JPWO2006022215A1 - SARS−コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 - Google Patents
SARS−コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2006022215A1 JPWO2006022215A1 JP2006531889A JP2006531889A JPWO2006022215A1 JP WO2006022215 A1 JPWO2006022215 A1 JP WO2006022215A1 JP 2006531889 A JP2006531889 A JP 2006531889A JP 2006531889 A JP2006531889 A JP 2006531889A JP WO2006022215 A1 JPWO2006022215 A1 JP WO2006022215A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sars
- dis
- vaccinia virus
- protein
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
また本発明者らは、マウスへ本発明の組換えDIs株を皮下または経鼻投与することにより、該マウスがSARS-CoVの感染から完全に防御されることを実証した。
〔1〕 SARS-コロナウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔2〕 前記SARS-コロナウイルスタンパク質が構造タンパク質である、〔1〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔3〕 前記構造タンパク質が、E、M、N、およびSタンパク質からなる群より選択される1もしくは複数のタンパク質である、〔2〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔4〕 発現可能な状態で前記タンパク質をコードするDNAがゲノムDNAの非必須領域上に配置された構造のゲノムを有する、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔5〕 非必須領域が対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、〔4〕に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株、
〔6〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA、
〔7〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルスワクチン、
〔8〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞応答誘導剤、
〔9〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤、
〔10〕 〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤、
を提供するものである。
さらに本発明は、以下の〔11〕〜〔20〕を提供するものである。
〔11〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、SARS-コロナウイルスワクチンの製造における使用、
〔12〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞応答誘導剤の製造における使用、
〔13〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤の製造における使用、
〔14〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株の、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤の製造における使用、
〔15〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体(対象者、被検者、患者等)へ投与する工程を含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞応答を誘導する方法、
〔16〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体(対象者、被検者、患者等)へ投与する工程を含む、SARS-コロナウイルス中和抗体を誘導する方法、
〔17〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体(対象者、被検者、患者等)へ投与する工程を含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫を誘導する方法、
〔18〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体(対象者、被検者、患者等)へ投与する工程を含む、SARSウイルスの感染を防御、またはSARSウイルスを排除する方法、
〔19〕前記組換えワクチニアウイルスDIs株を個体(対象者、被検者、患者等)へ投与する工程を含む、SARS(重症急性呼吸器症候群)を予防もしくは治療する方法、
〔20〕 前記組換えワクチニアウイルスDIs株、および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
(1)MVAは一部の哺乳類細胞で増殖するが、DIsは殆ど増殖しない。
(2)MVAには複数の領域の欠損および重複があるため、野生株には存在しない新たなタンパク質が複数生成しており、これらの因子が何らかの未知の影響を宿主に与える可能性が否定できないが、DIsでは欠損は1箇所のみであり、このような影響を考慮する必要がない。
(1) プロモーターmH5(配列番号:10)の下流に発現可能な状態でEタンパク質をコードするDNA(配列番号:2)が連結した構造のDNA(図4;rDIsSARS-E)
(2) プロモーターmH5(配列番号:10)の下流に発現可能な状態でMタンパク質をコードするDNA(配列番号:4)が連結した構造のDNA(図4;rDIsSARS-M)
(3) プロモーターmH5(配列番号:10)の下流に発現可能な状態でSタンパク質をコードするDNA(配列番号:6)が連結した構造のDNA(図4;rDIsSARS-S)
(4) プロモーターmH5(配列番号:10)の下流に発現可能な状態でNタンパク質をコードするDNA(配列番号:8)が連結した構造のDNA(図4;rDIsSARS-N)
(5) 上記(1)のDNAと上記(2)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA(図5;rDIsSARS-E/M)
(6) 上記(1)のDNAと上記(2)のDNAと上記(3)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA(図5;rDIsSARS-E/M/S)
(7) 上記(4)のDNAと上記(3)のDNAがタンデムに連結した構造のDNA(図5;rDIsSARS-N/S)
本発明におけるワクチンは、通常、SARS-CoVの感染防御、ウイルス排除またはSARSの治療のために使用される。ワクチンは抗原を含んでいるか、または抗原を発現可能であり、これにより抗原に対する免疫応答を誘導することができる。SARS-CoVの感染防御、ウイルス排除またはSARSの治療のために、本発明のワクチンは、所望の形態で用いることができる。
また本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株、もしくは本発明の薬剤を個体(例えば、患者等)へ投与する工程を含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞応答を誘導する方法、SARS-コロナウイルス中和抗体を誘導する方法、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫を誘導する方法、SARSウイルスの感染を防御、もしくはSARSウイルスを排除する方法、または、SARS(重症急性呼吸器症候群)を予防もしくは治療する方法に関する。
本発明の方法における個体とは、好ましくはヒトであるが、特に制限されず、免疫系を有する非ヒト動物であってもよい。
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、対象者(患者等)の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
さらに本発明は、本発明の組換えワクチニアウイルスDIs株のSARS-コロナウイルスワクチンの製造における使用、並びに、本発明の上記薬剤の製造における使用に関する。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例1〕DIs株の遺伝子構造の解析
ワクチニアウイルスDIs株を用いて組換えウイルスを作成するため、DIs株のゲノム上に存在する変異の同定を行った。親株のDIE株およびDIs株よりゲノムDNAを精製し、HindIIIで消化してできる断片をアガロースゲル電気泳動で比較した結果、ゲノムの5'端付近に約15kbpの欠損が存在することが明らかとなった。この欠損の付近を増幅するため、2本のPCRプライマー
Vac H-C [5’-ATAATGTAGCTCCTTCATCAATCATACATT]/配列番号:11
Vac H-F [5’-AGGAGGTGGTGTAATAGACGAAGATTATAG]/配列番号:12
を合成した。DIsのゲノムDNAをテンプレートとしてPCR増幅を行い、プラスミドpUC19のEcoRI部位に挿入して増幅されたフラグメントの配列決定を行い、親株と比較して5'端より17.1kbpと32.5kbpの間の部分が欠損していることを明らかにした(Ishii K., Ueda Y., Matsuo K., Matsuura Y., Kitamura T., Kato K., Izumi Y., Someya K., Ohsu T., Honda M. and Miyamura T. (2002) Structural analysis of vaccinia virus DIs strain: Application as a new replication-deficient viral vector. Virology in press)(図1)。なお、ここで作成したベクターをpUc/DIsと呼ぶ。
DIs株をウイルスベクターとして、あるいは組換え生ワクチンとして用いるためには、同ウイルスへ外来遺伝子を組み込む手法を確立することが必須である。ワクチニアウイルスはゲノムのみでは感染性がなく、またゲノムサイズが約200kbpあり、外来遺伝子をゲノム中に直接挿入することは現在の遺伝子工学技術では非常に困難である。そのため、トランスファーベクターを使用し、感染細胞内で相同組換えをおこさせることにより外来遺伝子を挿入する方法が一般に用いられる(ウイルスゲノムの一部と同じ配列を持つプラスミドが感染細胞内に存在する場合、ゲノム複製の際に一定の頻度で、プラスミド上の配列と、それに対応するゲノム上の配列の交換がおこる。この現象が相同組換えである。)。従って、DIsゲノムの一部をプラスミドにサブクローニングし、このDIs配列内に目的の外来遺伝子を挿入することで、このプラスミドをDIsに外来遺伝子を挿入するトランスファーベクターとして用いることができる。
ワクチニアウイルスDIs株約106pfu(plaque forming unit)を含む500μlのウイルス液を、CEF(chick embryo fibroblast)細胞約107個が播かれた80 mmシャーレに接種し、15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させた。その後、1 mlの10% FCS(fetal calf serum)を含むDMEM(Dalbecco-modified Eagle培地)を加え、37℃、5% CO2条件下にて2時間培養した。培地を取り除き、PBS(phosphate-buffered serine)で洗浄してから0.05% トリプシン溶液0.5 mlを加え、細胞を遊離させた後、細胞懸濁液を2000 rpmで3分遠心して細胞を回収し、400μlのPBSに懸濁した。この細胞懸濁液にトランスファーベクター10μgを溶解し、Gene Pulser II(Bio Rad社)を用いて0.4 cmキュベット中、250 v、500μFDで1回電圧をかけ電気穿孔法を行った。細胞を10% FCSを含むDMEM 2 mlに懸濁し、35 mmシャーレに播いて37℃、5% CO2条件下にて7日間培養した。感染細胞を培地とともに回収し、凍結乾燥3回、超音波処理2分行った後、同じ培地で10、100、1000倍希釈した。35 mmシャーレに106個の細胞を播き、培地(10% FCSを含むDMEM)にMPA、xantine、hypoxantineをそれぞれ25μg/ml、250μg/ml、15μg/ml添加して一晩培養した後、上記の希釈細胞液を接種した。15分ごとに8回震盪することによりウイルスを細胞に感染させ、希釈細胞液を除いてから、1%軟寒天添加培地(10% FCSを含むDMEM。MPA、xantine、hypoxantineを含む)2 mlを加え、固化させてから37℃、5% CO2条件下にて7日間培養した。形成されたプラーク部分をパスツールピペットでピックアップし、200μlの10% FCSを含むDMEMに懸濁し、2分間超音波処理を行ってウイルスを寒天より放出させた。この培養液を同じ培地で10、100、1000倍希釈し、上記と同様のプラークアッセイ操作をさらに2回繰り返して組換えウイルスを純化した後、CEF細胞に感染させてスケールアップを行った。このウイルスには外来遺伝子も同時に組み込まれているため、目的とする組換えウイルスを効率良く選別することができる(図3)。
CEF(chick embryo fibroblast)細胞及びVero E6細胞は、10% FCSと抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン)を添加したDMEM培地(GIBCO社)で培養した。
SARS-CoV(HKU39849株)をmoi=1.0にてVero E6細胞に感染させ、2日間培養の後、培養上清を回収した。この培養上清を3000 rpm、10分間遠心し、その上清をさらに8000 rpm、30分間遠心して細胞及び細胞破砕物を除いた後、8%ポリエチレングリコール/0.5 M 塩化ナトリウムでウイルスを沈殿させた。この沈殿を生理食塩水で懸濁した後、不連続蔗糖密度勾配遠心法(20% / 60%)によりウイルス粒子を精製した。この精製ウイルス分画を紫外線照射で不活化し、不活化SARS-CoV全粒子分画とした。
SARS-CoVよりゲノムRNAを抽出し、常法によりcDNAを作成し、PCR法により構造蛋白をコードするopen reading flame(ORF)に相当する領域を増幅した。増幅した各フラグメントを制限酵素BamHI(ただしEのみ制限酵素BglIIを使用した)で切断し、弱毒化ワクチニアウイルスDIsへのトランスファーベクターであるpDIsgptmH5(図2)のBamHI部位に、TakaraのLigation kitを用いて挿入した(それぞれをpDIsSARS-E、pDIsSARS-M、pDIsSARS-N、pDIsSARS-S、pDIsSARS-EM、pDIsSARS-EMSと名付けた)。上記のプラスミドには弱毒化ワクチニアウイルスの配列が挿入してあるため、本ウイルスが増殖する細胞であるCEF細胞に感染させ、上記プラスミドを感染細胞内に導入すると、一定の頻度でプラスミドとウイルスゲノムとの間で相同組換えが起こる。
5週令、メスのBalb/cマウスに、106 pfuの組換えDIsを皮下または経鼻で投与した。2週後と6週後に同量の同じ組換えウイルスを同じ経路で投与し、7週目に採血、鼻腔洗浄液の採取及び脾臓の摘出を行って免疫誘導能の測定に用いた。
SARS-CoVを感染させたVero E6細胞の細胞溶解液を、0.05 M 炭酸緩衝液(pH 9.6)で1000倍希釈し、マイクロプレート(immulon 2, Dynatech, Chantilly, VA)に1ウェルあたり100μlづつ添加した。4℃で一晩コートした後、1% 卵白アルブミンでブロッキングした。試料(血清または鼻腔洗浄液の希釈液100μl)を各ウェルに添加し、結合した抗体をペルオキシダーゼ標識マウスIgG抗体またはIgA抗体(Zymed, San Francisco, CA)及びo-フェニレンジアミン基質溶液(Zymed)により検出した。
その結果、Nを発現する組換えDIsを投与されたマウス、Sを発現する組換えDIsを投与されたマウスのいずれも、ELISA法によりSARS-CoVに対する抗体を産生していた。投与経路は皮下、経鼻どちらも有効であった。(表1)。
96ウェルプレート(住友ベークライト)にコンフルエントになるようにVero E6細胞をまいておき、培地を5% FCS / DMEM 50μlに交換した。1x105 pfu/mlのSARS-CoV 80μlと、PBSで20倍より段階希釈したマウス血清 80μlを混合し、37℃で1時間反応させた後、100μlを上記の細胞プレートに添加し、37℃で48時間培養した。10% ホルマリン溶液で細胞を固定した後、クリスタルバイオレットで細胞を染色し、細胞傷害効果を観察した。細胞傷害を中和し得た最高希釈度の逆数を中和抗体価とした。
その結果、Sを発現する組換えDIsを皮下投与した群では、いずれのマウスの血清もSARS-CoVを中和する活性を持っていた。この組換えDIsを経鼻投与した群でも、一部は同様に中和活性を持っていた。Nを発現する組換えDIsを投与した群は、皮下、経鼻いずれの投与法でも中和活性は誘導されなかった(表1)。
ELISPOT assayは、Diaclone社のγ-Interferon検出ELI-spotキット(Besancon, France)を用いて行った。96ウェルプレート(MaxiSorp, Nunc, Rochester, NY)にELI-spotキットのcapture antibodyを加え、37℃で1時間結合させた後、洗浄後に2% 卵白アルブミンを加え、4℃で一晩ブロッキングした。組換えDIsを投与されたマウスの脾臓及び後頚部リンパ節を摘出してT細胞を調製した。T 細胞を5x105 個、抗原提示細胞として3000 rad γ線照射したA20.2J細胞を1x104 個ウェルに加え、抗原はSARS-CoVのSまたはNの部分ペプチド(20mer)を合成して5μM加えた。37℃で16時間培養した後プレートを洗浄し、ELI-spotキットのbiotinylated detection antibodyを加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後にAlkaline phosphatase-streptavidinを加え、37℃で1時間インキュベートした。洗浄後にBCIP/NBTを添加した軟寒天を加えて固化させ、37℃で3時間インキュベートした。γ-Interferonを分泌する特異的cytotoxic T lymphocyte (CTL)の数を、KS ELISPOT compact system(Carl Zeiss, Jena, Germany)を用いて測定した。
5週令、メスのBalb/cマウスに、106pfuの組換えDIsを皮下または経鼻で投与した。2週後と6週後に同量の同じ組換えウイルスを同じ経路で投与し、7週目に104pfu/mlのSARS-CoVを鼻から吸入させることにより感染させ、3日後に肺洗浄液を採取してSARS-CoVのウイルス価を測定した。その結果、4種の構造タンパク質(EMNS)すべてを発現する組換えDIsを投与された群は、経鼻、皮下いずれのルートでもSARS-CoVの感染から完全に防御された。3種の膜タンパク質(EMS)を発現する組換えDIsを投与された群では、皮下投与の場合はSARS-CoVの感染から完全に防御され、経鼻投与の場合もウイルス価はコントロール群(DIs投与群)と比べ著名に減少した。キャプシドタンパク質(N)のみを投与された群では、コントロール群との差は見られなかったことから、本発明においてNタンパク質を利用する場合には、該タンパク質に加えて、3種のタンパク質EMSと併せて用いることが好ましいことが示唆された(図11)。
Claims (12)
- SARS-コロナウイルスタンパク質の全部もしくは一部のタンパク質をコードするDNAをゲノムDNA上に保有し、該タンパク質を発現し得る組換えワクチニアウイルスDIs株。
- 前記SARS-コロナウイルスタンパク質が構造タンパク質である、請求項1に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
- 前記構造タンパク質が、E、M、N、およびSタンパク質からなる群より選択される1もしくは複数のタンパク質である、請求項2に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
- 発現可能な状態で前記タンパク質をコードするDNAがゲノムDNAの非必須領域上に配置された構造のゲノムを有する、請求項1〜3のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
- 非必須領域が対DI株欠損領域もしくは該領域の近傍領域である、請求項4に記載の組換えワクチニアウイルスDIs株。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株のゲノムDNA。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルスワクチン。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、ウイルス特異的細胞傷害性T細胞応答誘導剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、SARS-コロナウイルス中和抗体誘導剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株を有効成分として含む、呼吸器表面におけるSARS-コロナウイルスに対する粘膜免疫誘導剤。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、請求項7に記載のワクチンの製造における使用。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の組換えワクチニアウイルスDIs株の、請求項8〜10のいずれかに記載の薬剤の製造における使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004242937 | 2004-08-23 | ||
JP2004242937 | 2004-08-23 | ||
PCT/JP2005/015193 WO2006022215A1 (ja) | 2004-08-23 | 2005-08-22 | SARS-コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2006022215A1 true JPWO2006022215A1 (ja) | 2008-05-08 |
Family
ID=35967427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006531889A Pending JPWO2006022215A1 (ja) | 2004-08-23 | 2005-08-22 | SARS−コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2006022215A1 (ja) |
WO (1) | WO2006022215A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5884100B2 (ja) * | 2011-08-31 | 2016-03-15 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来組換えワクシニアウイルス |
CN112746059A (zh) * | 2020-09-15 | 2021-05-04 | 清华大学 | 基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒细胞模型 |
-
2005
- 2005-08-22 JP JP2006531889A patent/JPWO2006022215A1/ja active Pending
- 2005-08-22 WO PCT/JP2005/015193 patent/WO2006022215A1/ja active Application Filing
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6011001540, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 200404, Vol.101, No.17, p.6641−6646 * |
JPN6011001541, Virology, 2002, Vol.302, p.433−444 * |
JPN6011001543, 重症急性呼吸器症候群(SARS)の診断及び検査手法等に関する緊急調査研究, 200403, 第29−41頁 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006022215A1 (ja) | 2006-03-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20080044384A1 (en) | Recombinant Human Cytomegalovirus And Vaccines Comprising Heterologous Antigens | |
JP2020054380A (ja) | PRRSウイルス変異株、ヨーロッパ型PRRSウイルスcDNAクローンおよびそれらの使用 | |
Kohlmann et al. | Protective efficacy and immunogenicity of an adenoviral vector vaccine encoding the codon-optimized F protein of respiratory syncytial virus | |
CN106377767A (zh) | 麻疹‑人乳头瘤组合疫苗 | |
US20210401983A1 (en) | Arthrogenic alphavirus vaccine | |
WO2006038742A1 (ja) | 組み換えウイルスおよびその用途 | |
JP6175167B2 (ja) | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス | |
WO2022080413A1 (ja) | ベータコロナウイルス低温馴化株及びワクチン | |
US11298417B2 (en) | Measles virus vaccine expressing SARS-CoV-2 protein(s) | |
ZA200210354B (en) | BVDV virus-like particles. | |
US20040037850A1 (en) | Attenuated bovine respiratory syncytial virus | |
Hu et al. | Development of a reverse genetics system for respiratory syncytial virus long strain and an immunogenicity study of the recombinant virus | |
YOKOYAMA et al. | Further development of a recombinant feline herpesvirus type 1 vector expressing feline calicivirus immunogenic antigen | |
JP5584407B2 (ja) | C型肝炎ウイルス遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス | |
JPWO2006022215A1 (ja) | SARS−コロナウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 | |
JP5884100B2 (ja) | 新型インフルエンザウイルス由来ヘマグルチニンタンパク質遺伝子を有するDIs株由来組換えワクシニアウイルス | |
EP2473599B1 (en) | Bovine herpesvirus vaccine | |
JP2024502837A (ja) | 高病原性コロナウイルスに対する細胞傷害性t細胞免疫療法 | |
CA2113641A1 (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
JPWO2006013815A1 (ja) | HCVウイルスタンパク質をコードするDNAを保有する組換えワクチニアウイルスDIs株、およびその利用 | |
WO2022025298A1 (ja) | 組換えワクシニアウイルス | |
Yuan et al. | Development of recombinant canine adenovirus type-2 expressing the Gn glycoprotein of Seoul virus | |
Crick | Rabies virus genome | |
CN113322264B (zh) | 具有沉默突变的重组rsv、其相关疫苗和方法 | |
Egyed et al. | Genomic and pathogenic studies on a glycoprotein E variant field isolate of bovine herpesvirus 1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080624 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110117 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110202 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110317 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110803 |