MX2007001749A - Vectores vivos recombinantes del virus de la viruela aviar y su uso en composiciones farmaceuticas contra el virus de la hepatitis c. - Google Patents

Abstract

Virus de viruela aviar recombinantes para combinaciones proteicas basadas en antigenos del virus de la hepatitis C y su uso en composiciones farmaceuticas capaces de inducir una respuesta inmune celular contra el virus de la hepatitis C, despues de la administracion de un numero reducido de dosis; las composiciones farmaceuticas de esta invencion son utiles para la prevencion y tratamiento de infecciones asociadas con el virus de la hepatitis C en mamiferos.

Description

VECTORES VIVOS RECOMB1NANTES DEL VIRUS DE LA VIRUELA AVIAR Y SU USO EN COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS CONTRA EL VIRUS DE LA HEPATITIS C CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con la rama de la inmunología y las vacunas virales, particularmente con el Virus de viruela aviar recombinante para combinaciones proteicas basadas en antígenos del virus de la hepatitis C (VHC) y composiciones farmacéuticas capaces de inducir una respuesta inmune celular contra el VHC.

TÉCNICA ANTERIOR El VHC es identificado por primera vez en el año 1989, mediante el empleo de técnicas de biología molecular, como el principal agente causal de las hepatitis No-A, No-B postransfusionales (Choo Q-L., Kuo G., et al. (1989) Isolation of a cADN clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244:359-62; EP0318216 Chiron Corp). Actualmente existen en el mundo más de 170 millones de personas infectadas por este agente viral. El 85 % de las infecciones por el VHC son persistentes, causando frecuentemente cirrosis y carcinoma hepatocelular (Caselmann W.H., Alt M. (1996) Hepatitis C virus infection as a major risk factor for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 24:61-66). Se ha estimado que el 25 % de los portadores crónicos que viven al menos 20 años después de la infección por el VHC, desarrollan cirrosis y que de ellos, entre 1 y 4 % desarrolla carcinoma hepatocelular anualmente (Prince A.M., Shata M.T. (2001 ) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103). En la rama terapéutica, el tratamiento que ha rendido los mejores resultados consiste en la administración combinada de interferón alfa (IFN-a) pegilado y la ribavirina en regímenes intensivos. Sin embargo, este tratamiento es agresivo, costoso y efectivo en menos del 50 % de los casos (Prince A.M., Shata M.T. (2001 ) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103). Se han evaluado como alternativas vacunales disímiles variantes de subunidades proteicas, partículas similares a virus, péptidos sintéticos, vectores vivos recombinantes y plasmidios para la inmunización con ADN, basadas en diferentes antígenos del VHC (US6635257, US6387662, US6235888, US6685944, US2003021805, Lechmann M., Líang T.J. (2000) Vaccíne development for hepatitis C. Semin. Liver. Dis. 20:211-26). Algunas de estas variantes han demostrado su capacidad para inducir una respuesta inmune específica contra epitopos del VHC, aunque esta respuesta no parece ser aún suficiente. Hasta el momento no se han establecido completamente los parámetros inmunológicos que correlacionan con la protección a la infección por el VHC. Sin embargo, varios estudios sugieren que una respuesta temprana, vigorosa y multiespecífica de células T citotóxícas, caracterizadas por un patrón de citocinas característico de linfocitos T auxiliadores de tipo I, favorece la resolución de la enfermedad y la inmunidad contra el virus. Por el contrario, una respuesta de células T tardía se relaciona con el establecimiento de la inmunopatología crónica del hígado (Cerny A., Chisari F.V. (1999) Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral persistente. Hepatology. 30:595-601 ; Cooper S., et al. (1999) Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity 10:439-49; Lechner F., et al. (2000) Why do cytotoxic T lymphocytes fail to eliminate hepatitis C virus? Lessons from studies using major histocompatibilíty complex class I peptide tetramers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. ß. Biol. Sci. 355:1085-92; Takaki A., et al. (2000). Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C. Nat. Med. 6:578-82). Los vectores vivos recombinantes son candidatos atractivos para generar una respuesta inmune celular contra el VHC. La inmunización con adenovirus recombínantes para la cápsida y la E1 en ratones indujo una respuesta de tipo T citotóxica específica contra estos antígenos (Bruna-Romero O., et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-7). Aunque estos resultados han sido alentadores, los problemas recientes con el uso de adenovirus recombinantes en terapia génica han creado incógnitas sobre su uso en humanos. El empleo de virus recombinantes de tipo vaccinia y virus de viruela de canarios, conteniendo diferentes genes del VHC ha inducido respuestas de tipo T citotóxicas en ratones, de acuerdo al antígeno evaluado, cuando se han combinado con candidatos basados en vacunas de ADN (Pancholi P., et al. (2000) ADN prime-canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infect. Dis. 182:18-27; Pancholi P., et al. (2003) ADN immunízation with hepatitis C virus (HCV) polycistronic genes or immunization by HCV ADN priming-recombinant canarypox virus boosting induces immune responses and protection from recombinant HCV-vaccinia virus infection in HLA-A2.1-transgenic mice. J. Virol. 77:382-90). De hecho, no se ha evidenciado hasta el momento que la administración única de virus de viruela de canario recombinantes para antígenos de la región estructural del VHC induzca una respuesta celular in vivo efectiva por ejemplo en el modelo de reto con virus vaccinia recombinante. A este grupo de virus pertenece también el virus de viruela aviar (WA), cuyo empleo para la inducción de respuesta inmune no se ha reportado previamente para antígenos del VHC. El virus de viruela aviar no se replica en células de mamíferos, pero puede infectar y expresar eficientemente las proteínas codificadas por su genoma en el citoplasma. Debido a estas características, los riesgos regulatorios relacionados con el empleo en humanos es muy inferior al de otras variantes virales.

Actualmente no existe ninguna vacuna disponible en el mercado y la mayoría de los estudios se concentran aún en la fase pre-clínica. Por tanto, la urgente necesidad de desarrollar un agente preventivo y/o terapéutico efectivo contra la infección por el VHC es un problema por solucionar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención venciendo las limitaciones y el arte previo, resuelve el problema antes mencionado al proporcionar un virus de viruela aviar recombínante el cual contiene fragmentos de ADN depvados del virus de la hepatitis C en una región no esencial del genoma del WA, capaz de inducir una respuesta celular específica contra el VHC dependiendo de las regiones aminoacídicas provenientes de los antígenos del VHC contenidas en la proteína expresada por el WA. De acuerdo a la presente invención el virus FPCoEl expresa una proteína que comprende los aa 79-338 (SEQ ID No: 1 ) que incluye parte de la proteína de la cápsída y la E1 y el virus FPBS comprende una proteína quimérica (SEQ ID No: 2) que incluye epitopos específicos para linfocítos T tanto CD4+ como CD8+ correspondientes a diferentes antígenos del VHC. En estos virus, la secuencia codificante para los antígenos del VHC procede del ADNc proveniente de un aislamiento cubano del VHC (Morales J, et al. WO 98/25960).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para inducir respuesta inmune celular específica contra el VHC en sujetos vacunados. Dicha composición comprende una cantidad inmunizante efectiva del virus de viruela aviar recombínante y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los virus de viruela aviar que componen la invención tienen la capacidad de penetrar las células humanas y expresar los antígenos del VHC en el citoplasma de las mismas. La expresión en células humanas está dirigida por la unidad transcripcíonal, compuesta por un promotor inmediato/temprano sintético para WA. Estos virus contienen también el gen de la xantin guanosin fosforribosil transferasa bajo el control del promotor 7.5K de vaccinia. Estos virus no tienen capacidad para replicarse en humanos. Esta composición puede ser administrada por vía intramuscular, ¡ntraperitoneal o subcutánea. El método de administración puede ser mediante jeringuillas, pistola de genes, spray u otros dispositivos de administración. Cada individuo recibe una dosis que oscila desde 2.5 x 107 a 1 x 108 UFP/dosis en un volumen determinado. En esta invención se describen también los procedimientos para la inmunización de los WA en esquemas alternos con plasmidíos para la inmunización con ADN. Los WA también pueden ser administrados en esquemas alternos con proteínas u otros virus recombínantes para antígenos del VHC, o en esquemas paralelos con citocinas y otros compuestos inmunomoduladores. Estas combinaciones permiten la aparición de nuevas especificidades epitópícas o la potenciación de alguna rama de la respuesta inmune en particular. Las composiciones farmacéuticas compuestas por virus de viruela aviar recombinantes para antígenos del VHC pueden tener las siguientes ventajas: Es posible obtener una respuesta celular específica vigorosa. Se requiere un reducido número de dosis para lograr el efecto deseado. - Es posible el empleo de estas formulaciones como núcleo para vacunas combinadas. No se requiere adyuvación. Pueden ser empleadas en combinación con agentes antivírales. Dependiendo de las circunstancias, a determinar en cada caso, la composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse para inducir inmunidad contra el VHC antes de, simultáneamente o después de otra terapia o vacuna, igualmente para inducir inmunidad preventiva contra la infección por el VHC y para inducir inmunidad contra el VHC en pacientes con hepatitis C crónica, cirrosis y cáncer de hígado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 representación esquemática de la región correspondiente a los antígenos del VHC en los virus de viruela aviar recombinantes; figuras 2A-2C son esquemas de inmunización con los diferentes virus de viruela aviar. La figura 2A muestra la respuesta de anticuerpos. La figura 2B muestra la respuesta de linfocitos secretores de interferón gamma. La figura 2B muestra la respuesta frente al reto con virus vaccinia; figura 3 esquema de inmunización con FPCoEl y FPBS por diferentes vías de inoculación. Respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de la región estructural del VHC; figura 4 esquema de inmunización con FPCoEl y FPBS con diferentes cantidades. Respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de la región estructural del VHC; figuras 5A-5B son esquemas de inmunización basado en combinaciones de FPCoEl y una formulación de una vacuna de ADN. La figura 5A muestra la respuesta de anticuerpos contra Core, E1 y E2. La figura 5B muestra la respuesta frente al reto con virus vaccinia recombinante para los antígenos de la región estructural del VHC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se entiende en esta invención, los términos Virus de Hepatitis C o VHC describen al virus de una manera genérica, por lo que los términos no son limitantes a una secuencia viral particular del VHC o aislamiento. A si mismo por secuencia codificante se entiende una molécula de ácido nucleico la cual es traducida a un polipéptido, usualmente vía ARNm, cuando es colocada bajo control de una secuencia regulatoria apropiada. En este caso una secuencia codificante puede incluir, pero no es limitante para ADNc y secuencias nucleotidicas recombinantes. La presente invención será descrita más completamente medíante los ejemplos siguientes, los cuales son ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Evaluación de los virus FPCoEl c. FPCoEl, y el FPBS Con el objetivo de evaluar la capacidad de virus de viruela aviar recombinantes para antígenos del VHC de inducir una respuesta inmune celular específica se obtuvieron los virus FPCoEl c, FPCoEl y FPBS. La Figura 1 muestra una representación esquemática de la secuencia correspondiente a los antígenos del VHC. Los virus fueron obtenidos de la siguiente forma. Fibroblastos de pollo fueron infectados con WA y posteriormente fueron transfectados con los plasmldíos pFPCoElc, pFPCoEl o pFPBS utilizando lipofectamina (Invitrogen, USA). Estos plasmidios son derivados del plasmidio pFP67xgpt (Vázquez-Blomquist D., González S., Duarte C.A. (2002) Effect of promoters on cellular immune response induced by recombinant fowlpox virus expressing multi-epitope polypeptídes from HIV-1. Biotechnol. Appl. Biochem. 36:171-9) que contienen la secuencia codificante para las regiones que comprenden los aa 1-338, aa 79-338 (SEQ ID No: 1 ), o la secuencia codificante para una proteína quimérica basada en epitopos específicos para linfocitos T (SEQ ID No: 2) (plasmidios pFPCoElc, pFPCoEl y pFPBS, respectivamente). A continuación se realizaron varios cíelos de purificación viral en medio selectivo con xantína, hipoxantina y ácido micofenolico. Después se amplificó el producto viral de una placa de infección y se confirmó la presencia del inserto correspondiente al VHC mediante reacción en cadena de la polimerasa. Se analizó la inmunogenicidad de los virus FPCoEl c, FPCoEl y FPBS en ratones BALB/c hembras de 8 semanas, después de administrar 2 dosis de 2.5x107 UFP por vía intraperitoneal con un intervalo de 3 semanas entre ellas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. La Figura 2A muestra que solo la inmunización con el FPCoEl fue capaz de inducir niveles detectables de anticuerpos contra Core y E1. Sin embargo, la Figura 2B muestra la inducción de una respuesta positiva de linfocitos secretores de IFN-gamma en los animales inmunizados con el FPCoEl y el FPBS, estadísticamente superior (Prueba T de Student, p<0.05) a la detectada en los animales inmunizados con el virus negativo (FP9). La inmunización con el FPCoElc no indujo una respuesta positiva de linfocitos secretores de IFN-gamma. Adicionalmente, como se muestra en la Figura 2C, los animales de los grupos inmunizados con los virus FPCoEl y FPBS fueron capaces de reducir de manera significativa (Prueba T de Student, p<0.05) la carga viral en ovarios después del reto con 106 UFP de un virus vaccínia recombinante (vvRE) para los antígenos de la región estructural del VHC (aa 1-650 de la poliproteína viral) con relación a la observada después del reto con el virus vaccinia no recombinante para antígenos del VHC (WR). Igualmente la carga viral del vvRE en los animales inmunizados con el FPCoEl y el FPBS fue estadísticamente inferior a la detectada en los animales inmunizados con el virus de viruela aviar negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). La inmunización con el FPCoElc no redujo de forma significativa la carga viral en ovarios. El reto con virus vaccínia se realizó por vía ¡ntraperitoneal, 2 semanas después de la última inmunización con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE. El ensayo de reto con virus vaccinia recombinante ha sido ampliamente evaluado para evidenciar la capacidad de un candidato vacunal de inducir una respuesta celular fuerte in vivo. Particularmente, la reducción del título viral en ovarios se relaciona fundamentalmente con la inducción de una fuerte respuesta de linfocitos T CD8+.

EJEMPLO 2 Vías de administración de WA (intraperitoneal. subcutánea e intramuscular) Con el objetivo de evaluar la influencia de la vía de inoculación sobre la respuesta inmune generada por los virus de viruela aviar recombinantes, se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. Los virus (2.5x107 UFP) fueron administrados por vía ¡ntraperitoneal, intramuscular o subcutánea en 2 ocasiones con intervalo de 3 semanas entre ellas. La Figura 3 evidencia que no existió diferencias significativas entre las vías de inmunización en cuanto a la capacidad de los virus de viruela aviar recombinantes FPCoEl y FPBS para reducir la carga viral del virus vaccinia recombinante vvRE en ovarios. Estos 2 recombinantes indujeron una respuesta positiva de reducción de la carga viral con relación al virus de viruela aviar control negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). El reto viral se realizó mediante la inoculación intraperitoneal de 106 UFP del vvRE, 2 semanas después de la última dosis con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE.

EJEMPLO 3 Comparación de las dosis (0.9x107, 2.5x107, 5x107, 1x108) Fueron inmunizados por vía intramuscular, ratones BALB/c hembras en las semanas 0 y 3 con diferentes cantidades de los virus recombinantes. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 animales. Como se aprecia en la Figura 4, los anímales inmunizados con 0.9x107 UFP no tuvieron diferencias significativas entre la carga viral detectada en ovarios del vvRE después del reto con 106 UFP de este virus vaccinia, 2 semanas después de la última inmunización con los virus de viruela aviar. En cambio, la administración de 2.5x107, 5x107, 1 x108, de FPCoEl y FPBS redujo de manera significativa el título de vvRE en ovarios con relación al detectado en animales inmunizados con cantidades similares del virus de viruela aviar control negativo FP9 (Prueba T de Student, p<0.05). En todos los casos, la extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE.

EJEMPLO 4 Esquemas alternos con ADN y WA Con el objetivo de evaluar la respuesta inmune inducida en esquemas que combinasen un candidato vacunal de ADN con un virus de viruela aviar recombinante para antígenos del VHC se inmunizaron ratones BALB/c hembras de 8 semanas. Los grupos de inmunización estuvieron compuestos por 10 anímales. Un grupo (Co-plDKE2) fue inmunizado por vía intramuscular en la semana 0, 3, 7 y 12 con una mezcla de 100 µg de un plasmidio que expresa los primeros 650 aa de la poliproteína del VHC, plDKE2 (Dueñas-Carrera S., et al. (2004). Immunízation with a ADN vaccine encoding the hepatitís-C-virus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca irus (crab-eating macaque monkeys). Biotechnol Appl Biochem. 39:249-55) y 10 µg de la proteína recombinante de la cápsida del VHC, Co.120 (Alvarez-Obregon J.C., et al. (2001 ). A truncated HCV core proteín elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice. Vaccine 19:3940-46). Un grupo de animales (pAEC-K6) fue inmunizado en condiciones similares con el plasmidio control negativo pAEC-K6 (Herrera A.M., et al. (2000). A family of compact plasmid vectors for ADN immunization ¡n humans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-51 ). Otro grupo fue inmunizado con 2.5x107 UFP del FPCoEl por vía intramuscular en las semanas 0 y 3. También se inmunizaron animales con el virus de viruela aviar control negativo FP9 en las mismas condiciones. Adicionalmente, un grupo (Co-plDKE2/FPCoE1 ) fue inmunizado por vía intramuscular en las semanas 0 y 3 con la mezcla Co-plDKE2 y en las semanas 9 y 12 con el FPCoEl . Otro grupo (Co-plDKE2/FP9) fue inmunizado de forma similar, pero las dosis de la semana 6 y 9 fueron administradas con el FP9. En la Figura 5 A se aprecia que los mayores niveles de anticuerpos se indujeron en el grupo Co-plDKE2 (Prueba T de Student, p<0.05). Además, la administración alterna de Co-plDKE2 y FPCoEl indujo niveles de anticuerpos superiores a los detectados en el grupo inmunizado con el FPCoEl solo (Prueba T de Student, p<0.05). En la Figura 5B se puede apreciar que tanto los grupos inmunizados con FPCoEl , Co-plDKE2, como los inmunizados con Co-plDKE2 en las 2 primeras dosis y FPCoEl en las otras 2, redujeron de forma significativa (Prueba T de Student, p<0.05) la carga viral del vvRE después del reto con relación a los animales inmunizados con los controles negativos. El valor promedio más bajo de carga viral fue detectado en los animales inmunizados con Co-plDKE2 en las 2 primeras dosis y FPCoEl en las otras 2. El reto viral se realizó mediante la inoculación intraperitoneal de 106 UFP del vvRE, 2 semanas después de la última dosis con los virus de viruela aviar. La extracción de los ovarios se realizó 5 días después de inoculado el vvRE.

Claims (8)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un virus de viruela aviar recombinante caracterizado porque contiene un fragmento de ADN derivado del virus de la hepatitis C (HCV), dicho fragmento de ADN codificando un fragmento de poliproteína cápsida-E1 que comprende la secuencia de aminoácidos (aa) definida por SEQ ID No: 1 , correspondiente a aa79-338 de dicho polipéptido.

2. Un virus de viruela aviar recombinante caracterizado porque contiene un fragmento de ADN derivado de HCV, dicho fragmento de ADN codificando una proteína quimérica que consta de la secuencia de aminoácidos definida por SEQ ID No: 2, dicha proteína quimérica comprendiendo epitopos HCV específicos para células auxiliares y linfocitos T citotóxicos.

3. El virus de viruela aviar recombínante de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque se deriva de pFP67xgpt.

4. Una composición farmacéutica para inducir una respuesta inmune celular específica contra el VHC, que comprende una cantidad inmunizante efectiva del virus de viruela aviar recombinante de conformidad con las reivindicaciones 1 a la 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la dosis inmunizante efectiva varía entre 2.5 x107 y 1x 108 UFP/ dosis.

6. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5 para inducir inmunidad preventiva contra la infección por el VHC.

7. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5 para inducir inmunidad contra el VHC en pacientes con hepatitis C crónica, cirrosis y cáncer de hígado.

8. La composición farmacéutica de conformidad con las reivindicaciones 4 y 5 para inducir inmunidad contra el VHC antes de, simultáneamente o después de otra terapia o vacuna.