CN117164699A - 新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 - Google Patents
新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117164699A CN117164699A CN202310914221.9A CN202310914221A CN117164699A CN 117164699 A CN117164699 A CN 117164699A CN 202310914221 A CN202310914221 A CN 202310914221A CN 117164699 A CN117164699 A CN 117164699A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tcr
- nucleic acid
- novel coronavirus
- acid fragment
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 38
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 26
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 5
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 abstract 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 101710189078 Helicase Proteins 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical group SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 102000006707 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087408 alpha-beta T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒特异性TCR及其应用，所述TCR为C152‑1，其能够与TPSGTWLTY‑HLA‑B3501复合物和DTDFVNEFY‑HLA‑B3501复合物结合；所述C152‑1包含α链和β链，所述α链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“NSAFQY”、“TYSSGN”和“CAMRGGNQFYF”，所述β链的CDR1、CDR2和CDR3的序列依序为“MNHEY”、“SVGAGI”和“CASSYLLGAGELFF”。本发明的TCRC152‑1能够赋予正常细胞对新型冠状病毒抗原的反应性，为新型冠状病毒的预防和治疗提供了一种新的方案。
Description
技术领域
本发明属于新型冠状病毒治疗领域，具体涉及一种新型冠状病毒特异性TCRC152-1及其应用。
背景技术
研究发现，大部分新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)原始株感染或疫苗接种建立的新冠病毒特异性T细胞能够维持对新冠病毒突变株的反应性，发挥抗病毒作用(NARANBHAI V,NATHAN A,KASEKE C,et al.T cell reactivity to the SARS-CoV-2Omicron variant is preserved in most but not all individuals[J].Cell,2022,185(6):1041-1051.e6.)。因此，建立高效的特异性T细胞免疫对新冠病毒突变株的预防和治疗具有重要作用。
在病毒感染过程中，抗原递呈细胞将病毒抗原加工成抗原短肽，并与HLA分子结合形成稳定的抗原肽-MHC复合物表达在细胞膜上，特异性T细胞通过表面的T细胞受体(TCR)与之结合，在共刺激信号的协同下，引起一系列信号传导和生理功能，达到清除病毒的作用。TCR-T过继细胞疗法，主要将病人自体细胞经体外改造转入特异性识别新冠病毒的TCR，再回输到病人体内，从而达到高效清除病毒的目的。研究显示，将新冠病毒TCR转导到健康人T细胞表面，可以赋予正常T细胞对新冠病毒抗原的反应性(BRUNK F,MORITZ A,NELDE A,et al.SARS-CoV-2-reactive T-cell receptors isolated from convalescent COVID-19 patients confer potent T-cell effector function[J].European Journal ofImmunology,2021,51(11):2651-2664.)。因此，本领域技术人员致力于鉴定新冠病毒特异性TCR及其表位，为新冠病毒感染的TCR-T免疫细胞治疗提供重要依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型冠状病毒特异性TCR C152-1及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种新型冠状病毒特异性TCR，所述TCR为C152-1，其能够与TPSGTWLTY-HLA-B3501复合物和DTDFVNEFY-HLA-B3501复合物结合。TCR C152-1能够交叉识别新冠病毒N蛋白上的抗原肽TPSGTWLTY和ORF1蛋白上的抗原肽DTDFVNEFY，均由HLA-B3501分子递呈。
TCR C152-1包含α链和β链，所述α链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“NSAFQY”、“TYSSGN”和“CAMRGGNQFYF”，所述β链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“MNHEY”、“SVGAGI”和“CASSYLLGAGELFF”。
本发明的一种实现方式中，TCR C152-1的α链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，β链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
本发明的一种实现方式中，TCR C152-1为αβ异质二聚体，其包含TCR C152-1的α链恒定区TRAC*01和β链恒定区TRBC*02。
本发明的一种实现方式中，TCR C152-1的α链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列，β链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列。
本发明的一种实现方式中，TCR C152-1的α链和β链恒定区之间引入人工二硫键，将TRAC*01的第48位的苏氨酸和TRBC*02的第57位的丝氨酸突变成半胱氨酸；除此之外，将TRBC*02的第75位的半胱氨酸突变为丙氨酸；点突变后的TCR C152-1的α链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列，β链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列。
本发明的第二方面提供了一种编码本发明新型冠状病毒特异性TCR C152-1的核酸片段，所述核酸片段编码C152-1的α链和β链。
本发明的一种实现方式中，所述核酸片段包含编码α链可变区的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.7所示；编码β链可变区的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明的一种实现方式中，所述核酸片段包含如SEQ ID NO.8所示的α链全长核苷酸序列和如SEQ ID NO.12所示的β链全长核苷酸序列。
本发明的一种实现方式中，所述核酸片段包含如SEQ ID NO.9所示的密码子优化后的α链全长核苷酸序列和如SEQ ID NO.13所示的密码子优化后的β链全长核苷酸序列。
本发明的一种实现方式中，所述核酸片段包含如SEQ ID NO.10所示的点突变后的α链全长核苷酸序列和如SEQ ID NO.14所示的点突变后的β链全长核苷酸序列。
需要说明的是，以上具体的核苷酸序列只是本发明的一种实现方式中具体采用的核苷酸序列，可以理解，对于一个氨基酸而言可以有多个密码子；因此，根据密码子的简并性，在保障编码序列不变的情况下，除了以上限定的核苷酸序列以外，还可以有若干种编码相同TCR C152-1的α链或β链的核苷酸序列，都在本发明的保护范围内。
本发明的第三方面提供了一种含有本发明的核酸片段的慢病毒载体。
本发明的第四方面提供了一种含有本发明的核酸片段或本发明的慢病毒载体的T细胞系，其用于转导TCR C152-1，用于鉴定TCR C152-1的特异性并筛选TCR C152-1识别的新冠病毒表位。
本发明的第五方面提供了一种含有本发明的核酸片段或本发明的慢病毒载体的原代细胞，其用于转导TCR C152-1，用于构建转导TCR C152-1的原代细胞并检测细胞因子产生。
本发明的一种实现方式中，所述原代细胞为原代T细胞。
本发明的第六方面提供了一种新型冠状病毒特异性TCR的特异性鉴定方法，包括利用慢病毒体系构建表达本发明的T细胞系，利用T细胞系表达TCR C152-1，通过新型冠状病毒多肽筛选方法来鉴定TCR C152-1的特异性及其识别的抗原肽和HLA分子类型。
本发明的第七方面提供了本发明的TCR C152-1，或者本发明的核酸片段，或者本发明的慢病毒载体，或者本发明的T细胞系，或者本发明的原代细胞在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
由于采用以上技术方案，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种交叉识别两个新型冠状病毒表位的特异性TCR C152-1，其能够赋予正常细胞对新型冠状病毒抗原的反应性，为新型冠状病毒的预防和治疗提供了一种新的方案。
附图说明
图1为本发明新型冠状病毒特异性TCR C152-1的表位鉴定结果。
图2a为不同HLA型的LCL细胞递呈表位条件下，J76.8-C152-1的激活水平检测结果；图2b为K562-B3501细胞递呈表位条件下，J76.8-C152-1的激活水平检测结果。
图3为原代T细胞转导TCR C152-1的多聚体-PE染色结果。
图4为原代T细胞转导TCR C152-1的功能检测实验结果。
具体实施方式
本发明从一名感染新冠病毒的病人肺泡灌洗液TCR数据中鉴定得到了一个新冠病毒特异性TCR C152-1，发现该TCR C152-1能够交叉识别由HLA-B3501递呈的新冠病毒N蛋白抗原肽TPSGTWLTY和ORF1蛋白抗原肽DTDFVNEFY。具体地，本发明通过对感染新冠病毒的病人肺泡灌洗液样本的单细胞测序数据进行分析，选取TCR C152-1体外合成并插入到慢病毒载体中，通过慢病毒感染构建稳定表达TCR C152-1的T细胞系，利用新冠病毒多肽进行刺激，通过检测细胞的激活水平鉴定出了一个新冠病毒特异性TCR C152-1并明确了其识别的抗原肽和HLA分子。
本发明进一步将TCR C152-1通过慢病毒体系转导到原代T细胞表面，通过流式细胞仪检测转导后的细胞在抗原肽刺激条件下的细胞因子表达，证明了该TCR C152-1转导原代T细胞后具有功能活性。
本发明的主要优点在于：本发明鉴定得到的新冠病毒特异性TCR C152-1具有交叉识别两种不同新冠病毒蛋白抗原肽的能力，且转导原代T细胞后能够赋予正常细胞对新冠病毒抗原的特异性反应，为新冠病毒感染的防治提供了新的策略。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的限制。除非特别说明，以下实施例中采用的仪器、材料都是实验室常规使用的器材，所述技术方案均为本领域的常规技术。
本研究由深圳市第三人民医院伦理委员会批准(批准号：2021-210)，参与者提供了书面知情同意书，用于样本采集和后续分析。
实施例1：新冠病毒特异性TCR C152-1的获取和慢病毒包装
本发明对新冠病人肺泡灌洗液样本的单细胞测序结果分析得到TCR C152-1的核苷酸及氨基酸序列信息，TCR C152-1的α链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，α链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示序列，α链氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；β链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列，β链可变区核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示序列，β链氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列。分析结果显示，TCR C152-1的α链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“NSAFQY”、“TYSSGN”和“CAMRGGNQFYF”，β链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“MNHEY”、“SVGAGI”和“CASSYLLGAGELFF”。
根据测序信息对TCR C152-1的α链和β链的全长序列进行拼接，α链全长核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示序列，β链全长核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示序列。将拼接后的TCRC152-1的α链全长核酸序列与β链的全长核酸序列通过T2A连接形成TCRα-T2A-TCRβ核酸片段，然后通过南京金斯瑞生物科技有限公司将拼接好的TCRα-T2A-TCRβ核酸片段经过密码子优化后克隆到慢病毒表达载体pHR-SFFV-IRES-EGFP上，得到含有本发明TCR C152-1序列的慢病毒载体pHR-SFFV-C152-1-IRES-EGFP，密码子优化后的TCR C152-1的α链全长核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示序列，密码子优化后的TCR C152-1的β链全长核苷酸序列为SEQ IDNO.13所示序列。利用第二代慢病毒包装系统，用3种质粒(pHR-SFFV-C152-1-IRES-EGFP、含有构建传染性但非复制型慢病毒颗粒所必需的其他组分的2种质粒pMD2.G和pSPAX2)共同转染293T细胞制备慢病毒并浓缩病毒。具体步骤以175cm2培养瓶包装慢病毒实验为例进行说明：
取15×106个293T细胞培养于175cm2培养瓶，37℃，5％CO2培养箱过夜，待细胞长到培养瓶约60％密度时进行转染；转染前1小时细胞换液，加入30mL新鲜DMEM完全培养基；每个175cm2培养瓶质粒用量为：10μg pMD2.G、30μg pSPAX2、40μg pHR-SFFV-C152-1-IRES-EGFP，转染试剂PEI与质粒的比例是4:1，即320μg；配制A液为750μL无血清DEME中加入上述三种质粒，涡旋混匀；B液为750μL无血清DEME中加入相应的PEI，涡旋混匀；将A液与B液混合并充分涡旋混匀，室温静置20分钟，滴加到准备好的293T细胞中，轻晃培养瓶使培养基混匀，37℃，5％CO2下培养；转染72小时后，收集培养基上清，离心(500g，4℃，5分钟)，离心后的上清经0.45μm过滤器过滤，最后加入5×PEG8000浓缩病毒，4℃混匀2小时，4℃静置过夜；过夜后离心(4000g，4℃，20分钟)，完全弃掉上清，200μL PBS溶解沉淀，溶解后的慢病毒样品冻存在-80℃。
作为对照，同时进行空载pHR-SFFV-IRES-EGFP的慢病毒包装，包装步骤同上述pHR-SFFV-C152-1-IRES-EGFP的慢病毒包装步骤。
实施例2：TCR C152-1的特异性鉴定和新冠病毒抗原肽筛选
本发明通过转导CD8分子以及在NFAT下游插入荧光素酶报告基因对已敲除TCR的T细胞系Jurkat 76(J76)进行了改造，使该T细胞系被特异性激活后能够通过检测荧光信号来表征细胞的特异性激活水平，利于高通量鉴定TCR C152-1的特异性，将该细胞系简称为J76.8细胞。通过慢病毒感染的方法将本发明的TCR C152-1表达在J76.8细胞系表面，该细胞简称为J76.8-C152-1细胞。具体方法为：实施例1包装的TCR C152-1的慢病毒上清在加入PEG8000浓缩前取1mL用于感染细胞系；J76.8细胞计数，取1×105个J76.8细胞放入24孔板的一个孔；加入1mL TCR C152-1的慢病毒上清，离心感染(700g，32℃，1.5小时)；离心后补充1mL 1640完全培养基，37℃，5％CO2培养3天；流式细胞仪检测GFP阳性率和CD3+TCRαβ+双阳性率为90％以上即为J76.8-C152-1细胞构建成功。
本发明同时构建了与TCR C152-1同源的淋巴母细胞样细胞系(LCL)作为抗原递呈细胞，用于特异性鉴定和抗原肽筛选，具体方法为：将B95-8细胞在2％FBS低浓度血清的1640培养基培养条件下培养两周，生产含EBV病毒的上清；收集含有EBV病毒的上清离心(500g，4℃，5分钟)去除细胞碎片，再通过0.45μm无菌滤器过滤；复苏TCR C152-1来源病人的外周单个核细胞(PBMC)，依据1×106个细胞/mL病毒上清的标准，取相应体积的EBV上清重悬细胞，37℃感染2小时；感染后的细胞离心(350g，4℃，5分钟)，去除上清，按2×105个细胞/mL密度用1640完全培养基(含0.4μg/mL环孢霉素A)重悬细胞；重悬的细胞按1mL/孔的标准培养在48孔板中，37℃，5％CO2培养三周，每周半量换液，补充一半新鲜的1640完全培养基(含0.4μg/mL环孢霉素A)；三周后，细胞开始聚团，淋巴母细胞样细胞系(LCL)形成。
将构建好的J76.8-C152-1细胞和LCL细胞共孵育，在新冠病毒多肽刺激条件下，检测J76.8-C152-1细胞的荧光信号鉴定TCR的特异性及识别的抗原肽。具体方法为：96孔板每孔加入1×105个J76.8-C152-1细胞和1×105个同源LCL细胞，加入3.5μg/mL新冠病毒肽库(15个氨基酸为一条多肽，每条多肽与上一条多肽有4个氨基酸重叠，除ORF1蛋白只合成已报道的表位序列，所用肽库涵盖新冠病毒全基因组，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，每孔总体积200μL，同时设置不刺激对照组加与肽库等量的DMSO，37℃，5％CO2培养箱中刺激6小时；600g，离心3分钟，弃上清，每孔用50μL PBS重悬，转移到96孔白板，加入50μL荧光素酶检测底物(诺维赞公司产品)，混匀反应3分钟，酶标仪检测化学发光。
结果如图1所示，用不相关肽(unrelated peptide，即非特异性肽)作为阴性对照，CD3抗体和PMA+离子霉素作为阳性对照，证明新冠病毒N蛋白刺激条件下，J76.8-C152-1细胞明显激活，此外ORF1蛋白刺激也引起细胞较低水平的激活，进一步实验证明引起J76.8-C152-1细胞激活的表位为位于N蛋白上的TPSGTWLTY和位于ORF1蛋白表位上的DTDFVNEFY，并且两个表位引起的细胞激活水平具有强弱差别。
实施例3：TCR C152-1识别的HLA分子鉴定
在实施例2中，已鉴定本发明的TCR C152-1识别新冠病毒抗原肽为TPSGTWLTY和DTDFVNEFY，而与TCR C152-1同源的LCL包括6个HLA一类分子类型，即A1101、A0206、B3501、B5502、C0102和C0303，需要进一步明确递呈这两个抗原肽的HLA分子类型。为达到该目的，本实施例利用另外的LCL细胞(来源于其他样本的LCL细胞，与TCR C152-1同源LCL的HLA分子类型部分重叠，用于排除法鉴定同源LCL递呈抗原肽给TCR C152-1的具体HLA分子类型)与J76.8-C152-1细胞进行共孵育，加入上述两个抗原肽进行刺激，同样通过检测荧光信号指示细胞激活水平，利用排除法鉴定与抗原肽相结合的HLA分子类型。
结果如图2a所示，只有与含有HLA-B3501的LCL共孵育时，J76.8-C152-1细胞在TPSGTWLTY和DTDFVNEFY刺激条件下才会激活。此外还构建只表达HLA-B3501分子的K562细胞进行验证，结果如图2b所示，K562-B3501与同源LCL均能呈递上述抗原肽给TCR C152-1，引起细胞激活，进一步证明了本发明的TCR C152-1交叉识别由HLA-B3501递呈的抗原肽TPSGTWLTY和DTDFVNEFY。
实施例4：TCR C152-1的突变
为验证TCR C152-1外源转导T细胞是否能赋予正常细胞分泌炎症细胞因子以及杀伤性细胞因子的功能，本发明需要进一步将TCR C152-1转导到原代T细胞进行检测。为降低转导原代T细胞时外源TCR C152-1与细胞本身的TCR分子之间的错配率，提高TCR C152-1分子的稳定性，本实施例在TCR C152-1分子的α链恒定区和β链恒定区之间引入了人工的二硫键。具体地，将TCR C152-1的α链恒定区TRAC*01第48位苏氨酸突变为半胱氨酸，TCR C152-1的β链恒定区TRBC*02第57位丝氨酸突变为半胱氨酸；另外，还将TCR C152-1的β链恒定区TRBC*02第75位半胱氨酸突变为丙氨酸，以防止该位点的半胱氨酸与突变后的α链恒定区TRAC*01第48位半胱氨酸错配形成二硫键，从而保证突变后的α链恒定区TRAC*01第48位半胱氨酸与β链恒定区TRBC*02第57位半胱氨酸之间形成人工二硫键，降低TCR C152-1转导原代T细胞的错配率。点突变后，TCR C152-1的α链全长核苷酸序列为SEQ ID NO.10所示序列，α链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列，β链全长核苷酸序列为SEQ ID NO.14所示序列，β链全长氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列。
实施例5：TCR C152-1转导原代T细胞
本发明为证明TCR C152-1识别HLA B3501递呈的两个表位后具有功能活性，本实施例利用慢病毒感染的方法将TCR C152-1转导到原代T细胞表面，通过检测慢病毒载体带有的GFP表达以及HLA-B3501-TPSGTWLTY-PE多聚体进行染色鉴定TCR C152-1的转导效率。感染具体方法为：取PBMC复苏，离心(400g，4℃，5分钟)，计数；根据1×106个细胞/mL培养基的标准，加入相应体积的人血清培养基将细胞培养在适宜的孔板中；加入10μL/mL anti-CD3+anti-CD28激活混合物(美天旎公司产品)和50U/mL IL-2(peprotech公司产品)进行T细胞激活；收集激活24小时后的原代T细胞，离心(400g，4℃，5分钟)，人血清培养基重悬计数；按每孔2.5×105个细胞的标准将细胞分到48孔板，每孔加入包装好的点突变后的TCRC152-1慢病毒(慢病毒包装方式同实施例1)，并相应地将包装的空白载体慢病毒作为对照组，每孔用人血清培养基补至500μL体积，离心感染(1000g，32℃，离心1小时)；离心后每孔补500μL人血清培养基，加50U/mLIL-2，37℃，5％CO2培养3天；取2×105个培养后的细胞进行多聚体染色，50μL PBS重悬细胞，加入5μL HLA-B3501-TPSGTWLTY-PE多聚体混匀，4℃避光染色30分钟，加入表面染色抗体，4℃避光染色30分钟，PBS洗2次，200μL 2％多聚甲醛重悬细胞，流式细胞仪检测。流式抗体：HLA-B3501-TPSGTWLTY-PE、CD3-BUV805、CD8-BUV737、CD4-BV570、Viability-eFluor506。
结果如图3所示，空白载体包装的慢病毒感染组能够检测到GFP表达但无HLA-B3501-TPSGTWLTY-PE阳性细胞，证明慢病毒感染成功且该细胞不表达本发明的TCR C152-1，TCR C152-1慢病毒感染组能检测到GFP表达和多聚体阳性细胞，证明TCR C152-1成功转导了原代T细胞。
实施例6：TCR C152-1的功能性检测
为验证本发明的TCR C152-1转导原代T细胞后，是否能使转导后的T细胞被新冠病毒抗原肽激活，产生相应的炎症细胞因子和杀伤性细胞因子。本实施例通过实施例5的方法将TCR C152-1转导到原代T细胞，再与同源的LCL共孵育，在新冠病毒抗原肽的刺激条件下，通过流式细胞仪检测细胞因子的水平。具体方法为：96孔板每孔加入5×105个转导TCRC152-1的原代T细胞和5×105个同源LCL细胞，加入0.01μg/mL新冠病毒抗原肽、1μg/mLanti-CD28抗体(Biolegend公司产品)、3μL/孔的CD107a-PE/Cy7流式抗体(Biolegend公司产品)，每孔总体积200μL，同时设置不刺激对照组加与肽库等量的DMSO以及不相关肽刺激对照组加同等浓度的非抗原肽；37℃，5％CO2培养箱中刺激2小时后加蛋白转运阻断剂(Biolegend公司产品)用于阻断刺激后细胞因子分泌，继续培养18小时；600g，离心3分钟，弃上清，进行表面抗体染色，4℃避光染色30分钟，PBS洗2次；弃上清，每孔加入100μL破膜液(BD公司产品)，破膜20分钟，配套破膜洗液洗2次；每孔加50μL破膜洗液配制的胞内流式抗体，4℃避光染色30分钟，破膜洗液洗2次，200μL2％多聚甲醛重悬细胞，流式细胞仪检测。流式抗体：CD3-BUV805、CD8-BUV737、CD4-BB700、Viability-eFluor506、Perforin-BV421、CD107a-PE/Cy7、TNF-PE-CF574、IFN-γ-APC、Granzyme-PE、IL-2-APC/Cy7。
结果如图4所示，与不刺激对照组和不相关抗原肽对照组相比，抗原肽TPSGTWLTY和DTDFVNEFY刺激后，均引起转导本发明的TCR C152-1的T细胞的炎症细胞因子IFN-γ和TNFα产生增强，同样引起杀伤性细胞因子CD107a、颗粒酶B(GranzymeB)和穿孔素(Perforin)的表达升高，证明了TCR C152-1具有功能活性，能够赋予正常T细胞对新冠病毒抗原的反应性，有望成为一种新的新冠病毒感染的免疫细胞治疗策略。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒特异性TCR，其特征在于，所述TCR为C152-1，其能够与TPSGTWLTY-HLA-B3501复合物和DTDFVNEFY-HLA-B3501复合物结合；所述C152-1包含α链和β链，所述α链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“NSAFQY”、“TYSSGN”和“CAMRGGNQFYF”，所述β链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依序为“MNHEY”、“SVGAGI”和“CASSYLLGAGELFF”。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒特异性TCR，其特征在于，所述C152-1的α链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，β链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3.一种编码权利要求1或2所述的新型冠状病毒特异性TCR的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码C152-1的α链和β链。
4.根据权利要求3所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段包含编码α链可变区的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO.7所示；编码β链可变区的核苷酸序列，其序列如SEQ IDNO.11所示。
5.根据权利要求3所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段包含如SEQ ID NO.8所示的α链全长核苷酸序列，如SEQ ID NO.12所示的β链全长核苷酸序列。
6.一种含有权利要求3～5任一项所述的核酸片段的慢病毒载体。
7.一种含有权利要求3～5任一项所述的核酸片段或权利要求6所述的慢病毒载体的T细胞系。
8.一种转导权利要求3～5任一项所述的核酸片段或权利要求6所述的慢病毒载体的原代细胞。
9.权利要求1或2所述的新型冠状病毒特异性TCR的特异性鉴定方法，其特征在于，包括使用权利要求7所述的T细胞系表达权利要求1或2所述的C152-1，进行新型冠状病毒多肽筛选，鉴定所述C152-1特异性识别的抗原肽和HLA分子。
10.权利要求1或2所述的新型冠状病毒特异性TCR，或者权利要求3～5任一项所述的核酸片段，或者权利要求6所述的慢病毒载体，或者权利要求7所述的T细胞系，或者权利要求8所述的原代细胞在制备治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310914221.9A CN117164699A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310914221.9A CN117164699A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117164699A true CN117164699A (zh) | 2023-12-05 |
Family
ID=88930744
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310914221.9A Pending CN117164699A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117164699A (zh) |
-
2023
- 2023-07-25 CN CN202310914221.9A patent/CN117164699A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3271382B1 (en) | Method of detecting new immunogenic t cell epitopes and isolating new antigen-specific t cell receptors by means of an mhc cell library | |
| Charrier et al. | Lentiviral vectors targeting WASp expression to hematopoietic cells, efficiently transduce and correct cells from WAS patients | |
| Ferre et al. | HIV controllers with HLA-DRB1* 13 and HLA-DQB1* 06 alleles have strong, polyfunctional mucosal CD4+ T-cell responses | |
| Schubert et al. | Augmentation of virus secretion by the human immunodeficiency virus type 1 Vpu protein is cell type independent and occurs in cultured human primary macrophages and lymphocytes | |
| US20190389940A1 (en) | Construction and application of recombinant gene for chimeric antigen receptor for treating hiv infection | |
| Kannian et al. | Distinct transformation tropism exhibited by human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) and HTLV-2 is the result of postinfection T cell clonal expansion | |
| US20140057354A1 (en) | Antigen-specific regulatory t-cell induction | |
| WO2016073595A1 (en) | T cells and dendritic cells for polyomavirus therapy | |
| US20220280565A1 (en) | Chimeric antigen receptor carrying truncated or untruncated myeloid cell triggering receptor signaling structure and applications thereof | |
| CN107298715B (zh) | Slit2D2-嵌合抗原受体及其应用 | |
| EP3419997B1 (en) | T cell receptors from the hiv-specific repertoire, means for their production and therapeutic uses thereof | |
| NZ572644A (en) | T-cell vaccine | |
| CN112940108B (zh) | 识别ebv抗原的t细胞受体以及该t细胞受体的应用 | |
| Chiu et al. | Humoral, cellular and cytokine immune responses against SARS-CoV-2 variants in COVID-19 convalescent and confirmed patients with different disease severities | |
| WO2023083224A1 (en) | The construction of a new virus vector packaging cell line of high productivity | |
| Nicholas et al. | A 16-amino acid peptide of respiratory syncytial virus 1A protein contains two overlapping T cell-stimulating sites distinguishable by class II MHC restriction elements. | |
| CN114349847B (zh) | 靶向新型冠状病毒rna依赖性rna聚合酶的特异性tcr | |
| CN117003834A (zh) | 用于转导nk细胞假型化慢病毒载体的包膜糖蛋白及其应用 | |
| CN117164699A (zh) | 新型冠状病毒特异性tcr c152-1及其应用 | |
| Macchia et al. | Expression of CD8α identifies a distinct subset of effector memory CD4+ T lymphocytes | |
| CN112940109B (zh) | 识别ebv抗原的t细胞受体及其应用 | |
| EP0260714B1 (en) | The use of activated t-lymphocytes for preparing a pharmaceutical composition for the treatment of AIDS | |
| Xiong et al. | Identification of novel HLA-A* 11: 01-restricted HPV16 E6/E7 epitopes and T-cell receptors for HPV-related cancer immunotherapy | |
| Vyakarnam et al. | T cell responses to peptides covering the gag p24 region of HIV-1 occur in HIV-1 seronegative individuals | |
| Zhao et al. | Development of transgenic mice expressing a coronavirus-specific public CD4 T cell receptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |