CN101035560A - 重组活禽痘病毒载体及其在抗丙型肝炎病毒的药物组合物中的应用 - Google Patents

重组活禽痘病毒载体及其在抗丙型肝炎病毒的药物组合物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于基于丙型肝炎病毒抗原的蛋白质组合的重组禽痘病毒，和涉及其在药物组合物中的应用，所述药物组合物能在施用减少的剂量之后诱导抗丙型肝炎病毒的细胞免疫应答。根据本发明，所述药物组合物可以用于在哺乳动物中预防和治疗与丙型肝炎病毒有关的感染。

Description

重组活禽痘病毒载体及其在抗丙型肝炎病毒的药物组合物中的应用
发明领域
本发明涉及免疫学和病毒疫苗的分支，特别是表达丙型肝炎病毒(HCV)的蛋白质的重组禽痘病毒和能够诱导抗HCV的细胞免疫应答的药物组合物。
现有技术
于1989年第一次通过使用分子生物学技术将HCV鉴定为非甲、非乙型输血后肝炎的主要致病因子(Choo Q-L.，Kuo G.，等人.(1989)Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A，non-B viral hepatitis genome.Science.244：359-62；EP0318216Chiron Corp)。目前全球有超过一亿七千万人感染了这种病毒性因子。85％的HCV感染是持久的，其常常引起肝硬化和肝细胞癌(CaselmannW.H.，Alt M.(1996)Hepatitis C virus infection as a major riskfactor for hepatocellular carcinoma.J.Hepatol.24：61-66)。事实上，在感染25年后，每年有25％的HCV慢性携带者形成肝硬化，和他们中的1％至4％形成肝细胞癌(Prince A.M.，Shata M.T.(2001)Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection.Clin.Liver.Dis.5：1091-103)。
选择用于HCV感染的治疗基于以高强度的用药方案来联合施用PEG化的干扰素α(IFN-α)和病毒唑。但是，该治疗具侵袭性，价格昂贵，且只在低于50％的案例中有效(Prince A.M.，Shata M.T.(2001)Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection.Clin.Liver.Dis.5：1091-103)。
已经作为疫苗接种的方法评价了以HCV抗原为基础的蛋白质亚基、病毒样颗粒、合成肽、重组活载体和用于DNA免疫接种的DNA构建体的各种不同的变体(US6635257，US6387662，US6235888，US6685944，US2003021805，Lechmann M.，Liang T.J.(2000)Vaccinedevelopment for hepatitis C.Semin.Liver.Dis.20：211-26)。这些变体中的一些已被证实能引起针对HCV表位的特异性免疫应答，尽管所述免疫应答还不够。目前，与抗HCV感染的保护相关的免疫学参数尚未完全确定。不过，有几项研究提出，早期、强烈且多特异性的细胞毒性T细胞应答同CD4+Th1细胞一起，促进抗病毒的免疫和疾病的消除。相反，晚期的T细胞应答与慢性肝免疫病理学状态的形成相关(Cerny A.，Chisari F.V.(1999)Pathogenesis of chronichepatitis C：immunological features of hepatic injury and viralpersistente.Hepatology.30：595-601；Cooper S.等人，(1999)Analysis of a successful immune response against hepatitis Cvirus.Immunity 10：439-49；Lechner F.等人，(2000)Why docytotoxic T lymphocytes fail to eliminate hepatitis C virus？Lessons from studies using major histocompatibility complexclass I peptide tetramers.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.355：1085-92；Takaki A.等人，(2000).Cellular immuneresponses persist and humoral responses decrease two decadesafter recovery from a single-source outbreak of hepatitis C.Nat.Med.6：578-82)。
重组活载体是用于产生抗HCV的细胞免疫应答的很吸引人的候选手段。用重组有HCV核心和E1的腺病毒免疫小鼠引起针对这些抗原的特异性细胞毒性T细胞应答(Bruna-Romero 0.等人，(1997)Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis Cvirus structural antigens using a defective recombinantadenovirus.Hepatology 25：470-7)。尽管这些研究结果一直都被抱以希望，但近来随着将重组腺病毒用于基因治疗而出现的问题使得产生了关于它们在人类中使用的置疑。当它们与基于DNA构建体的疫苗候选物相联合时，依据所评估的抗原，使用包含不同HCV基因的重组痘苗和金丝雀痘病毒在小鼠中诱导了细胞毒性T细胞免疫应答，(Pancholi P.等人，2000)DNA prime-canarypox boost withpolycistronic hepatitis C virus(HCV)genes generates potentimmune responses to HCV structural and nonstructural proteins.J.Infect.Dis.182：18-27；Pancholi P.等人，(2003)DNAimmunization with hepatitis C virus(HCV)polycistronic genesor immunization by HCV DNA priming-recombinant canarypox virusboosting induces immune responses and protection fromrecombinant HCV-vaccinia virus infection inHLA-A2.1-transgenic mice.J.Virol.77：382-90)。事实上，没有证据显示，在个别施用重组有HCV结构抗原的金丝雀痘病毒后，在体内诱导了细胞免疫性，其例如在用重组痘苗病毒的攻击模型中可以是有效的。禽痘病毒也属于这一类群的病毒，禽痘病毒迄今未被用于诱导抗HCV抗原的免疫应答。禽痘病毒在哺乳动物细胞中不复制，但却能在宿主细胞的细胞质中有效地感染和表达由其基因组所编码的蛋白质。由于这些特性，比起其他活病毒载体，与在人类中使用重组禽痘病毒相关的调节风险得以降低。
目前，市场上没有可获得的抗HCV感染的疫苗，事实上，大部分的研究仍处在临床前阶段。因此，有效抗HCV感染的预防和/或治疗性试剂的开发是没有解决并迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明跳过了限制和现有技术，通过提供在禽痘病毒基因组的非必需区中包含源自HCV的DNA片段的重组禽痘病毒而解决了上述问题，依据由禽痘病毒表达的相应于HCV抗原的氨基酸区域，所述重组禽痘病毒能够诱导抗HCV的特异性细胞免疫应答。
根据本发明，病毒FPCoE1表达包含氨基酸79-338的蛋白质(SEQID No：1)，其中包括一部分的核心蛋白和E1，而病毒FPBS包含嵌合蛋白(SEQ ID No：2)，其中包括对于相应于不同HCV抗原的CD4+和CD8+T淋巴细胞来说特异的表位。在这些病毒中，编码HCV抗原的序列来源于HCV古巴分离物的eDNA(Morales J等人，WO 98/25960)。
本发明的另一方面涉及用于诱导抗HCV的特异性细胞免疫应答的药物组合物，其包含有效免疫量的重组禽痘病毒和药学上可接受的赋形剂。
包括在本发明中的重组禽痘病毒能渗透进入人类细胞并在细胞质中表达HCV抗原。所述在人类细胞中的表达由基于禽痘病毒的早期/晚期合成启动子的转录单元控制。这些病毒同样也包含在痘苗病毒的7.5K启动子控制之下的黄嘌呤鸟苷磷酸核糖转移酶基因。这些病毒在人体内不能复制。
该组合物可通过肌内、腹膜内或皮下途径施用。施用方法可以为通过使用注射器、基因枪、喷雾器或其他免疫接种设备。每个个体以确定的体积接受2.5×107至1×108PFU/剂的剂量。本发明还描述了以使用DNA构建体的引发(prime)/加强(boost)策略来施用重组禽痘病毒的过程。重组禽痘病毒也可以以使用蛋白质或其他重组有HCV抗原的病毒或者同时使用细胞因子和其他免疫刺激分子的引发/加强策略来施用。特别地，这些联合使得能够产生新的表位特异性或增强免疫应答的某个分支。
基于重组有HCV抗原的禽痘病毒的药物组合物有如下优点：
-可能诱导有效的特异性细胞免疫性；
-减少了为达到所希望的效果而需要的免疫次数；
-可能使用这些组合物作为联合疫苗的核心；
-不需任何佐剂；
-它们能与抗病毒剂联合使用。
依照这种情况，所述药物组合物可以在另一种疗法或疫苗之前、同时或之后进行施用以诱导抗HCV的免疫性。可以施用这些药物组合物从而诱导抗HCV感染的预防性免疫性，还从而在患有慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者中诱导免疫性。
附图简述
图1：重组禽痘病毒中相应于HCV抗原的区域的示意性图示。
图2：使用不同重组禽痘病毒的进行免疫接种的图表。抗体应答(A)。干扰素γ分泌应答(B)。针对使用重组有HCV结构抗原的痘苗病毒进行攻击的应答(C)。
图3：通过不同的接种途径使用FPCoE1和FPBS进行免疫接种的图表。针对使用重组有HCV结构抗原的痘苗病毒进行攻击的应答。
图4：使用不同量的FPCoE1和FPBS进行免疫接种的图表。针对使用重组有HCV结构抗原的痘苗病毒进行攻击的应答。
图5：基于FPCoE1和DNA疫苗制剂的联合进行免疫接种的图表。针对核心、E1和E2的抗体应答(A)。针对使用重组有HCV结构抗原的痘苗病毒进行攻击的应答(B)。
实施例
如在本发明中所理解的，术语“丙型肝炎病毒”或“HCV”以一般的方式描述该病毒，因此该术语不限于特定的病毒序列或HCV分离物。
同样地，编码序列被理解为核酸分子，当其位于精确调节序列的控制之下时通常经mRNA而被翻译为多肽。在这种情况下，编码序列可以包含但不仅限于cDNA和重组核苷酸序列。
本发明将通过下述实施例进行更详细的说明，这些实施例是示例性的而并不限制本发明的目的。
实施例1：FPCoE1c、FPCoE1和FPBS的评估
为了评估重组有HCV抗原的禽痘病毒诱导特异性细胞免疫应答的能力，产生了病毒FPCoE1c、FPCoE1和FPBS。图1显示了相应于HCV抗原的序列的示意性图示。如下获取病毒：用禽痘病毒感染鸡胚胎成纤维细胞，并通过使用lipofectamine(Invitrogen，USA)用质粒pFPCoE1c、pFPCoE1或pFPBS进行转染。这些质粒来源于质粒pFP67xgpt(Vázquez-Blomquist D.，González S.，Duarte C.A.(2002)Effect of promoters on cellular immune response induced byrecombinant fowlpox virus expressing multi-epitopepolypeptides from HIV-1.Biotechnol.Appl.Biochem.36：171-9)，并且含有编码包含氨基酸1-338、氨基酸79-338(SED ID No：1)的区域的序列，或编码在对于T淋巴细胞来说特异的表位基础上的嵌合蛋白的序列(SED ID No：2)(分别为质粒pFPCoE1c、pFPCoE1和pFPBS)。接下来在具有黄嘌呤、次黄嘌呤和霉酚酸的选择培养基中进行几轮病毒纯化。然后，扩大来自感染平板的病毒产物，并通过聚合酶链式反应来确认相应于HCV序列的插入物的存在。
在以2.5×107PFU进行两次腹膜内施用(间隔3周)之后，在八周龄的BALB/c雌性小鼠中研究病毒FPCoE1c、FPCoE1和FPBS的免疫原性。每个免疫接种组有十只动物。图2A显示只有用FPCoE1进行免疫才能够诱导可检测水平的针对核心和E1的抗体。可是，图2B显示，在用FPCoE1和FPBS免疫接种的动物中出现了分泌IFN-γ的淋巴细胞的阳性应答，其与在用阴性病毒即FP9免疫接种的动物中所检测到的应答相比是统计学上显著的(Student T检验，p＜0.05)。用FPCoE1c进行免疫不能诱导分泌IFN-γ的淋巴细胞的阳性应答。另外，如图2C所示，相对于在用痘苗病毒对照(WR)而不是用重组有HCV抗原的痘苗病毒进行攻击之后所观察到的，来自用病毒FPCoE1和FPBS免疫接种的组的动物能够显著减少(Student T检验，p＜0.05)在用106PFU的重组有HCV结构抗原(HCV多蛋白的氨基酸1-650)的痘苗病毒(vvRE)进行攻击之后卵巢中的病毒负荷。此外，相对于在用阴性禽痘病毒FP9进行免疫接种的动物中所检测到的，在用FPCoE1和FPBS免疫接种的动物中的vvRE病毒负荷在统计学上更低(Student T检验，p＜0.05)。用FPCoE1c进行免疫不能显著减少卵巢中的病毒负荷。在用禽痘病毒进行最后一次免疫之后2周，通过腹膜内接种来进行使用痘苗病毒的攻击。卵巢的摘取在接种痘苗病毒5天后进行。用重组痘苗病毒进行攻击已广泛用于证实疫苗候选物在体内引起强烈的细胞免疫应答的能力。特别地，卵巢中病毒滴度的降低主要与强CD8+T淋巴细胞应答的诱导有关。
实施例2：禽痘病毒的施用途径(腹膜内、皮下和肌内)
为了评估接种途径对由重组禽痘病毒产生的免疫应答的影响，对八周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫接种。每个免疫接种组有十只动物。病毒(2.5×107PFU)通过腹膜内、肌内或皮下途径进行施用，进行两次免疫接种，间隔三周。图3显示，关于重组禽痘病毒FPCoE1和FPBS减少在用痘苗病毒vvRE攻击之后卵巢中的病毒负荷的能力，在所述免疫接种途径之间无显著差异。这两种重组病毒诱导了以相对于禽痘病毒阴性对照FP9来说病毒负荷减少(Student T检验，p＜0.05)为基础的阳性应答。在用禽痘病毒进行最后一次免疫之后2周，通过腹膜内接种106PFU的痘苗病毒vvRE来进行使用痘苗病毒的攻击。卵巢的摘取在接种痘苗病毒5天后进行。
实施例3：剂量比较(0.9×107，2.5×107，5×107和1×108PFU)
雌性BALB/c小鼠在第0周和第3周通过肌内途径用不同量的重组禽痘病毒进行免疫接种。每个免疫接种组有十只动物。图4显示，关于在用禽痘病毒进行最后一次免疫之后2周，于用106PFU的vvRE进行攻击之后在卵巢中检测的病毒负荷，用0.9×107PFU免疫接种的小鼠没有显著差异。相反地，相对于在用相同量的禽痘病毒阴性对照FP9接种的动物中所检测到的，施用2.5×107、5×107和1×108PFU的FPCoE1和FPBS明显减少了卵巢中的vvRE病毒负荷(Student T检验，p＜0.05)。在所有情况下，卵巢的摘取在接种vvRE 5天后进行。
实施例4：用DNA和禽痘病毒进行引发/加强免疫
为了评估在将DNA疫苗候选物和重组有HCV抗原的禽痘病毒联合在一起的引发/加强免疫之中所诱导的免疫应答，对八周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫接种。每个免疫接种组有十只动物。一个组(Co-pIDKE2)于第0、3、7和12周通过肌内途径用100μg表达HCV多蛋白的前650个氨基酸的质粒即pIDKE2( -Carrera S.等人，(2004).Immunization with a DNA vaccine encoding thehepatitis-C-virus structural antigens elicits a specificimmune response against the capsid and envelope proteins inrabbits and Macaca irus(crab-eating macaque monkeys).Biotechnol Appl Biochem.39：249-55)和10μg重组HCV核心蛋白即Co.120(Alvarez-Obregon J.C.等人，(2001)A truncated HCV coreprotein elicits a potent immune response with a strongparticipation of cellular immunity components in mice.Vaccine19：3940-46)的混合物进行免疫接种。一个组的动物(pAEC-K6)在相同条件下用阴性对照质粒pAEC-K6(Herrera A.M.等人，(2000).Afamily of compact plasmid vectors for DNA immunization in humans.Biochem.Biophys.Res.Common.279：548-51)进行免疫接种。另一个组于第0周和第3周通过肌内途径用2.5×l07PFU的FPCoE1进行免疫接种。另外，一组动物在相同条件下用阴性禽痘病毒FP9进行免疫接种。此外，一个组(Co-pIDKE2/FPCoE1)通过肌内途径于第0周和第3周用混合物Co-pIDKE2，和于第9周和第12周用FPCoE1进行免疫接种。另一个组(Co-pIDKE2/FP9)以相似方式进行免疫接种，但在第6周和第9周的给药是施用FP9。图5显示，在组Co-pIDKE2中诱导了最高水平的抗体(Student T检验，p＜0.05)。此外，相对于在仅用FPCoE1进行免疫接种的组中所检测到的，联合了Co-pIDKE2和FPCoE1的引发/加强施用诱导了更高水平的抗体(Student T检验，p＜0.05)。在图5B中，可以观察到，相对于用阴性对照进行免疫接种的组，用FPCoE1或Co-pIDKE2进行免疫接种的两个组以及最初2剂用Co-pIDKE2、另2剂用FPCoE1进行免疫接种的组显著减少攻击后的vvRE病毒负荷。在最初2剂用Co-pIDKE2、另2剂用FPCoEl进行免疫接种的动物中检测出最低的病毒负荷。在最后一次免疫之后2周，通过腹膜内接种106PFU的痘苗病毒vvRE来进行使用痘苗病毒的攻击。卵巢的摘取在接种痘苗病毒5天后进行。
                            序列表
<110>Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología
<120>重组活禽痘病毒载体及其在抗丙型肝炎病毒的药物组合物中的应用
<130>Seq HCV
<140>
<141>
<150>CU 2004-0174
<151>2004-08-11
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>831
<212>DNA
<213>源自HCV编码区的DNA片段(核苷酸237至1014)
<400>1
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gcagacgaca tgatcatgca cacccccgga tgcgtgccct gcgttcggga ggacaacacc  480
tcccgctgct gggtagcgct cacccccaca ctcgcggcca ggaatgccag cgtccccacc  540
acgacaatac gacgccacgt cgatttgctc gttggggcgg ctgctctctg ctccgctatg  600
tacgtggggg atctctgcgg atctgttttc ctcgtttccc agctgttcac cttctcgcct  660
cgccggcatg agacagcaca ggactgcaac tgctcaatct atcccggcca cgtatcaggt  720
caccgcatgg cctgggatat gatgatgaac tggtcacctt caacagccct agtggtatcg  780
cagttactcc ggatccgtcg acctgcagca tgccatggca taagtgacta g           831
<210>2
<211>602
<212>DNA
<213>包括HCV表位的人工序列
<400>2
atgggatcca cccacgtgac cggcggcagc caggcccgca ccacccacag cttcacctcc  60
ctgctgcgcc agggcgccaa gcagaacgtg cagctgatcg gcaaggtgat cgacaccctg  120
accagcggct tcgccgacct gatgggctac atcccactgg tgggcgcccc actgggcggc  180
gccgcccgcg ccaagaaggg ccacgtgagc ggccaccgca tggcctggga catgatgatg  240
aactgggcca gcaagaaggc cgccagccgc gccgccggct tgcaggacag caccatgctg  300
gtgagcgaag gccgcagctg ggcccagcct ggctacccat ggccactgta tggcaacgag  360
ggcatgggca agaagggctc cagcttcagc ctgttcctgt tggccctcct gagcagcttg  420
accatcaaga agatgagcta ctcctggacc ggcgccctgg tgaccccaag cgccgccgag  480
aagaagctgt tgttcaacat cctgggcggc tgggtgaaga agagcatggt gggcaactgg  540
gccaaggtga agaagtacac cggcgacttc gacagcgtga tcgactccag gccttaactg  600
ca                                                                 602

Claims (10)

1.能够诱导抗HCV抗原的特异性细胞免疫应答的重组禽痘病毒，其在禽痘病毒基因组的非必需区中包含来源于HCV的DNA片段。
2.如权利要求1所述的重组禽痘病毒，其中所述来源于HCV的DNA片段为编码包含氨基酸79-338的多蛋白核心-E1的序列(SEQ ID No：1)。
3.如权利要求1所述的重组禽痘病毒，其中所述来源于HCV的DNA片段为编码基于对T淋巴细胞特异的表位的嵌合蛋白的序列(SEQID No：2)。
4.如权利要求1和2所述的重组禽痘病毒，其是FPCoE1。
5.如权利要求1和3所述的重组禽痘病毒，其是FPBS。
6.用于诱导抗HCV的特异性细胞免疫性的药物组合物，其包含有效免疫量的如权利要求1至5所述的重组禽痘病毒和药学上可接受的赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中有效免疫剂量为2.5×107至1×108PFU/剂。
8.如权利要求6和7所述的药物组合物，其用于诱导抗HCV感染的预防性免疫性。
9.如权利要求6和7所述的药物组合物，其用于在患有慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌的患者中诱导抗HCV的免疫性。
10.如权利要求6和7所述的药物组合物，其用于在其他疗法或疫苗之前、同时或之后诱导抗HCV的免疫性。
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