CN101663399B - 一种抗hcv的疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

一种抗hcv的疫苗及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的疫苗，其是通过将HCV的各种非结构基因组合后再与腺病毒载体重组而成的，与载体连接的非结构基因串联组合包括NS3/NS4和NS4/NS5等，本发明也公开了所述丙型肝炎病毒疫苗的制备方法及其用途，本发明的载体疫苗具有安全性高，使用方便，不受肌肉注射等特定条件限制等优点。

Description

一种抗HCV的疫苗及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种抗丙型肝炎病毒的疫苗，以及该疫苗的制备方法和用途。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是一个重要的公共卫生问题，全世界HCV感染达1.7亿人，我国HCV感染的标化流行率约为3.2％。HCV感染的显著特征为慢性化率高，而HCV慢性感染是导致肝硬化、肝细胞癌等终末期肝病的主要原因。
清除病毒能改善肝脏炎症，抑制肝纤维化及防止病情进展。干扰素(interferon，IFN)α联合利巴韦林(ribavirin，RBV)是治疗HCV感染唯一相对有效的药物，但持久应答率(sustained virological response，SVR)低，且仍有部分患者无应答或治疗后复发。虽然聚乙二醇化的干扰素的问世可使SVR提高到50-60％，但仍有相当部分患者经系统治疗后不能获得SVR，因此，人们迫切需要寻找HCV治疗的新药物和新方法。
慢性HCV患者体内缺乏抗原特异性的细胞和体液免疫，这可能是HCV病毒持续感染的主要原因。病毒感染免疫的启动是由T细胞和抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)相互作用而介导，而特异性免疫应答需要抗原递呈细胞有效地摄取、处理和递呈抗原给T淋巴细胞，同时通过信号分子的刺激活化T细胞，以激活特异性免疫反应，抑制或清除病毒感染。因此，研究HCV治疗性疫苗，激活慢性HCV感染者体内特异性免疫反应，从而清除病毒可能会成为慢性丙型肝炎分子治疗的有效手段。
目前研究较多的HCV肽疫苗诱导的免疫反应较弱，且受HLA型别的限制，适用人群范围较窄，而HCV结构基因的表达被证实损害DC的功能，因此，HCV非结构基因理应成为制备HCV疫苗的主要候选基因。
发明内容
本发明人通过构建HCV各种非结构基因串联组合后再与腺病毒重组的复制缺陷型腺病毒载体，得到了理想的用于治疗丙型肝炎的疫苗，从而为慢性HCV感染的免疫治疗奠定了基础。
发明人经研究发现，两个基因串联比单一基因以及多个HCV表位肽联合免疫诱导的细胞免疫反应强，同时克服了使用更多的非结构基因串联免疫的缺陷，包括容易出现扩增、转录以及翻译的错误，和由于腺病毒载体的容量有限而造成的重组困难等。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于治疗丙型肝炎的重组腺病毒载体疫苗；所述的载体疫苗分别携带HCV非结构基因NS3/NS4和NS4/NS5。
本发明的另一个目的是提供携带HCV非结构基因的载体疫苗的制备方法；
本发明的再一个目的是提供重组腺病毒载体疫苗在制备治疗丙型肝炎的药物中的应用。
为了实现本发明目的，本发明重组腺病毒载体疫苗的构建如下：
1、由感染HCV(1b型)的病人血清提取RNA，RT-PCR扩增HCVNS3，NS4，NS5，NS3/NS4和NS4/NS5基因。扩增基因的引物见下表1：
表1：PCR引物
Figure GPA00001011652900021
Figure GPA00001011652900031
2、将HCV NS基因克隆至Pshuttle-CMV质粒。目的基因和载体的双酶切：HCV NS基因PCR产物酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收，XbaI，XhoI双酶切HCV NS3，NS4，NS3/NS4扩增产物和Pshuttle-CMV质粒，EcoRV，XhoI双酶切HCVNS5，NS4/NS5扩增产物和Pshuttle-CMV质粒。
酶切反应体系
Figure GPA00001011652900032
加入ddH2O至总体积为    50μl
在T4DNA连接酶作用下将目的基因和载体按摩尔比3∶1进行连接。
3、将携带目的基因的Pshuttle-CMV质粒与腺病毒骨架质粒Adeasy1(来源于5型腺病毒，即Ad5)在大肠杆菌BJ5183中重组，使用PacI内切酶鉴定重组正确的大质粒，并进行大量制备。
4、腺病毒的包装、扩增和纯化。PacI酶切释放腺病毒基因组，脂质体转染293细胞，7-10天后收集细胞，反复冻融，CsCl密度梯度离心取上清，即含纯化的感染性腺病毒颗粒，腺病毒滴度达到1011PFU/ML。
本发明通过动物实验和人体外实验比较了携带不同HCV非结构基因的腺病毒载体以及7个HCV表位肽联合免疫诱导细胞免疫反应的能力，筛选出了免疫原性最强的以HCVNS3/NS4或NS4/NS5基因为目的基因的腺病毒载体疫苗。
发明的病毒载体可以和其它疫苗佐剂联合使用，可采用的免疫增强剂包括：IL-12、脱氧核苷酸或大肠杆菌DNA形式的未甲基化的CpG基序以及CaCl2，PEG 6000，Freund′s佐剂等。
为清楚理解本发明，以下将结合具体实施方式和附图作进一步说明，但其并非用来限制本发明的范围。
附图说明
图1：PCR获得HCV非结构基因的电泳图。
其中A图中1和2泳道分别为NS3和NS4扩增结果；B图中泳道1为NS5扩增结果；C图中泳道1和2分别为NS3/NS4和NS4/NS5扩增结果。
图2：以腺病毒重组质粒为模板扩增目的基因的鉴定结果
图3：PacI内切酶酶切腺病毒重组质粒的鉴定结果
图4：HCV NS蛋白表达的鉴定结果
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：携带HCV各种非结构基因的腺病毒载体的构建及HCV蛋白的表达鉴定
一.实验材料
HCV感染者血清来自志愿捐献者，签有知情同意书。
Pshuttle-CMV(德国，默克公司，货号ST240007)，Adeasy-1质粒(德国，默克公司，货号ST240005)，大肠杆菌BJ5183和携带GFP的重组腺病毒(AdGFP)购自北京诺赛基因组研究中心有限公司；
Huh7肝癌细胞系购自人民医院(贾因棠等，干扰素刺激基因ISG20真核表达载体的构建及其抗丙型肝炎病毒复制作用的研究，中国免疫学杂志，2006Vol.22No.11P.997-1001)；
DH5α化学转化感受态购自北京鼎国生物技术有限公司；
M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit和LA-Taq DNA聚合酶购自日本TOKARA公司；
XbaI，XhoI，EcoRV，PmeI，PacI限制性内切酶，T4DNA连接酶和小牛肠碱性磷酸酯酶(CIAP)购自美国Promega公司；
RNA提取试剂盒(QIAGEN Rneasy Mini kit)，DNA凝胶回收纯化试剂盒(QIA quick Gel Extraction Kit)及大提质粒试剂盒(Maxi plasmidExtract Kit)购自德国Qiagen公司；
PCR引物参照HCV1b序列自行设计，引入酶切位点，由北京赛百胜基因技术有限公司合成，引物序列及扩增片断长度见上表1；
细胞培养试剂：DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FB S)购自美国Hyclone公司；
二甲基亚砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma公司；
胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)购自华美生物工程公司；
抗体：小鼠抗HCV NS3，抗HCV NS4A和抗HCV NS5A单克隆抗体购自美国BIODESIGN公司；
HRP标记的羊抗鼠IgG购自美国Santa Cruz公司；
琼脂，酵母提取物，胰蛋白胨购自Oxid公司；
琼脂糖购自Flua公司。
二.实验方法
1)RT-PCR扩增HCV NS3，NS4，NS5，NS3/NS4，NS4/NS5基因：
HCV1b型感染者血清提取RNA(方法参见QIAGEN Rneasy Minikit说明书)，使用目的基因下游引物(见表1)逆转录获得cDNA(方法参见M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit说明书)，以此cDNA为模板PCR扩增各种HCV NS基因。
PCR反应条件：
HCV NS3，NS4，NS3/NS4：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火55℃1min，延伸72℃3min，共30个循环。
HCV NS5和NS4/NS5：预变性94℃5min，变性94℃1min，退火58℃1min，延伸72℃4min，共30个循环。
PCR反应体系
Figure GPA00001011652900061
加入ddH2O至总体积为        50μl
2)HCV NS基因克隆至Pshuttle-CMV质粒
目的基因和载体的双酶切：HCV NS基因PCR产物酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收，XbaI，XhoI双酶切HCV NS3，NS4，NS3/NS4扩增产物和Pshuttle-CMV质粒，EcoRV，XhoI双酶切HCVNS5，NS4/NS5扩增产物和Pshuttle-CMV质粒。
酶切反应体系
Figure GPA00001011652900062
加入ddH2O至总体积为        50μl
37℃酶切2小时，0.7％的琼脂糖凝胶电泳切胶后用DNA凝胶回收试剂盒回收酶切后质粒和目的片断，分别溶于8μl H2O，取3μl进行琼脂糖电泳定量。
目的基因和载体的连接：
目的基因和载体按摩尔比3∶1进行连接
Figure GPA00001011652900071
3)转化大肠杆菌及阳性克隆的鉴定
大肠杆菌化学感受肽50μl与5μl连接产物轻轻混匀，冰浴30min，42℃热休克90s，继续冰浴2min，加入LB培养基1ml，37℃恒温摇床180rpm温育1小时，将菌液均匀涂在卡那霉素抗性的LB平板上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养16小时。牙签挑取15个单克隆菌落接种于2ml含卡那霉素的LB培养基，37℃摇动(230rpm)培养，过夜。培养过夜的菌液小提质粒，步骤如下：
试管中2ml菌液转移到EP管中
            ↓
4℃12000rpm离心1min
            ↓
弃上清，加予碱裂解液I 100μl，剧烈振荡
            ↓
在冰上加室温碱裂解液II 200μl，快速倒置混匀
            ↓
在冰上加冷碱裂解液III 150μl，混匀后冰浴3-5min
            ↓
4℃12000rpm离心5mim
            ↓
上清转移到另一EP管中，加2倍体积乙醇室温沉淀核酸
获得的质粒使用双酶切鉴定和PCR鉴定，方法同前。
4)大肠杆菌BJ5183电转感受态的制备
步骤如下：
BJ5183菌液500μl接种于50mlLB培养液中，37℃，250rpm过夜
                            ↓
接种两份25ml的过夜培养物分别到500mlLB培养液中37℃，250rpm
                            ↓
OD600为0.4时，培养物冰浴15-30min
               ↓
4℃2500rpm离心20min，弃上清
          ↓
250ml冰冷的10％甘油重悬，4℃2500rpm离心20min，弃上清
                        ↓
重复此过程共三次，最后一次留上清2ml，重悬细菌
                  ↓
分装感受态细胞，没入液氮中快速冰冻，储存于-70℃备用
5)携带目的基因的Pshuttle-CMV质粒与腺病毒骨架质粒Adeasy1重组
携带目的基因的Pshuttle-CMV质粒线性化及去磷酸化：
酶切反应体系
加入ddH2O至总体积为        50μl
37℃作用2小时，琼脂糖凝胶电泳检测是否完全线性化，将线性化的片断切胶回收，使用CIAP进行去磷酸化。
去磷酸化反应体系
Figure GPA00001011652900091
50℃，15min，37℃，15min后补充2μlCIAP，再次50℃，15min，37℃，15min，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀备用。
Pshuttle-CMV和Adeasy1共转化BJ5183：取40μlBJ5183的电转感受态，同时加入线性化并去磷酸化的Pshuttle-CMV和Adeasy1各2μl(15ng左右)，置于冰上60s。调节电转仪，电脉冲25μF，电压2.5kV，电阻200Ω。将细菌和质粒混合物加入电转杯，按设定参数启动对细菌的脉冲。结束后迅速加入1ml LB培养液，37℃，180rpm，培养1小时后铺于氨苄青霉素和卡那霉素双抗的LB平板，待液体吸收，倒置培养板于37℃培养。
重组体的鉴定：挑取单克隆菌落接种于2ml LB培养基，摇菌过夜，小提质粒，使用PacI内切酶鉴定重组正确的质粒。
大量制备腺病毒重组正确的质粒：使用大提质粒试剂盒，方法参照说明书。
6)腺病毒的包装，扩增和纯化
PacI酶切释放腺病毒基因组，脂质体转染293细胞，7-10天后收集细胞，通过反复-70℃和室温冻融，CsCl密度梯度离心取上清，即含感染性的腺病毒颗粒。多次感染293细胞可以进行腺病毒的扩增。
7)Huh7细胞的培养
人肝癌细胞系Huh7细胞以1.5×106接种于6cm培养皿，培养基为含10％FBS，200μmol L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素及链霉素的DMEM，置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中。24小时后，移去培养液，以复感染指数(MOT)50加入携带HCV NS基因的重组腺病毒，1.5小时后，加入培养基，37℃，5％CO2继续培养48小时。
8)细胞总蛋白的提取
弃培养液，PBS冲洗2次后，加入细胞裂解液80μl。细胞刮刮取细胞，收集于EP管中，冰浴30min。4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液，即为细胞总蛋白溶解液，BCA法测定细胞总蛋白浓度后，在-70℃条件下保存。
9)Western Blot检测HCV NS蛋白的表达
三.实验结果：
1)PCR方法成功获得了上述基因，片断大小分别为1826bp，1193bp，2999bp，3019bp，4192bp，电泳结果见图1。
2)获得了携带HCV各种非结构基因的重组正确的腺病毒质粒。PCR法鉴定重组质粒，见图2，其中泳道1为HCV NS3(1.8kb)，泳道2为HCV NS4(1.2kb)，泳道3为HCV NS5(3kb)，泳道4为HCVNS3/NS4(3kb)，泳道5为HCV NS4/NS5(4kb)；PacI内切酶酶切鉴定重组质粒，重组正确的大质粒经PacI酶切后，释放4.5kb或3kb的小片段，大片段在30kb以上(图3)。
3)构建的重组腺病毒感染靶细胞后可以正确表达HCV目的蛋白。由图4可见，70KD，33KD，126KD，159KD条带分别为HCV NS3，NS4，NS5，NS3/NS4和NS4/NS5蛋白。
实施例2：健康人体外实验
一.实验材料
1)研究对象：19例HLA-A2阳性的健康人外周血来自北京红十字血液中心。
2)淋巴细胞分层液：购自鼎国生物技术有限公司，比重1.077g/ml；重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)和重组人白细胞介素4(rh-IL-4)购自美国R&D公司；
AIM-V无血清培养基购于美国GIBCO公司；
RPMI 1640培养基购于鼎国生物技术有限公司，完全RPMI 1640中含10％胎牛血清、1％谷氨酰胺、100IU/ml链霉素和100μg/ml青霉素；
鼠抗人HLA-A2单克隆抗体购自美国BD公司，LPS、丝裂霉素购自美国Sigma公司；
稳定转染了HCV复制子并表达HCV NS3，NS4和NS5蛋白的Hhu7细胞(HCVR)购自人民医院(贾因棠等，干扰素α对丙型肝炎病毒复制子的抑制作用，中华医学杂志，2005Vol.85No.29P.2065-2069)并鉴定为HLA-A2阳性；
IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT检测试剂盒购自法国DIACLONE公司；
IL-2购自美国R&D公司；
7段HLA-A2限制性CTL表位多肽来自HCV NS3，NS4和NS5区域，上海生工委托合成，经高效液相色谱法(HPLC)纯化后，纯度大于90％，其冻干粉以5mg/ml浓度溶于DMSO，再用PBS稀释为1mg/ml，分装冻存于-20℃备用，肽序列见表2。
表2HLA-A2限制性CTL表位多肽的来源及序列
多肽编号      病毒蛋白        氨基酸位置       氨基酸序列
P1            HCV NS3         1073-1081        CINGVCWTV
P2            HCV NS3         1406-1415        KLVALGINAV
P3            HCV NS4B        1671-1680        VLAALAAYCL
P4            HCV NS4B        1807-1816        LLFNILGGWV
P5            HCV NS5A        2145-2154        LLREEVSFRV
P6            HCV NS5B        2578-2587        RLIVFPDLGV
P7            HCV NS5B        2594-2602        ALYDVVTKL
二、实验方法
1)HLA-A2型别的鉴定
全血法：新鲜采集抗凝外周全血200ul，分成2管：待测管和阴性对照管，每管各100ul，再加入2ml红细胞裂解液，轻弹管壁以混匀，作用10min后离心(1500rpm，4℃，5min)，弃上清，FACS洗液洗细胞两次，其中实验管加入鼠抗人HLA-A2抗体(HB8.2细胞株培养上清)100ul后，与对照管同置室温孵育15min，FACS洗液洗涤细胞2次，每管加入FACS固定液200ul，用于流式细胞仪检测，用CELLQuest软件对检测结果进行分析。
2)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)
抽取外周静脉血，EDTA-K3抗凝。将全血沿管壁缓慢加入含有等量Ficoll-Hypaque分层液的无菌离心管中，室温离心，1500rpm，15～18min。以尖吸管吸取单个核细胞层，用无血清RPMI1640(pH7.2)洗细胞3次，依次为1500rpm、1200rpm、1000rpm，室温下离心各10min，以完全RPMI1640培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，加入6孔培养板中，每孔2ml，37℃，5％CO2孵箱培养4h，使其中的单核细胞贴壁，用温热的无血清RPMIl640培养基轻轻洗培养板以去除非贴壁细胞，获得贴壁的单核细胞，备诱导DC用。收集未贴壁细胞：冻存-70℃备用。
3)树突状细胞的体外培养扩增及鉴定
贴壁的单核细胞DC的培养参照Romani N(Romani N，GrunerS，Brang D，et al.Proliferatin dendritic cell progenitors in humanblood.J Exp Med，1994，180(1)：83-93)的方法，在培养板中加入含rhGM-CSF1000IU/ml、rhIL-4800IU/ml的AIM-V培养液，置于37℃、5％CO2孵箱中，隔天半量更换培养液培养第7天，收集悬浮细胞。通过光镜观察形态学。收集的DC转入流式细胞仪检测管，1×105/管，用FACS洗液悬浮后，离心弃上清，管内分别加入FITC标记的鼠抗人CD83，CD86，CD14单克隆抗体和PE标记的鼠抗人HLA-DR，CD1a，CD11c，CD80单克隆抗体5μl，室温避光标记15min后，用FACS洗液洗涤细胞2次，每管加入200μlFACS固定液，通过流式细胞仪检测细胞表型。
4)腺病毒的感染
来自5位健康人外周血的DC在培养第六天分别以MOI400感染AdNS3，AdNS4和AdNS5，以AdGFP感染DC(MOI400)为对照设为A组；来自4位健康人外周血的DC在培养第六天分别以MOI400感染AdNS3，AdNS4和AdNS3/NS4，设为B组；另外四位健康人外周血来源的DC分别以MOI400感染AdNS4，AdNS5和AdNS4/NS5，设为C组；其余六例健康人的DC分别以MOI400感染AdNS3/NS4和AdNS4/NS5，以AdGFP感染DC(MOI400)为对照，设为D组，在D组中，留部分DC不感染腺病毒，在收集上述感染DC的同时，收集未感染DC。未感染DC同时负载7个HLA-A2限制性CTL表位多肽2小时，终浓度分别为10μg/ml。
5)丝裂霉素的作用
HCV基因转染的DC和肽负载的DC，分别加入50μg/ml丝裂霉素，37℃作用45min，用培养基充分清洗，去除残留的MMC，加入96孔圆底培养板，细胞数为2×104/孔。
6)非贴壁PBMC与DC的相互作用
复苏冻存的同源非贴壁PBMC，以1∶10的比例加入DC培养孔，作3复孔，4天后加入IL-230U/ml，隔天半量更换培养基，继续培养3天，收获T细胞并计数。
7)ELISPOT分别检测分泌IFN-γ，IL-4和GrB的T细胞频数
采用DIACLONE公司的IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT试剂盒，方法参见说明书，以HCVR为靶细胞或再刺激物，效靶比为10∶1。
三.实验结果(见表3，4，5，6)
1)分别携带HCVNS3，NS4和NS5基因的腺病毒载体诱导的细胞免疫反应没有统计学上的差异。
2)携带HCVNS3/NS4基因的腺病毒载体诱导的细胞免疫强于携带HCVNS3或HCVNS4基因的腺病毒载体。
3)携带HCVNS4/NS5基因的腺病毒载体诱导的细胞免疫强于携带HCVNS4或HCVNS5基因的腺病毒载体。
4)分别携带HCVNS3/NS4和HCVNS4/NS5基因的腺病毒载体诱导的细胞免疫反应没有统计学的差异，并且都强于7个肽联合负载的DC诱导的免疫反应。
表3A组IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT结果(SFC/2×105PBMC)
Figure GPA00001011652900141
表4B组IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT结果(SFC/2×105PBMC)
表5C组IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT结果(SFC/2×105PBMC)
Figure GPA00001011652900143
表6D组IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT结果(SFC/2×105PBMC)
Figure GPA00001011652900151
实施例3：HCV感染者体外实验
一.实验材料
同前
二.实验方法
HCV感染组处理方式与实施例2中的D组相同，非贴壁PBMC与DC相互作用时，先相互作用24小时，加入IL-230IU/ml，隔天半量更换培养基，继续培养48小时，其它同前。
三.实验结果(见表7)
分别携带HCVNS3/NS4和HCVNS4/NS5基因的腺病毒载体均诱导了较强的细胞免疫反应，但二者之间无统计学差异，且均强于7个肽联合负载的DC诱导的免疫反应。
表7HCV感染组IFN-γ，IL-4和GrB ELISPOT结果(SFC/2×105PBMC)
实施例4：动物实验
一.实验材料及实验方法
实验动物为18只雌性Balb/c小鼠，5-6周龄，随机分成三组，腹腔分别注射1×108PFU的携带HCVNS3/NS4，HCVNS4/NS5的重组腺病毒和PBS，此后隔12天一次，共注射三次。第三次注射12天后，处死小鼠，无菌取脾脏研磨而制成单细胞悬液，进行IFN-γELISPOT实验，仍以HCVR作为靶细胞，方法同前。
二.实验结果(见表8)
携带HCVNS3/NS4或HCVNS4/NS5基因的腺病毒均可诱导较强的细胞免疫反应，且二者之间未见统计学差异。
表8动物实验IFN-γELISPOT结果(SFC/5×105PBMC)
Figure GPA00001011652900161
工业实用性
通过本发明所述的方法，将HCV的非结构基因串联组合后与腺病毒载体重组制备本发明所述的抗HCV疫苗，或进一步与免疫增强剂组合成抗HCV药物，用于HCV慢性感染疾病的预防和治疗。动物实验表明，本发明携带HCVNS3/NS4或HCVNS4/NS5基因的腺病毒抗HCV疫苗可诱导较强的细胞免疫反应，且其安全性高、使用方便，不受肌肉注射等特定条件限制。

Claims (7)

1.一种抗HCV的疫苗，其是通过将HCV的非结构基因串联组合后与腺病毒载体重组制备而成，其特征在于，所述的非结构基因串联组合为NS3/NS4或NS4/NS5。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述的腺病毒为复制缺陷型Ad5。
3.一种制备权利要求1或2所述疫苗的方法，其包括步骤：
1)制备目的基因：设计引物，通过RT-PCR扩增出HCV NS3/NS4或NS4/NS5基因；
2)将HCV NS3/NS4或NS4/NS5基因克隆至Pshuttle-CMV质粒，具体为：将所述基因分别和所述质粒按摩尔比3:1进行连接；
3)将携带目的基因的Pshuttle-CMV质粒与腺病毒骨架质粒Adeasy1重组；
4)酶切步骤3)得到的重组质粒，释放腺病毒基因组，脂质体转染293细胞、反复冻融2-3次，CsCl密度梯度离心，然后将纯化后的基因组结构均一的重组腺病毒冻存。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，RT-PCR扩增的引物为：
Figure FDA00001697284200011
。
5.权利要求1或2所述的疫苗在制备治疗丙型肝炎的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物是载体疫苗与免疫增强剂的混合物。
7.根据权利要求6所述的应用，所述的免疫增强剂为IL-12、脱氧核苷酸或大肠杆菌DNA形式的未甲基化的CpG基序、CaCl2、PEG6000或Freund′s佐剂中的一种或多种。 
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