ES2573704T3 - Virus de la variolovacuna recombinante que tiene el gen del virus de la hepatitis C - Google Patents
Virus de la variolovacuna recombinante que tiene el gen del virus de la hepatitis C Download PDFInfo
- Publication number
- ES2573704T3 ES2573704T3 ES09717492.4T ES09717492T ES2573704T3 ES 2573704 T3 ES2573704 T3 ES 2573704T3 ES 09717492 T ES09717492 T ES 09717492T ES 2573704 T3 ES2573704 T3 ES 2573704T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- virus
- hcv
- cells
- recombinant
- hepatitis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 39
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 10
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 7
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 6
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 6
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 2
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000008722 morphological abnormality Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012929 tonicity agent Substances 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
- C12N15/8636—Vaccina virus vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
- A01K2217/203—Animal model comprising inducible/conditional expression system, e.g. hormones, tet
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Un virus de la variolovacuna recombinante que comprende un promotor de la expresión y un ADNc del genoma del virus de la hepatitis C, donde el ADNc es: (a) ADN representado por la SEQ ID NO: 2; o (b) ADN que se hibrida con ADN que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas que tiene 95 % o más de homología con la secuencia de nucleótidos representada por la SEQ ID NO: 2 y que codifica la proteína no estructural del virus de la hepatitis C.
Description
15
25
35
45
55
65
Una composición farmacéutica de la presente invención puede introducirse en un organismo mediante cualquier método conocido tal como inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; inhalación nasal, bucal o pulmonar; o administración oral. Además, un virus recombinante contenido en una composición farmacéutica de la presente invención se puede usar en combinación con un medicamento antiviral existente (por ejemplo, interferón). Una realización de uso combinado no está particularmente limitada y el virus recombinante de la presente invención y el fármaco antiviral existente puede introducirse en un organismo mediante un método donde ambos se administran simultáneamente o mediante método donde uno se administra después del otro a un cierto intervalo.
Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede mezclar con un vehículo conocido farmacéuticamente aceptable tal como un excipiente, un agente de carga, un aglutinante y un lubricante, un tampón, un agente de tonicidad, un agente quelante, un colorante, un conservante, una fragancia, un agente aromatizante, un agente edulcorante o similares.
La composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral de acuerdo con su forma, por ejemplo, como un agente administrado por vía oral tal como un comprimido, una cápsula, un agente en polvo, un agente granular, una píldora, una solución, jarabe o similares, o un agente administrado por vía parenteral, como una inyección, un agente tópico, un supositorio, una gota ocular o similares. Preferentemente, es, por ejemplo, una inyección local tal como una inyección intradérmica, intramuscular o intraperitoneal.
Aunque la dosis se selecciona apropiadamente de acuerdo con el tipo del elemento activo, la vía de administración, el objetivo de la administración, la edad, el peso, el sexo y los síntomas del paciente y otras condiciones, la dosis diaria del virus es de aproximadamente 1,000-1.000.000.000 UFP (unidades formadoras de placas) y, preferentemente, de aproximadamente 100.000-100.000.000 UFP en el caso de la administración oral, mientras que es de aproximadamente 100-1.000.000.000 UFP y, preferentemente, de aproximadamente 1.000-100.000.000 UFP en el caso de administración parenteral. El virus puede administrarse una vez o varias veces al día.
El virus recombinante de la presente invención se puede usar como una vacuna para prevenir o tratar la hepatitis C. Además, el desarrollo de una vacuna contra el VHC hasta la fecha se basa en la investigación que se centra en los anticuerpos contra el VCH y las células T citotóxicas (CTL). Por lo tanto, el título de anticuerpos o la actividad de la inmunidad celular como vacuna se miden, preferentemente, de antemano.
Se divulga que, por ejemplo, los títulos de anticuerpos contra los VVR-CN5, VVR-CN2, VVR-N25 preparados o la cepa LC16m8, es decir, la cepa parental, se pueden obtener mediante la vacunación de un conejo con la cepa de virus, la recogida de los sueros con el tiempo y la medición del valor ELISA contra el VHC en el suero. En los sueros de conejos vacunados con VVR-CN5-o VVR-CN2, los títulos de anticuerpos contra el VHC aumentaron tras cuatro semanas desde la vacunación.
También se divulga que la actividad de la inmunidad celular se puede medir mediante la vacunación de un ratón con VVR-CN5, VVR-CN2, VVR-N25 o la cepa LC16m8, es decir, la cepa parental, aislando las células de bazo del ratón inmunizado, y determinando si o no los CTL específicos del VHC son inducidos por el ensayo ELISPOT. De acuerdo con la presente divulgación, cuando las células del bazo derivadas de ratones BALB/c vacunados con VVR-CN5 se estimularon con un péptido sintético de una secuencia del epítopo del CRL específico de E1 restringido a H H-2d, se detectaron células productoras de INF-γ casi diez veces las de control. De acuerdo con lo anterior se encontró que la vacunación con VVR-CN5 inducía CTL específicos de E1 en ratones BALB/c.
Por lo tanto, los VVR-VHC preparados por los presentes inventores han confirmado que inducen inmunidad humoral y celular contra el VHC.
La presente invención se describirá más específicamente mediante los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no deben limitar el alcance de la presente invención.
Ejemplo 1
Preparación del virus de la variolovacuna recombinante
Las regiones génicas completas (CN5), la región de la proteína de la cápside externa (CN2) y la región génica de la región de la proteína no estructural asociada a la replicación (N25) del virus de la hepatitis C (DDBJ/EMBL/ número de acceso en GenBank; AY045702) se integraron en los sitios SbfI y Sgfl del plásmido pBMSF7C (solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público n.º 6-237773) para preparar los vectores plasmídicos pBMSF7C-CN5, pBMSF7C-CN2 y pBMSF7C-N25 que tienen los genes del VHC insertados aguas abajo del promotor híbrido ATI-p7.5 en la región génica de la hemaglutinina (HA) (Figura 1).
Se sembraron células de riñón de cultivo primario en un matraz T175. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se usó la cepa del virus de la variolovacuna atenuado LC16m8 para la infección a un moi = 10 y a 30 ºC durante 2 horas. En el presente documento, moi (multiplicidad de infección) hace referencia a las UFP por célula.
15
25
35
45
55
65
Después de la infección, la solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron con PBS (-). A continuación, después del tratamiento con 0,05 % de tripsina/EDTA 0,5 mM/PBS (-) y lavado con 10 % de FCS/medio MEM, PBS (-) y tampón de HeBS, las células se suspendieron en 600 µl de tampón de HeBS. 40 µg de cada uno de los vectores plasmídicos pBMSF7C-CN5, pBMSF7C-CN2 y pBMSF7C-N25 se diluyeron usando un tampón HeBS para obtener una cantidad total de 200 µl, que se añadió y se mezcló con la suspensión celular y se dejó reposar en hielo durante 10 minutos. La suspensión celular añadida con el vector plasmídico se transfirió a una cubeta de 0,4 cm para realizar la electroporación (0,2 kV, 960 µF) usando un electroporador (Bio-Rad). Después de la electroporación, se añadió inmediatamente 1 ml de 10 % de FCS/medio MEM a la suspensión celular para la dilución. Esta suspensión celular se añadió a las células RK13 o células de riñón de cultivo primario que se habían sembrado en un matraz T175 y se cultivaron a 30 ºC durante 24 horas.
Después de 24 horas de cultivo, se retiró el sobrenadante del cultivo mediante aspiración y las células se lavaron con PBS (-). A continuación, se realizó el tratamiento con 0,05 % de tripsina/EDTA 0,5 mM/PBS (-) y las células se suspendieron en un 10% de FCS/medio MEM. Se recogió la suspensión de células, se sometió a ultrasonidos (30 s x 4 veces) en agua fría y después se centrifugó (2000 rpm, 10 min). El sobrenadante resultante se utilizó como una solución de virus. La solución de virus se diluyó en 10 % de FCS/medio MEM y se usó para infectar la célula de riñón de cultivo primario que se habían sembrado en una placa de 100 mm a 30 ºC durante una hora. La solución de virus se eliminó mediante aspiración y, a continuación, las células se lavaron con PBS (-). Se añadió 10 % de FCS/0,5% de metilcelulosa/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas de cultivo, se retiró el sobrenadante mediante aspiración y se lavó con PBS (-). Una solución de eritrocitos de pollo diluida en PBS (+) se añadió a la placa de 100 mm para el cultivo a 37 ºC durante 30 minutos. La solución de eritrocitos se eliminó mediante aspiración y, a continuación, las células se lavaron dos veces con PBS (-). Las placas sobre las que no se adsorbieron los eritrocitos de pollo se recogieron usando un Pipetman. La transferencia de genes del VHC en las placas recogidas se confirmó mediante PCR y secuenciación génica. Las placas confirmadas de la transferencia génica se sometieron a purificación en placa tres veces.
Los virus sometidos a tres veces purificación en placa se sometieron a cultivo a pequeña escala. La colonia obtenida después de la tercera purificación se suspendió en 700 µl 10 % de FCS/medio MEM y se sometió a ultrasonidos en agua fría. Después de la centrifugación (2.000 rpm, 10 min), se añadieron 500 µl de sobrenadante a las células de riñón de cultivo primario sembradas en T25 para la infección a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se retiró mediante aspiración y las células se lavaron con 2,5 ml de 10 % de FCS/medio MEM. El medio se retiró mediante aspiración y se añadieron 2,5 ml de 10 % de FCS/medio MEM reciente para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, las células se rasparon del matraz con un raspador para recoger la suspensión de células. La suspensión celular recogida se sometió a ultrasonidos (30 s, 4 veces) en agua fría, seguido de centrifugación, y el sobrenadante se recogió como la solución de virus. La solución de virus recogido se diluyó en serie y después se añadió a las células RK13 o a las células de riñón de cultivos primarios que se habían sembrado en placas de 6 pocillos para la infección a 30 ºC durante una hora. La solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron dos veces con PBS (-) y se añadió 10 % de FCS/ 0,5 % de metilcelulosa/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, se contó el número de placas formadas en el pocillo para calcular el título.
Sobre la base de este título calculado, se realizó el cultivo a escala masiva. Las células RK13 o las células de riñón de cultivos primarios se sembraron en diez matraces T175. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se usó la solución de virus de la variolovacuna recombinante para la infección a un moi = 10 y a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se retiró mediante aspiración y las células se lavaron con 20 ml de 10 % de FCS/medio MEM. El medio se retiró mediante aspiración y se añadieron 20 ml de 10% de FCS/medio MEM reciente para el cultivo a 30 ºC durante 72 horas. Después de 72 horas, las células se rasparon de los matraces usando un raspador y las suspensiones celulares se recogieron y se congelaron a -8 0 ºC para su conservación, Esta suspensión de células se sometió a tres rondas de congelación y descongelación, seguido de tratamiento con ultrasonidos (30 segundos, 4 veces) en agua fría y centrifugación para recoger el sobrenadante como una solución de virus. La solución de virus recogida se transfirió a un tubo de centrifugación de alta velocidad y se sometió a centrifugación a 18.000 rpm durante 45 minutos para permitir la precipitación del virus. El sobrenadante se retiró mediante aspiración y, a continuación, los sedimentos se resuspendieron en una pequeña cantidad de 10 % de FCS/medio MEM. Mediante este procedimiento se preparó una solución de virus que se concentró diez veces más fuerte que una con el cultivo en matriz T175. Esta solución de virus concentrado se diluyó en serie y se utilizó para infectar las células RK13 o las células de riñón de cultivos primarios que se habían sembrado en una placa de 6 pocillos y los títulos de virus de las soluciones se calcularon de la misma manera que en el método descrito anteriormente. Las soluciones concentradas de virus con títulos calculados se utilizaron en varios experimentos descritos en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 2
Confirmación de la transferencia de genes del VHC mediante PCR
La PCR se realizó usando los siguientes cebadores específicos de genes del VHC y el genoma del virus de la variolovacuna recombinante obtenido como molde para confirmar si el gen del VHC se había introducido o no en el
15
25
35
45
55
65
genoma del virus recombinante mientras que el gen del VHC no se había transferido si no se observaba dicha banda.
Como se muestra en la Figura 3, como resultado de la electroforesis en gel de agarosa al 2 % del producto de la PCR (fragmento amplificado), se encontró que el gen del VHC se había transferido al genoma del virus recombinante.
Ejemplo 3
Confirmación de la expresión de proteínas del VHC mediante el método de transferencia de tipo Western
El virus de la variolovacuna recombinante RVV-S se utilizó para infectar células RK13 que se habían sembrado en una placa de 6 pocillos a moi = 30 y a 30 ºC durante 2 horas. Después de la infección, la solución de virus se eliminó mediante aspiración y las células se lavaron dos veces con PBS (-). A cada pocillo, se añadieron 2 ml de 10% de FCS/medio MEM para el cultivo a 30 ºC durante 24 horas. Después de 24 horas, se retiró el medio por aspiración, y se añadieron 100 µl de tampón de lisis (1 % de SDS, 0,5 % de NP-40, NaCl 0,15 M, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4)) para lisar las células y la solución resultante se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. La solución recogida se sometió a ultrasonidos en agua fría hasta que la viscosidad llegó a ser cero. La cantidad de proteína en la solución preparada se cuantificó según el método de Lowry.
La electroforesis se llevó a cabo durante 50 µg de proteína con gel de acrilamida al 10%. Al final de la electroforesis, se eliminó el gel y la proteína en el gel se transfirió a una membrana de PVDF con un papel secante semiseco pasando una corriente de 5,5 mA/cm2 durante 60 minutos. Después de lavar la membrana con una solución de TBS-T, la membrana se sumergió en una solución al 5 % de leche descremada-TBS-T para el bloqueo. Después del bloqueo, la membrana se lavó tres veces con una solución de TBS-T. El anticuerpo primario fue un anticuerpo monoclonal de ratón obtenido mediante la purificación de Core-31-2, E1-384, E2-544, NS3-10-1, NS4B-52-1 y 14-5-NS5B clon IgG. La cantidad de proteína del anticuerpo purificado se cuantificó por el método de Lowry y se preparó a 10 µg/ml para su uso. Al final de la reacción con el anticuerpo primario, la membrana se lavó tres veces con una solución de TBS-T. El anticuerpo secundario utilizado fue IgG anti-conejo unida a HRPO (de Donkey, Amersham). Al final de la reacción con el anticuerpo secundario, la membrana se lavó de nuevo tres veces con una solución de TBS-T, y se añadió una solución de ECL a la membrana para el desarrollo de la película.
En consecuencia, como se muestra en la Figura 4, se encontró que la proteína del VHC se expresaba en los genomas de los virus recombinantes RVV-CN2, RVV-N25 y RVV-CN5.
Ejemplo 4
Experimentos de vacunación de conejos y ratones con virus de la variolovacuna recombinantes (Figura 5)
La figura 5 muestra un método para confirmar la capacidad de HCV-RVV para inducir inmunidad humoral/celular.
Se vacunó a conejos New Zealand hembra blancos por vía transendotelial con los virus de la variolovacuna recombinantes o la cepa parental LC16m8 obtenida en el Ejemplo 1 a 1x108 ufp. Se extrajo sangre de la vena de la oreja después de 1, 2, 3, 4 y 6 semanas desde la vacunación. Además, después de seis semanas tras la vacunación viral inicial, se usó RVV-S de nuevo para la vacunación a 1x108 ufp. De un modo similar, se extrajo sangre de nuevo de la vena de la oreja después de 1, 2, 3, 4 y 6 semanas desde la segunda vacunación. Toda la sangre recogida se introdujo en tubos de vacío de recogida de sangre (TERUMO, nombre comercial: Venoject II Tubos para extracción de sangre al vacío (estériles), 9 ml) y se sometió a centrifugación (3.000 rpm, 20 minutos) para separar y recoger los sueros. Los sueros se congelaron a -20 ºC para su conservación hasta el ensayo ELISA descrito más adelante.
Ejemplo 5
Medición de los títulos de anticuerpos contra la proteína del VHC en sueros de conejos vacunados con HCV-RVV mediante el método ELISA
Una placa de 96 pocillos se recubrió con la proteína del núcleo y la proteína E2, al que se añadió una dilución de 100 veces de la muestra de suero congelado. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante una hora, la placa de 96 pocillos se lavó con una solución de TBS-T y luego se añadió anti-IgG de conejo ligado a HRPO (de Donkey, Amersham) a la placa de 96 pocillos como anticuerpo secundario. Después de la reacción con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante una hora, la placa de 96 pocillos se lavó de nuevo tres veces con una solución de TBS-T, a la que se añadió una solución de desarrollo de color a 100 µl/pocillo. Después de dejar reposar a temperatura ambiente durante 10-20 minutos, se midió la absorbancia a 450 nm se con un lector de microplacas.
Como resultado, como se muestra en la Figura 6, los títulos de anticuerpos más altos se indujeron contra la proteína del núcleo y E2 en el suero de conejos vacunados con RW-CN2-y RVV-CN5.
15
25
35
45
55
65
Ejemplo 6
Confirmación de las capacidades inducción de inmunidad celular de HCV-RW como vacunas mediante ensayo ELISPOT
(Día 1)
El anticuerpo anti-ratón de IFN-γ purificado (R4-6A2) (1µg/ml) (Pharmingen) se sembró en una placa de nitrocelulosa de 96 pocillos a 75-100 µl/pocillo, al tiempo que se ajustó la concentración final a 8 µg/ml (125 veces diluido en PBS estéril) y se dejó reposar a 4 ºC durante la noche.
(Día 2)
Se recogieron las células de bazo de ratón y se dejaron suspender en una cantidad adecuada en el lavado con RPMI. El lavado con RPMI utilizado se suplementó con FCS al 2,5%. Las células se recogieron mediante centrifugación a 1200 rpm a 4 ºC durante 5 minutos. Las células se trataron con ACK, se suspendieron en RPMI de lavado en una cantidad adecuada y de nuevo se centrifugaron a 1200 rpm y a 4 ºC durante 5 minutos para recoger las células. Se forzó a 500 µl de RPMI de lavado seguido de la suspensión celular a pasar a través de un filtro. Después del pase completo, las células se lavaron con 1,5 ml de lavado RPMI. El producto resultante se lavó una vez con medio RPMI suplementado con 10 % de FCS, se suspendieron en medio H-h y se ajustó a 1x107/ml.
1) Medio H-h: Una mezcla de cantidades iguales de medio RPMI suplementado con 10 % de FCS y medio de CLICK suplementado con 10 % de FCS. 2) RPMI suplementado con 10 % de FCS: RPMI-1640 (SIGMA R8758), FCS (final 10 %), 2-mercaptoetanol (concentración final 5 µM), penicilina-estreptomicina (concentración final PC: 100 u/ml, SM: 0,1 mg/ml) y 4 ml de NaHCO3 al 7,5 %. 3) Medio de CLICK suplementado con 10 % de FCS: Medio de CLICK (SIGMA C5572), FCS (concentración final 10 %), 2-mercaptoetanol (concentración final 5µM), penicilina-estreptomicina (concentración final PC: 100 u/ml, SM: 0,1 mg/ml) y 4 ml de NaHCO3 al 7,5 %.
Inicio del cultivo
La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó tres veces con PBS (100 µl/pocillo), se añadió RPMI suplementado con 10 % de FCS a 100 µl/pocillo y se introdujo en un incubador con CO2 a 37 ºC durante una hora para el bloqueo. El medio se descartó y las células efectoras se sembraron en dilución en serie de dos veces a partir de 1x106/100 µl/pocillo a 0,125 x 106/100 µl/pocillo.
Una solución de péptido (200 µg/ml) se añadió a 100 µl/pocillo (concentración final 100 µg/ml) para el cultivo en un incubador de CO2 a 37 ºC durante 24 horas.
(Día 3)
Se descartó el medio y el resultante se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). El IFN-γ biotinilado anti-ratón (XMG1.2) (0,5 mg/ml) (Pharmingen) se ajustó a una concentración final de 2 µg/ml (diluido 250 veces en PBS) y se añadió a 100 µl/pocillo. La mezcla se deja reposar a 4 ºC durante la noche.
(Día 4)
La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). La estreptavidina-fosfatasa alcalina (1 mg/ml) (MABTECH AB) se ajustó a una concentración final de 1 µg/ml (diluido 1000 veces en PBS) y se añadió a 100 µl/pocillo.
La solución turbia resultante se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Un tampón de desarrollo de color 25x AP (BIO-RAD) se diluyó 25 veces con AD y se añadieron 1/100 cantidades de los reactivos de color A y B (BIO-RAD) para preparar una mezcla de reacción. La placa de nitrocelulosa de 96 pocillos se lavó diez veces con PBS, 0,05 % de Tween 20 (200 µl/pocillo). La mezcla de reacción se añadió a 100 µl/pocillo y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 10-20 minutos. Una vez que se desarrolló el color y apareció un punto oscuro, la mezcla de reacción se descartó y se lavó minuciosamente en agua. Se despegó el fondo de la placa de nitrocelulosa de 96 pocillos y se secó para contar el número de puntos con el lector ELISPOT.
Los recuentos resultantes se muestran en la Figura 7, donde se indujo una fuerte inmunidad celular.
Ejemplo 7
Examen del efecto terapéutico de las VHC-VVR contra la hepatitis C
15
25
35
45
55
65
Un ratón transgénico (Cre/loxP/HCV-Tg) (en la Figura 8, "loxP-HCV") al que se había transferido con el gen del VHC con un sistema Cre/loxP se apareó con un ratón transgénico que expresaba Cre inducida por IFN (en la Figura 8, "MxCre") para preparar un ratón Tg (Cre/loxP/HCV-MxCre Tg) que expresa como un interruptor el gen del VHC en un momento arbitrario (Figura 8) para analizar la afección patológica de los mismos. Para el análisis de la afección patológica, se usó poli IC, es decir, un agente inductor de interferón con el fin de permitir la expresión génica de la enzima recombinante Cre con interferón.
En el presente documento, en la Figura 8, el panel A muestra la expresión del gen del VHC por el sistema de conmutación Cre/loxP mientras que el panel B muestra el apareamiento entre el ratón transgénico loxP-HCV y el ratón transgénico que expresa el gen de MxCre.
Como VHC-VVR se usaron VVR-CN2 que expresa predominantemente la proteína estructural del VHC, VVR-N25 que expresa la proteína no estructural asociada con la replicación y VVR-CN5 que expresa la proteína completa (Figura 1). Con el fin de evaluar los efectos terapéuticos de estas VHC-VVR, se vacuno a los ratones Cre/IoxP/HCV-MxCre Tg que expresaban de forma persistente la proteína del VHC durante 3 meses por vía intradérmica una vez con las VHC-VVR (1 x 107 UFP), y se obtuvieron muestras de los hígados de los ratones después de cuatro semanas después de la vacunación (Figura 9). Posteriormente, se examinaron los niveles de expresión y la morfología de las proteínas del VHC en los hígados de los ratones.
Los resultados se muestran en la Figura 10. En la Figura 10, el panel A muestra las transiciones de la cantidad de la proteína del núcleo del VHC ("núcleo del VHC") y ALT (alanina aminotransferasa), donde la cantidad de proteína del núcleo del VHC ("núcleo del VHC") y de ALT están representados por un gráfico de barras y una gráfico de líneas, respectivamente. La ALT es un indicador del grado de daño hepático. En el Panel B, " d0", "d90", "d180" y "d480" indican alteración del tejido en el hígado antes de la expresión de genes del VHC y después de 90 días, 180 días y 480 días después de la expresión de genes del VHC, respectivamente.
La proteína del VHC en el hígado del ratón Cre/loxP/HCV-MxCre Tg (en la Figura 10, "núcleo del VHC") no se eliminó por completo y se confirmó la expresión persistente durante más de un año, lo que indica una afección patológica de hepatitis crónica, tal como inflamación o degeneración adiposa, fibrosis y similares en el hígado (Figura 10).
Adicionalmente, en los hígados de los ratones Cre/loxP/HCV-MxCre Tg después de cuatro semanas tras la vacunación con VHC-VVR, el nivel de expresión de la proteína del núcleo se redujo para el grupo de vacunación con VRR-N25 (Figura 11). Además, para el grupo de VVR-N25, la anomalía morfológica en el hígado (estructura similar a un cordón del hígado, condiciones de las células hepáticas o similares) volvió a la normalidad (Figura 11).
En la Figura 11, "m8", "CN2", "CN5" y "N25" representan la cepa LC16m8, VVR-CN2, VVR-CN5 y VVR-N25, respectivamente. El panel A muestra las cantidades de proteínas del núcleo del VHC en el hígado, mientras que el panel B muestra imágenes de los tejidos del hígado después de cuatro semanas tras la vacunación con VHC-VVR. En el Panel B, "a" muestra la imagen del tejido hepático antes de la expresión de genes del VHC, mientras que "b" muestra las imágenes de los tejidos hepáticos tras cuatro semanas después de la vacunación con VHC-VVR. Como se puede apreciar en la figura 11, el hígado del ratón al que se ha administrado VVR-N25 volvió a la normalidad. Por tanto, se ha demostrado que el virus de la variolovacuna de la presente invención tiene un efecto terapéutico sobre la hepatitis C.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención se proporciona un nuevo virus de la variolovacuna recombinante que es eficaz y muy seguro en la prevención o tratamiento de la hepatitis C y un agente profiláctico o terapéutico para la hepatitis C (una vacuna para prevenir o tratar la hepatitis C) que comprende el nuevo virus.
[Listado de secuencias]
SEQ ID NO: 5: ADN sintético
SEQ ID NO: 6: ADN sintético
SEQ ID NO: 7: ADN sintético
SEQ ID NO: 8: ADN sintético
SEQ ID NO: 9: ADN sintético
SEQ ID NO: 10: ADN sintético
SEQ ID NO: 11: ADN sintético
SEQ ID NO: 12: ADN sintético
SEQ ID NO: 13: ADN sintético
SEQ ID NO: 14: ADN sintético
SEQ ID NO: 15: ADN sintético
SEQ ID NO: 16: ADN sintético
SEQ ID NO: 17: Péptido sintético
Claims (1)
-
imagen1
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008057515 | 2008-03-07 | ||
JP2008057515 | 2008-03-07 | ||
JP2008294361A JP5584407B2 (ja) | 2008-03-07 | 2008-11-18 | C型肝炎ウイルス遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
JP2008294361 | 2008-11-18 | ||
PCT/JP2009/054825 WO2009110644A1 (ja) | 2008-03-07 | 2009-03-06 | C型肝炎ウイルス遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2573704T3 true ES2573704T3 (es) | 2016-06-09 |
Family
ID=41056188
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES09717492.4T Active ES2573704T3 (es) | 2008-03-07 | 2009-03-06 | Virus de la variolovacuna recombinante que tiene el gen del virus de la hepatitis C |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9000136B2 (es) |
EP (1) | EP2267120B1 (es) |
JP (1) | JP5584407B2 (es) |
KR (1) | KR101607349B1 (es) |
CN (1) | CN101965396B (es) |
AU (1) | AU2009220401B2 (es) |
CA (1) | CA2717626A1 (es) |
ES (1) | ES2573704T3 (es) |
WO (1) | WO2009110644A1 (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2011314630B2 (en) | 2010-10-15 | 2016-02-04 | Km Biologics Co., Ltd. | Recombinant vaccinia virus having hemagglutinin protein genes derived from novel influenza viruses |
KR102141887B1 (ko) | 2013-01-31 | 2020-08-07 | 포틀랜드 스테이트 유니버시티 | 규화바이러스를 포함하는 면역성 조성물 및 사용 방법 |
WO2014162031A1 (es) * | 2013-04-02 | 2014-10-09 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Vectores recombinantes basados en el virus modificado de ankara (mva) como vacunas preventivas y terapéuticas contra la hepatitis c |
EP3219323B8 (en) * | 2014-11-11 | 2021-04-28 | Nobelpharma Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of hepatitis c |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH06237773A (ja) | 1992-12-22 | 1994-08-30 | Tonen Corp | ポックスウイルスのa型封入体(ati)プロモーター及び前期プロモーターを含んで成る外来遺伝子発現ベクター |
JP2003064096A (ja) * | 2001-08-29 | 2003-03-05 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | C型肝炎ウイルス特異的細胞障害性t細胞認識エピトープ |
DE10143490C2 (de) * | 2001-09-05 | 2003-12-11 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen |
FR2855758B1 (fr) | 2003-06-05 | 2005-07-22 | Biomerieux Sa | Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique |
AU2003289223A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-24 | Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. | Highly safe smallpox vaccine virus and vaccinia virus vector |
JP4921164B2 (ja) * | 2004-02-20 | 2012-04-25 | 財団法人 東京都医学総合研究所 | ヒトc型肝炎ウイルスの全長ゲノムを含む核酸構築物及び該核酸構築物を導入した組換え全長ウイルスゲノム複製細胞、並びにc型肝炎ウイルス粒子の作製方法 |
JPWO2006013815A1 (ja) * | 2004-08-02 | 2008-05-01 | 財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | HCVウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 |
JP4665122B2 (ja) * | 2004-10-08 | 2011-04-06 | 財団法人 東京都医学研究機構 | 組み換えウイルスおよびその用途 |
JP2008057515A (ja) | 2006-09-04 | 2008-03-13 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | ピックアップセンサの出力電圧判定方法および装置 |
JP5103058B2 (ja) | 2007-05-28 | 2012-12-19 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 欠陥観察装置及び欠陥観察方法 |
-
2008
- 2008-11-18 JP JP2008294361A patent/JP5584407B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-06 EP EP09717492.4A patent/EP2267120B1/en not_active Not-in-force
- 2009-03-06 AU AU2009220401A patent/AU2009220401B2/en not_active Ceased
- 2009-03-06 ES ES09717492.4T patent/ES2573704T3/es active Active
- 2009-03-06 WO PCT/JP2009/054825 patent/WO2009110644A1/ja active Application Filing
- 2009-03-06 CA CA2717626A patent/CA2717626A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-06 KR KR1020107022452A patent/KR101607349B1/ko active IP Right Grant
- 2009-03-06 US US12/736,079 patent/US9000136B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-03-06 CN CN200980107538XA patent/CN101965396B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009232836A (ja) | 2009-10-15 |
US9000136B2 (en) | 2015-04-07 |
EP2267120A1 (en) | 2010-12-29 |
KR101607349B1 (ko) | 2016-03-29 |
WO2009110644A1 (ja) | 2009-09-11 |
CN101965396A (zh) | 2011-02-02 |
JP5584407B2 (ja) | 2014-09-03 |
AU2009220401A1 (en) | 2009-09-11 |
CA2717626A1 (en) | 2009-09-11 |
AU2009220401B2 (en) | 2015-07-30 |
EP2267120B1 (en) | 2016-05-18 |
KR20100131480A (ko) | 2010-12-15 |
CN101965396B (zh) | 2013-08-14 |
US20110275139A1 (en) | 2011-11-10 |
EP2267120A4 (en) | 2012-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5006782B2 (ja) | 弱毒ペスチウイルスを含むワクチン | |
US8748591B2 (en) | Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof | |
US10421790B2 (en) | Feline calicivirus vaccine | |
CN102210861B (zh) | 丙型肝炎病毒多表位肽负荷的树突状细胞治疗性疫苗 | |
ES2748039T3 (es) | Partículas similares a virus (VLP) de segunda generación a partir de virus de Epstein-Barr para fines de vacunación | |
US20210401983A1 (en) | Arthrogenic alphavirus vaccine | |
ES2573704T3 (es) | Virus de la variolovacuna recombinante que tiene el gen del virus de la hepatitis C | |
CN113308441A (zh) | 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用 | |
ES2893542T3 (es) | Vacuna | |
CN105802921B (zh) | 表达猪瘟病毒e2蛋白的重组伪狂犬病病毒变异株及其构建方法和应用 | |
White et al. | An animal model of varicella virus infection | |
ES2240968T3 (es) | Capsides y proteinas recombinantes del virus de la enfermedad hemorragica del conejo (rhdv), kits de diagnostico y vacunas que las contienen. | |
ES2257753T3 (es) | Pseudo-particulas virales recombinantes y aplicaciones vacunales y antitumorales. | |
RU2730657C1 (ru) | Противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины и способ его получения | |
ES2869575T3 (es) | Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de la hepatitis C | |
CN117024605B (zh) | 嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的小胶质细胞及其应用 | |
CN104694553A (zh) | 新型生殖器疱疹疫苗 | |
JPWO2006022215A1 (ja) | SARS−コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 | |
WO1997020036A1 (es) | Adenovirus recombinantes que expresan antigenos del virus de la gastroenteritis porcina transmisible (vgpt) y su empleo en la formulacion de vacunas | |
CN104645326A (zh) | 一种预防猪流行性腹泻疾病的疫苗 | |
RU2353651C2 (ru) | Рекомбинантные векторы на основе "живого" вируса оспы домашней птицы и их применение в фармацевтических композициях против вируса гепатита с | |
MARLOW et al. | Altered biodistribution of adenovirus vectors modified with polyethylene glycol (PEG) |