en la superficie celular muestra que el procesamiento de antígenos y la expresión de MHC en K562 parental no es un defecto general, sino debido al silenciamiento del locus endógeno de MHC. Las células K562 expresan un proteasoma constitutivo en comparación con las DC que expresan proteasoma inmunitario, que se asemeja al procesamiento del antígeno por una célula tumoral típica [27] . Las células T transducidas con TCR cocultivadas con células K562 en ausencia del antígeno diana no mostraron liberación de IFNg de base y regulación por incremento de CD137 minimizando la activación inespecífica de las células T.

[0028] Los atributos de células K562 discutitos anteriormente los hace el sistema APC artificial celular preferido para establecer una biblioteca de células MHC como una diana para el análisis de TCR sin conocimiento previo de especificidad de epítopo y restricción a MHC. En principio, cualquier antígeno diana puede expresarse en células K562, que incluye antígenos derivados de patógenos, así como antígenos asociados a tumores (TAA), antígenos de cáncer de testículo (CTA) y antígenos de linaje. Para la inmunoterapia del cáncer, los antígenos específicos de tumor (TSA) son de particular interés para identificar TCR específicos para epítopos virales o epítopos derivados de mutaciones.

[0029] Latouche y Sadelain utilizaron células NIH/3T3 de fibroblastos de ratón adherentes a placa, que expresaban de forma estable alelos de MHC humano individuales (28) y por lo tanto lograban una presentación endógena de los epítopos en el contexto de los complejos de MHC humanos. Las células NIH/3T3 se han utilizado con éxito para expandir las líneas de células T específicas de CMV para su uso en la terapia adoptiva con células T postrasplante [29] , y se pueden usar como una biblioteca alternativa en el contexto de la invención.

[0030] Alternativamente, el MHC puede ser MHC II. En ese caso, la biblioteca de células comprende preferiblemente células que expresan MHC II, tales como células K562 transfectadas con un alelo de MHC II cada una. Butler et al. describen una biblioteca de ejemplo. (30) Alternativamente, se pueden usar bibliotecas de células que expresan MHC II individuales que se basan en células B RM3 (Raji) humanas, que se generaron después de mutagénesis aleatoria con metilsulfonato de etano (EMS) para eliminar el locus de MHC II (31). Las células T estimuladas por estas células serán CD4+ y, típicamente, se presentarán epítopos de proteínas secretadas, proteínas de diferentes compartimentos celulares, proteínas de membrana o proteínas de presentación cruzada.

[0031] Las células de la biblioteca, en particular las células K562, pueden expresar además moléculas coestimuladoras, por ejemplo, CD40, CD40L, CD70, CD80, CD83, CD86, ICOSL, GITRL, CD137L y/o CD252, de manera que las células pueden adaptarse para el contacto óptimo de subconjuntos de células T. Los conjuntos de moléculas coestimuladoras pueden ser CD80, CD86 y CD137L, o CD80, CD83, CD64 (30) o CD80, CD70 y CD137L (19). Esto puede amplificar la respuesta de las células T para detectar claramente la liberación de IFNg específica de antígeno y la expresión de CD137 y puede conducir a la detección de un rango más amplio de TCR con respecto a la afinidad. Sin embargo, para aislar TCR de alta afinidad, puede ser preferible que las células de la biblioteca, en particular las células K562, no expresen moléculas coestimuladoras adicionales. Además, las células de la biblioteca, en particular las células K562, pueden expresar moléculas que mejoran el procesamiento y la presentación de antígeno, por ejemplo, HLA-DM y CD74.

[0032] Las células de la biblioteca presentan epítopos del antígeno definido en sus moléculas de MHC después del procesamiento endógeno. Preferiblemente, expresan de manera estable el antígeno completo de longitud completa, por ejemplo, después de la transfección con ARNivt que codifica el antígeno. La expresión transitoria también se puede utilizar. En consecuencia, no se requiere conocimiento previo del epítopo.

[0033] El contacto de la biblioteca con células T se realiza durante entre 12 y 36 horas, preferiblemente, 18-22 horas o aproximadamente 20 horas para lograr la activación óptima de células T específicas de antígeno dentro de la muestra de células T. Preferiblemente, se evita la adición de citoquinas durante el contacto para evitar que las células T se activen inespecíficamente.

[0034] Estas células T que portan un TCR específico para un epítopo presentado por las células de la biblioteca están activadas. En consecuencia, se pueden seleccionar en función de un marcador de activación (etapa c), de modo que no se requiere conocimiento previo del epítopo de células T y el elemento de restricción de MHC. Las células T regulan por incremento los marcadores de activación tras el acoplamiento del TCR con el complejo de pMHC afín en las células diana. La señalización de TCR junto con señales coestimuladoras induce la expresión a corto plazo de moléculas de activación como CD25, CD69, CD107, CD137 y/o CD154, que pueden usarse como marcadores para detectar y aislar células T específicas de antígeno (32), por ejemplo, mediante FACS o MACS. Se demostró que CD137 era un marcador específico para el aislamiento de células T CD8+ específicas de antígeno (33,34). La clasificación basada en la expresión de CD137, por ejemplo, mediante FACS, es un procedimiento preferido para la selección de células T específicas. En una realización, esto se combina con la medición de la liberación de IFNg, por ejemplo, mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o mediante la captura de citoquinas de IFNg por FACS. La medición de la liberación de IFNg, por ejemplo, mediante ELISA, es un procedimiento estándar para evaluar la actividad funcional de las muestras de células T.

[0035] Los ensayos de captura de citoquinas proporcionan una herramienta alternativa para detectar y aislar células T funcionalmente activas sin conocimiento previo de la especificidad de pMHC (35,36). Las células T CD8+ activadas a través de pMHC I afín liberan vesículas con citoquinas como IFNg y TNFa. La detección y el aislamiento de células T individuales tras la secreción de citoquinas se ha facilitado mediante el desarrollo de ensayos de captura de citoquinas en combinación con análisis FACS o MACS (36,37). Los ensayos de captura de citoquinas proporcionan una alternativa atractiva a los marcadores de activación de células T para la clasificación de células T, que se activaron mediante señalización de TCR.

[0036] Después de la selección de las células T activadas, los ácidos nucleicos que codifican la cadena alfa de TCR y la cadena beta de TCR del receptor de células T de dichas células T se aíslan directamente. Por ejemplo, el ARN puede aislarse para generar ADNc a través de la amplificación rápida en 5' de los extremos de ADNc (RACE) de los genes de lafa de TCR y beta de TCR, seguido de la amplificación por PCR. Los productos de PCR pueden clonarse en un plásmido de expresión para transformar bacterias. Puede considerarse que cada colonia bacteriana contiene un vector de secuenciación con un fragmento del gen de alfa de TCR o beta de TCR en PCR. Se puede preparar el ADN del vector de numerosas colonias bacterianas, seguido de la secuenciación de los insertos del vector (fragmentos de gen de alfa de TCR o beta de TCR). Los resultados de la secuenciación de cada colonia bacteriana se pueden analizar, por ejemplo, utilizando IMGT/V-Quest. Las frecuencias de las cadenas alfa de TCR alfa o beta de TCR idénticas reflejan la proporción de clonotipos de células T idénticas dentro de la muestra de células T clasificada. Otra estrategia para analizar las secuencias de genes de alfa de TCR y beta de TCR de células T clasificadas es el uso de enfoques de secuenciación de próxima generación. Por ejemplo, los productos de PCR de los genes de alfa de TCR y beta de TCR, que se ligaron en vectores de secuenciación, se pueden transformar en bacterias y crecer en matraces que contienen medio selectivo y seguido de la preparación del ADN del vector. Las preparaciones de ADN del vector pueden usarse directamente para el análisis de secuenciación de próxima generación. Se considera que la frecuencia de vectores que contienen genes de alfa de TCR o beta de TCR idénticos es representativa de la cantidad inicial de células T del mismo clonotipo dentro de la muestra de células T clasificadas. La coincidencia de frecuencia de las cadenas alfa de TCR y beta de TCR dentro de una muestra de células T se puede utilizar para analizar el emparejamiento de TCR funcionales (38), por ejemplo, los TCR que representaban la liberación de IFNg específica de antígeno-MHC y la regulación por incremento de CD137. La sensibilidad de estos procedimientos permite el análisis detallado de los repertorios de TCR dentro de las muestras de células T. La coincidencia de las frecuencias de las cadenas alfa de TCR y beta de TCR también permite la reconstitución de abundantes pares de cadenas de TCR de muestras de células T, lo que hace sea un cultivo de clones de células T intensivos de recursos prescindible. El cultivo a largo plazo es necesario para expandir los clones de células T en el cultivo, lo que solo puede favorecer el crecimiento de células T, que tenían un fenotipo de memoria central u original, por lo tanto, excluyen las células T del análisis, que tienen una capacidad de crecimiento limitada in vitro. Por lo tanto, para el análisis de los repertorios de TCR es una ventaja cribar y clasificar las respuestas de células T específicas de antígeno-MHC después de solo 14 a 28 días de enriquecimiento específico de antígeno.

[0037] Por lo tanto, preferiblemente, si después del análisis de los ácidos nucleicos que codifican las cadenas alfa de TCR y beta de TCR de la población seleccionada de células T, se identifica más de una cadena alfa de TCR y cadena beta de TCR, se analiza la frecuencia de las cadenas alfa de TCR y cadenas beta de TCR en la población y las cadenas alfa de TCR alfa y beta de TCR que constituyen un TCR capaz de reconocer el epítopo se emparejan en función de su frecuencia. Alternativamente, puede llevarse a cabo un análisis adicional, por ejemplo, la generación de células T que llevan combinaciones de diferentes cadenas alfa de TCR y beta de TCR beta predominantes, y el análisis de su activación por células de la biblioteca utilizadas en la etapa b.

[0038] Las cadenas alfa y beta de TCR se pueden modificar, lo que lleva a construcciones de cadena alfa de TCR (TRA) y construcciones de cadena beta de TCR (TRB) de la invención. Opcionalmente, el uso de codones de TRA y TRB puede optimizarse para mejorar la expresión del TCR en células T recombinantes. Además, las regiones variables humanas pueden combinarse con regiones constantes murinas (39), o una región constante murina mínima, es decir, regiones constantes humanas que contienen solo aminoácidos definidos de la región constante murina (40) y que además comprenden un puente de cisteína adicional (41, 42), que aumenta la unión preferencial de las cadenas de TCR transgénicas entre sí y reduce el emparejamiento con las cadenas de TCR endógenas expresadas por células T receptoras.

[0039] Además la optimización de la expresión es posible, por ejemplo, mediante la generación de construcciones de TCR de una sola cadena que alberga las regiones variables de las TRA y TRB para evitar el emparejamiento de cadenas de TCR endógenas con cadenas introducidas y para mejorar la actividad funcional. Además, pueden generarse moléculas receptoras solubles y proteínas de fusión que contienen las regiones variables de los genes de las cadenas TRA y TRB y, por ejemplo, dominios de anticuerpos.

[0040] Las células T específicas para un epítopo de un antígeno definido presentado en un MHC pueden generarse expresando los ácidos nucleicos que codifican las TRA y TRB. Si tales células T están destinadas a la terapia de un paciente, se prefiere usar células T autólogas. Alternativamente, es posible un entorno alogénico utilizando supresión inmunitaria.

[0041] Los análisis de la activación de células T transfectadas con construcciones de TCR adecuadas con células de la biblioteca que expresan alelos de MHC específicos se pueden usar fácilmente para analizar la restricción a MHC de TCR.

[0042] La presente invención proporciona además un procedimiento para la identificación de un epítopo de un antígeno definido capaz de ser presentado por una molécula de MHC, que comprende llevar a cabo las etapas a-d del procedimiento de la invención descrito anteriormente, e identificar el epítopo capaz de activar dichas células T seleccionadas o células T modificadas con ácidos nucleicos que codifican las TRA y TRB que constituyen la construcción de TCR. Las estrategias de mapeo de epítopos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, las células de la biblioteca que expresan el alelo de MHC relevante pueden transfectarse con minigenes que cubren secciones del antígeno relevante, y se pueden analizar las respuestas, por ejemplo, secreción de IFNg, para encontrar la sección que alberga el epítopo. La pulsación de péptidos con péptidos externos también puede ser útil. La predicción de epítopos puede emplearse como parte de dicha estrategia, pero es importante tener en cuenta que, tal como se muestra en los experimentos descritos a continuación, la especificidad de TCR no necesariamente coincide con los datos pronosticados a partir de los algoritmos de predicción de epítopos.

[0043] Además, el epítopo identificado para inducir respuestas de células T específicas de antígeno, que se demuestra por el aislamiento de los TCR específicos de antígeno que representan esta respuesta, se puede utilizar para desarrollar formulaciones de vacunas que contienen la secuencia de epítopo. El procedimiento descrito en las invenciones asegura el reconocimiento de epítopos en MHC, que son procesados de manera endógena y presentados por células que expresan un antígeno definido. La aplicación de la vacuna que contiene epítopos puede proporcionar inmunidad de células T a los pacientes para eliminar las células que expresan de forma natural el antígeno definido.

[0044] En resumen, el procedimiento de la invención tiene varias ventajas sobre los procedimientos convencionales de proporcionar construcciones de TCR que pueden usarse, por ejemplo, para la terapia adoptiva de células T. Por ejemplo, el repertorio completo de células T está cubierto, por ejemplo, incluyendo todos los elementos de restricción de MHC I similares de un donante determinado. El procedimiento también permite la detección de células T con la especificidad de antígeno deseada, pero no requiere conocimiento previo de epítopos. Se basa en el reconocimiento de epítopos procesados endógenamente y presentados sin predeterminación de epítopos seleccionados. Los diferentes epítopos de un antígeno tienen una jerarquía de expresión definida como dominancia inmunitaria. Las construcciones de TCR identificadas por el procedimiento de la invención reconocen los epítopo dominantes inmunitarios dentro de los antígenos diana, que se presentan de manera más eficiente en uno de los seis alelos de MHC I. El procedimiento también permite la identificación de células T que reconocen epítopos subdominantes del mismo antígeno. Finalmente, el procedimiento permite la detección paralela de clonotipos de células T diferentes que reconocen el mismo antígeno.

[0045] La invención también proporciona nuevas construcciones de TCR y los epítopos reconocidos por estas construcciones de TCR, que son obtenibles mediante el procedimiento de la invención y se describe a continuación, así como ácidos nucleicos, por ejemplo, vectores, tales como vectores de expresión, que codifican estas construcciones de TCR o las respectivas TRA y TRB o fragmentos de las mismas, tales como fragmentos variables o la región CDR3 de las TRA o TRB, o células T transgénicas que expresan dichos ácidos nucleicos.

[0046] La infección por el virus del papiloma humano (VPH) es la causa principal del desarrollo de cánceres de cuello uterino, anogenitales y carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (43,44). Los tipos oncogénicos de VPH representan aproximadamente 610.000 casos de cáncer por año en todo el mundo.

[0047] El tipo oncogénico más prevalente es VPH16 que representa más del 50% de los casos de cáncer de cuello uterino. E6 y E7 de VPH16 tienen potencial de transformación y se consideran oncogenes impulsores (45,46). Se ha demostrado que E5 de VPH16 tiene potencial oncogénico, debido a su capacidad para transformar fibroblastos in vitro (47,48). Además, se encontró que E5 se expresa en biopsias de cáncer de cuello uterino invasivo, lo que indica un papel importante de E5 en el inicio y mantenimiento del fenotipo transformado de los queratinocitos malignos (49­ 51).

[0048] Aunque los programas de vacunación profiláctica junto con exámenes médicos e intervenciones reducirán la morbilidad relacionada con VPH en varios países durante los próximos siglos, el VPH seguirá siendo un problema de salud global significativo con una necesidad de tratamientos terapéuticos del cáncer de cuello uterino y otros cánceres causados por VPH.

[0049] Los intentos de tratamiento terapéutico de tumores malignos asociados al VPH se han descrito en numerosos estudios. Sin embargo, solo un estudio de fase I/II que aplica péptidos largos sintéticos que cubren la secuencia completa de E6 y E7 de VPH16 ha mostrado datos de pacientes que experimentaron una regresión de neoplasias intraepiteliales vulvares (VIN) de alto grado en más del 50% de los pacientes. Esta respuesta se asoció con respuestas de células T específicas de VPH (52). Sin embargo, faltan resultados comparables dirigidos a las lesiones de CIN y el cáncer de cuello uterino, lo que sugiere que los intentos actuales de vacunación terapéutica dirigida a E6 y E7 de VPH16 no superan los mecanismos de escape inmunitario del VPH (52,53). Además, faltan TCR potentes dirigidos a E6 y E7 que permitan la validación del tratamiento inmunoterapéutico de tumores malignos inducidos por el VPH.

[0050] Como se buscan nuevas estrategias terapéuticas para tratar cánceres inducidos por VPH, los esfuerzos de los inventores se concentraron en el aislamiento de TCR específicos de antígeno para los antígenos derivados de VPH y la identificación de epítopos inmunogénicos de estos antígenos utilizando el procedimiento descrito anteriormente. E5, E6, E7 y L1 de VPH16 se usaron como antígenos.

[0051] El citomegalovirus (CMV), también designado virus del herpes humano 5 (HHV-5), es un miembro de la familia del virus del herpes. Las infecciones por CMV se parecen a otras infecciones por el virus del herpes, ya que están controladas por las células T CD8+ y CD4+, que aparecen con una frecuencia precursora muy alta en individuos seropositivos del CMV (54). La infección por CMV suele ser asintomática en individuos inmunocompetentes y persiste durante toda la vida en una etapa latente en hasta el 90% de la población. La enfermedad por CMV puede manifestarse en algunas personas inmunocomprometidas después del nacimiento o después del trasplante de células madre hematopoyéticas o del trasplante de órganos sólidos, lo que causa un total de 5.600 casos de enfermedad grave con 560 muertes por año en los EE. UU. (54). El CMV ha sido ampliamente considerado como no oncogénico, ya que la infección no parece conducir a la transformación celular, pero puede infectar de manera oportunista las células malignas. Estudios recientes han asociado el CMV con el glioblastoma, cuestionando que el CMV es un virus no oncogénico (55-58). A la luz de esto, los inventores han decidido investigar también TCR específicos para antígenos de CMV.

[0052] Se observó una respuesta fuerte de células T a E5 de VPH16 en combinación con HLA-B*15:01 tras el cribado con células K562 que expresaban antígeno de la biblioteca de células MHC. Además, se observó una respuesta de células T específicas de pp65 de CMV sobre HLA-B*07:02. Las muestras de células T que respondieron a una combinación de antígeno-MHC se clasificaron directamente y se analizaron para determinar las secuencias del gen del TCR. Los genes predominantes del TCR en una muestra se clonaron en un vector de expresión retroviral y se evaluaron ensayos mediante la transducción de diferentes combinaciones de cadenas alfa y beta de TCR en p BmC. Se pudo reconstituir un TCR funcional específico de E5 de VPH16 y un TCR funcional específico de pp65 de CMV, que reconocieron epítopos procesados endógenamente presentados en HLA-B*15:01 y B*07:02, respectivamente.

[0053] En particular, de este modo, la presente invención proporciona una construcción de TCR específica de E5 de VPH, tal como se define adicionalmente en la reivindicación 7, que se puede usar, por ejemplo, para terapia génica con TCR para tratar la infección por VPH, en particular, tumores malignos inducidos por VPH. La invención proporciona un ácido nucleico que codifica una TRA y/o TRB de una construcción de TCR específica para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 en complejo con un MHC I humano, tal como se define adicionalmente en la reivindicación 7. El ácido nucleico puede obtenerse u se obtiene del procedimiento de la invención descrito en este documento.

[0054] Los inventores proporcionan una construcción de TCR específica para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 en complejo con HLA-B*15:01, que comprende la SEQ ID NO: 1, tal como se define adicionalmente en la reivindicación 7. La construcción de TCR preferiblemente también reconoce una versión más larga en N-terminal del epítopo, por ejemplo, puede consistir en SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51, 52 y 57. Los inventores mostraron que estos péptidos se procesan endógenamente y pueden presentarse en HLA-B*15:01, y por lo tanto pueden ser la diana del reconocimiento de TCR. Además de la terapia génica con TCR, las vacunas que comprenden péptidos de SEQ ID No: 1, 45, 47, 49, 51, 52 y 57 pueden ser una segunda estrategia para proporcionar inmunidad con células T en pacientes positivos de HLA-B*15:01. Aproximadamente el 12% de la población alemana tiene al menos un alelo HLA-B*15:01. Se ha encontrado que los estudios de población en China, Corea del Sur y Japón tienen frecuencias alélicas de B*15:01 aún más altas (59).

[0055] La especificidad de un TCR o una construcción de TCR se define principalmente por las regiones CDR3 del TCR. La construcción de TCR de la invención específica para el epítopo E5 presentado en HLA-B*15:01 comprende una TRA que comprende una CDR3 de SEQ ID NO: 2 o una CDR3 que tiene al menos un 84%, preferiblemente, al menos un 92% de identidad de secuencia con la misma, es decir, puede haber una o dos sustituciones, inserciones o deleciones. Si hay mutaciones, se prefieren las sustituciones conservadoras. La SEQ ID NO: 2 es una secuencia preferida de una c DR3 de una TRA de la invención. En una realización, la TRA comprende la CDR3 de SEQ ID NO: 2, la CDR1 de SEQ ID NO: 64 y la CDR2 de SEQ ID NO: 65.

[0056] La región variable de la TRA comprende preferiblemente la SEQ ID NO: 3 o tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 3, en la que, preferiblemente, la región variable comprende la SEQ ID NO: 2. La región variable puede estar codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 60. La TRA preferiblemente tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente, al menos 90%, al menos 95% o 100% con la SEQ ID NO: 4 o consiste en la misma, en la que la región constante es preferiblemente una región constante murina o una región constante murina mínima para mejorar el emparejamiento de cadenas TCR transgénicas. Alternativamente, la región constante también puede ser humana, lo que minimiza el riesgo de reconocimiento inmunitario por parte de las células inmunitarias del receptor.

[0057] Un ácido nucleico optimizado en codones preferido que codifica la TRA de la construcción de TCR específica para el epítopo E5 de VPH de la invención es la SEQ ID N°: 5.

[0058] La construcción de TCR de la invención específica para el epítopo E5 presentado en HLA-B*15:01 comprende una TRB que comprende una CDR3 de SEQ ID NO: 6 o una CDR3 que tiene un una o dos sustituciones conservadoras en SEQ ID NO: 6. La SEQ ID NO: 6 es una secuencia preferida de una CDR3 de una TRB de la invención. En una realización, la TRB comprende la CDR3 de SEQ ID NO: 6, CDR1 de SEQ ID NO: 66 y CDR2 de SEQ ID NO: 67.

[0059] La región variable de la TRB preferiblemente comprende SEQ ID NO: 7 o tiene una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente, al menos 90% o al menos 95% con la SEQ ID NO: 7, en la que, preferiblemente, la región variable comprende la SEQ ID NO: 6. La región variable puede estar codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 61. La TRB preferiblemente tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, preferiblemente, al menos 90%, al menos 95% o 100% con la SEQ ID NO: 8 o consiste en la misma, en la que la región constante es preferiblemente una región constante murina o una región constante murina mínima para mejorar el emparejamiento de cadenas de TCR transgénicas. Alternativamente, la región constante también puede ser humana, lo que minimiza el riesgo de reconocimiento inmunitario. Un ácido nucleico optimizado en codones preferido que codifica la TRB es la SEQ ID NO: 9.

[0060] La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica tanto TRA como TRB específicas para el epítopo de E5 de VPH en un casete de expresión adecuado, por ejemplo, para la terapia génica con TCR para tratar las infecciones por VPH, en particular tumores malignos inducidos por VPH, por ejemplo, que comprende la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO: 40.

[0061] En base a las secuencias proporcionadas por el procedimiento de la invención, es posible llevar a cabo la maduración por afinidad de las secuencias de TCR (60,61). Las sustituciones de nucleótidos no sinónimos que conducen a intercambios de aminoácidos en la secuencia de CDR3 pueden conducir a una mayor afinidad del TCR por el antígeno diana. Además, los cambios de secuencia de TCR en otras partes de las regiones de TRA y TRB variables pueden cambiar, preferiblemente aumentar, la afinidad de la construcción de TCR al complejo pMHC. Se prefiere que las construcciones de TCR que varían de las secuencias específicas proporcionadas retengan una especificidad exclusiva para el antígeno siana proporcionado. Por consiguiente, se prefiere que la transferencia adoptiva de células T que expresan la construcción de TCR de la invención no tenga efectos negativos significativos sobre el tejido sano.

[0062] Los ácidos nucleicos de la invención pueden proporcionarse como vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la invención que codifican la TRA y/o TRB de la invención, por ejemplo, vectores en los que la TRA y/o TRB están unidas operativamente a un promotor adecuado para la expresión en células T, tales como las células T humanas. Preferiblemente, dicho promotor es un promotor heterólogo, es decir, no está unido a los genes de alfa o beta de TCR en células naturales, en particular, en células T humanas. El promotor puede ser un promotor constitutivo o inducible, preferiblemente un promotor del virus de sarcoma mieloproliferativo (MPSV), CMV, CAG o EF1a. Los ácidos nucleicos de la invención pueden proporcionarse como ARN, como vectores retrovirales, como vectores g-retrovirales, como vectores lentivirales o como vectores basados en transposones. En una realización, el vector es adecuado para la terapia génica con TCR de un paciente humano. Preferiblemente, el vector es MP71. Los ácidos nucleicos de la invención, por ejemplo, que codifican TRA y TRB, pueden fusionarse a través de un enlazador genético, preferiblemente un elemento 2A derivado de virus, para proporcionar un único cassette transgénico que codifica ambas cadenas de una construcción de TCR funcional.

[0063] La invención también proporciona proteínas codificadas por los ácidos nucleicos de la invención, o proteínas de fusión de los mismos, en particular TRA y/o TRB codificadas por los ácidos nucleicos de la invención y específicas para los antígenos descritos, por ejemplo, para el epítopo de la oncoproteína E5 de VPH16. Una TRA y/o TRB de la invención puede comprender todas las características o dominios correspondientes a su homólogo nativo, pero esto no es esencial. Preferiblemente, la TRA y la TRB comprenden al menos una región variable, o una región variable y constante, por ejemplo, la región variable y/o constante que tiene al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% de identidad de secuencia con una región de TCR variable o constante humana. Para la terapia adoptiva de células T, se prefiere que la construcción de TCR sea un TCR que comprende cadenas alfa y beta de TCR de longitud completa que comprenden regiones variables, constantes y transmembrana.

[0064] La construcción también puede ser una proteína de fusión, por ejemplo, regiones variables de las cadenas de TCR pueden estar fusionadas a dominios de Ig, por ejemplo, un dominio constante de IgG, preferiblemente, dominios de anticuerpo anti-CD3 en una proteína de fusión de la invención, por ejemplo, para proporcionar reactivos de TCR monoclonales solubles para reconocer células malignas que expresan el pMHC respectivo en la superficie celular y se acoplan a las células T mediante, por ejemplo, un dominio de reconocimiento anti-CD3 para proporcionar funciones efectoras a las células diana (63).

[0065] Las construcciones de cadena única (scTCR) están abarcadas, así como construcciones de TCR heterodiméricas. Una scTCR puede comprender una región variable de una construcción de una primera cadena de TCR (por ejemplo, una cadena alfa) y una segunda cadena de TCR completa (de longitud completa) (por ejemplo, una cadena beta), o viceversa. Además, la scTCR puede comprender opcionalmente uno o más enlazadores que unen los dos o más polipéptidos. El enlazador puede ser, por ejemplo, un péptido que une dos cadenas individuales, tal como se describe en el presente documento. También se proporciona dicha scTCR de la invención, que se fusiona con una citoquina, por ejemplo, una citoquina humana, tal como IL-2, IL-7 o IL-15.

[0066] La construcción de TCR de acuerdo con la invención también puede proporcionarse en forma de un complejo multimérico, que comprende al menos dos moléculas scTCR, en la que dichas moléculas scTCR están cada fusionadas a al menos un resto de biotina, y en la que dichas scTCR están interconectadas por interacción biotinaestrepavidina para permitir la formación de dicho complejo multimérico. También se proporcionan complejos multiméricos de un orden superior, que comprenden más de dos, por ejemplo, cuatro, scTCR de la invención.

[0067] La construcción de TCR de la invención puede modificarse para comprender una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas (por ejemplo, partículas de oro o partículas magnéticas).

[0068] La invención también se refiere a una célula huésped, preferiblemente, una célula T CD8+ que comprende un ácido nucleico que codifica la TRA y TRB de una construcción de TCR de la invención, a saber, una construcción de TCR específica para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 y que expresa dicha construcción de TCR. La TRA y el TRB se expresan preferiblemente a partir de un promotor heterólogo, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. La célula T es preferiblemente una célula T humana. Puede aislarse de un paciente infectado con el virus relevante, en particular, un paciente que padece una neoplasia maligna asociada con dicho virus, tal como cáncer de cuello uterino, cáncer anogenital y cáncer de cabeza y cuello en el caso del VPH. El paciente expresa el MHC al que está restringido el epítopo reconocido por el TCR. La célula T puede ser una célula T de memoria central o una célula T original.

[0069] La invención también se refiere a dicha célula huésped, por ejemplo, célula T, o un ácido nucleico de la invención para usar en medicina, por ejemplo, en una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica puede usarse para el tratamiento de un paciente infectado con

a) el virus del papiloma humano 16, en el que el TCR es específico para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 y en el que el paciente es positivo en HLA-B*15:01.

[0070] Para uso en medicina, se emplea la construcción de TCR que comprende tanto TRA como TRB, ya sea en forma de ácido nucleico, proteína o células T. Puede ser útil cribar los pacientes infectados con VPH para la expresión del antígeno de E5 antes de la terapia, y tratar solo aquellos pacientes con expresión de E5.

La composición farmacéutica también puede ser para usar en la prevención de la infección o en la reducción de la infección con un virus del papiloma humano 16, en la que el TCR es específico para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 y en la que el paciente es positivo HLA-B*15:01.

[0071] Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas en las que el TCR es específico para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 y en las que el paciente es positivo en HLA-B*15:01 pueden utilizarse para la prevención del cáncer de cuello uterino en un paciente infectado con VPH16 por ejemplo, si se detectan lesiones premalignas de alto grado del cuello uterino.

[0072] La invención también se refiere a un procedimiento de tratamiento de un paciente en necesidad del mismo (por ejemplo, infectado con VPH16, o que sufre de una enfermedad maligna asociada con dicho virus), o de reducción de la infección con el virus, o los síntomas de dicha infección, que comprende administrar a dicho paciente una célula T recombinante adecuada, o un ácido nucleico de la invención.

[0073] La invención también se refiere a un ácido nucleico que codifica un fragmento de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que comprende un epítopo, o un fragmento peptídico de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que comprende un epítopo, en el que el epítopo es capaz de ser reconocido por la construcción de TCR de la célula T de la invención, en el que el epítopo se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID No: 47, 51 y 52. Tales fragmentos de E5 pueden ser utilizados ventajosamente en la vacunación, por ejemplo, para la vacunación de péptidos largos sintéticos. Preferiblemente, el ácido nucleico codifica un epítopo, o el péptido consiste en un epítopo, que puede identificarse mediante el procedimiento de la invención para la identificación de un epítopo. Preferiblemente, el epítopo es un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 capaz de ser reconocido por la construcción TCR descrita anteriormente. El epítopo de E5, que se ha identificado por primera vez mediante el procedimiento de la invención, se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4751 y 52.

[0074] La invención también se refiere a dicho ácido nucleico que codifica dicho fragmento de péptido E5 o dicho epítopo, o a dicho fragmento de péptido o epítopo para usar en medicina, preferiblemente, para prevenir la infección (o reducir la infección) con el virus del papiloma humano 16, para la prevención de cáncer de cuello uterino en una paciente infectado con VPH16, por ejemplo, si se detectan lesiones premalignas de alto grado del cuello uterino, o para el tratamiento de la infección por VPH16, en particular, un tumor maligno inducido por VPH16. Las vacunas que proporcionan dicho epítopo pueden administrarse a sujetos, por ejemplo, pacientes, que son positivos en HLA-B*15: 01.

[0075] La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende

a) un ácido nucleico que codifica un fragmento de oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consiste en un epítopo o

b) un fragmento peptídico de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consiste en un epítopo

en la que el epítopo es capaz de ser reconocido por la construcción de TCR de la célula T de la invención, en la que el epítopo de E5 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51 y 52, para usar en prevenir la infección con el virus del papiloma humano 16 en un sujeto, o para usar en el tratamiento de un paciente infectado con el virus del papiloma humano 16, en el que el sujeto o paciente es positivo en HLA-B*15:01.

[0076] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que pretenden ejemplificar la invención, y no limitar su alcance. Todas las realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden combinarse.

Leyendas de las Figuras

[0077]

Figura 1. Vectores de HLA retrovirales. Esquema del vector g-retroviral MP71 que contiene diferentes alelos de HLA fusionados a un marcador de expresión (a) IRES-GFP o (b) IRES-CFP.

Figura 2 Biblioteca de células de MHC de clase I. Las células K562 se transdujeron con el vector retroviral MP71 que incluyen un cassette (a) MHC-IRES-GFP o (b) MHC-IRES-CFP. Se muestra una selección de gráficos FACS de 10 transducciones de MHC que cubren todos los alelos de MHC de clase de dos donantes de células T. La expresión de GFP y CFP indica los índices de transducción. La expresión de superficie de MHC de células positivas para GFP o CFP se muestra mediante tinción de anticuerpos de MHC de clase I y se indica en porcentajes.

Figura 3 Ejemplos de expresión de antígeno estable en la biblioteca de células MHC. Las células K562 se transdujeron de manera estable con antígeno (E5 de VPH16) fusionado a un marcador IRES-mCherry y se detectaron mediante citometría de flujo midiendo la expresión de mCherry. Los alelos de MHC I se fusionan con el marcador IRES-GFP y la expresión se indica mediante detección por citometría de flujo de GFP. Los porcentajes de células dobles positivas a MHC-IRES-GFP/antígeno-IRES-mCherry se representan en los gráficos FACS. (a) Las células K562 de la biblioteca de células MHC se transdujeron de manera estable con E7. (b) Las células K562 transducidas con MHC (HLA-B*15:01) se transdujeron de manera estable con las construcciones de microgenes truncados de E5, que se usaron para el mapeo de epítopos (nt, nucleótidos).

Figura 4 Expresión de antígenos de ivtRNA en células diana. Las células K562 transducidas con MHC individuales que expresan el marcador IRES-CFP se transfectaron mediante electroporación con ivtRNA que codifica GFP. La expresión de GFP se midió 5 h después de la electroporación y sirvió como control para la eficacia de la transfección.

Figura 5 Inducción de la respuesta de células T específicas de antígeno tras el cocultivo con células K562 de la biblioteca de células MHC. (a) TCR-B23 y (b) TCR-S51 se transdujeron de forma estable en células T, que se tiñeron para expresión de CD8 y TRB transgénica y se analizaron por citometría de flujo. (c) Las células T transducidas con TCR se cocultivaron con células diana K562-B*27:05 3 h después de la transfección con ivtARN coE5. La expresión de CD137 se midió por citometría de flujo. Las células diana K562-B*27:05 transfectadas con H2O sirvieron como control negativo.

Figura 6 mDC expresan GFP de ivtARN. Se generaron mDC a partir de monocitos adherentes a la placa. (a) Los histogramas de citometría de flujo muestran mDC que expresan las moléculas de activación de células T CD80, CD83 y CD86 (líneas negras) en comparación con los controles de isotipo (áreas grises). (b) Cuatro a seis horas después de la transfección con 15 pg de ivtARN de antígeno, se midió la expresión de GFP. Se indican los porcentajes de DC GFP+.

Figura 7 Cribado de células T específicas de virus. Las células T, que habían sido estimuladas específicamente de antígeno con mDC autólogas, se cultivaron conjuntamente con células K562 que expresan seis MHC I individuales correspondientes de la biblioteca de células MHC. (a) El sobrenadante del cocultivo se analizó para la liberación de IFNg con ELISA. (b) Las células del mismo pocillo se analizaron por citometría de flujo para determinar los porcentajes de células T CD137+ de CD8+.

Figura 8 Clasificación por FACS de células T específicas de virus. (a) Las células T, que mostraron reactividad a pp65 (Fig. 7b), se cocultivaron con células K562 que expresaban HLA-B*07:02 transfectadas con pp65 de la biblioteca de células MHC. (b) Las células T reactivas con E5 (Fig. 7b) se cultivaron conjuntamente con células K562 que expresaban HLA-B*15:01 transfectadas con E5 de la biblioteca de células MHC. Los linfocitos individuales de ambos cocultivos se controlaron en FSC/SSC y las células que expresan CD137 de las células CD8 se clasificaron mediante FACS para su posterior análisis de TCR.

Figura 9 Expresión y análisis funcional de combinaciones de cadenas alfa de TCR y beta de TCR. (a) Las combinaciones de cadenas alfa de TCR y beta de TCR se expresaron retroviralmente en PBMC de donantes sanos. La expresión de TCR transgénica en células T se midió mediante citometría de flujo después de la tinción de anticuerpos para CD8 y el segmento de cadena beta de TCR constante murino. Las células T no transducidas (ut) se usaron como control negativo. El resultado es representativo de dos experimentos independientes con diferentes donantes de PBMC. (b) Las células T transducidas con las diferentes combinaciones de cadenas alfa de TCR y beta de TCR se cocultivaron con células diana K562-B*15:01 y K562-B*07:02 transfectadas con antígeno (E5 de VPH16 o pp65 de CMV), respectivamente. La liberación de IFNg de las células T transducidas con alfa de TCR/beta de TCR se midió mediante ELISA. Los resultados se muestran como media /- SEM de duplicados.

Figura 10. Generación de PBMC modificadas con gen de TCR con casetes transgénicos de TCR optimizados. Se realizó la transducción retroviral de PBMC con casetes transgénicos de TCR. Los índices de transducción se evaluaron mediante la tinción de anticuerpos del TRBC murino seguido del análisis de citometría de flujo. Los resultados son representativos de los experimentos con PBMC de dos donantes diferentes (ut, PBMC no transducidas).

Figura 11 Mapeo de la secuencia antigénica de E5 de VPH16 (a) E5 de tipo salvaje de longitud completa (wt) (252 nt), versión de E5 optimizado en codones (co) (252 nt) y versiones de minigenes truncados en 3' (63-189 nt) de E5wt se fusionaron con un marcador IRES-mCherry, se clonaron en el vector retroviral MP71 y se expresaron en células diana K562-B*15:01. Se indica la longitud de las secuencias de genes que comienzan con A del codón de inicio ATG. (b) Las células T transducidas con E5 de TCR se cultivaron conjuntamente durante 18 h con células diana K562-B*15:01 que portaban una de las versiones del gen de E5. La liberación de IFNg se determinó por ELISA. Los resultados se muestran como media /- SEM de duplicados.

Figura 12 Mapeo de epítopos del TCR específico de E5 de VPH16 y el TCR específico de pp65 de CMV. (a) Los epítopos de E5 de VPH16 predichos por IEDB como epítopos potenciales presentados en HLA-B*15:01 se agruparon de acuerdo con las similitudes de secuencia. La primera fila (p4-p17) (SEQ ID NOs: 1, 49-61) indica el rango de péptidos en la predicción de epítopos (Tabla 2). La segunda fila (unidades) la longitud del péptido. (b) Las PBMC transducidas con E5 de TCR se cocultivaron con células diana K562-B*15:01 pulsadas con péptido y se determinó la liberación de IFNg por ELISA. Las células T no transducidas (ut) se usaron como control negativo. (c) El péptido p1 de pp65 de CMV (SEQ ID NO: 10) representa un epítopo previamente descrito de pp65 presentado en HLA-B*07:02 (66,67). (d) PMBCs transducidas con TCR pp65 se cocultivaron con células diana K562-B*07:02 pulsadas con p1 de pp65. La liberación de IFNg se midió por ELISA. Todos los resultados de ELISA se muestran como media /- SEM de duplicados.

Ejemplos

1.1 Generación de una biblioteca de vectores de MHC

[0078] Los genes para los alelos de MHC I comunes se clonaron en el vector g-retroviral MP71 (68-70) para generar primero una biblioteca de vectores de MHC, para generar células K562 que expresan MHC individuales (23), que se usaron como APC artificiales que comprenden la biblioteca de células de MHC. Las versiones alélicas de los genes de HLA-A, -B o -C son altamente polimórficas. Las secuencias son de acceso abierto en la base de datos de IMGT/HLA. Sin embargo, los extremos 5' y 3' de diferentes tipos tienen altas similitudes de secuencia, lo que dificulta la amplificación por PCR de un gen de HLA específico de un ADNc de una célula. Para superar este problema, se generó ADNc a partir de células linfoblastoides (LCL) obtenidas del Internationa1Histocompatibility Workshop, que eran homocigotas para los alelos HLA-A, -B y -C deseados para permitir la amplificación eficiente de genes por PCR. Los fragmentos de HLA amplificados se fusionaron con un marcador de expresión IRES-GFP o IRES-CFP y se clonaron en el vector de expresión retroviral MP71 (Fig. 1).

1.2 Generación de la biblioteca de células de MHC

[0079] La línea celular K562 eritroleucémica (20) se utilizó como andamio de APC artificial para la generación de la biblioteca de células de MHC. Las células K562 carecen de expresión endógena de moléculas de MHC de clase I aunque expresan microglobulina p-2, un componente ubicuo de los complejos de MHC funcionales. Sin embargo, tras la transfección con un alelo de cadena a de MHC de clase I, se puede demostrar que las células poseen una maquinaria de procesamiento de antígeno funcional con expresión de superficie de MHC, lo que convierte a K562 en un andamio atractivo para la generación de APC artificiales (19, 23, 24) . La transducción estable de células K562 con alelos de HLA individuales se realizó usando la biblioteca de HLA basada en el vector retroviral MP71. La producción de sobrenadante retroviral en células de empaquetamiento 293T y la transducción se realizaron, tal como se ha descrito (72), y dieron como resultado poblaciones que expresan GFP o CFP, tal como se confirmó mediante análisis de citometría de flujo. El ensamblaje funcional y la expresión en superficie de los complejos de MHC se indicaron mediante la tinción de anticuerpos para MHC de clase I de poblaciones de células positivas para GFP o CFP (Fig. 2). Todos los alelos de HLA transducidos en células K562 se expresaron en la superficie celular. Para un análisis posterior de los TCR aislados, se generaron paneles de células K562 que cubren los seis alelos de MHC de clase I del donante de células T original.

1.3 Expresión de antígeno en la biblioteca de células de MHC

[0080] Para usar células K562 de la biblioteca de células MHC como APCs artificiales, se transdujeron células K562 que expresaban células de MHC individuales con el vector retroviral MP71 para expresar de manera estable las construcciones antigénicas en el contexto de un único alelo de MHC. La transducción retroviral se realizó, tal como se ha descrito (71). La expresión de antígeno en células K562 permitió el procesamiento endógeno y la presentación de epítopos en el contexto de alelos de MHC individuales. Muchos antígenos (E5, E6 y L1 de VPH16, pp65 e IE-1 de CMV) no pudieron detectarse fácilmente mediante tinción intracelular con FACS. Además, los anticuerpos no estaban disponibles para los antígenos truncados de E5 de VPH16 (construcciones de minigenes), que se utilizaron para el mapeo de epítopos, así como las secuencias de nucleótidos mutadas. Por lo tanto, todos los antígenos se fusionaron con un marcador IRES-mCherry para confirmar indirectamente la expresión por citometría de flujo (Fig.

3).

[0081] Una segunda estrategia para expresar secuencias antigénicas en células diana fue transfectar ivtARN mediante electroporación. Por lo tanto, las secuencias de antígeno se clonaron en vectores de expresión para permitir la generación de ivtARN dependiente del promotor T7 y la posterior poliadenilación usando kits de mMessage mMachine y poli (A) de Ambion (Life Technologies). La electroporación de ivtARN en células K562 se realizó con un BioPad GenePulser usando un protocolo de electroporación exponencial. En general, se usó ivtARN que codifica GFP como control para la eficiencia de la electroporación. La figura 4 muestra que las células K562 transducidas con HLA expresaron GFP después de la electroporación con ARNt ivt.

1.4 Inducción de la respuesta de células T específicas de antígeno por células diana de la biblioteca de células de MHC

[0082] En los experimentos anteriores, se demostró que el células K562 transducidas con HLA de la biblioteca de células MHC expresan un antígeno definido después de la transducción retroviral o después de la transfección con el ivtARN de antígeno. El siguiente paso fue probar la capacidad de la biblioteca de células de MHC para procesar endógenamente y presentar epítopos para inducir respuestas de células T específicas de antígeno. Se ha descrito que la estimulación específica de antígeno HLA de las células T a través del TCR conduce a la regulación por incremento del marcador de activación temprana CD137 (32-34).

[0083] Para esto, se utilizaron dos TCR bien caracterizados (B23, S51), que se aislaron de clones de células T específicas de antígeno, que reconocían un epítopo endógenamente procesado y presentado en HLA-B*27:05. Las PBMC diseñadas para expresar los TCR (Fig. 5a, b) se usaron para analizar la capacidad de células K562 que expresaban el antígeno de la biblioteca de células de MHC para activar las células T específicas de antígeno. La activación de las células T se midió mediante la expresión de CD137 mediante citometría de flujo. Tal como se muestra en la Fig. 5c, todas las PBMC modificadas con TCR expresaron el marcador de activación CD137 después de 20 h de cocultivo con células diana K562-B*27:05 transfectadas con ivtARN de antígeno. La cantidad de células T CD8+/CD137+ fue de alrededor del 6% para las células T modificadas con TCR-B23 y del 8% para las células T modificadas con TCR-S51, lo que refleja la cantidad total de células T modificadas con TCR/CD8+ (Fig. 5a, b) utilizadas para el cocultivo. En conclusión, las células K562 procesaron endógenamente el epítopo antigénico y lo presentaron en HLA-B*27:05 transgénico, lo que condujo a la estimulación de todas las células T específicas de antígeno en la muestra, medida por la expresión de CD137. Además, la expresión de CD137 se correlacionó con la liberación de IFNg específica de antígeno de células T transducidas con TCR, medida por ELISA.

2.1 Expansión específica de antígeno de células T

[0084] A continuación, se describe la configuración de una estrategia de cribado para detectar y aislar los TCR con especificidad de antígeno deseada. Se puede transferir a diferentes antígenos, por ejemplo, de diferentes virus o diferentes antígenos específicos de tumor.

[0085] Por lo tanto, se generaron DC y se maduraron a partir de monocitos adherentes a placa (72,73) utilizando un medio libre de endotoxina. El estado de maduración de las DC maduras (mDC) se confirmó mediante la tinción de los marcadores de activación de células T CD80, CD83 y CD86, así como la expresión de MHC II, seguida de citometría de flujo (Fig. 6). El ivtARN de antígeno se generó a partir de seis antígenos virales (pp65 e IE1 de CMV, L1, E5, E6 y E7 de VPH16), que representaban secuencias de genes de tipo salvaje de referencia de longitud completa de VPH16 y CMV, tal como se indica en la base de datos UniProt de acceso abierto. Las mDC se transfectaron con ivtARN de antígeno para asegurar la presentación de epítopos procesados y presentados de forma natural en la superficie celular (74). Se usó ivtARN que codifica GFP como control de transfección. La expresión se midió 4-6 h después de la transfección (Fig. 6). Las mDC que expresan antígeno se usaron en una relación PBMC a DC de 10:1. La estimulación de PBMC con DC se realizó usando un medio que contenía suero humano al 10% (74,75). IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (5 ng/ml) recibieron el medio a partir del día 2 de estimulación para favorecer la proliferación de células T. Tres veces a la semana se proporcionó IL-2 (20 U/ml) e IL-7 (5 ng/ml) al cultivo. Las PBMC proliferantes se dividieron en proporciones de 1:2 a 3:4.

2.2 Detección de células T específicas de virus

[0086] Se llevó a cabo una segunda estimulación 14 días después de la primera ronda de estimulación usando mDCs autólogas que expresan uno de los seis antígenos virales. Después de 28 días, los 12 cultivos de células T se cribaron para determinar la reactividad a combinaciones específicas de antígeno-MHC empleando la biblioteca de células de MHC (Fig. 2). Las células de la biblioteca de células de MHC se transfectaron con ivtARN de antígeno mediante electroporación y cada cultivo de células T generado contra un antígeno se cribó para determinar la reactividad al antígeno en combinación con un tipo de MHC. El contacto de la biblioteca con las células T se realizó preferiblemente 18-22 h para lograr la activación óptima de las células T específicas de antígeno dentro de la muestra de células T. Se evitó la adición de citoquinas durante el contacto para evitar la activación inespecífica de las células T. La liberación de IFNg de células T específicas de antígeno se midió mediante ELISA. Además, las células T en el cocultivo se analizaron para la expresión de CD137 mediante citometría de flujo (33).

[0087] Las células T mostraron reactividad específica a pp65 y E5 en combinación con HLA-B*7:02 y HLA-B*15:01, respectivamente. La reactividad de células T específicas de antígeno-MHC podría medirse mediante la liberación de IFNg y la regulación por increment de CD137 en la superficie de las células T. Por lo tanto, la combinación de ELISA de liberación de citoquinas y el análisis citométrico de flujo del marcador de activación de células T representa un sistema robusto de lectura de dos procedimientos para detectar respuestas de células T específicas de antígeno-MHC.

2.3 Clasificación de células T específicas de virus para analizar el repertorio de TCR

[0088] Las células T, que mostraron respuestas específicas a una combinación de antígeno-MHC en ambos ensayos, se seleccionaron para la clasificación FACS para analizar el repertorio de TCR. Las células T, que se expandieron con pp65 de CMV, se cultivaron conjuntamente con células diana K562-B*07:02 transfectadas con pp65, y las células T CD137+ se separaron del cultivo. Casi la mitad de las células T CD8+ eran CD137+ en esta configuración. El trece por ciento de las células T CD8+ expresó CD137 tras el cocultivo con células diana K562-B*15:01 transfectadas con E5 de VPH16.

[0089] Después de la clasificación de las células T específicas de antígeno-MHC, se aisló ARN y se generó ADNc usando el kit de amplificación de SMARTer RACE cDNA (Clontech) para la PCR 5'-RACE de los genes de alfa y beta de TCR. La amplificación por PCR generó fragmentos de genes de alfa y beta de TCR, que representaban cuantitativamente la cantidad de cada clonotipo de células T en la muestra de células T clasificada por FACS. Los productos de PCR de fragmentos de genes de alfa y beta de TCR se ligaron en vectores de secuenciación usando el sistema de clonación TOPO® (Invitrogen, Life Technologies), se transformaron en bacterias y se cultivaron en placas que contenían medio selectivo. Se consideró que cada colonia bacteriana contenía un vector de secuenciación con un fragmento del gen de alfa o beta de TCR de la PCR. Las preparaciones de ADN de vector de numerosas colonias bacterianas fueron seguidas por la secuenciación de los insertos del vector (fragmentos de gen de alfa o beta de TCR). Los resultados de la secuenciación de cada colonia bacteriana se analizaron utilizando el IMGT/V-Quest basado en la web. Las frecuencias de cadenas alfa o beta de TCR idénticas reflejaron la proporción de clonotipos de células T idénticos dentro de la muestra de células T clasificada por FACS. A continuación, se realizó la coincidencia de frecuencia de las cadenas alfa y beta de TCR para reconstituir los TCR funcionales, que habían representado la liberación de IFNg específica de antígeno-MHC y la regulación por incremento de CD137.

[0090] El análisis de TCR reveló que las cadenas TRAV17 y TRAV38-2 estaban presentes en casi el 40% de todas las células T clasificadas tras la respuesta a E5 de VPH16 y HLA-B * 15:01. Se encontró que tres cadenas variables beta de TCR estaban presentes en el 21-32% de las células T (Tabla 1). Se supuso que cada una de las dos cadenas alfa de TCR podría ensamblar un TCR funcional específico de E5 con una de las tres cadenas beta de TCR. Por lo tanto, había seis combinaciones posibles de cadenas alfa de TCR y beta de TCR candidatas para ensamblar un TCR funcional específico para E5 de VPH16.

[0091] Las células T clasificadas para reactividad a pp65 de CMV y HLA-B*7:02 tenía un TCR predominante con una cadena TRAV17 y una cadena TRBV7-9, estando ambas presentes en aproximadamente el 70% de las colonias de alfa de TCR y beta de TCR, respectivamente (Tabla 1).

[0092] En resumen, el análisis de TCR mostró que la clasificación de CD137 de las células T específicas de antígeno-MHC está acompañado por un fuerte enriquecimiento de algunas cadenas alfa y beta de TCR predominantes, que aparecen a alta frecuencia y que puede reconstituir TCR específicos de antígeno-MHC funcionales.

Tabla 1 Análisis de TCR

MHC clase I Segmento V_____CDR-3_________________ SEQ ID NO: Frecuencia_____% del total Antígeno VPH16E5

HLA-B*15:01 TRAV17*01 F CAESEYGNKLVF 2 10 38,5

homsap.

TRAV38- CAYRSWNYGQNFVF 19 10 38,5 2/DV8*01 F

homsap.

TRAV8-6*02 F CAVSEPAAG NKLTF 20 2 7,7

homsap.

TRAV26-2*01 F CILRGAGGTSYGKLTF 21 1 3,8

homsap.

TRAV8-6*02 F CAVITNAGKSTF 22 1 3,8

homsap.

TRAV25*01 F CAGPPSGTYKYIF 23 1 3,8

homsap.

TRAV6*02 (F) CALPMEYGNKLVF 24 1 3,8

homsap.

TRBV5-1*01 F CASSSRGHQNTGELFF 25 6 21,4

homsap.

TRBV12-3*01 F CASSPEGEGVTGELFF 26 8 28,6

homsap.

TRBV6-5*01 F CASSYRQQETQYF 6 9 32,1

homsap.

TRBV5-1*01 F CASTLRGYTEAFF 27 1 3,6

homsap.

TRBV5-5*02 (F) CASSPWADSNQPQHF 28 1 3,6

homsap.

TRBV20-1*01 F CSAGTSGGPAYEQYF 29 1 3,6

homsap.

TRBV27*01 F CASSSPLADDYNEQFF 30 1 3,6

homsap.

TRBV6-2*01 F CASSHRRAHRAREQYF 31 1 3,6

... homsap.

Antígeno VPH16E5

HLA-B*07:02 TRAV14/DV4*01 CAMREGKDSSYKLIF 32 2 8,7

F homsap.

TRAV17*01 F CATVIRMDSSYKLIF 11 17 73,9

homsap.

TRAV8-1*01 F CAVNRGGSNYKLTF 33 1 4,3

homsap.

TRAV3*01 F CAVRDIGGFKTIF 34 1 4,3

homsap.

TRAV1-2*01 F CALDGQKLLF 35 1 4,3

homsap.

TRAV4*01 F CLVGGLRGNVLHC 36 1 4,3

homsap.

TRBV7-9*03 F CASSLIGVSSYNEQFF 15 13 68,4

homsap.

TRBV27*01 F CASRLGGGNYNEQFF 37 4 21,1

homsap.

TRBV20-1*01 F CSASPRDRKFSGNTIYF 38 1 5,3

homsap.

TRBV7-9*03 F CASSSHDNQGAKSPLHF 39 1 5,3

homsap.

Las cadenas alfa y beta de TCR se amplificaron con cebadores inversos específicos de TRAC y TRBC de ADNc 5'-RACE de células T, que habían mostrado respuestas de células T específicas de antígeno-MHC. El análisis de TCR se realizó con IMGT/V-Quest. El uso del gen V(D)J y las secuencias CDR3 especifican cadenas alfa de TCR o beta de TCR idénticas. Se indican las frecuencias de colonias que contienen una cadena alfa de TCR o beta de TCR. El porcentaje del total indica la proporción de colonias con cadenas alfa de TCR o beta de TCR idénticas.

2.4 Análisis funcional de combinaciones de cadenas alfa de TCR y beta de TCR

[0093] Para la expresión transgénica de TCR, cada gen de la cadena alfa de TCR y beta de TCR se clonó en el vector g-retroviral MP71. La expresión en la superficie celular y el análisis funcional de los TCR se realizaron después de la transducción estable de PBMC con diferentes combinaciones de genes de alfa de TCR y beta de TCR.

[0094] Las regiones variables de genes de cadena alfa de TCR y beta de TCR predominantes (TRAV y TRBV), que son responsables de la unión péptido-MHC (pMHC) I, se fusionaron a segmentos de genes de cadena alfa de TCR y beta de TCR constantes murinos optimizados en codones (mTRAC y mTRBC) para permitir el emparejamiento preferencia! de cadenas de TCR transgénicas después de la transducción retroviral de células T (39, 40, 71). La tinción de los TCR transgénicos con un anticuerpo específico para el mTRBC fue seguida por un análisis de citometría de flujo y mostró que todas las combinaciones de cadenas TRA/TRB se expresaron en PBMC (Fig.

9a). Sin embargo, los índices de transducción de diferentes combinaciones variaron entre 6-25%. Para el análisis funcional, se probó la reactividad de las células T transducidas con TCR a las células diana K562-B*15:01 o K562-B*07:02, que se transfectaron mediante electroporación con ivtARN de antígeno E5 de VPH16 o pp65 de CMV, respectivamente. Sorprendentemente, las células T que expresan TRAV17 (SEQ ID NO: 3) en combinación con TRBV6-5 (SEQ ID NO: 7) reconocieron las células diana transfectadas con E5, mientras que ninguna de las otras cinco combinaciones TRA/TRB mostró reactividad específica de antígeno a E5 (Fig. 9b). Por lo tanto, TRAV17 en combinación con TRBV6-5 reconstituyó un TCR específico de antígeno funcional. La única combinación candidata TRA/TRB de células T reactivas al CMV (TRAV17 (SEQ ID NO: 12) y TRBV7-9 (SEQ ID NO: 16)) mostró un reconocimiento específico de pp65 de las células diana K562-B*07:02. Las élulas T transducidas por TRA/TRB no mostraron reactividad de fondo a células diana transfectadas con H2O (Fig. 9b), permitiendo así la identificación clara de los TCR específicos de antígeno-MHC funcionales.

[0095] En conclusión, las reconstituciones de los TCR de clonotipos de células T específicas de antígeno se lograron a través de la combinación de cadenas TRA y TRB, que se encontraron en altas frecuencias en muestras de células T clasificadas por FACS. Este enfoque, que se basó en el uso de la biblioteca de células de MHC pudo lograr el cribado, detección y aislamiento de TCR con la especificidad de antígeno deseada.

2.5 Optimización de los TCR específicos de VPH y CMV para la expresión transgénica en PBMC

[0096] Para aumentar la eficiencia de la expresión de TCR transgénico, se aplicaron varias optimizaciones de secuencias transgénicas de TCR (71). Las secuencias de las cadenas TRA y TRB fueron optimizadas por codones y los segmentos de genes de TRAC y TRBC humanos fueron reemplazados por sus homólogos murinos para aumentar la unión preferencial de las cadenas de TCR transgénicas y reducir el emparejamiento con cadenas de TCR endógenas expresadas por las células T receptoras (SEQ ID NO: 5, 9, 14, 18). El gen de TRB optimizado se unió a continuación a través de un elemento p2a a los genes de TRA y los casetes transgénicos de TCR individuales resultantes (específicos de E5: SEQ ID NO: 40, específicos de pp65: SEQ ID NO: 41) se clonaron molecularmente en el vector g-retroviral MP71. Las partículas retrovirales que incluían los casetes transgénicos de TCR optimizados se generaron mediante una transfección de tres plásmidos de células 293T y las PBMC de donantes se transdujeron de manera estable con partículas retrovirales que codificaban los TCR (70). Las células T modificadas con el gen de TCR dentro de la muestra de PBMC se analizaron por citometría de flujo después de la tinción de anticuerpos de la TRBC murina transgénica. Los índices de transducción de TCR del 45% para el TCR específico de E5 (TRAV17 TRBV6-5, SEQ ID NO: 40) y el 37% para el TCR específico de pp65 (TRAV17 TRBV7-9, SEQ ID NO: 41) pudieron lograrse en las PBMC, en las que el 27% y el 22%, respectivamente, fueron positivos para CD8 y el TCR transgénico. En conclusión, la expresión de ^tC^r transgénico podría mejorarse notablemente del 6-7% cuando se usan los casetes transgénicos de cadena sencilla de TRA y TRB no optimizados, que se usaron para reconstituir los TCR funcionales, a aproximadamente el 40% cuando se usan los casetes transgénicos de TCR optimizados.

2.6 Mapeo de epítopos del TCR específico de E5 de VPH16

[0097] Después de la detección de clonotypes de células T que reconocen la combinación inmunogénica antígeno-MHC sin conocimiento previo de epítopos inmunogénicos, se realizó el mapeo de epítopos para revelar la secuencia peptídica exacta dentro de la proteína antigénica E5 de VPH16, que es reconocida por el TCR específico de E5. El TCR específico de E5 de VPH16 compuesto de las secuencias TRAV17 y TRBV6-5 era un TCR único, que no se ha descrito antes. Para mapear la secuencia antigénica reconocida por el TCR, se generaron versiones de minigenes truncados en 3' de E5 de VPH16 mediante PCR con cebadores que amplifican la región del gen de interés respectiva. Los minigenes de E5 se clonaron en el vector retroviral MP71 y se transdujeron de forma estable en células diana K562-B*15:01 (Fig. 11a). Las células T transducidas con el cassette del gen de TCR específico de E5 optimizado reconocieron las células diana que portaban la secuencia de minigenes de E5 de longitud completa y E5 de 189 nt, pero no minigenes de E5 de 126 y 63 nt, tal como se indica mediante la liberación de IFNg (Fig.

11b). Además, las células T transducidas con TCR para E5 liberaron IFNg independientemente de si las células objetivo albergaban secuencias de genes E5wt o E5co (Fig. 11b). En conclusión, el TCR para E5 de VPH16 fue específico para un epítopo dentro de la región de la proteína E5 entre los aminoácidos 42-63.

[0098] Para reducir los epítopos candidatos que pueden ser objeto de reconocimiento por TCR específico de E5, la predicción in silico de epítopos se realizó mediante el predictor combinado de epítopos de células T IEDB basado en la web, que integra las predicciones de la escisión proteasomal, transporte de TAP, procesamiento en ER y unión a MHC clase I. La predicción integrada de epítopos se realizó incluyendo péptidos de 8-14 unidades en un análisis. Los resultados de predicción de epítopos se calcularon como una puntuación total, que puede interpretarse como la probabilidad de que un péptido determinado sea procesado y presentado en una molécula de MHC en la superficie celular. La Tabla 2 incluye todos los epítopos (p1-p17) de la predicción con una puntuación total positiva usando la predicción constitutiva del proteasoma. A diferencia de las DC, las células K562 expresan un proteasoma constitutivo, que se asemeja a los proteasomas expresados en las células tumorales (76). Todos los epítopos, que no se expresaron a partir de la secuencia de aminoácidos 42-63 de E5 de VPH16, se excluyeron de un análisis adicional. Sorprendentemente, los tres primeros epítopos predichos (p1-p3) tuvieron que descartarse.

Tabla 2 Predicción de epítopos de E5 de VPH16

[0099] El resultado de la predicción integrada de epítopos de E5 de VPH16 se indica en la Tabla 2. El mejor epítopo predicho se clasificó en primer lugar. Los péptidos codificados dentro de la secuencia de aminoácidos 42-63 se muestran en negrita. Estos diez epítopos candidatos se agruparon de acuerdo con las similitudes de secuencia (Fig.

12a) y los péptidos se cargaron exógenamente en células diana K562-B*15:01. Las PBMC transducidas con TCR E5 reconocieron específicamente el epítopo p4 de E5 de VPH16 (SAFRCFIVY, SEQ ID NO: 1). Además, el TCR reconoció claramente todos los derivados alargados en N-terminal de SAFRCFIVY (SEQ ID NO: 1) incluyendo longitudes de péptidos no convencionales que confieren 12, 13 y 14 unidades para MHC I (Fig. 12b). HLA-B*15:01 puede tolerar la unión de péptidos que sobresalen en el extremo N-terminal. Por el contrario, ninguno de los otros péptidos fue reconocido, aunque se predijo que los péptidos p6 y p13 tenían mayores afinidades de unión a HLA-B*15:01 que p4.

[0100] En resumen, la predicción integrada de epítopos facilitó el mapeo del epítopo exacto reconocido por el TCR específico de E5. Sin embargo, el algoritmo no pudo predecir el epítopo inmunogénico, y fue necesario mapear la secuencia antigénica con minigenes truncados de E5 antes de la predicción del epítopo.

[0101] Las secuencias de TRAV17 y TRBV7-9 aisladas se parecían a un TCR específico de CMV. Las secuencias de TCR específicas para pp65 de CMV y restringidas a HLA-B*07:02 se han publicado con una diferencia de uno a cinco aminoácidos en las regiones CDR3 (66,67) (Tabla 1). Se ha descrito que estos TCR reconocían el epítopo de 10 unidades TPRVTGGGAM (SEQ ID nO: 10) de pp65 de CMV cuando se presentó en HLA-B*07:02. Aquí, las PBMC transducidas con TCR para pp65 se cocultivaron con células diana K562-B*07:02 cargadas con el epítopo p1 derivado de pp65 de CMV (^t P^rV^tG^g GAM, SEQ ID NO: 10) (Fig. 12a). De hecho, las células T transducidas con TCR reconocieron las células diana pulsadas con p1 y liberaron IFNg (Fig. 12b). Las PBMC transducidas con TCR para pp65 fueron específicos para p1, a pesar de las diferencias de secuencia en la región CDR3 en comparación con los TCR específicos pp65-B*07:02 publicados previamente.

[0102] En resumen, este enfoque permitió la identificación de un nuevo epítopo inmunogénico E5 de VPH16 y su correspondiente TCR y de un epítopo inmunodominante pp65 de CMV y su correspondiente TCR. Ambos TCR fueron específicos para epítopos procesados endógenamente y reflejaron la respuesta de células T causada por un solo clonotipo de células T en el cribado inicial basado en la biblioteca de células MHC. Por lo tanto, es posible un cribado imparcial de las respuestas de células T naturales y la identificación de TCR rápidamente después de la estimulación in vitro específica de antígeno con el procedimiento de la invención, sin conocimiento previo del epítopo, evitando así las limitaciones de los programas de predicción de epítopos para predecir respuestas de células T funcionales a un antígeno definido y evitando el cultivo de clones de células T desfavorables y que requieren muchos recursos. Este enfoque también se puede aplicar a TIL o células T residentes en tejidos y los cribados pueden extenderse a más antígenos derivados de patógenos y específicos de tumor, así como a cualquier antígeno que sea reconocido por un TCR.

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para preparar uno o dos ácidos nucleicos que codifican la construcción de la cadena alfa (TRA) del receptor de células T (TCR) y la construcción de la cadena beta de TCR (TRB) de una construcción de TCR específica para un epítopo de un antígeno definido presentado en un MHC humano, que comprende

(a) estimular células T aisladas de un donante humano con células presentadoras de antígeno profesionales humanas que presentan epítopos de dicho antígeno definido, para enriquecer células T específicas de antígeno; y (b) poner en contacto dichas células T enriquecidas en células T específicas de antígeno de la etapa (a) con una biblioteca de células, en la que cada célula expresa un único alelo de MHC humano, en el que la biblioteca comprende células que expresan todos los alelos de MHC I o MHC II presentes en el donante, y en la que las células de dicha biblioteca presentan epítopos de dicho antígeno definido; y

(c) seleccionar células T activadas por dicho contacto; y

(d) aislar los ácidos nucleicos que codifican las cadenas alfa de TCR y beta de TCR del TCR de dichas células T.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el MHC es MHC I, en el que la biblioteca de células comprende preferiblemente células K562 que expresan MHC I.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el procedimiento comprende además optimizar la secuencia, en el que dicha optimización consiste en

• optimizar el uso de codones de la TRA y TRB y/o

• combinar regiones variables humanas con regiones constantes murinas o regiones constantes murinas mínimas y/o

• maduración por afinidad de las secuencias de TCR y/o

• generación de moléculas receptoras solubles que contienen las regiones variables de los genes de las cadenas TRA y TRB y/o

• fusionar t Ra y TRB a través de un conector genético para proporcionar un único cassette transgénico que codifica ambas cadenas de una construcción de TCR funcional o preparar una construcción de TCR de cadena única, • generar ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden las regiones variables de los genes de las cadenas TRA y TRB, opcionalmente, que codifican además dominios de anticuerpos.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el ácido nucleico es un vector que comprende las TRA y TRB unidas operativamente a un promotor adecuado para la expresión en células T, en el que el vector se selecciona del grupo que comprende un vector g-retroviral, un vector lentiviral y un vector basado en transposones.

5. Procedimiento para preparar una célula huésped que expresa una construcción de TCR específica para un epítopo de un antígeno definido presentado en un m Hc , que comprende llevar a cabo el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y expresar dichos ácidos nucleicos que codifican las TRA y TRB en la célula huésped.

6. Procedimiento para identificar un epítopo capaz de ser presentado por un MHC en un antígeno definido, que comprende llevar a cabo las etapas (a) -(d) de la reivindicación 1 e identificar el epítopo capaz de activar células T transfectadas con ácidos nucleicos que codifican las TRA y TRB aisladas que constituyen la construcción de TCR, en el que el epítopo se prepara opcionalmente en forma de péptido o ácido nucleico.

7. Ácido nucleico que codifica una TRA y/o TRB de una construcción de TCR específico para un epítopo en complejo con un MHC I humano, en el que el epítopo es un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 restringida a HLA-B*15:01, que comprende la SEQ ID NO: 1,

en el que la TRA comprende una CDR3 que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y/o en la que la TRB comprende una CDR3 de la SEQ ID NO: 6 o que tiene solo una o dos sustituciones conservadoras en SEQ ID NO: 6.

8. Ácido nucleico, según la reivindicación 7, en el que la región variable de la TRA tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3;

y/o en el que la región variable de TRB tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7.

9. Célula huésped que comprende un ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, que codifica la TRA y TRB de una construcción de TCR específica para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16, y que expresa dicho TCR, en la que la célula huésped preferiblemente es una célula T CD8+.

10. Proteína codificada por el ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, que comprende preferiblemente TRA y TRB.

11. Composición farmacéutica que comprende la proteína, según la reivindicación 10, la célula T recombinante, según la reivindicación 9, o el ácido nucleico, según cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en la que la construcción de TCR comprende las TRA y TRB.

12. Composición farmacéutica, según la reivindicación 11, para usar en el tratamiento de un paciente infectado con el virus del papiloma humano 16, en la que la construcción de TCR es específica para un epítopo de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 en complejo con HLA-B*15:01 y en la que el paciente es positivo en HLA-B*15:01.

13. Ácido nucleico que codifica un fragmento de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consiste en un epítopo capaz de ser reconocido por la construcción de TCR de la célula T, según la reivindicación 9, en el que el epítopo E5 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, 51 y 52.

14. Fragmento peptídico de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consiste en un epítopo, en el que el epítopo es capaz de ser reconocido por la construcción de TCR de la célula T, según la reivindicación 9, en el que el epítopo E5 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 47, 51 y 52.

15. Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico, según la reivindicación 13, o el péptido, según la reivindicación 14.

16. Composición farmacéutica que comprende

a) un ácido nucleico que codifica un fragmento de oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consiste en un epítopo o

b) un fragmento peptídico de la oncoproteína E5 del virus del papiloma humano 16 que tiene una longitud de hasta 40 aminoácidos que consisten en un epítopo,

en la que el epítopo es capaz de ser reconocido por la construcción de TCR de la célula T, según la reivindicación 9, en la que el epítopo de E5 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 45, 47, 49, 51 y 52,

para usar en la prevención de la infección con el virus del papiloma humano 16 en un sujeto, o para usar en el tratamiento de un paciente infectado con el virus del papiloma humano 16, en el que el sujeto o paciente es positivo en HLA-B*15:01.