CN101965396B - 具有丙型肝炎病毒基因的重组痘苗病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对防止丙型肝炎感染发病具有有效性且安全性高的重组病毒、及含有该病毒的丙型肝炎病毒用疫苗。本发明的重组痘苗病毒可表达丙型肝炎病毒基因。本发明的丙型肝炎病毒疫苗含有上述本发明的重组病毒。

Description

具有丙型肝炎病毒基因的重组痘苗病毒
技术领域
本发明涉及丙型肝炎的预防药及治疗药。详细而言，涉及能够表达丙型肝炎病毒基因的重组痘苗病毒、以及含有该重组痘苗病毒的丙型肝炎用的预防药及治疗药。 
背景技术
在日本，丙型肝炎病毒(HCV)的感染者存在200万人以上，其中每年有3万6千之多的人发生肝细胞癌，其癌患者很多会死亡。现在唯一且有效的抗HCV药使用的是干扰素(IFN)，但其效果有限，副作用也很严重，因此要求开发更安全且有效的药剂。进而，感染者在高龄化，与此相伴得癌的风险也增高，因此要求快速应对。 
现状下，开发了抑制HCV的病毒复制的核酸类似物、蛋白酶抑制剂等药剂并用于治疗。然而，使用这些药剂进行治疗时，容易出现耐药性病毒，另外从其作用机理来看也难以完全排除病毒，因此需要终生投药治疗。从这样的现状出发，强烈希望建立一种根治疗法，以从终生投药治疗中脱离和解放。 
本发明人等通过制作具有感染性的HCV的cDNA克隆、建立可感染HCV的转基因小鼠及人肝脏嵌合小鼠等感染动物等，建立了有关HCV研究的研究资源，并逐渐建立了各种模型实验体系(例如参照非专利文献1)。作为HCV感染的很大的特征，可列举出高发的持续感染和向慢性肝炎发病的转变。本发明人等长年累月从免疫耐受的获得和其破坏等观点出发，用上述模型实验体系等对其机理进行了深入的分析和研究(例如参照非专利文献2)。 
迄今为止，尝试开发了很多用于预防HCV感染的疫苗，但没有获得能够完全预防感染的结果(例如参照非专利文献3、4、5、6)。 
非专利文献1：Wakita T.，et al.，J.Biol.Chem.，1998，vol.273，p9001-9006 
非专利文献2：Inoue K.，et al.，Hepatology，2007，vol.45，p921-928 
非专利文献3：Choo QL.，et al.，Pros.Natl.Acad.Sci.1994，vol.91，1294-1298 
非专利文献4：Puig M.，et.al.，Vaccine 2004，vol.22，991-1000 
非专利文献5：Abraham JD.，Vaccine 2004，vol.22，3917-3928 
非专利文献6：Elmowalid GA.，et.al.，Pros.Natl.Acad.Sci.2007，vol.104，8427-8432 
发明内容
本发明要解决的课题在于，提供一种含有对阻止丙型肝炎的感染发病有效的重组痘苗病毒的治疗药或预防药。 
本发明人等基于前述有关HCV感染的分析及研究结果，进一步进行了深入研究，结果想到，将使用重组牛痘疫苗带来的免疫强力活化与有力的丙型肝炎感染预防法联系起来。进而想到，将使用重组牛痘疫苗等带来的免疫引起清除(elimination)系统的强力活化与一个有力的丙型肝炎根治疗法联系起来，能够有望完全控制难以根治的病毒疾患的病情。并且，本发明人等以由长年有关病毒感染症的研究得到的见解为基础，为了解决上述课题而进行了深入研究。结果成功制作了对阻止丙型肝 炎的感染发病有效的重组痘苗病毒，从而完成了本发明。 
即，本发明如下所述。 
(1)一种重组痘苗病毒，其包含表达启动子、及丙型肝炎病毒基因组的cDNA的全部或一部分。 
作为痘苗病毒，例如可列举出LC 16m8株。另外，丙型肝炎病毒基因组的cDNA可列举出编码丙型肝炎病毒的结构蛋白或丙型肝炎病毒的非结构蛋白的cDNA，另外，也可以是编码丙型肝炎病毒的结构蛋白及丙型肝炎病毒的非结构蛋白这两者的cDNA。 
具体而言，丙型肝炎病毒基因组的cDNA可例示出以下的(a)～(f)的DNA： 
(a)由序列号1所示的碱基序列构成的DNA， 
(b)与由序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的结构蛋白的DNA， 
(c)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA， 
(d)与由序列号2所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的非结构蛋白的DNA， 
(e)由序列号3所示的碱基序列构成的DNA， 
(f)与由序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的结构蛋白及非结构蛋白的DNA。 
进而，作为本发明的重组痘苗病毒中所含的表达启动子，例如可列举出杂合启动子。具体而言，杂合启动子的碱基序列可例示出以下的(a)或(b)的DNA： 
(a)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA， 
(b)与由序列号4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且具有启动子活性的DNA， 
(2)含有上述(1)的重组痘苗病毒的药物组合物。 
上述药物组合物可作为丙型肝炎的预防药或治疗药使用。 
附图说明
图1是表示用于制作H CV重组痘苗病毒的质粒的基因结构的图。 
图2是表示利用PCR确认HCV基因导入中所使用的引物的位置和名称的图。 
图3是表示利用PCR确认HCV基因导入的结果的、琼脂糖凝胶电泳的照片。 
图4是表示利用免疫印迹法确认HCV蛋白表达的结果的、PVDF膜的照片。 
图5是表示HCV-RVV的体液性/细胞性免疫诱导功能的确认方法的图。 
图6是表示通过ELISA法测定HCV-RVV的作为疫苗的体液性免疫诱导功能效果得到的结果的图。 
图7是表示通过ELISPOT分析测定HCV-RVV的作为疫苗的细胞性免疫诱导功能效果得到的结果的图。 
图8是表示表达丙型肝炎病毒基因转基因小鼠的Cre/loxP开关基因表达的图。 
图9是表示HCV基因表达后的转基因小鼠肝脏内HCV核心蛋白量的经日变化(画面A)及转基因小鼠肝脏的肝炎发病所致的组织变化(画面B)的图。 
图10是表示向HCV转基因小鼠投与HCV重组痘苗病毒的日程表的图。 
图11是表示向HCV转基因小鼠投与HCV重组痘苗病毒后的治疗效果的图。 
具体实施方式
以下，对本发明的重组痘苗病毒及其用途进行详细说明，但本发明的范围并不局限于这些说明，除以下的例示以外，可在不损害本发明的主旨的范围内作适当变更而实施。 
本说明书包含作为本申请优先权要求的基础的日本国专利申请即日本特愿2008-57515号(2008年3月7日申请)及日本特愿2008-294361号(2008年11月18日申请)的说明书的内容。 
另外，本说明书中引用的专利文献、非专利文献及其他出版物作为参照而引入本说明书中。 
1.概要 
在各种疫苗中，活疫苗是特别有效的疫苗之一，已知的是通常开发新病毒的减毒疫苗需要非常长的时间，认为这一点上HCV也同样。 
作为在这种情况下采取的方法之一，已知有制作重组痘苗病毒(RVV)作为活疫苗的基因工程学的方法。例如，已证实本发明人等开发的狂犬病病毒用或牛瘟(rinderpest)用的重组痘苗病毒在野外试验等中可发挥优异的感染发病预防效果(例如参照Tsukiyama K.，et al.，Arch.Virol.，1989，vol.107，p.225-235)。 
另外关于新型肺炎SARS，本发明人等成功制作了具有已知为其病原体的SARS-CoV的cDNA的重组痘苗病毒(WO2006/038742)，确认是具有优异的预防效果和可再投与的制剂(例如参照Kitabatake M.，et al.，Vaccine，2007，vol.25，p.630-637)。 
作为用于制作RVV的重组母体即痘苗病毒，必须是已确定安全性的疫苗株，作为这种疫苗株，已知有痘苗病毒LC 16m8株(例如参照临床和病毒vol.3，No.3，269，1975)。LC 16m8株由Lister株分离得到，具有实际作为预防疫苗的投与成绩，且已确认安全性及有效性，是现在制造的唯一的疫苗株。 
另外，本发明人等在开发研究针对牛瘟、HIV、SARS-CoV等的重组痘苗病毒的过程中发现，使用能够大大提高抗体产生功能及细胞性免疫的诱导功能的基因表达启动子，对于本发明的痘苗病毒是有效的。具体而言，发现作为质粒载体优选使用pSFJ 1-10、pSFJ2-16(例如参照Jin N-Y，et al.，Arch.Virol.1994，Vol.138，p.315-330、Elmowalid GA.，et.al.，Pros.Natl.Acad.Sci.2007，vol.104，8427-8432；Arch.Virol.138，315-330，1994；日本特开平6-237773号公报等)。 
其结果是，本发明人通过将编码HCV的非结构蛋白的基因和/或编码结构蛋白的基因与启动子一起引入痘苗病毒中，从而成功制作了HCV重组痘苗病毒。 
作为本发明的重组痘苗病毒的母体的病毒是如上所述的痘苗病毒。在其基因组中引入HCV的cDNA即得到本发明的重组痘苗病毒。分别克隆编码HCV的蛋白的所有基因区、外壳蛋白区域及参与复制的非结构蛋白区域的基因，将其作为表达单元，并分别导入到痘苗病毒载体中。将该表达单元导入到痘苗病毒的HA遗传区(GENETIC REGION)中。已知的是，即使在HA遗传区中导入外来基因，对于痘苗病毒的增殖活性也没有影响，因此可使用增殖能力弱的安全的疫苗株作为重组母病毒(Vaccine 12，675-681，1994)。 
重组牛痘活疫苗中，针对狂犬病病毒、牛瘟病毒的疫苗进行了野外试验，证明了其感染发病预防效果的优秀性。 
本发明人在杂合启动子的下游插入编码丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白的所有基因、编码外壳蛋白区域的基因、及编码参与复制的非结构蛋白区域的基因，并将这些基因引入到减毒痘苗病毒株的血细胞凝集素(HA)基因区中，从而制作了重组痘苗病毒(RVV)。 
杂合启动子由痘病毒A型包涵体(ATI)启动子及多次重复的痘苗病毒7.5kDa蛋白(p7.5)早期表达启动子构成(参照JinN-Y，et al.，Arch.Virol.1994，vol.138，p.315-330)。该启动子由北海道大学的志田寿利博士开发，也能够由该博士提供。 
已确认通过使制作的RVV感染动物细胞可大量表达HCV蛋白，另外还确认通过接种到动物个体早期产生了针对HCV的高效价的抗体。另外，通过ELISPOT分析确认接种到动物个体时细胞性免疫也被活化，从而完成了本发明。 
2.HCV重组痘苗病毒的制作 
编码丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白的所有基因、编码外壳蛋白区域的基因及编码参与复制的非结构蛋白区域的基因已被克隆，并插入到质粒中。因此，本发明的重组病毒中所含的基因可通过通常的基因工程学的方法获得。例如可使用基因工程学的方法中通常使用的利用DNA合成装置合成核酸的方法。另外，可以使用：分离或合成作为模板的基因序列后，设计各个基因的特异性引物，使用PCR装置扩增其基因序列的PCR法；或使用克隆载体的基因扩增法。本领域技术人员可根据Moleculer cloning 2nd Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等容易地进行上述方法。所得PCR产物的纯化可使用公知的方法。 
在本发明的优选方式中，模板可使用上述质粒中插入的HCV基因(基因型1b；核酸号1-9611；DDB J/EMBL/GenB ank accession number；AY045702)。并且，以HCV基因cDNA作为模板，使用HCV基因特异性引物进行PCR，从而能够制备HCV的各基因区。本发明中，将HCV的所有基因区称为“CN5”，将编码外壳蛋白的结构蛋白区域的基因称为“CN2”，将编码参与复制的非结构蛋白区域的基因称为“N25”。 
CN2、N25及CN5的碱基序列分别如序列号1、序列号2、序列号3所示。但是，除由序列号1～3所示的碱基序列构成的DNA以外，本发明中还可以使用以下的DNA。 
与由序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的结构蛋白的DNA(CN2的突变型DNA)。 
与由序列号2所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的非结构蛋白的DNA(N25的突变型DNA)。 
与由序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的结构蛋白及非结构蛋白的DNA(CN5的突变型DNA)。 
这里，“编码丙型肝炎病毒的结构蛋白”是指编码构成病毒的外壳的蛋白，具体而言，至少编码核心区域、E1区域、E2区域(图1的A)。另外，“编码丙型肝炎病毒的非结构蛋白”是指编码病毒增殖时细胞中产生的蛋白，具体而言，至少编码NS2区域、NS3区域、NS4a区域、NS4b区域、NS5a区域、NS5b区域(图1的B)。 
另外，上述编码结构蛋白的基因及编码非结构蛋白的基因，除全长序列以外，也包含其部分序列。为CN2时，只要包含核心区域、E1区域及E2区域的全部或任一区域，则没有必要是全长，也可以是其一部分。例如，可使用序列号1所示的碱基序列 的E1区域(589～1164位)、E2的区域(1165～2253位)。为N25时，只要包含NS2区域、NS3区域、NS4a区域、NS4b区域、NS5a区域及NS5b区域的全部或任一区域，则没有必要是全长，也可以是其一部分。例如，可使用序列号2所示的碱基序列的NS2区域(805～1455位)、NS3区域(1456～3348位)。为CN5时，只要包含核心区域、E1区域、E2区域、NS2区域、NS3区域、NS4a区域、NS4b区域、NS5a区域及NS5b区域的全部或任一区域，则没有必要是全长，也可以是其一部分。例如，可使用序列号3所示的碱基序列的E1区域(589～1164位)、E2区域(1165～2253位)、NS2区域(2443～3093位)、NS 3区域(3094～4986位)。 
上述突变型DNA可通过化学合成获得，或者，以由序列号1～3所示的碱基序列构成的DNA或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬菌斑杂交、DNA印迹等公知的杂交法，由cDNA文库及基因组文库获得。上述杂交中，作为严格的条件，例如可列举出0.1×SSC～10×SSC、0.1％～1.0％SDS及20℃～80℃的条件，更详细而言，可列举出在37℃～56℃下进行30分钟以上预杂交后，在0.1×SSC、0.1％SDS中、室温下进行1～3次10～20分钟的洗涤的条件。关于杂交法的详细步骤，可参照“MolecularCloning，A Laboratory Manual 2nd ed.”(Cold Spring HarborPress(1989))等。 
另外，可使用与序列号1所示的碱基序列具有50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性且编码丙型肝炎病毒的结构蛋白的DNA(CN2的突变型DNA)，与序列号2所示的碱基序列具有50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性且编码丙型肝炎病毒的非结构蛋白的DNA(N25的突变型DNA)，与序列号3所示的碱基序列具有50％ 以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同源性且编码丙型肝炎病毒的非结构蛋白及结构蛋白的DNA(CN5的突变型DNA)。 
本发明的重组痘苗病毒中所含的启动子是痘苗病毒的血细胞凝集素(HA)基因区内由痘病毒A型包涵体(ATI)启动子及多次重复的痘苗病毒7.5kDa蛋白(p7.5)早期表达启动子构成的杂合启动子。该启动子可与适当的质粒连接，例如已知有pBMSF7C(Arch.Virol.138，315-330，1994；日本特开平6-237773号公报)。 
本发明中可使用的杂合启动子的碱基序列如序列号4所示。但是，除由序列号4所示的碱基序列构成的DNA以外，本发明中也可以使用与由序列号4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且具有启动子活性的DNA。“严格的条件”与前述相同。“具有启动子活性”是指具有编码结构蛋白或非结构蛋白的基因的转录活性。 
通过该杂合启动子表达的蛋白从痘苗病毒感染前期至后期可以受到完全的糖修饰的形式大量表达。本发明中，将在pBMSF7C的启动子下游插入有HCV基因(CN5)的质粒载体称为pBMSF7C-CN5。另外，本发明中，将在pBMSF7C的启动子下游插入有外壳蛋白区域基因(CN2)的质粒载体称为pBMSF7C-CN2。进而，将在pBMSF7C的启动子下游插入有非结构蛋白基因(N25)的质粒载体称为pBMSF7C-N25。 
通过将这些质粒载体导入到作为宿主的痘苗病毒中，可制作重组痘苗病毒。质粒载体向宿主中的导入可采用公知的任意方法，例如通过在感染了减毒痘苗病毒LC 16m8株的动物细胞中分别导入质粒载体pBMSF 7C-CN5、pBMSF7C-CN2、pBMSF7C-N25，从而在痘苗病毒的血细胞凝集素(HA)基因 区引起同源重组，可制作分别表达HCV的各蛋白的重组痘苗病毒(RVV-CN5、RVV-CN2及RVV-N25)。 
另外，用于制作RVV的痘苗病毒LC16m8株是可在动物个体中增殖、但在神经细胞中的增殖性非常低的减毒株。在日本被批准作为天花疫苗，接种于约5万的幼儿，结果没有产生严重的副作用(厚生省种痘研究班研究报告、临床和病毒vol.3，No.3，269，1975)。另一方面，据报道免疫诱导功能与作为亲株的Lister株相同，LC 16m 8株是安全且有效的疫苗。 
所制作的RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25由于在痘苗病毒的HA基因区插入了HCV的蛋白基因，因此HA蛋白的表达欠缺，不会引起红细胞凝集反应。因此，使动物细胞感染RVV-CN5、RVV-CN2及RVV-N25，以由此形成的噬菌斑中的鸡红细胞的凝集反应为指标，进行RVV的筛查。目标RVV只要筛选没有出现红细胞凝集的白噬菌斑即可。 
对于由白噬菌斑获得的病毒，以病毒基因组作为模板通过HCV基因特异性引物进行PCR，可确认HCV的基因导入。 
HCV蛋白的表达可以感染RVV-CN5、RVV-CN2及RVV-N25后的动物细胞作为样品、并通过免疫印迹法进行确认。另外，抗体可使用由用HCV多肽进行免疫而制作的抗血清(J.Biol.Chem.279：14531-14541，2004)通过Protein G纯化IgG而得到的抗体。 
作为RVV的制作中目标基因的插入部位，除HA基因区以外，通常使用胸苷激酶(TK)基因区，已知的是，通过在TK基因区插入目标基因，由于TK的表达缺陷而RVV的增殖性降低。另一方面，据报道，HA蛋白表达缺陷对RVV的增殖性基本没有影响(Vaccine 12，675-681，1994)。因此，本发明中，作为目标基因的插入部位，优选HA基因区。 
3.丙型肝炎预防或治疗用药物组合物 
本发明提供含有上述重组痘苗病毒的丙型肝炎预防药及丙型肝炎治疗药(药物组合物)。 
本发明的药物组合物可通过所有公知的方法例如肌肉、腹腔内、皮内或皮下等的注射、或由鼻腔、口腔或肺的吸入、经口投与导入到生物体内。进而，也可以将本发明的药物组合物中所含的重组病毒与现有抗病毒药(例如干扰素)并用。并用的方式没有特别限定，可以同时投与本发明的重组病毒和现有抗病毒药，也可以通过投与一者后经过一定时间后投与另一者的方法导入到生物体内。 
另外，本发明的药物组合物可以与赋形剂、增量剂、结合剂、润滑剂等公知的药学上容许的载体、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等混合。 
本发明的药物组合物可根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等经口投与剂、注射剂、外用剂、坐剂、滴眼剂等非经口投与剂等形态进行经口投与或非经口投与。优选例示出对皮内、肌肉、腹腔等的局部注射等。 
投与量可根据有效成分的种类、投与途径、投与对象、患者的年龄、体重、性别、症状及其他条件适当选择，作为病毒的一天投与量，经口时为1000～1000000000PFU(噬菌斑形成单位，plaq ue forming units)左右，优选为100000～100000000PFU左右，非经口时为100～1000000000PFU(plaq ue formingunits)左右，优选为1000～100000000PFU左右。病毒可以1天1次投与，也可以分数次投与。 
本发明的重组病毒可作为丙型肝炎预防用或治疗用疫苗使用。另外，迄今为止，在针对HCV的疫苗的开发中，着眼于针对HCV的抗体和细胞毒性T细胞(CTL)进行了研究。因此，优 选预先测定作为疫苗的抗体效价或细胞性免疫活性。 
例如，针对所制作的RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25或作为亲株的LC 16m8株的抗体效价可通过将这些病毒株接种于兔后，经时回收血清，测定血清的针对HCV的ELI SA价而获得。接种了RVV-CN5、RVV-CN2的兔的血清从接种4周后确认到针对HCV的抗体效价开始上升。 
另外，关于细胞性免疫活性，将RVV-CN5、RVV-CN2、RVV-N25或作为亲株的LC 16m8株接种于小鼠后，从免疫了的小鼠分离脾细胞，通过ELISP OT分析测定HCV特异性CTL是否被诱导。本发明中，若将RVV-CN5免疫BALB/c小鼠来源的脾细胞用H-2d限制性的E 1特异性CTL表位序列的合成肽进行刺激，则检测到接近于对照的10倍的INF-γ产生细胞。由此可知，RVV-CN5免疫在BALB/c小鼠中诱导E1特异性CTL。 
以上，确认了本发明人等制作的HCV-RVVs可诱导针对HCV的体液性及细胞性免疫。 
通过以下的实施例更具体地说明本发明。这些实施例只是用于说明，并不限定本发明的范围。 
[实施例1] 
重组痘苗病毒的制作 
通过在pBMSF7C质粒(日本特开平6-237773)的SbfI和SgfI位点中引入丙型肝炎病毒的所有基因区(CN5)、外壳蛋白区域(CN2)及参与复制的非结构蛋白区域(N25)的基因区(DDBJ/EMBL/GenBank accession number；AY045702)，从而制作在血细胞凝集素(HA)基因区内的ATI·p7.5杂合启动子下游插入了HCV基因的质粒载体pBMSF7C-CN5、pBMSF7C-CN2、pBMSF7C-N25。(图1) 
将初代肾培养细胞接种于T175烧瓶中，达到汇合生长时， 以moi＝10在30℃下感染痘苗病毒减毒株LC16m8株2小时。另外，moi(感染复数，multiplicity of infection)是指每1个细胞的PFU。感染后，吸除病毒溶液，将细胞用PBS(-)洗涤。接着，通过0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA/PBS(-)进行处理，以10％FCS/MEM培养基、PBS(-)、HeBS缓冲液洗涤后，将细胞悬浮于HeBS缓冲液600μl中。将质粒载体pBMSF7C-CN5、pBMSF7C-CN2及pBMSF7C-N25各40μg用HeB S缓冲液稀释至各自的总量为200μl，加入细胞悬浮液并混合，在冰上静置10分钟。将添加有质粒载体的细胞悬浮液转移至0.4cm比色杯中，用电穿孔仪(Bio-Rad公司制)进行电穿孔(0.2kV、960μF)。电穿孔后，立即将10％FCS/MEM培养基1ml加到细胞悬浮液中进行稀释。将该细胞悬浮液添加到预先接种于T175烧瓶中的RK13细胞或初代肾培养细胞中，在30℃下培养24小时。 
培养24小时后，吸除培养上清，用PBS(-)洗涤细胞。接着，进行0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA/PBS(-)处理后，将细胞悬浮于10％FCS/MEM培养基中。回收细胞悬浮液，在冷水中进行超声波处理(30秒×4次)后，离心分离(2000rpm、10分钟)。使用该上清作为病毒溶液。将病毒溶液稀释到10％FCS/MEM培养基中，在30℃下感染预先接种在100mm培养皿中的初代肾培养细胞1小时。吸除病毒溶液后，用PBS(-)洗涤细胞。添加10％FCS/0.5％甲基纤维素/MEM培养基，在30℃下培养72小时。培养72小时后，吸除上清，以PBS(-)进行洗涤。将用PBS(+)稀释了的鸡红细胞溶液添加到100mm培养皿中，在37℃下培养30分钟。吸除红细胞溶液后，将细胞用PBS(-)洗涤2次。用自动移液器(Pipetman)回收没有吸附鸡红细胞的噬菌斑。回收的噬菌斑通过PCR及基因序列的鉴定确认HCV基因的导入。对于确认到基因导入的噬菌斑，重复3次噬 菌斑纯化。 
对于经3次噬菌斑纯化的病毒，进行小规模培养。将第3次得到的菌落悬浮于700μl的10％FCS/MEM培养基中，在冷水中进行超声波处理。进行离心分离(2000rpm、10分钟)后，将上清500μl添加到事先接种于T25中的初代肾培养细胞中，在30℃下感染2小时。感染后，吸除病毒溶液，用2.5ml的10％FCS/MEM培养基洗涤细胞。吸除培养基，新添加2.5ml的10％FCS/MEM培养基，在30℃下培养72小时。72小时后用刮板将细胞从烧瓶剥离，回收细胞悬浮液。将回收的细胞悬浮液在冷水中进行超声波处理(30秒、4次)后，离心分离，回收其上清作为病毒溶液。将回收的病毒溶液系列稀释并添加到事先接种于6孔板中的RK 13细胞或初代肾培养细胞中，在30℃下感染1小时。吸除病毒溶液后，用PBS(-)将细胞洗涤2次后，添加10％FCS/0.5％甲基纤维素/MEM培养基，在30℃下培养72小时。72小时后，通过数出孔中形成的噬菌斑数而算出效价(titer)。 
以该算出的效价(titer)为基础进行大规模培养。在10个T175烧瓶中接种RK13细胞或初代肾培养细胞，达到汇合生长时，以moi＝0.1在30℃下感染重组痘苗病毒溶液2小时。感染后，吸除病毒溶液，用20ml的10％FCS/MEM培养基洗涤细胞。吸除培养基，新添加20ml的10％FCS/MEM培养基，在30℃下培养72小时。72小时后用刮板将细胞从烧瓶剥离，回收细胞悬浮液，在-80℃下冷冻保存。将该细胞悬浮液进行三次冷冻融化后，在冷水中进行超声波处理(30秒、4次)、离心分离，回收其上清作为病毒溶液。将回收的病毒溶液转移至高速离心用管中，以18000rpm进行45分钟离心分离，使病毒沉淀。吸除上清后，将颗粒用少量的10％FCS/MEM培养基再悬浮。通过该操作制备与在T175烧瓶中培养时相比浓缩了10倍的病毒溶液。将该浓缩病 毒溶液系列稀释，感染事先接种于6孔板中的RK 13细胞或初代肾培养细胞，通过与上述同样的方法计算出溶液中的病毒效价(titer)。将计算出效价(titer)的该浓缩病毒溶液用于以下的实施例所示的各种实验。 
[实施例2] 
利用PCR的HCV基因导入的确认 
使用对HCV基因为特异性的以下的引物，以得到的重组痘苗病毒基因组作为模板，通过进行PCR，确认是否在该病毒基因组中导入了HCV基因(图2、图3)。 
(1)克隆用引物碱基序列 
Fw：HCV-CL-Fw(序列号5) 
5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCCCAAAGAAAAACCAAACG-3 
Rv：HCV-CL-MRv(序列号6) 
5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTAAAGGAGCCGCCACCCCTGCCCTTCAAGACTATC-3 
Fw：HCV-CL-MFw(序列号7) 
5-GGGCGGCCCTGCAGGTAATACGACTCACTATAGGGCGTAGACCGTGCATCATGACGCGGCCGCCGCAAGGCAACTGGTTCGGC-3 
Rv：HCV-CL-Rv(序列号8) 
5-GGGCGGCGCGATCGCCTATCATTATCGGTTGGGGAGCAGGTAGATGCCTAC-3 
(2)插入确认PCR用引物碱基序列 
<HA> 
Fw：HA-1-S(序列号9) 
5-GGTCTTATATACACCGAGTAAGG-3 
Rv：PB SF-110-350-R20(序列号10) 
5-TCAGGAAAGACAGCCATAGC-3 
<前半区域> 
Fw：PB SF-110-1204-S22(序列号11) 
5-CATCACATTGAAACATTGGGAC-3 
Rv：6-354-R20(序列号12) 
5-GATTTGTGCTCATGATGCAC-3 
Rv：6-2139-R23(序列号13) 
5-CCGAACCACATTTTGTGTAAGTG-3 
<后半区域> 
Fw：6-3251-18S(序列号14) 
5-AGTAGAGCCCGTTGTCTT-3 
Fw：6-9168-S20(序列号15) 
5-TACCTCTTCAACTGGGCAGT-3 
Rv：HA-6-R(序列号16) 
5-CTAGTTCTGAGAAACCAGAGG-3 
具体而言，反应液组成为：相对于市售的聚合酶附带的缓冲液50μL，DNA聚合酶为1U，dNTP为0.3mM，F引物为1μM，R引物为1μM，循环条件为：以在95℃下熔解0.5分钟、在58℃下退火0.5分钟、在72℃下延伸2分钟作为1循环，进行25个循环。将所得到的PCR产物用琼脂糖凝胶进行电泳，确认条带。其结果是，若确认到通过引物设计而预想的长度的单一条带，则可知重组病毒基因组中导入了HCV基因，另一方面，若没有确认到该条带，则可知没有导入HCV基因。 
如图3所示，由PCR产物(扩增片段)的2wt％琼脂糖凝胶电泳的结果可知，在重组病毒基因组中导入了HCV基因。 
[实施例3] 
利用免疫印迹法的HCV蛋白的表达确认 
用重组痘苗病毒以moi＝30的RVV-S在30℃下感染预先接种于6孔板中的RK 13细胞2小时。感染后，吸除病毒溶液，通过PB S(-)将细胞洗涤2次。在各孔中添加2ml的10％FCS/MEM培养基，在30℃下培养24小时。24小时后，吸除培养基，添加100μl的溶解缓冲液(1％SDS、0.5％NP-40、0.15M NaCl、10mMTris-HCl(pH 7.4))将细胞溶解，将该溶液转移至1.5ml的埃彭道夫(eppendorf)管中。将回收的溶液在冷水中进行超声波处理直至没有粘性。制备的溶液中的蛋白量通过Lowry法进行定量。 
使用10％丙烯酰胺凝胶对50μg的蛋白进行电泳。电泳结束后，取出凝胶，用半干印迹仪(Semi-dry blotter)以5.5mA/cm2通电60分钟，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜。将膜用TBS-T溶液洗涤后，浸渍到5％脱脂乳-TBS-T溶液中进行封闭。封闭结束后，将膜用TBS-T溶液洗涤3次。第一抗体为小鼠单克隆抗体，使用将Core-31-2、E1-384、E2-544、NS3-10-1、NS4B-52-1、NS5B-14-5克隆经IgG纯化而得到的抗体。纯化的抗体的蛋白量通过Lowry法进行定量，调制成10μg/ml使用。与第一抗体的反应结束后，将膜用TBS-T溶液洗涤3次。第二抗体使用抗兔IgG-linked HRPO(Donkey、Amersham公司制)。与第二抗体的反应结束后，再次用TBS-T溶液将膜洗涤3次，将ECL溶液添加到膜上，在薄膜上显影。 
如图4所示，由该结果可知，RVV-CN2、RVV-N25及RVV-CN5的重组病毒基因组表达了HCV蛋白。 
[实施例4] 
兔及小鼠中的重组痘苗病毒接种实验(图5) 
图5是表示HCV-RVV的体液性/细胞性免疫诱导功能的确认方法的图。 
将实施例1中得到的重组痘苗病毒或作为亲株的LC16m8株以1×108pfu经内皮接种到雌性新西兰白兔中后，1、2、3、4、6周后从耳静脉采血。另外，初次接种病毒6周后再次以1×108pfu接种RVV-S。再接种后也同样在1、2、3、4、6周后从耳静脉进行采血。采集的血液全部放入真空采血管(TERUMO公司制，产品名：ベノジエクトII真空采血管(灭菌品)，9mL)中，离心分离(3000rpm、20分钟)，分离回收血清。将血清在-20℃下冷冻保存至进行后述的ELISA试验。 
[实施例5] 
对于用HCV-RVV免疫的兔血清中的HCV蛋白利用ELISA法测定抗体效价 
预先用核心(Core)蛋白及E2蛋白包被96孔板，将预先冷冻的血清样品稀释至100倍并添加。室温下静置1小时后，将96孔板用TBS-T溶液洗涤后，在96孔板中添加抗兔IgG-linkedHRPO(Donkey、Amersham公司制)作为第二抗体。室温下1小时的与第二抗体的反应结束后，再次用TBS-T溶液将96孔板洗涤3次，以100μl/孔添加显色液。在室温下静置10-20分钟后，用酶标仪(Microplate Reader)测定450nm的吸光度。 
其结果如图6所示，确认接种了RVV-CN2及RVV-CN5的兔血清对Core及E2具有高的抗体效价的诱导。 
[实施例6] 
利用ELISPOT分析确认HCV-RVV的作为疫苗的细胞性免疫诱导功能效果 
(第1天) 
在96孔硝基纤维素板中，将纯化抗小鼠IFN-γ抗体 (R4-6A2)(1μg/ml)(Pharmingen)调整至最终浓度8μg/ml(用无菌PBS稀释125倍)，以75～100μl/孔进行接种，在4度下静置一夜。 
(第2天) 
从小鼠取脾细胞，用洗涤用RPMI使其适量悬浮。洗涤用RPMI使用添加有2.5％FCS的溶液。以1200rpm、4度离心5分钟，收集细胞。进行ACK处理，用洗涤用RPMI使其适量悬浮，再次以1200rpm、4度下离心5分钟，收集细胞。在过滤器中通入500μl的洗涤用RPMI后，通入细胞悬浮液，完全通入后用洗涤用RPMI1.5ml洗涤。用添加有10％FCS的RPMI洗涤1次，在H-h培养基中悬浮后，调整至1×107/ml。 
1)H-h培养基：添加有10％FCS的RPMI与添加有10％FCS的CLICK′S培养基等量混合而成。 
2)添加有10％FCS的RPMI：RPMI-1640(SIGMA R8758)，FCS(终浓度10％)，2-巯基乙醇(终浓度5μM)，青霉素-链霉素(终浓度PCs：100u/ml，SM：0.1mg/ml)，7.5％NaHCO34ml。 
3)添加有10％FCS的CLICK′S培养基：CLICK′S培养基(SIGMA C5572)，FCS(终浓度10％)，2-巯基乙醇(终浓度5μM)，青霉素-链霉素(终浓度PCs：100u/ml，SM：0.1mg/ml)，7.5％NaHCO34ml。 
培养的开始 
将96孔硝基纤维素板用PB S(100μl/孔)洗涤3次后，以100μl/孔加入添加有10％FC S的RPMI，在37度下放入CO2孵化器中1小时进行封闭。扔掉培养基，由1×106/100μl/孔至0.125×106/100μl/孔以2倍系列稀释接种效应细胞。 
以100μl/孔(终浓度100μg/ml)添加肽溶液(200μg/ml)，在37度下在CO2孵化器中培养24小时。 
(第3天) 
扔掉培养基，用PBS、0.05％Tween20(200μl/孔)洗涤10次。将生物素标记抗-小鼠IFN-γ(XMG1.2)(0.5mg/ml)(Pharmingen)调整至最终浓度2μg/ml(用PBS稀释250倍)，并按照100μl/孔进行添加。在4度下静置1夜。 
(第4天) 
将96孔硝基纤维素板用PBS、0.05％Tween20(200μl/孔)洗涤10次。将链霉亲合素-碱性磷酸酶(1mg/ml)(MABTECHAB)调整至最终浓度1μg/ml(用PBS稀释1000倍)，并按照100μl/孔进行添加。 
将所得溶液在室温下静置1.5小时。将25×AP显色缓冲液(color development buffer)(BIO-RAD)用DW稀释25倍，分别添加1/100量的AP color reagent A和B(BIO-RAD)，调制反应混合物。将96孔硝基纤维素板用PBS、0.05％Tween 20(200μl/孔)洗涤10次。以100μl/孔添加反应混合物，在室温下静置10～20分钟。显色，若出现斑点(dark spot)，扔掉反应混合物，在水中洗涤干净。将96孔硝基纤维素板的底剥离，并干燥，用酶联斑点分析仪(ELISPOT Reader)数出斑点的数目。 
计数的结果如图7所示，确认诱导了很强的细胞性免疫。 
[实施例7] 
HCV-RVV对丙型肝炎的治疗效果的研究 
使通过Cre/loxP系统导入HCV基因的转基因(Cre/loxP/HCV-Tg)小鼠(图8中“loxP-HCV”)与IFN诱导性的表达Cre的转基因小鼠(图8中“MxCre”)交配，制作在任意的时期开关表达HCV基因的Tg小鼠(Cre/loxP/HCV-MxCre Tg)(图8)，进行其病理分析。在病理分析中，为了通过干扰素使Cre重组酶基因表达，使用作为干扰素诱导剂的聚肌苷酸-胞苷 酸(poly IC)。 
另外，图8中，画面A是表示利用Cre/loxP开关系统的HCV基因表达的图，画面B是表示loxP-HCV转基因小鼠与表达MxCre基因转基因小鼠的交配的图。 
作为HCV-RVV，使用主要表达HCV的结构蛋白的RVV-CN2、表达参与复制的非结构蛋白的RVV-N25、表达全部蛋白的RVV-CN5(图1)。为了评价这些HCV-RVV的治疗效果，对3个月间持续表达HCV蛋白的Cre/loxP/HCV-MxCre Tg小鼠单次皮内接种HCV-RVV(1×107pfu)，从接种4周后，对小鼠肝脏进行取样(图9)。并且，对小鼠肝脏的HCV蛋白的表达量和形态学进行研究。 
结果示于图10中。图10中，画面A是表示HCV核心蛋白量(“HCV Core”)和ALT(丙氨酸氨基转移酶)的推移的图，HCV核心蛋白量(“HCV Core”)用棒图表示，ALT用线图表示。另外，ALT是表示肝脏损伤的程度的指标。画面B中“d0”、“d90”、“d180”、“d480”分别表示HCV基因表达前、HCV基因表达90天后、180天后、480天后的肝脏中的组织变化。 
Cre/loxP/HCV-MxCre Tg小鼠的肝脏中的HCV蛋白(图10中“HCV Core”)没有完全被排除，确认到1年以上的持续的表达，显示出了肝脏中的炎症、脂肪变性、纤维化等慢性肝炎的病情(图10)。 
另外，接种HCV-RVV4周后的Cre/loxP/HCV-MxCre Tg小鼠肝脏中，RVV-N25接种组的核心蛋白表达量减少(图11)。进而，在RVV-N25接种组中，确认到肝脏中的形态学的异常(肝脏的索状结构(cord-like structure)、肝细胞的状态等)的正常化(图11)。 
图11中，“m8”、“CN2”、“CN5”、“N25”分别表示LC 16m8 株、RVV-CN2、RVV-CN5、RVV-N25。画面A表示肝脏中的HCV核心蛋白量，画面B表示接种HCV-RVV4周后的肝脏组织像。画面B中，a表示HCV基因表达前的肝脏组织像，b表示接种HCV-RVV4周后的肝脏组织像。由图11可知，投与RVV-N25的小鼠的肝脏正常化。因此表示，本发明的痘苗病毒具有丙型肝炎的治疗效果。 
产业上的可利用性
根据本发明，可提供对丙型肝炎的预防或治疗有效、且安全性高的新型重组痘苗病毒、及含有该病毒的丙型肝炎用预防药或治疗药(丙型肝炎的预防或治疗用疫苗)。 
序列表自由文本 
序列号5：合成DNA 
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Claims (12)

1.一种重组痘苗病毒，其包含表达启动子、及以下的(a)或(b)的DNA：
(a)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA，
(b)与由序列号2所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的由NS2区域、NS3区域、NS4a区域、NS4b区域、NS5a区域和NS5b区域所组成的非结构蛋白、和由E2区域的一部分及P7区域所组成的结构蛋白的DNA。
2.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，表达启动子为杂合启动子。
3.根据权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，杂合启动子的碱基序列为以下的(a)或(b)的DNA：
(a)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA，
(b)与由序列号4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且具有启动子活性的DNA。
4.一种药物组合物，其含有权利要求1～3中任一项所述的重组痘苗病毒。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其为丙型肝炎的预防药。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其为丙型肝炎的治疗药。
7.一种重组痘苗病毒LC16m8株，其包含表达启动子、及以下的(a)或(b)的DNA：
(a)由序列号2所示的碱基序列构成的DNA，
(b)与由序列号2所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码丙型肝炎病毒的由NS2区域、NS3区域、NS4a区域、NS4b区域、NS5a区域和NS5b区域所组成的非结构蛋白、和由E2区域的一部分及P7区域所组成的结构蛋白的DNA。
8.根据权利要求7所述的重组痘苗病毒LC16m8株，其中，表达启动子为杂合启动子。
9.根据权利要求8所述的重组痘苗病毒LC16m8株，其中，杂合启动子的碱基序列为以下的(a)或(b)的DNA：
(a)由序列号4所示的碱基序列构成的DNA，
(b)与由序列号4所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且具有启动子活性的DNA。
10.一种药物组合物，其含有权利要求7～9中任一项所述的重组痘苗病毒LC16m8株。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其为丙型肝炎的预防药。
12.根据权利要求10所述的药物组合物，其为丙型肝炎的治疗药。
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