MXPA04003867A - Uso de la timosina para aumentar la inmunizacion genetica y composiciones farmaceuticas inmunologicas a base de timosina. - Google Patents
Uso de la timosina para aumentar la inmunizacion genetica y composiciones farmaceuticas inmunologicas a base de timosina.Info
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Abstract
La presente invencion describe el uso de timosina para aumentar las respuestas inmunes celulares al virus de la hepatitis C. Tambien se describen metodos para inmunizar contra dicha infeccion a un sujeto susceptible de infectarse con el virus de la hepatitis C, los cuales comprenden la administracion al sujeto de uno o mas polinucleotidos que codifican para uno o mas peptidos del virus de la hepatitis C, en combinacion con una o mas timosinas. Asimismo, se describen composiciones adecuadas para inmunizacion contra el virus de la hepatitis C, las cuales comprenden uno o mas polinucleotidos que codifican para uno o mas peptidos del virus de la hepatitis C, y una o mas timosinas.
Description
USO DE LA TIMOSINA PARA AUMENTAR LA INMUNIZACION GENÉTICA, Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS INMUNOLÓGICAS A BASE DE TIMOSINA
Campo de la Invención La presente invención describe el uso de timosina para aumentar las respuestas inmunes celulares al virus de la hepatitis C. También se describen métodos para inmunizar contra dicha infección a un sujeto susceptible de infectarse con el virus de la hepatitis C, los cuales comprenden la administración al sujeto de uno o más polinucleótidos que codifican para uno o más péptidos del virus de la hepatitis C, en combinación con una o más timosinas.
Antecedentes de la Invención Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional 60/330,638, presentada el 26 de octubre de 2001. La infección por el virus de la hepatitis C (HCV) crónica es un problema médico importante que conduce a una enfermedad hepática crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular. El virus de la hepatitis C es el agente putativo, en la mayoría de los casos, de la hepatitis adquirida después de una transfusión. Pese a la mejora en la calidad de la recolección de donadores de sangre y a la implementación de las pruebas de la sangre donada, la incidencia de la infección aguda entre las personas que reciben transfusiones todavía es importante. La hepatitis crónica se desarrolla en por lo menos la mitad de los pacientes con infección de HCV aguda (lo que representa aproximadamente el 90 por ciento de los pacientes con hepatitis no A, no B (NANB)), y desarrollos de cirrosis en al menos el 20 por ciento de este grupo. Se ha evaluado una variedad de medicamentos con la finalidad de detener o frenar el avance de las enfermedades relacionadas con HCV. La norma dé cuidado actual implica el uso de interferón-alfa y de ribavirina. Sin embargo, un número importante de individuos no responden a esa terapia. La inmunización genética ha demostrado que aumenta las respuestas inmunológicas celulares de base amplia, a proteínas estructurales y no estructurales de HCV. Sin embargo, la actividad biológica de diversas construcciones de
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HCV ha sido débil en varios modelos animales experimentales. Tokushige y coautores (1996). La inmunización genética es una alternativa emergente al uso de las vacunas tradicionales a base de antígenos, tales como las vacunas subunitarias con virus atenuados o proteínas. La inmunización genética utiliza ADN simple para inmunizar al receptor. El ADN es "simple" en el sentido de que está libre de cualquier vehículo de suministro infeccioso que pudiera actuar para facilitar la entrada en la célula, tal como partículas virales. Cuando se administra ADN simple, el receptor es capaz de expresar las proteínas codificadas por el ADN plásmido, lo que puede estimular una respuesta inmunológica específica, compuesta de células T citotóxicas, células auxiliares T y anticuerpos. El uso de vacunas de ADN elimina la necesidad de purificar el patógeno o antígeno inmunoprotector para vacunar, y no hay posibilidad de que se revierta a virulencia, debido a que el ADN codifica una sola proteína viral. Hay numerosas ventajas en el uso de polinucleótidos para inmunizaciones. Por ejemplo, se puede lograr la inmunización usando cualquier antígeno codificado por un polinucleótido. Además, los antígenos codificados por polinucleótidos son expresados como antígenos "puros" en su estado natural, y han sufrido modificaciones normales de la célula anfitriona. También los polinucleótidos son manipulados de manera fácil y no onerosa, y son estables como un producto seco o en solución, en un rango amplio de temperaturas. De tal manera, esta tecnología es valiosa para el desarrollo de vacunas subunitarias sumamente efectivas. La respuesta inmunológica humoral y/o mediada por células, provocada, puede dar protección o inmunidad protectora contra infecciones provocadas por agentes patógenos, tales como bacterias, virus y organismos eucarióticos (por ejemplo, parásitos). Las respuestas inmunológicas humorales y/o mediadas por células, protectoras, interfieren entonces con la infectividad o con la actividad del patógeno, o limitan su difusión o desarrollo, lo que da por resultado protección contra desafíos subsecuentes por el patógeno. La respuesta inmunológica también puede combatir enfermedades y trastornos que involucran a células que producen proteínas específicas. La inmunización genética, por medio de inyección intramuscular, ha demostrado ser efectiva en diversos animales, contra muchos virus. Por ejemplo, la inmunización de cuyos
- - contra infección por virus del herpes simplex (HSV) tipo 2 (Boume y coautores (1996)); la inmunización de ratones contra el virus de la influenza (Fu y coautores, 1997)); la vacunación de pollos contra los virus de influenza (Kodihalli y coautores (1997)); y de mamíferos y aves contra rotavirus (Herrmann y coinventores, patente estadounidense No. 5,620,896). Daheshia y coautores (1997) describen que una sola aplicación de ADN simple que codifica IL-1 a la córnea de animales que expresan queratitis estrómica herpética, resolvió las lesiones que afectaban estos animales, provocando la remisión de la lesión.
Una discusión acerca de inmunización genética en general y de su uso puede ser encontrada, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 5,830,876 (Weiner y coinventores). Una clase de modificadores inmunológicos de polipéptido, derivados de la glándula del timo, las timosinas, ha demostrado que desata eventos de maduración en los linfocitos, para aumentar la función de las células T y promover la reconstitución de efectos inmunológicos. La timosina (???a?) es un polipéptido ácido de 28 aminoácidos, con un peso molecular de 3100, que tiene actividad inmunológica potente, que incluye el estímulo de la producción de -interferón y ?-interferón, aumento en la producción del factor que inhibe la migración del macrófago, inducción en la expresión de marcadores de célula T, receptores de IL-2 y mejora en la actividad de célula auxiliar de célula T. El aislamiento, la caracterización y el uso de ???a? están descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,079,127. Se han usado varios agentes antivirales como agentes de terapia individual, en un intento por tratar HCV crónico, incluyendo acyclovir, vidarabine y adenina arabinosida. La terapia individual con estos agentes antivirales generalmente no ha tenido éxito, ya sea debido a que el agente era sumamente tóxico o que daba por resultado inicialmente cierta inhibición en la reproducción viral, pero no podía mantener la inhibición de la reproducción viral, por largo tiempo. Véase, por ejemplo, Alexander y coautores (1988). Sigue habiendo necesidad importante de una terapia para HCV que ataque el virus de manera eficiente, y con menores efectos colaterales, y que module el sistema de respuesta inmunológica y reduzca la frecuencia de la recaída.
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Compendio de La Invención Esta invención describe el uso de -timosina para aumentar las respuestas inmunológicas celulares CD4+ y CD8+, a péptidos inmunogénjcos de HCV, en una modalidad preferida, a la proteína NS5 de HCV. Ha sido difícil aumentar las respuestas inmunológicas celulares a las proteínas virales y celulares. Esta invención describe el uso in vivo de -timosina para incrementar de manera sobresaliente las respuestas de célula T citotóxicas y proliferantes a los epítopes de proteínas de HCV. En una modalidad preferida, la timosina es timosina i . Las vacunas a base de ADN son una tecnología tan nueva y son tan diferentes de todos los tipos de vacunas previos (los basados en proteínas, péptidos o virus muertos, todos los cuales crean inmunidad humoral o mediada por anticuerpos, mientras que las vacunas a base de ADN crean inmunidad mediada por célula), que el hecho de que la a-timosina aumente la eficacia de la vacuna, provee una mejora novedosa e inesperada para el uso de vacunas a base de ADN, en el tratamiento y la profilaxis de HCV.
Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una ilustración del mecanismo de inmunización a base de ADN.
La figura 2 es una representación esquemática de la genoma del virus de hepatitis C
(HCV). La figura 3 muestra el efecto de la coadministración de 5 µ de timosina ai por vía i. p., con un polinucleótido que codifica NS5, sobre la respuesta proliferante de células T, a tres concentraciones de desafío (0.1 µg, 0.5 µg y 1 g). La figura 4 muestra el efecto de la coadministración de 5 µg de timosina i por vía i. p., con un polinucleótido que codifica NS5, sobre la respuesta de citotoxicidad a dos proporciones de efector de linfocito / blanco de destino (L/T).
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Esta invención describe el uso de a-timosina en combinación con inmunización a base de ADN o inmunización "genética", para incrementar sorprendentemente las respuestas inmunológicas celulares a HCV. Una modalidad preferida provee el aumento de
- - las vacunas a base de ADN con timosina i (timalfasina). La invención tiene implicaciones amplias en el desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas, y provee una mejora importante en las respuestas inmunológicas celulares a proteínas virales y celulares, después de la inmunización a base de ADN. El polinucleótido que codifica un péptido, un polipéptido o una proteína de HCV inmunogénico, es administrado directamente a un animal in vivo, en combinación con una o más a-timosinas. El polinucleótido codifica un polipéptido que comparte por lo menos un epítope con una proteína de HCV inmunogénica a la que se va a dirigir. El polinucleótido es expresado por las células del individuo para formar proteínas de blanco de destino inmunogénicas, que desatan una respuesta inmunológica contra HCV, que tiene una base amplia. La genoma de HCV codifica dos proteínas de envolvente (El y E2) y seis proteínas estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). Figura 2. Se puede usar en la presente invención los polinucleótidos que codifiquen cualquiera de esas proteínas virales, o cualesquiera combinaciones o fragmentos de ellos. La invención es aplicable a a-timosina natural (es decir, que ocurre en la naturaleza), así como a a-timosina sintética y a ct-timosina recombinante, que tengan la secuencia de aminoácidos de las cc-timosinas naturales, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a ellas, o una secuencia abreviada respecto a aquéllas; y sus análogos biológicamente activos, que tengan secuencias sustituidas, omitidas, alargadas, reemplazadas o modificadas de otra manera, pero que posean bioactividad sustancialmente similar a la de una a-timosina natural. Una timosina preferida es la timosina ai. El aislamiento, la caracterización y el uso de a-timosina están descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 4,079,127, en la patente estadounidense No. 4,353,821 ; en la patente estadounidense No. 4,148,788, y en la patente estadounidense No. 4,116,951. La cantidad de a-timosina necesaria para provocar el grado deseado de aumento en el efecto de una vacuna a base de ADN, puede ser determinada mediante experimentos rutinarios de titulación de dosis. Se ha encontrado que la a-timosina es segura para los humanos cuando es administrada a dosis de hasta 16 mg/kg de peso del cuerpo/día. Una dosis preferida de a-timosina está en la escala de 0.001 mg/kg de peso del cuerpo/ día a 10 mg/kg de peso del cuerpo/día; siendo lo que más se prefiere una dosis
- - aproximada de 0.02 mg/kg de peso del cuerpo/día. Las secuencias de polinucleótido de la invención son secuencias de ADN o de AR que codifican los polipéptidos de HCV antigénicos/inmunogénicos, enlazados de manera operable a secuencias reguladoras de trascripción. Estas secuencias pueden ser usadas en asociación con otras secuencias de polinucleótido que codifican proteínas reguladoras que controlan la expresión de esos polipéptidos. La proteína reguladora puede actuar enlazándose al ADN genómico, a fin de regular su trascripción; alternativamente, puede actuar uniéndose a ARN mensajero para incrementar o disminuir su estabilidad o su eficiencia de traslación. Mediante el término "enlazado de manera operable a secuencias reguladoras de trascripción y traslación", se quiere decir que una secuencia codificadora de polipéptido y secuencias mínimas controladoras de trascripción y de traslación están conectadas de manera tal que permiten la expresión del polipéptido cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de trascripción) están unidas a la secuencia o las secuencias reguladoras. Un polinucleótido codifica operativamente un polipéptido cuando tiene toda la información genética necesaria para ser expresado por una célula blanco de destino, tal como los promotores y similares. Los términos "promotor" o "secuencia promotora" se refieren aquí a una secuencia mínima, suficiente para dirigir la trascripción. Una secuencia de polinucleótido de ADN comúnmente está unida mediante un sitio de iniciación y un sitio de terminación, para formar una unidad de trascripción de ADN, y se trascribe para producir un trascripto primario. El material polinucleótido entregado a las células in vivo puede adoptar cualquiera de entre muchas formas, y la presente invención no está limitada a ningún polinucleótido particular que codifique algún polipéptido de HCV particular; si bien se prefieren los polinucleótidos que codifican la proteína NS5 o un fragmento de ella. Se ha informado en la literatura de plásmidos que contienen genes que codifican antígenos de HCV o inmunógenos de HCV; y que pueden ser obtenidos fácilmente por quienes sean expertos en la materia (véase, por ejemplo, Tokushige y coautores, 1996). El polinucleótido puede codificar uno o más antígenos múltiples, tales como los antígenos de dos o más proteínas virales diferentes. Alternativamente, el polinucleótido puede contener dos o más secuencias diferentes de ADN: una secuencia que codifica un
- - antígeno y la otra o las otras que codifican polipéptidos que pueden ser o no antigénicos. Por ejemplo, el vector puede codificar dos (o más) antígenos de HCV. En otra modalidad, el otro polipéptido o los otros polipéptidos pueden servir para incrementar una respuesta inmunológica contra HCV (por ejemplo, epítopes de auxiliar, citocinas, polipéptidos portadores, subunidades de toxina del cólera u otros inmunoestimulantes). Se puede insertar adicionalmente el polinucleótido en un vector que incluya secuencias para la expresión del polinucleótido. Cuando están presentes dos o más secuencias de ADN codificadoras de polipéptido en un vector, la trascripción de cada secuencia de ADN codificadora de antígeno puede ser dirigida desde su propio promotor, para la expresión de dos o más polipéptidos no fundidos. Alternativamente, un promotor puede regir la expresión de dos o más secuencias de ADN codificadoras de antígeno, unidas en marco entre sí, para expresar una proteína de fusión. Los polinucleótidos usados en estos métodos pueden ser secuencias que no se integran en la genoma de la célula anfitriona. Éstas pueden ser secuencias de ADN no replicantes, o secuencias replicantes específicas, diseñadas por ingeniería genética para que carezcan de la capacidad de integración al genoma. Se puede administrar el polinucleótido al sujeto en presencia de adyuvantes o de otras sustancias que tengan la capacidad de promover la incorporación de ácido nucleico o de reclutar células del sistema inmunológico al sitio de la inoculación. Se debe entender que el propio polinucleótido es expresado en la célula anfitriona por factores de trascripción provistos por la célula anfitriona o provistos por una unidad de trascripción de ADN. De acuerdo con los métodos de la invención se puede suministrar a las células tanto ADN como ARNm expresables, para formar en ellas un producto de traslación de polipéptido. Si los ácidos nucleicos contienen las secuencias de control apropiadas, dirigirán la síntesis de cantidades relativamente grandes de proteína codificada. La dosis del polipéptido inmunogénico puede ser determinada fácilmente por un personal clínico o veterinario que emplee modelos animales u otros sistemas de prueba, que son bien conocidos en la técnica. Las formulaciones contendrán una cantidad efectiva del ADN en una solución acuosa. La cantidad de ADN que se va a administrar depende de factores como la edad, el peso y la condición física del sujeto considerado para ser vacunado. La cantidad de ADN también depende de la capacidad del sistema
- - irrmunológico del sujeto para sintetizar anticuerpos, y del grado de protección deseado. Se puede establecer con facilidad las dosis efectivas, por quien tenga experiencia ordinaria en la técnica, mediante ensayos rutinarios que establezcan curvas de respuesta a la dosis. Una escala de dosis preferida está entre 1 µ¾¾ de peso de cuerpo del sujeto y 1 mg kg de peso de cuerpo del sujeto. Se puede inmunizar el sujeto administrándole ADN una sola vez o mediante administraciones múltiples. Las administraciones múltiples pueden ser necesarias para mantener un estado de inmunidad en el sujeto, a un patógeno particular. Las composiciones y los métodos para construir polinucleótidos heterólogos para transformaciones satisfactorias, son bien conocidos por los que tengan experiencia en la materia; y se pueden usar las mismas composiciones y los mismos métodos de construcción para producir los polinucleótidos útiles en la presente. La composición específica del polinucleótido no es central para la presente invención; y la invención no depende de la composición del polinucleótido de transformación específico, usado. Los componentes adecuados de los polinucleótidos que incluyen promotores, secuencias de poliadenilación, señales de terminación, señales de división, marcadores seleccionables, genes informadores, incrementadotes, replicones virales, intrones y secuencias de plásmido bacterianas, son bien conocidos en la técnica. Sambrook y coautores (1989) provee métodos adecuados para la construcción de polinucleótidos heterólogos. Los polinucleótidos pueden ser producidos por varios métodos conocidos. Por ejemplo, se puede insertar un ADN que codifique un antígeno preseleccionado, en un vector de expresión (véase, por ejemplo, Sambrook y coautores (1989)). Con la disponibilidad de equipo automático para sintetizar ácido nucleico, se puede sintetizar el ADN directamente cuando se conoce la secuencia de nucleótidos, o por medio de una combinación de reacción de cadena de polimerasa (RCP), clonación y fermentación. Además, cuando se conoce la secuencia del polipéptido preseleccionado se puede inferir una secuencia codificadora adecuada para el polinucleótido. Cuando el polinucleótido es ARNm puede ser preparado fácilmente a partir del ADN correspondiente, in vitro. Por ejemplo, las técnicas convencionales usan las ADN-polimerasas de fago SP6, T3 o T7 para preparar ARNm a partir de plantillas de ADN, en presencia de los trifosfatos de ribonucleosida individuales. Se coloca un promotor de fago apropiado, tal como un T7 origen de sitio de reproducción, en el ADN de plantilla,
- - inmediatamente corriente arriba del gene que va a ser trascrito. Son bien conocidos los sistemas que utilizan T7 de esta manera, y están descritos en la literatura. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición inmunológica que, cuando es introducida en un individuo capaz de tener inducida dentro de él una respuesta inmunológica, induce una respuesta inmunológica en ese individuo, hacia una proteína de HCV, codificada a partir de él; donde la composición comprende un polinucleótido que codifica y expresa uno o más antígenos/inmunógenos de HCV, en combinación con una o más timosinas. Se puede usar terapéutica o profilácticamente la respuesta inmunológica, y puede adoptar la forma de una inmunidad de anticuerpo o de una inmunidad celular, tal como la que se constituye a partir de células T CTL o CD4+.
Ejemplo 1 Construcción de Plásmido Como una fuente de genes virales, se usó un plásmido, designado pBRTM/HCVl-3011, que cubre toda la longitud del marco de lectura abierto (ORF) del HCV, para clonar en los vectores de expresión (Grakoui y coautores, 1993). Se clonó por RCP la construcción pAp031-NS5, después de insertar codones de inicio y de alto, diseñados especialmente, así como sitios de enzima de restricción, usando los siguientes sensibilizadores: para NS5, 5'-T CAG TCT AGA ATG TCC GGC TCC TGG CTA AGG GA-3' (Xbal) (SEQ ID No. 1) y 5'-A GCT ACG CGT TCA CCG GTT GGG GAG GAG GT-3' (MluI) (SEQ ID No. 2). Después de la amplificación por RCP, usando un sistema de RCP de alta fidelidad (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, E. U. A.), se insertaron los fragmentos de ADNc en el vector de expresión de plásmido pAp031 que contenía un elemento incrementador del virus de sarcoma de Rous, y un promotor de CMV. Se transformaron las construcciones a células DH5 y posteriormente se purificó el ADN plásmido mediante centrifugación 2x con cloruro de cesio, o con un equipo Qiagen Giga, usando un sistema regulador Endofree (Santa Clara, CA, E. U. A.). Se verificó la inserción correcta de los ADNc que codifican las proteínas no estructurales, mediante análisis secuenciador, usando métodos estándar. Para establecer líneas de células estables, que expresen NS5, como células de blanco de destino para los análisis de CTL, se clonó
- - también los fragmentos de gene que codifican proteina no estructural, en los vectores de expresión pcADN3 y pcADN3.1/Zeo(-) (Invitrogen, San Diego, CA, E. U. A.), con un marcador seleccionable de neomicina. Se subclonó el fragmento NS5 de Xbal y MluI en el sitio Nhel/Mlul del vector Litmus-38 (New England Biolabs, Beverly, MA, E. U. A.), se cortó con EcoRl y Salí, y se ligó en el sitio de clonación múltiple EcoRI/Xhol de pcADN3 y pcADN3, I Zeo(-), respectivamente. Se ligó un fragmento Hbal y BamHI que contenía NS4 a Litmus-29 (New England Biolabs), se volvió a cortar con Kpnl y EcoRI, y se ligó posteriormente en el vector pcADN3. Se designó los plásmidos como pcADN3.1/Zeo(-)-NS5. Se clonó el plásmido de expresión de ADN que codifica IL-2 (pcD/3-I12) de múrido, y se purificó como se describió previamente (Geissler y coautores, 1997a, 1997b, 1997c).
Inmunización Genética Para incrementar la incorporación celular del ADN plásmido, se inyectó el músculo cuadríceps de ratones Balb/c, en sitios múltiples, con un total de 100 de hupivacaína al 0.25%. Cuatro días después se inyectó las construcciones de plásmido en la misma región, en cinco sitios diferentes, a un volumen final de 100 iL en NaCl al 0.9 por ciento. Dos semanas después se potenciaron los ratones en la pata opuesta con ADN plásmido. Se sacrificó los ratones diez días después de la última inmunización. Se formaron tres grupos de ratones, cada uno de los cuales contenía cinco animales. El grupo 1 fue de ratones inmunizados con 100 µg de ADN fingido; el grupo 2, por ratones inmunizados con 50 g de pAp031NS5 y 50 µg de ADN fingido; el grupo 3, por ratones inmunizados con 50 µg de pAp031 NS5 y 50 \ig de ADN fingido; y recibieron 5 µg de timosina a por vía i. p., dos veces por semana. Se inmunizaron los animales tres veces a un mtervalo de dos semanas, y se llevaron a cabo estudios diez días después de la inmunización final.
Análisis de Proliferación de Células T Se anestesiaron ratones con isoflurane (Aerrane, Anaquest, NJ, E. U. A.), se sacó sangre mediante punción retrobulbar y se cosechó las células de bazo. Se sacó los glóbulos rojos por incubación en 8.3 por ciento de NH4G/O. I7 mol/L de Tris (pH 7.4), durante 10 minutos, a 37°C. Se cultivó las células de bazo por triplicado, usando placas de fondo
- - plano, de 96 concavidades, a 5 x 105 células por concavidad, en 100 de medio de Eagle modificado de Dulbecco, completo (Mediatech, Washington, DC, E, U. A.) que contenía 10 por ciento de FCS. Se estimularon las células de bazo con NS5 recombinante a diferentes concentraciones (1, 5, 10 µ^G??,). Finalmente se añadió 2-mercaptoetanol a una concentración final de 50 µ????/L. Como control para la especificidad del antígeno se estimularon células efectoras con 10 µg/mL de subunidad beta recombinante de gonadotropina coriónica humana, que es secretada por la célula y se ha demostrado que es un inmunógeno fuerte de célula T (Geissler y coautores, 1997d). Se estimularon las células de bazo durante tres días. Después de añadir (3H)-timidina (1 µCi conc vidad), se incubó las células durante 18 horas. Se midió la incorporación de (3H)-timidina en el ADN después de cosechar. Figura 3. Se corrigió la incorporación de la radiactividad para la actividad de fondo (? cpm).
Análisis de Citotoxicidad Se suspendieron células de bazo de ratones inmunizados, en DMEM completo, que contenía 10 por ciento de FCS y 50 µp???/L de 2-mercaptoetanol; luego se analizaron las células para la actividad citotóxica, cinco días después de la estimulación in vitro. Se añadió IL-2 de múrido recombinante, una sola vez, a una concentración de 5 U/mL, y se co-cultivaron las células respondedoras (4 x 107) con 6.25 x 106 células singeneicas, que expresan establemente NS5, después de tratamiento con 20,000 rad. Se cosecharon las poblaciones de linfocitos efectores citotóxicos después de 5 días de incubación. Se llevó a cabo un análisis de liberación de 51Cr, a cuatro horas, en una placa de fondo redondo, de 96 concavidades, utilizando como línea de células blanco de destino las células SP2-NS5 marcadas con 51Cr. Se llevó a cabo análisis de CTL a proporciones de efector linfocito:blanco de destino (L/T) de 1 :10 y 1 :100. Se calculó el porcentaje de citotoxicidad como: (liberación experimental - liberación espontánea) (liberación máxima - liberación espontánea).
La liberación experimental representa las cuentas medias por minuto liberadas por las células de blanco de destino, en presencia de las células efectoras. La liberación total
- - representa la radiactividad liberada después de la lisis total de las células blanco de destino, con 5% de Triton X-100. Figura 4. La liberación espontánea representa la radiactividad presente en el medio, derivada únicamente de las células de destino.
Análisis Estadístico Para comparar los resultados entre los diferentes grupos, se usó una prueba U no paramétrica de Mann-Whitney. Se consideró P < 0.05 estadísticamente importante. Se derivó los números para los valores P, de acuerdo con las respuestas de célula T CD4+ y CD8+, de todas las concentraciones de NS5 recombinantes usadas para el estímulo, y las proporciones E:T respectivas, Los resultados mostrados en las figuras 3 y 4 demuestran la mejora dramática en la respuesta inmunológica que se puede lograr por la coadministración de a-timosina en un tratamiento de inmunización a base de ADN. La coadministración de -timosina incrementó la respuesta proliferante de CD4 en aproximadamente 100 por ciento, contra las tres concentraciones de desafío. Figura 3. También se incrementó en 100 por ciento o más la citotoxicidad porcentual, al coadministrar a-timosina. Figura 4.
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Claims (7)
- Novedad de La Invención. 1. Un método para inmunizar un sujeto susceptible a infección por virus de la hepatitis C, contra dicha infección, caracterizado porque comprende administrar al sujeto un polinucleótido que codifica uno o más péptidos del virus de la hepatitis C, en combinación con una o más -timosinas.
- 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el polinucleótido codifica una o más de las proteínas de envolvente del virus de la hepatitis C.
- 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el polinucleótido codifica una o más de las proteínas del virus de la hepatitis C, seleccionadas del grupo que consiste de la proteína NS3, la proteína NS4A, la proteína NS4B, la proteína NS5A y la proteína NS5B.
- 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el polinucleótido codifica una o más proteínas NS5.
- 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque la cc-timosina es timosina i.
- 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque se administra la timosina a una dosis de entre 0.001 mg/kg de peso del cuerpo/día y 10 mg/kg de peso del cuerpo/día.
- 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque se administra la timosina a una dosis aproximada de 0,02 mg/kg de peso del cuerpo/día.
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