JPS59500719A - 合成ピコルナビ−ルス抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｔｌｌ　別々の容器に、 （ａ）　抗Ｗ性ピコルナビールスキャデンソド蛋白質のアはノ末端から、そのア ミノ酸配列長の約６０〜約７タ係に等しい距離に位置している、抗原性ピコルナ ビールスキャプシソド蛋白質の領域のアミノ酸残基配列に対応する約２０個のア ミノ酸残基配列を含む合成抗原にデシドであって、該被プシドはキイホールアオ ガイのヘモチアニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての有効量 で寄主動物に導入されると該ピコルナビールスと免疫反応してこのビールスによ り起こされる感染から寄主を守る抗体の製造を誘起することができるところの合 成ペプチドを生理的に活性な形で含む第一の反応剤；及び （ｂ）上記合成ペプチドと免疫反応する遺伝型含有ボリアばドを生理的に活性な 形で含む第二の反応剤ならびに第−及び第二の反応剤の間の免疫反応の存在を指 示するための手段 を包含する、体成分中のピコルナビールスの存在をテストするための診断系であ って、 第一と第二の反応剤はテストされるべき体成分の所定量の存在下で所定量で混合 されると、指示手段により知らされる量の免疫反応を与え、この際この免疫反応 量が、ピコルナビールス抗原が体成分中に存在する場合には既知の免疫反応量と は異るところの診断系。

弘ユ　左から右へかつアεノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて Ｖａ　ＩＧ　ｌ　ｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ｌＶａ　ＩＧ　ｌ　ｎＨｉ　ｓ 　（Ａ　ｒｇ）ＡｒｇＳｅ　ｒＡｒｇｓｅ　ｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒ（Ｔｈｒ）　 ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅ（ここでカッコ内のアミノ酸残基の各々は個々に、 カッコの直圧の隣接アε）酸残基と代ることができる）より成るアミノ酸残基配 列の群の一員のそれに対応するアミノ酸残基配列を、第１の反応剤のペプチドが 持つ請求の範囲第弘１項記載の診断系。

ｌ１３　左から右へかつアばノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて Ｖａｌ（Ｓｅｒ又はＣｌｎ又はＸ）Ｐｒｏ（Ｇｌｙ又はＹ）Ａｓｎ　ｆＺ）Ｌｅ ｕ（Ａｒｇ又はＶａｌ）Ａｒｇ（Ｓｅｒ又はＡｌａ）ＧｌｙＡｓｐＬｅｕ（Ｍｅ ｔ又はＰｈｅ）Ｇｌｎ（Ｇｌｙ）Ｖａｌ　［Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＨｉｓ）Ｌｅ ｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧｌｎ（Ａｌａ又はＰ　ｒｏ）　Ｌｙｓ　（Ａ　ｒＢ又は Ａｌａ）Ｖａｌ　（Ｈｉｓ）Ａｌａ（Ｖａｌ）Ａｒｇ（Ｔｈ　ｒ又はＬｙｓ）　 Ｔｈ　ｒ　（Ｇ　ｌ　ｎ又はＨｉｓ）ＬｅｕＰｒ。

（ここでカッコ内のアミノ酸残基Ｘ、Ｙ又はＺの各々は個々に、カッコの直圧の 隣接アｉ）酸残基と代ることができ、そして ペプチドアεノ酢残基配列中に存在する×及び／又はＹ及び／又はＺは独立に、 カッコの直圧の隣接アミノ酸残基の位置におけるアミノ酸残基の不存在を示し、 それによってＲプチド長は各々／、氾又は３個のアミノ酸残基の分だけ短縮され る。）より成るアミノ酸残基配列の群の一員のそれに対応するアミノ酸残基配列 を第１の反応剤のペプチドが持つ請求の範囲第９７項記載の診断系。

４４　左から右へかつアεノ末端からカルボキシ末端へ書いて （１）　ＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｒｇ（ＥｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬ ｅｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒｏ　：（２）　Ｓ ｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｙＳｅｒｌ　ｌｅ△１ａ△ｌａＡｒｇ ＶａｌＡｌａＴｈｒＧｌｎＬｅｕＰｒｏ　、及びＣ３）　ＳｅｒＧｌｙＶａｌＡ ｒｇＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｙＳｅｒＬｅｕＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｌａＡ ｒｇＬｅｕＰｒ。

より成るアミノ酸残基配列の群の一員のそれに対応するアミノ酸残基配列を第１ の反応剤のペプチドが持つ請求の範囲第ｔｌ／項記載の診断系。

ｌＩＳ　遺伝型含有ボリアεドが、合成被ゾチドに対して生じた全体の完全な抗 体である請求の範囲第１１１項記載の診断系。

本発明１ｄ、出願Ｓｅｒ　ｉａ　ｌ　Ａ　３乙ｇ、３０ｇ（／９ｇ２年ｑ月／り 日出願）の一部継続出願である。

技術分野 本発明は、感染性疾病のだめのワクチン及び抗原に関し、より詳しくはピコルナ ビールス（Ｐ　ｉ　ｃｏｒｎａｖ　ｉ　ｒｕｓ　）科（ｆａｍｉ　ｌｙ　）のビ ールスにより起こされる疾病たとえば口蹄疫及び入山を髄炎の診断及び処置に有 用な抗原に関する。

背景 口蹄疫は、主に分跣蹄の動物がかかる、極めて経済的に深刻な、高度に感染性の 疾病である。口蹄疫に直接帰因する致死率は一般に低いが、若い動物では致死率 はかなり高い。経済的重要性に１関しては、この疾病は感染した動物を衰弱はせ て、経済的に飼育できなくする。従来発見された、感染を除去するための准−の 認められ有効な方法は、感染した総ての動物を殺し、かつて動物が占めていた総 ての土地建物全消毒し、そして死体を生石灰中で処理することである。感染は極 めて迅速に広がるので、口蹄疫の一つの大きな発生によって、地区又は地域全体 の経済的基礎が破壊されてしまう。

主にビールスの不活性化又は減弱により口蹄疫に対して免疫にするワクチンが作 られた。このようなワクチンはある程に有効であると判ったが、しかじ口蹄疫の 発生が、ビールスが不完全に不活性にされた又は不十分に減弱されたワクチンに 起因することがあった。また感染が、口蹄疫の研究又は口蹄疫ワクチンの製造に 携わる施設からのビールスの洩出によることもあった。

口蹄疫（Ｆ　Ｍ　Ｄ　：　ｆｏｏｔ　−ａｎｄ　−ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ 　）は、アフトビールス（ａｐｈｔｈｏ　ｖｉｒｕｓ　）属のピコルナビールス により起こされる。口蹄疫ビールス（ＦＭＤＶ）のいくつかのビールス血清タイ プがあシ、その厳も一般的なものは血清タイプ表示Ａ、Ｏ及びＣであり、一般的 でないものは５ＡＴ−／、５ＡＴ−ユ、５ＡＴ−３及びＡＳＩＡ−／と表示され る。これら血清タイプのなかで、いくつかのサブタイプ及びサブタイプストレイ ン（５ｔｒａｉｎ　）もまた確認されている。確認されたサブタイプ及びサブタ イゲストレインのうちに次のものが挙げられる：　ＦＭＤＭＡ、サブタイプ１０ 、ストレイン乙／及びサブタイプ／２、ストレイン／／９Ｓ　ＵＳＡ及びＰｉｒ ｂｒｉｇｈｔ　；　Ｆ　ＭＤＶＯ，サブタイプ／、ストレイ：、ｙ　Ｋａｕｆｂ ｅｕｒｅｎ　；及びＦＭＤＶ　Ｃ，サブタイプ３、ストレイｙ　１ｎｄａｉａｌ 。

出版、ＡＩ　Ｉａｎｈｅｌｄ、　Ｍｏｎｔｃｌａｉｒ、　Ｎ、　Ｊ、　／　９７ ７　）、ｌ）ｐ、　３−、？　、２　；　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｏｆ 　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　２２．１２０／（／９乙ｇ）にいく分詳しく記 載されている。このビールスの分子生物学については、Ｒ，Ｒ，Ｒｕｅｃｋｅｒ ｔ著、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ ｅｓ、　Ｒ，Ｐｅｒｅｘ　−Ｂｅｒｃｏｆｆ出版、Ｐｌｅｕｍ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、（／９７９　）、ｐ　／　／３に記載される。このビールスは、約りｘｌｏ 　ダルトンの分子量を持ち、約ｇ、　ｏ　ｏ　ｏのヌクレオチドのシラスねじれ の（ｐｌｕｓ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）　ＲＮ　Ａゲノムを含む：、ピコルナビール ス蛋白質は、感染した細胞中で蛋白・質の先駆体として合成されており、この先 駆体は次に細胞のビールスコード化プロテアーゼによシ処理すると四つの主なキ ャプンノ１’蛋白質（ＶＰ　、ＶＰ　、ＶＰ　及びｖｐ　）及１　２　３　４ び多数の非キャグンツド蛋白ｗにナル。

ＶＰ３　蛋白質全体は、接種された豚に用ハられると中和性（ｎｅｕｔｒａｌ　 ｉｚｉｎｇ　）抗体反応を誘起し、豚及び牛の双方を感染から保護する（　Ｊ、 　Ｌａｐｏｒｔｅら、Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、２７６：　３３９９　（ ／　９７３　）　：　Ｈ，Ｌ、Ｂａｃｋｒａｃｈら、Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．、／／！；：／乙３ろＣ／９７．！；Ｉ、及び米国特許Ｊ′１ ６ダ、／グ０，７乙３明細書参照）。この知見に基づいテ、Ｄｅｎｎｉｓ　Ｇ、 ＫＩｅｉｄ　らは口蹄疫のだめのクローン化ビールス蛋白質ワクチンを作ること ができ、これは牛及び豚において抗体反応を与えた。

この分野り文献は、異るキャブジッド蛋白質を言うのに同じ名前を用いているこ とに留意しなければならない。

すなわち、米国の上述の研究者は典型的に、本明細書及びヨーロッパでＶＰ□　 と言うキャブジッド蛋白質を、ＶＰ３　キャブジッドと言う。しかし、ここでｖ Ｐｌ　と言われ、また他の人にはＶＰ３　と言われるキャブジッド蛋白ｄは免疫 学的に活性なキャブジッド蛋白ｔ−ｒあルトいう一致点がある。

組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　）　Ｄ　Ｎ　Ａ分子及びロ蹄疫ビールス抗原 の特異性を持つ波プチドを作る方法は、英国特許出願２，０７９，２ｇｇＡ　Ｃ ／９ｇ２年／月λθ日）明細書に記載されている。Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄら、Ｎａ ｔｕｒｅ　、２９θ：ｇ００〜ｇ０２ＣＩ９ｇ／）；Ｋｌｅｉｄら、Ｓｃ　ｉ　 ｅｎｃｅ、２／’Ａ　：　／／２Ｓ〜／／２９　Ｃｌ９ｇ／　）；及びヨーロツ ノぐ特許出願公告Ｏθ乙ｇ乙９３２Ａ　（同出願ｇ２３０３θｌｌｏ、ｇ、１９ ｇ、２、乙、／／出願に対応）も参照のこと。

Ｋ、　Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒらは、Ｐｒｏｃ、　３　ｔｈ　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｇ ｒｅｓｓＶｉｒｏｌｏｇｙ　、　Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、　／　９　ｇ　／　、 　ｐｏｓｔｅｒ　５ｅｓｓｉｏｎでの発表によるとＶＰ蛋白質（そこではｖＰＴ ｈｒと呼ばれた）を酵素並びにソシアンプロマイドで消化し、この消化物の被ゾ チド片を用いて、中和性抗体を作った。この著者らは、蛋白質アミン末端からの 位置／り６〜／タタ及びユθ０〜２／３のアミノ酸残基配列が免疫学的に重要な 抗体の製造を誘起したことを示唆した。この著者らはまた、位置／’Ｉ／〜／４ ５及び１５５〜／乙／のアミノ酸残基配列は不活性な非誘起性−２ｆチドの領域 内にあることを示唆した。このＶＰ配列は、米国で先に記載されたＶＰ配列に対 応する（Ｍｅｌｏｅｎ、　Ａ、Ｈ，、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、。

３　−−一−−−−−−−−−−−− １１３ニア６／〜７Ａ３Ｃ／９７９）の説明参照）。

ＳｔｒｏｈｍａｉｅｒらによるＪ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５９．　：　 ２９　！；　−３０乙（１９ｇ２＞の報文は、前述のｐｏｓｔｅｒ　５ｅｓｓｉ ｏｎでの研究を詳述し、この分野の研究者に用いられる種々ノキャ７’ジッド蛋 白質の命名の関連を与える。この報文け、ＣＢ□及びＣＢ２と名付けられた二つ のノンアンブロマイド開裂生成物及びＶＰ　のＡ　と名付けられた酵２ 素開裂主成物（これらは各々、アミノ末端からのアミノ酸残基位ｆｔ５５〜７ｇ Ｏ，／ｇＯ−，２／３及び／’１１．−２／３に対応する。）か中和性抗体を作 るという、Ｉ）Ｏ５ｉｅｒｓｅｓｓｉｏｎにおいて報告された発見を繰返して述 べている。

この報文はまた、領域／グ／〜／’Ｉｓ及び／３３〜／乙／を含む池の開裂生成 物とのオーバーラツプの領域は明瞭な効果を持たないことを繰返している。この 著者らは第３θ３−！！−ノで、たぶん唯二つの小さな領域がこの蛋白質の免疫 能力のためて重要であると考えていると述べている。

天日を髄炎（以下ではポリオと云う）及びＡｍ肝炎ビールスもまた、ピコルナビ ールス科のメンバーすなわち属である。タイプ／、コ及び３のポリオビールスに 対スる有効なワクチンは７９３０年代から使用されているが、Ａ型肝炎に対する 有効なワクチンは鰯られていない。

ピコルナビールスの顕著な特徴の一つは、それらが四つのキャノンノド蛋白質を 含むことである。タイプ／のポリオＶＰ　と呼ばれるキャノンノド蛋白質は、ビ ールスを中和する抗体の製造を誘起することができる抗原決定因子領域を含むこ とが判っている。但し、従来Ｐ１キャブジッドの％足のアミン表決定因子頑域は 発見されていない。Ａｍ肝炎ビールスの特定のキャノンノドが中和性抗体の製造 を誘起するものであることはまだ確認されていない。抗ポリオワクチンは典型的 １（は、不活性化したタイプ／、コ及び３ビールスを用いる。ある例では、殺し たとされるビールスの総てが殺された訳ではなく、あるいはビールス粒子は十分 に減弱されてはいす、従って巨万性の接種のうちの７件が接種された人に臨床的 疾病をひき起す。

従って、生きているビールス、或いは減弱されたビールスを含む可能性が全くな い抗ポリオワクチンを作ることが出来れば、有益である。また、＋Ｉ′ＩＢ＠破 片、バクテリア内毒素及び主長媒体副生成物（後に述べるように組換えＤＮＡ技 術から得られたワクチン調製物中にしばしば存在する）を含まない有用な抗ポリ オワクチンを作ることが出来れば、有益である。加えて、安全で極めて効果的な ワクチン及び診断用製品が発見されるなら、より有益である。

過去において抗原は種々のやり方、たとえば天然物質からの誘導、ハプテンの担 体へのカップリング、及び組〜／２９　（１９６６年）もまた、ある合成抗原を 記載する。

天然、物質から誘導された抗原は、天然に生じる無ａ、７′）公刊の抗原たとえ ば血液型抗原、ＨＬＡ抗原分化抗原、ビールス及びバクテリア抗原などである。

この−計紀の間これら抗原を特定し研究することに多大の努力が注がれた。

ある「合成」抗原は、小ざな分子を担体たとえば牛血清アルブミンにカップリン グすることにより作られた。

このような抗原は、カップリングされた小さな分子に対する抗体の製造をひき起 すであろう。小笛な分子自体（は、注射される動物の免疫システムによって「認 識」されないので担体分子が必要である。この技法はまた、前述の５ｅｌａ　ら の文献で述べられているように、タガの■白にの被グチド片を担体知カップリン グすることによって抗原を作る別個の例においても用いられた。

このバッテン−担体技法は免疫反応の性質の研究において有効であったが、診断 又は治療において役立つ抗原を作るためにはあまシ用いられなかった。この欠売 の理由はいくつかある。

第一に、この方法によって病原から有用な抗原決定因子を選んで構成するために は、合理的な成功の憬会のためて病原の全蛋白゛貢配列を決定しなければならな い。この課題の困難性の故に、それは行われたとしても、まれである。

古典的にはワクチンは、殺した又は減弱した生体を適当な補剤と共てを主に導入 して、望ましくは寄主における生体の病原作用を避けながら生体に対する正常な 免役反応を開始させることによって作られる。このやり方は、良く知られた限界 を有する。すなわち、興味のある抗原決定因子のみでなく多くの関連する又は関 連しない有害物質（これの多数はいくつかの又は総ての置体において寄主におけ る望ましくない反応を誘起する。）をも含むワクチンの複雑性の故に、病原反応 を避けることは、まれにのみ可能である。

たとえば、古典的方法で作られたワクチンは、望む免疫反応に対して有害な競争 的抗原、無関係な免疫反応を包含する抗原、生体又は培ｇ菌からの核酸、内毒素 及び組成及び起源が未知の成分を包含するかも知れない。複雑な材料から作られ たこのワクチンは本来的に、興味ある意図する抗原からさえ競争的反応を誘起す る比較的高い可能性を持つ。加えて、ＦＭＤＶに対するこのような公知のワクチ ンは使用前に凍結状態に保たれねばならず、ワクチンが使用される遠隔地におけ る凍結を行うのはしばしば困難である。

組換えＤＮＡ技術１はワクチン技術″に新しいアプローチを開いた。これは、製 造が単一特異性の遺伝子から始まるという利薇を狩つ。しかしこの利点の多くハ 、エツンエリキア属大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ　：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ ｌｉ　）又は他の微生吻における抗原の実際の製造においては失われる。この手 順において遺伝子物質がシラスミド中に導入され、次にこれが望む蛋白質を作る エノンエリキア属大腸菌に、他の代謝生成物と共に栄養型と混合して導入される 。このやり方は、望む蛋白質が変形したＥ、Ｃｏ１１　において表現されるかど うかという不確実ざの故に複雑である。

さらに、望む蛋白質が作られるとしても、それを収集できるかどうか、あるいは それがＥ、Ｃｏ１１生長の過程で破壊されるかも知れないという不確実性がある 。たとえば、外部からの又は変化した蛋白質はＥ、ｃｏｌｉによシ消化されるこ とが良く知られている。たとえ蛋白質が興味ある程に十分な量で存在したとして も、それはまだＥ。

ｃｏｌｉ　代謝の他の生成物の認て、たとえば望ましくない蛋白質のような有害 物質、内毒素、核酸、遺伝子及び未知の又は予見できない物質から分離されなけ ればならない。

最後に、たとえＥ、ＣＯＩ　ｉ代謝の池の生成物の総てを望む蛋白質から分離す ることが進んだ必然的にコストのかかる技術により可能である又は可能になった としても、ワクチンはなおまだ、望ましくない抗原決定因子（そのあるものは極 めて重大な不都合な反応をひき起すことが冗られている）を包含するであろう全 蛋白質から成る。

実際に、さもなくばワクチンと考えることができるような成る蛋白質がワクチン としての使用を妨げる程に重大な相互干渉すなわち副反応を誘起する抗原決定因 子を含むことが凡られてい乙。

またハイブリドーマ技術を用いて、ビールス遺伝子生成切に対する抗体を作るこ とが可能である。基本的にはハイブリドーマ技術は、抗原の複雑な混合物から出 発して工程の後段において単一特異性の抗体を作ることを可能にする。対称的に 本発明は逆のプロセスであって、それは高度に純粋な抗原決定因子から出発する 、すなわち望む抗原生成物の精製の必要性を回避する。

・・イブリドーマ抗体は、親和力及び結合定数が低く、従って限られた価値しか 持たないことが四られている。

結局は、ハイブリドーマ技術においては、有害な細胞による抗体の製造に頓らな ければならず、分離技術、純度及び安全性Ｊ関係する総ての問題を伴う。

・・イブリドーマ製造は組織培養又はマウスへの導入に依存し、これは明らかに 製造をコスト高てする。またロットごとに本来的に変化がある。

加えて、・・イブリッドを、それから出発しなければならないところの複雑な混 合物を少パーセントでのみ含む分子とすることは困姓である。

Ａｒｎｏｎら、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＪ、　Ｓ、 　Ａ、６ｇ　：　／’１．！；ＯＣ／９７０）による従前の研究は、これらの研 究者によって、短い直鎖アミノＪ配列は一般に、天然の蛋白質構造と反応する抗 体をたぶん誘起しないことを示していると解釈されている。多くの分子の多くの 一項域について、アミノ識践泰から得られた抗原決定１囚子は線犬の配列によく 分かれるか、しかし抗体を誘起するために用いらｎるベノチドのコンフオメー／ ヨンが、多くの場合、配列において互に近いアミノ酸を含むこれら抗原について さ〜ｇ０３ｃ／９ｇ０）は、直鎖状の槓ゾチドに対する抗体（ｄ天然の分子と反 応することを発見した。すなわち精密な生合成は、不必要、不経済かつ時代遅れ となった。

口蹄疫に対する不活性化した又は減弱したビールスワクチンの有用ａＶＣ＠かか わらず、この疫病を起すＦ　Ｍ　Ｄ　Ｖの製造及び取扱いに従来つきまとってい た危険１１がなく、口蹄疫に対するワクチンの開発に対する大きな経済的及び実 際的な需要及び理論的興味があった。クローン化ビールス蛋白質の有用性はたし かに、旧来の極めて危険なやり方からの大きな前置である。

しかし、クローン化ビールス蛋白質ワクチンもまた、多数の固有の欠点、限界及 び危険を持っている。生合成系の変化自体が蛋白質の表現における変化をひき起 す、すなわち抗原の純度、収率、能力などに影響するかも知れない。刃口えて、 他の蛋白質の存在及び分離の困難さ及び不十分さは、クローン化蛋白質ルートに より作られたワクチンが単一特異性でない可能性を示役する。すなわち純肛、能 力及び安全：生が、この技法から作られた生成物の主な間；間熱である。

既知の硬プチド配列から又はケ゛ツムから出発して合成抗原を作ることの一般的 ・敢猷はすでに記載されており、また抗原材料に用いるのに適当な長さのペプチ ドの合成は今では極めてよく知られているけれど、まだ予見可能性を妨げている 抗原抗体技術の大きな領域が残存゛している。可能性のある抗原配列についての ・ハくっかの指針及び示唆はあるけれど、まだ推測の問題及び試行錯誤の問題が 大きく残っている。長い配列が抗原的に活性な構成要素を含むという認識があっ たとしても、この配列の総てが又は僅か一部が抗原性にとって必要なのかどうか 、あるいは配列の区画が小さいと抗原性か大きいのが又は小さいのかという点に ついての不明確さ及び推測が多大に残っている。

本発明の簡単なまとめ 約、２０個のアミノ酸残基の配列を含む特定の合成の抗原ペプチドが本発明で考 慮される。この抗原ペプチドは、抗原性のビコルナビールスキャプシノト°蛋白 質のある領域に対応するアミノ酸残基配列を含む。この領域は、アミン末端から 測定して、抗原キャノンラド蛋白質のアミノ酸残基配列の全長の約乙θ〜約７５ ％に等しい距離に位置する。このペプチドは、キイホールアオガイ（ｋｅｙｈｏ ｌｅ　Ｉｉｍｐｅｔ　）のヘモチアニン担体に結合されて複合体とされそしてワ クチンとしての有効量で寄主動物に導入されると、ピコルナビールスと免疫反応 してピコルナビールスによりひき起される感染がら寄主を守るところの抗体の製 造を寄主において誘起することができる。このペプチドは好寸しくけ、末端被ブ チドアミノ及び／又はカルボキシル基のイオン価を除いて、正味の正のイオン価 を持つ。

本発明（は別の態様において、ＦＭ、ＤＶ　ＶＰ　キャノシツド蛋白質のアミン 末端から約７３０〜約／ろ０の位置のアミノ酸残基配列に対応する約２θ個のア ミノ酸残基の配列を含む合成の抗原ペプチドを考慮しており、特に約／り／〜約 ／乙０の位置のそれが開示される。このペプチドは、キイホールアオガイのヘモ チアニン担体に結合されて複合体とされそしてワクチンとしての有効量で寄主動 物に導入はれると、口蹄疫ビールスと免疫反応してこのビールスによりひき起さ れる感染から寄主を守るところの抗体の製造を寄主において誘起することができ る。

また別の態様ておいて本発明）ハ、ポリオビールスＶＰ。

キャゾシツド蛋白直のアミン末端から各々約乙／〜約ｇ０、及び約７３０〜約２ ０７の位置のアミノ酸配列に対応する約、２０個のアミノ酸の配列を各々含む、 合成の抗原蛋白質を与える。このペプチドの各々は、キイホールアオガイヘモチ アニン担体に結合されて幀合体とされそして有効量で寄主動物に各々導入される と、ポリオビールスと免疫反応してポリオ感染からこの動物を守るところの抗体 の製造を誘導することができる。

本発明の合成抗原ペプチドは、生理的に許容できる希釈前すたとえば水及び／又 は補剤と共に、ピコルナビールスが誘起する病気から勧吻を守ることができるワ クチンにおいで、又はピコルナビールスが誘起する病気と関連する抗原蛋白質の 存在を検出するのに有用な抗体を作るために用いることができる。

約７３０〜約／６０のアミノ酸残基位置領域における、口蹄疫に関連する合成− ２ｆチドの約、２０個のアミノ酸残基の好ましい配列は、左から右へかつアミノ 酸末端からカルボキン末端への方向で書くと下記のような配列のアミノ酸残基に 対応するアミノ酸残基配列から選択されるＣ７３０） ＴｙｒＡｓｎ　（Ａｓｐ又はＴｈｒ　）　Ｇｌｙ（Ｐｈｅ）Ｇｌｕ（Ｔｈｒ）Ｃ ｙｓ　（Ｓｅｒ又けＡｓｎ又はＴｈｒ）Ａ、ｒｇ（Ｌｙｓ又ｕ　Ｔｈｒ）Ｔｙｒ Ａｓｎ（Ａｌａ又はＳｅｒ又はＴｈｒ）　Ａｒｇ　（Ｖａｌ又はＡｌａ又ＵＡｓ ｎ又けＴｈｒ）Ａｓｎ（Ｇｌｙ又は５ｅｒ）（／グ０） Ａ　ｌ　ａ　（Ａｓｐ又はＧｌｙ）Ｖａｌ　（Ｓｅｒ又はＧｌｎ又は刈Ｐｒｏ（ Ｇｌｙ又はＹ）Ａｓｎ　（Ｚ）　Ｌｅｕ　（Ａｒｇ又はＶａｌ　）Ａｒｇ（Ｓｅ ｒ又はＡｌａ）ＧｌｙＡｓｐＬｅｕ（Ｍｅｔ又はＰｈｅ）Ｇｌｎ（Ｇｌｙ）（／ ３０） Ｖａｌ（Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＨｉｓ）Ｌｅｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧｌｎ（Ａｌ ａ又はＰｒｏ）　Ｌｙｓ　（Ａｒｇ又はＡｌａ）Ｖａｌ　（Ｈｉｓ）Ａｌａ（Ｖ ａｌ）Ａｒｇ（Ｔｈｒ又はＬｙｓ） （／乙０） Ｔｈｒ（Ｇｌｎ又はＨｉ　ｓ）　ＬｅｕＰｒ。

ここでカッコ内］Ｃ記されるアミノ酸残基Ｘ、Ｙ又はＺの各々は１固々に、カッ コのすぐ左に隣−妾するアミノ鷹浅基と代わることができる。

６７″チドアミノ酸残基配列におけるＸ及び／又はＹ及び／又はＺは各々独立に 、カッコの直属に隣接するアミノ酸残基の位置におけるアミノ酸残基の不存在を 示し、それによって４ノチド長は各々／、コ又は３個のアミノ酸残基の分だけ短 縮され、また上記の配列において特定のアミノ酸残基の上のカッコ付きの数字は 、Ｔｕｂｉｎｇｅｎタイ′ｆ０、サブタイツ／、ストレインにａｕｆｂｅｕｒｅ ｎ　ＦＭＤＶのＶＰ、キャノンラド蛋白質のアミン末端に対する特定のアミノａ 残基の位置を示す。これら数字は、引用する目的のために示されている。

アミン末端から約／弘／〜約／乙θの位置に対応する、口蹄疫に関連するより好 ましいペプチドアミノ酸配列は、上述の配列において位置／り／のＶａｔ（Ｓｅ ｒ又はＧｌｎ又はＸ）残基でアミノ末端が始まる。

最も好ましい個々のペプチドは、表示の左から右へかつアミン末端からカルボキ ン末端の方向に約／り／がら約／ろ０の位置における口蹄疫ビールス＜／）　Ｔ ｕｂ　ｉ　ｎｇｅｎ　タイプ０、サブタイｆ／、ストレインＫａｕｆｂｅｕｒｅ ｎ　、（，２）タイｆＡ、サフ゛タイプ１０、ストレイン乙／及び（５）タイｆ Ａ、サブタイツ／２、ストレイン／／９のアミノ酸残基配〃１」てほぼ対応する ものであり、下記の各配列から選ばれる：（１）　ＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡ ｒｇＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬｅｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡ ｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒｏ　；（２）　ＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧＩｙＡｓｐＬｅｕＧ ｌｙＳｅｒｌｌｅＡｌａＡｌａＡｒｇＶａｌＡｌａＴｈｒＧｌｎＬｅｕＰｒｏ、 及び（、Ｉ　ＳｅｒＧｌｙＶａｌＡｒｇＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｙＳｅｒＬｅｕ ＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｌａＡｒｇＬｅｕＰｒｏ　０ ホリオＶＰ１キヤブジツドに関連する合成ペプチドの約、２０個のアミノ酸残基 の特に好ましい配列は、アミノ酸末端から約乙／〜約ｇｏ及び約／ｇ／〜約、２ ０／のアミノ酸残基位置領域にあるＶＰ　キャブジッドに対応すす る。左から右へかつアミン末端からカルボキン末端の方向に書くと、これら配列 のアミノ酸残基（１、各々下記のように表示される： （乙／） Ｖａ　ＩＧ　ｌ　ｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ｌＶａ　ＩＧＩ　ｎＨｉｓ　（ Ａｒｇ）ＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒ（ｇｏ） Ｇｌ　ｕｓｅｒｓｅｒ　（Ｔｈｒ）　ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅ　；及び（／ ｇ／ｌ ５ｅｒ　ｌ　ｌ　ｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌ　ｙＴｈｒ　（Ａ　ｌ　ａ） Ａ　ｌ　ａＰｒｏＡ　ｌ　ａＡｒｇ　ｌ　ｌ　ｅ（，２０／） ＳｅｒＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙｌ　ｌｅここで各配列においてカッコを 付されたアミノ酸残基は、各々独立に、カッコの直属に隣接するアミノ酸残基と 代わることができる。

また、上述の配列において特定のアミノ酸残基の上のカッコ付きの数字は、ポリ オタイｆ／ビールスのＶＰ。

ギャグシノド蛋白質のアミン末端に対する特定のアミノ酸残基の位置を示してい る。これら数字は対照の目的のため知懺示されたものである。

本発明は、とくにピコルナビールスが誘起する病気に対するワクチン及び人を含 めた動物におけるこれら病気又はビールスの存在のテストのだめの診断において 本発明のペプチドを用いる場合に、いくつかの利益及び利点をもたらす。

すなわち、顕著な利点の一つは、この合成ペプチドはこれらの病気から動物を守 るワクチンの要素を提供できることである。

本発明の特別の利益は、合成ペプチドを用いて作られたワクチンが、有効なワク チン注射を達成するために投与の前に凍結される必要はないということである。

本発明の別の利点は診断の分野にあシ、合成ペプチドに対して生じた抗血清中の 抗体が免疫反応をして、口蹄疫及びポリオのようなピコルナビールスに関係する 抗原蛋白質及σ抗体の存在を検出するのに使用できることである。

また他の利益及び利薇な、後記の詳細な説明、実施例及び請求の範囲から当業者 にとって明らかであろう。

図面の簡単な説明 この開示の一部をなす図面において、第１図は、各アミノ酸残基のだめの普通の 三文字コードを用いて、口蹄疫ビールスからのＶＰ、キャブジッドのアミノ駿残 基位置／３０〜／乙０における３個のアミノ酸残基配列を示す。配列は、左から 右へかつアミノ末端がらカルざキ／末端の方向に読まれる。、数字／３０、／グ ０、／３０及び／ろ０ば、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ　タイプ０、サブタイ７’／、スト レインＫａｕｆｂｅｕｒｅｎ　ビールス（○ｌｋ　）のアミン末端ＩＣ対するア ミノ酸残基位置を示し、他のビールスＶＰ　のアミノ酸残基配列は−又は複数の ハイフンを用いて、これらの配列の間の類似性がより明瞭になるように示した。

０１に以外のビールスに対する省略記号は下記の通りである。

○ｌｃ＝タイプ０、サブタイｆ／、ストレインＣａｍｐｏｓ　；Ａｔ〇−タイプ ０Ａ、サフ゛タイｆ１０、ストレイン乙／：Ａ／、２−タイプへ１サブタイｆ／ 、２、ストレイン／／ｑ；Ａ、２１１＝タイプＡ、サブタイｆ、２グ：Ａ、２７ −タイｆＡサブタイｆ、２７、Ａ７ワータイプＡ、サブタイプ７′７；Ｃ３＝タ イｆＣ、サブタイプ３、ストレイン１ｎｄａｉａｌ　。

第２図は、各アミノ酸残基のための普通の三文字コードを用いて、ポリオタイプ ／　Ｍａｈｏｎｅｙ及び５ａｂｉｎビールスストレイン及びタイプ３１−ｅｏｎ 　ポリオビールスストレインからのＶＰ　キャブジッドのアミノ酸残基位置ろ／ 〜ｇ０及び１ｇ２〜２０／におけるアミノ酸残基配列を示す。

配列は、左から右へ、アミン末端からカルボキン末端の方向に読まれる。数字乙 ／、ｇｏ、７ｇ２及びコθ／は、Ｍａｈｏｎｅｙタイプ／ポリオビールスＶＰ　 キャブシソド蛋白質のアミン末端に対するアミノ酸残基位置を示す。

発明の詳細な説明 ／　一般的説明 本発明は、特定の比較的短い合成ペプチド配列が全く予期せぬことにまた全く驚 くべきことに極端に抗原的に活性であるという発明に基つく。この合成のペプチ ドは、長さ方向に約２０個の酸のアミノ酸残基配列を含む。ペプチドのアミノ酸 残基配列は、抗原キャブジット蛋白質のアミノ酸残基配列全長の、そのアミン末 端から測って約乙θ〜約７Ｓ％に等しい距離に存在する、抗原性ピコルナヒール スキャフゾノド蛋白質上の領域のアミノ酸残基配列に少くとも対応する。合成ペ プチド蛋白質は、末端アミン及び／又はカルボキシル基の存在によるイオン価を 除いて、正味セロないし正のイオン価を有する。

また、後述するペプチド配列を含む合成抗原は、ピコルナビールスたとえば口蹄 疫ビールスの特定の血清タイプ、サブタイプ及びストレインに対して単−特異時 （ｍｏｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、壕だ低程度ではあるがこれらビールス の多数の血清タイプ、サブタイプ及びストレインに対して多特異的（ｐｏｌｙ− ｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。

口蹄疫（「ＭＤ）を起すピコルナビールスに関係する合成ペプチド、そのような ペプチドを用いるワクチン及び診断は、製造できる合成ペプチド、ワクチン及び 診断の例示として説明される。しかし、ここでＦＭＤに対して開示する一般的原 理、技術及び定義はまた、ピコルナビールス科の他の属に関係する合成ペプチド にも適応できることが理解されなければならない。しかしＦＭＤＶＶＰ、キャブ ジッドのアミノ酸残基位置に対応する特定のアミノ酸配列はそのビールスにのみ 関係し、ポリオＶＰ。

キャブジッドのアミノ酸残基位置に対応する特定のアミノ酸残基配列も同様であ る。

特に、Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖ　Ｖ　ｐ、蛋白質たとえばＴｉｉｂｉｇｅｎ　タイプ０、 サブタイプ／、ストレインＫａｕｆｂｅｕｒｅｎ　からの蛋白質のアミン末端か ら約７３０〜約／乙０、及び特に約／’ｌ／〜約／乙０の位置のアミノ酸残基配 列に対応する約２０個のアミノ酸を含む合成ペプチドが、従来の研究で示唆又は 予言されたよりもずっと高い抗原効力を持つことを見い出した。本発明のペプチ ドは単独で、直鎖状又は環状であり、近接するペプチドの酸化されたシスティン 残基により結合されたペプチド単位を持つポリマーとして又は担体に結合された 複合体として、口蹄疫のだめの有力な免疫反応を示す物（抗原）であり、後に詳 細に説明する。

アミノ末端から［約７３０〜約／ろ０の位置］及び「約／ＩＩ／〜約／乙０の位 置」という表現及び類以の表現をここで使用する。このアミノ酸残基の位置は、 タイプ０、サブタイプ／、ストレインＫａｕｆｂｅｕｒｅｎ　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖの ＶＰ、キャブジッド蛋白質を引用して、これとの関係で決定される。

この分野のいく人かの研究者たとえばヨーロッパ特許公開Ｎα００ｔｇｌ、９３ 　Ａ２におけるＫｌｅｉｄらは、ｖ　ＰＩ　（前述したＶＰ３）キャブジッド蛋 白質の７３０〜／乙０領域のアミノ酸残基の位置を、タイプＣ１サブタイプ３　 Ｖ　Ｐ。

キャブジッドのＡｓｐ−ｊ；３の後の付加的なアミノ酸（Ｖａ　ｌ　）の存在の 故に（他のキャブ７ノトはそこにはアミノ酸残基を含まない）、本明細書で与え る位置番号に比へてカルボキシ末端の方向に一つのアミノ酸位置番号たけずれる ことに留意しなければならない。結局、本明細書で７１１Ｏと呼ぶ位置のアミノ 酸は、上述のヨーロッパ特許出願では位置／’Ｉ１０アミノ酸として表わされる 。すなわち、異なる研究者が同じ蛋白質分子の配列を報告するときに、一つ又は それ以上のアミノ酸位置の差違が存在する。

捷だ、いくつかの口蹄疫ビールスからのキャブジット蛋白質は、第１図に示され また後述の式■の配列で文字ＸＸ　Ｙ及びＺで示されるように、タイプ０、サブ タイプ／、ストレインにａｕｆｂｅｕｒｅｎ　のタイプＶ　Ｐ、と対比して／３ θ〜／乙０領域の−又は二以上の位置でアミノ酸残基を含まない。このような削 除又は脱落の存在の観点で、ある研究者は、削除を考慮することなしにその蛋白 質から決められるアミノ酸位置又はその蛋白質のＤＮＡ分子コードを報告してい る。別の研究者は本明細書で行われるように、ハイフン、文字又は他の表示を用 いてアミノ酸削除を示し、残りのアミノ酸残基位置を、あたかも削除された残基 が存在するかのようにして番号付けすることによってＶＰ１キャプンソト間の類 似性を示している。

すなわち、アミノ酸位置の報告において、さらに少しの変法がある。

すなわち、上述の及び同様の表示において用いた「約」という言葉は、そのアミ ノ酸残基配列が指定された位置のどちらかの側に／ないし３までズしたアミノ酸 残基のどこかで始まる又は終ることができて、従って任意の特定のペプチド配列 において所与のアミノ酸残基について従来報告されたような／〜スの位置番号の 変化を辞し、またあるアミノ酸残基はあるＶ　Ｐ、キャブジット蛋白質では脱落 しているという事実を考ｆに入れることを意味する。

数種の合成ペプチドが本発明で考慮される。これら合成ペプチドの各々は、、Ｆ ＭＤＶのＶ　Ｐ、蛋白質の約７３０〜約／乙０の位置の領域における約同じ長さ のアミノ酸残基配列に対応する又はほぼ対応する配列の中の約２０個のアミノ酸 残基を含む配列を含む。

すでに述べたように、ＦＭＤＶのいくつかのタイプ、サブタイプ及びストレイン がある。従って引用の便のために本明細書において述べるペプチド配列は、特定 のタイプ、サブタイプ及びストレイン、すなわちＦＭＤＶＯＴｉｉ　ｂｉｎｇｅ ｎ　タイプ０、サブタイプ／、ストレインにａｕｆｂｅｕｒｅｎ　（また本明細 書ではタイプθ、サブタイプ／、ストレインにａｕｆｂｅｕｒｅｎ　及びｏｌｋ と云うこともある）を引用して説明することにする。すなわち引用（基準）とし て特定の一つのＦＭＤＶ蛋白質のアミノ酸配列を用いて、ペプチド鎖に沿う特定 の位置で置換された又は脱落したアミノ酸残基がある他の有用なペプチド配列が 記述される。

基準のタイプｏｌｋ蛋白質の番号付は体系を用いて、約７３０〜約／乙０の位置 のｇつのＦＭＤビールスのＶＰ１キャプンノト蛋白質からのペプチド配列を第１ 図に示す。各々約２０個のアミノ酸を含み、第１図に示すアミノ酸残基配列に対 応する又はほとんど対応するアミノ酸残基配列を持ち、後述の一元的テスト条件 に合格する合成の、好ましくは水溶性のペプチド（り、本発明の範囲に入ると考 えられる。

左から右へか２アミン末端からカルボキン末端の方向に考えて、約７３０〜約／ 乙０のアミノ酸残基位置に対応するアミノ酸残基配列を持つ好ましいペプチドは 、下記の式■で示される 式　■ （／３０） ＴｙｒＡｓｎ　（Ａｓｐ又はＴｈｒ）Ｇｌｙ　（Ｐｈｅ）　Ｇｌｕ　（Ｔｈｙ） 　Ｃｙｒ　（Ｓｅｒ又はＡｓｎ又はＴｈｒ）Ａｒｇ　（Ｌｙｓ又はＴｈｒ）Ｔｙ ｒＡｓｎ（Ａｌａ又はＳｅｒ又はＴｈｒ）Ａｒｇ（Ｖａｌ　又はＡｌａ又はＡｓ ｎ又はＴｈｒ）Ａｓｎ（Ｇｌｙ又は５ｅｒ） （／１１０） Ａ＋ａ（Ａｓｐ又はＧｌｙ’）Ｖａｌ　（Ｓｅｒ又はＧｌｎ又！ｄ　Ｘ）Ｐｒｏ （Ｇｌｙ又はＹ）Ａｓｒ（Ｚ）Ｌｅｕ（Ａｒｇ又はＶａｌ）Ａｒｇ（Ｓｅｒ又は Ａ　ｌ　ａ）　Ｇ　ｌ　ｙＡｓｐＬｅｕ（Ｍｅｔ又はＰｈｅ）　Ｇ　ｌ　ｎ　（ Ｇ−′ｌ　ｙ）（１５θ） Ｖａｌ（Ｔｈｒ又はＳｅｒ又は出５）Ｌｅｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧｌｎ（Ａｌａ 又はＰｒｏ）Ｌｙｓ（Ａｒｇ又はＡｌａ）Ｖａｌ（Ｈｉｓ）ＡＩａ（Ｖａｌ）Ａ ｒｇ（Ｔｈｒ又はＬｙｓ） ／ＡＯ Ｔｈｒ（Ｇｌｎ又は出ｓ）　Ｌｅｕｐｒ。

ここでカッコ内のアミノ酸残基Ｘ、Ｙ又は２の各々は各々独立に、カッコの直属 に隣接するアミノ酸残基すなわちアミン末端により近いアミノ酸残基と代わるこ とができる； ペプチドアミノ酸残基配列におけるＸ及び／又はＹ及び／又は２は各々独立に、 カッコの直属の（アミン末端により近い）アミノ酸残基の位置におけるアミノ酸 残基の不存在を示し、これによってペプチド長は各々／、２又は３つのアミノ酸 残基の分だけ短かくなり、また配列中の特定のアミノ酸残基の１のカッコ付きの 数字は、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ　タイプ０、サブタイプ／、ストレインＫａｕｆｂｅ ｕｒｅｎ　Ｆ　ＨＤ　ＶのＶ　Ｐ、キャブジッド蛋白質のアミノ末端からの特定 のアミノ酸残基の位置を示す。数字は引用目的のために表示される。

Ｖ　Ｐ、キャブジッド蛋白質の約／’Ｉ／〜約／乙０の位置に対応するより好ま しい配列は、式Ｉの位置／’Ｉ／においてＶａｌ（Ｓｅｒ又はＧｌｎ又はＸ）で アミン末端が始まる。

ＦＭＤＶ属のタイプ、サブタイプ及びストレインの間の多特異性及び交叉反応性 は、そのアミノ酸残基配列がＦ）４ＤＶ属の少くとも二以上のストレイン、より 好ましくは二以上のサブタイプ又は血清タイプのアミノ酸残基配列に対応する本 発明の抗原蛋白質の使用によって改善される。そのようなペプチドのアミノ酸残 基配列は、どのビールスのアミノ酸残基配列にも実質的に対応するものでないこ ともでき、しかじにも拘わらずワクチンとして寄主動物に接種されると、多数の ビールスタイプ、サブタイプ又はストレインと免疫反応して寄生をこれら二以上 のビールスから守る抗体の製造を誘起することができる。

そのアミノ酸残基配列がＦ　ＭＤＶのストレインの少くとも二以上のアミノ酸残 基配列に対応する多特異性ペプチドは、上述の式■において−又は複数のカッコ 内のアミノ酸残基Ｘ、Ｙ又はＺがカッコの直属の隣接するアミノ酸残基すなわち アミノ酸末端の方に隣接するアミノ酸残基と代るところの式Ｉのアミノ酸残基配 列を持つことができる。約／’ｌ／〜約１５５のアミノ酸残基位置の領域におけ る置換及び脱落は、単一のアミノ酸残基配列を持つペプチドにおいて多特異性を 得るために好ましい。

そのような長詩異的ペプチドは、本発明の他のペプチドと同じ方法で作られ、用 いられることができる。

アミン末端からカルボキシル末端の方向に左から右へ約／り／〜約／乙０の位置 で（１）　Ｔｕｂ　ｉ　ｎｇｅｎ　タイプ０、サブタイプ／、ストレインにａｕ ’ｆｂｅｕｒｅｎ　、　４２）タイプＡ１サブタイプ／θ、ストレイン乙／及び （３）タイプＡ１サブタイプ／２、ストレイン／／フのアミノ酸残基にほぼ対応 する最も好捷しい個々のペプチドは、下記の各々の配列により示される。

（１）　ＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｒｇＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬｅ ｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒｏ；Ｃ２）　Ｓｅｒ ＡｒｇＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｙＳｅｒｌｌｅＡｌａＡｌａＡｒｇＶａｌ ＡｌａＴｈｒＧｌｎＬｅｕＰｒｏ、及び（、？）　ＳｅｒＧｌｙＶａｌＡｒｇＧ ｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｙＳｅｒＬｅｕＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｌａＡｒｇＬ ｅｕＰｒｏ。

本明細書及び請求の範囲において「はぼ対応する」という言葉はピコルナビール スに関連するペプチド配列に関係して用いら・れると、記述されるペプチド配列 にアミン末端及びカルボキシ末端の一方又は双方において３個までのアミノ酸残 基のプラス又はマイナスを伴い、かつペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基に おいて控え目な置換のみを含むペプチド配列を意味する。「対応する」という言 葉は本明細書及び請求の範囲においてピコルナビールスに関連するペプチド配列 に関係して用いられると、記述されるペプチド配列にアミン末端又はカルボキシ 末端の一方又は双方において３個までのアミノ酸残基のプラス又はマイナスを伴 い、かつペプチド配列に沿う特定のアミノ酸残基において控え目な並びに根本的 な置換を含み、かつ特定のアミノ酸残基の脱落又は追加をも含むペプチド配列を 意味する。

ここで用いた「控え目な置換」とは、一つのアミノ酸残基が他の生物学的に類似 の残基により置き代えられることを意味する。控え目な置換の例としては、ｌ　 １５　Ｖａ　ｌ＋Ｌｅｕ又は間ｅｔのような疎水的残基の一つを他のもので置換 すること、又は極性残基の一つを他のもので置換する、たとえばＡｒｇとＬｙｓ 　ＸＧｌｕとＡｓｐ又はＧｌｎとＡｓｎの間などの置換が挙げられる。

ある例では、一つのイオン性残基を反対電荷のイオン性残基で置換する、たとえ はＡｓｐをＬｙｓで置換することは、これらイオン性基が単に溶解性を助けると 考えられていた従来技術においては控え目と呼ばれていた。しかし一般的に本発 明で述べる置換は、蛋白質全体と比べて比較的短い合成ペプチド抗原についての ものであるので、イオン性残基を反対電荷の他のイオン性残基で置換することは 本発明では根本的置換と考えられる。非イオン性とイオン性の残基の間、かさば る残基たとえばＰｈｅ　。

Ｔｙｒ又はＴｒｐとかさばらない残基たとえばＧｌｙ、ｌｌｅ及びＶａｌＯ間の 置換も同様である。

ここで「非イオン性」及び「イオン性」残基という言葉は、その普通の意味で、 生理的ｐＨ値において各々、通常電荷を持たない、及び通常電荷を持つアミノ酸 残基を意味するものとして使用される。非イオン性残基の例はＴｈｒ及びＧｌｎ であり、イオン性残基の例はＡｒｇ及びＡｓｐである。

式Ｉで示した上述の配列及び、ＦＭＤ　Ｖ　Ｐ、キャブ７ノドの約／り／〜約／ 乙０の位置に対応する、より短い、より好ましい合成配列は、多数の個々のペプ チドを包含し、その各々が、それが長さ方向に約２０個のアミノ酸残基を持つと き、本発明のペプチドである。たとえば、キャブジッドの位置／’Ｉ／で始する アミノ末端を持つ合成ペプチドは、アミノ末端Ｖａｌ　、　Ｓｅｒ又はＧｌｎ残 基で始まることができる。

またアミン末端アミノ酸残基位置がＸで表示されて、式■におけるカッコの直圧 のアミノ酸残基の不存在を示している場合には、ペプチドアミノ末端はキャブジ ッド位置／４．２のアミノ酸残基Ｐｒｏ、Ｇｌｙ又はＹで始まることができ、こ こでＹは独立にＰｒｏ及びＧｌｙ　の不存在を示しており、従ってペプチドアミ ノ末端は位置／’ｌ／又は／クコではなくてＯｌｋの位置１ｌＩ３に対応するア ミノ酸残基で始まる。また式Ｉを見ると、キャブジッド位置／ＩＬｔ３の残基は Ａｓｎ又はＺであることができ、従って不存在であることもできる。

すなわち、その配列がキャブジッド位置約／り／〜約／Ａθに対応するペプチド は、キャブジッド位置／［１で始ま′ることかできる。先に指摘したように、記 辻した配列に対応するペプチド配列は、どちらかの端において３個までのアミン 末端残基のプラス、マイナスを持つ。

そのアミノ酸残基配列が実際にタイプ０１ｋＶＰ、キャブジッド蛋白質に対比し て位置／１ｌｌｌで始まる上述のペプチドは、配列が「アミン末端及びカルボキ シ末端の一方又は双方で３個までのアミノ酸残基のマイナス」であるものに包含 される。

本発明に含捷れるペプチドの例は、タイプＡ１サブタイプ／、ストレインにａｕ ｆｄｅｕｒｅｎ　及びタイプＡ１サブタイプ／、２、ストレイ７／／９ＦＭＤＶ 蛋白質の約７３ｏ〜約／乙０領域（各々、タイプ０の位置番号を用いて示され、 ＯＩｋ及びＡ／、２と表示される）、及びタイプｃ１ＳＡＴ−／、　５ＡＴ−２ ，’５ＡＴ−３及びＡＳＩＡ−／の対応する領域に含まれる。そのような蛋白質 の二つの例を、Ｏ１ｋビールスの位置番号を用いて下に示す。ハ′イフンは脱落 したアミノ酸残基を示す。

Ｔｙ　ｒＡｓｎＧ　ｌ　ｙＧ　ｌ　ｕＣｙｓＡｒ　ｇＴｙ　ｒＡｓｎＡｒ　ｇＡ ｓｎＡ　ｌ　ａＶａ　ｌ　Ｐ　ｒ　ｏＡｓｎＬｅｕＡｒ　ｇ＜ｉｓθ）（／乙０ ） Ｇ　ＩｙＡｓｐＬｅｕＧ　ｌ　ｎＶａ　１ＬｅｕＡｌ　ａＧ　ｌ　ｎＬｙｓＶａ 　ＩＡ　ｌ　ａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒ。

また、約／り／〜約／乙０のキャブジッド領域のアミノ酸残基配列は後に詳述す るように独特にかつ全く予期させることに抗原的活性であり、かつ有効であるこ とが確認された。

約７３０−約／乙０の領域及び特に約／り／〜約／乙０の領域に約２０個のアミ ノ酸の配列を持ち、それにアミン末端又はカルボキシ末端のＣｙｓ又は他のアミ ノ酸が付加されていて、もし担体が用いられるなら担体たとえばキイホールアオ ガイのヘモチアニン（ＫＬＨ）に追加的合成段階によって相互結合（ｃｏｖａｌ ｅｎｔ　ｌｉｎｋｉｎｇ）により結合できる蛋白質は本発明の態様の−っである 。本発明のＦＭＤＶ単−特異的及び長詩異的な合成抗原決定因子ペプチドにより 示される独特かつ有能な抗原性を破壊しない又はほとんど変えないところのペプ チド長の変化、個々のアミノ酸に関する置換又は脱落がある上述のペプチドも本 発明の態様の一つである。

他の抗原的に活性な、又は抗原的にマスキングする配列から分離されたこれら配 列は、まだ別の形の本発明の態様を構成する。抗原的に妨害する又はマスキング する配列から分離され、互に化学的に会合又は混合された、前述の抗原的に活性 な配列の二以上より成る抗原は、また本発明の別の形である。−又は複数の前述 の抗原的に活性なアミノ配列を結合された担体より成る抗原は、本発明の別の態 様を構成する。本発明はもちろん、本発明の抗原ペプチドを単独で又は担体に結 合された形で、生理的に許容できる希釈剤と共に含むワクチンを具体化する。生 理的に許容できる希釈補剤の存在は任意的である。

本発明を考えるにおいて、本発明の一態様と考えられる抗原的に活性なアミノ酸 配列の下記の定義を認識することが重要である。たとえば、アミン末端からカル ボキン末端の方向に左から右へ書いてタイプ０、サブタイプ／、ストレイ７　Ｋ ａｕｆｂｕｒｅｎの位置／ｌＩ／〜／乙０に対応する配列 Ｖａ　ｌ　ＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｒ　ｇＧ　ｌ　ｙＡｓｐＬｅｕＧ　ｌ　ｎＶａ 　ｌ　ＬｅｕＡ　ｌ　ａＧ　ｌ　ｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒ 。

は、主体の蛋白質の抗原効果をマ、７りする又は妨害する又は交叉反応する又は 複雑にする傾向のある他の蛋白質、遺伝子片、アミノ酸及びアミノ酸配列から分 離された場合、本発明の特別の曹様である。すなわち、たとえば３０個又はそれ 以北のアミノ酸を含むより大きな蛋白質又はより大きなペプチドの一部分として 特定の配列を人は見い出すかも知れないが、そのような大きな物質は本発明を構 成しない。何故なら、蛋白質又は大きなペプチドは、本発明の約２０個のアミノ 酸長のペプチドが持つ活性、はぼ単一特異性の抗原活性の異例にかつ予期できぬ 程に高いレベルを有しないからである。

「ＦＭＤ■単一特異性の合成抗原決定因子ペプチド」という言葉は、ＦＭＤＶか ら直接又は間接に由来する遺伝子片、蛋白質又はペプチド又は何らかのアミノ酸 化合物の可能性を排外する化学的合成から得られ、そして動物においてＦＭＤＶ に対する抗体製造を誘起する特定のペプチドの単一特異的抗原活性を妨害する又 は変化させる蛋白質又はアミノ酸配列を含徒ない、上述に特定したような特別の ペプチドを意味する。ここで「単一特異性」という言葉を用いたが、個々のペプ チドは壕だ、多数のＦＭＤＶタイプ、サブタイプ及びストレインとの長時異的抗 原活性を示す。この広げられた特異性は、根本的置換がないならばその配列が特 定のＦＭＤＶキャブジッドのアミノ酸残基配列にほぼ対応するペプチドにおいて 根本的置換が行われた場合に特に見られること、及びこの根本的に置換されたア ミノ酸残基は別のビールスストレインにおける置換位置で見い出される残基であ ることに留意しなければならない。すなわち、「単一特異性」という言葉の使用 は、本発明のペプチドの比較的広い特異性についての省略した記述法である。

本発明の合成の抗原ペプチドは単独で、直鎖形又は環状形で近接のペプチド繰返 し単位が酸化された／スティン残基によって互に結合されたポリマーとして、又 は担体に結合された複合体として寄主動物にワクチンとして有効量で導入される と、関係するピコルナビールスと免疫反応して、そのピコルナウィルスにより起 される感染から寄主を守るところの抗体の製造を寄主において誘起することが典 型的に可能である。しかし本発明のペプチドはまた、ペプチドが終局的に用いら れる形態、すなわち直鎖状、環状、ポリマー状又は結合された複合体のいずれか によらないその抗原特性の一元的テストによって定義することができる。この一 元的テ、ストによれば、直鎖形の本発明のペプチドがキイホールアオガイのヘモ チアニン担体と結合されそして寄主動物にワクチンとじて有効量で導入されると 、それが関係するピコルナビールスと免疫反応してそのビールスから寄生を守る 抗体の製造を誘起することができる。ペプチド及び担体の量、及び複合化反応の だめの特定の反応条件及びワクチン製造は、Ｂｉｔｔｅｌ　らのＮａｔｕｒｅ、 　２９ｇ　：　３０〜３３　（１９ｇ−化７月）に記載されている。

ワクチンとしては本発明は、生理的に許容ヤきる希釈剤たとえば水又は食塩水と 共に存在する場合にワクチンとして単独で働きうる有効量のペプチド抗原より成 る。

このワクチンは、多数の担体たとえばキイホールアオガイのヘモチアニン（ＫＬ Ｈ）、破傷風トキソイド、ポリ−Ｌ　−（Ｌｙｓ　：　Ｇｌｎ　）、ビーナツツ 凝集素、卵アルブミン、大豆凝集素、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）など、ＦＭＤ Ｖ単一特異性の合成抗原決定因子ペプチドが結合される同等物などのいずれかで ありうる担体を含むことができる。本発明のペプチドの多数を、たとえば酸化さ れた末端システィン基の端一端の結合により、結合して作られたポリマーはまだ 、生理的に許容される希釈剤と共に外生的担体不含有のワクチンを成すことがで きる。

各側において本発明のペプチドは、特異的抗原決定因子として働く。

抗原ペプチドの「有効量」は多数の因子に依存する。

これら多くの因子としては、保護されるべき寄主動物の体重及び種、担体（用い られるなら）、補剤（用いられるなら）、望む接種の数、及び動物のために望ま れる保護の期間が含捷れる。７回の接種は典型的には、ペプチドが結合されてい るかも知れない担体を除く合成抗原ペプチド約２０マイクログラム〜約Ωミリグ ラムを含む。

本発明の抗原ワクチンが望む寄主に導入されると、それは上述した抗原ペプチド 及び関係するピコルナビールスたとえばＦＭＤＶに対する抗体の製造を寄生内で 開始させる。本発明のペプチドの有効量を含むワクチンが寄主における抗体の製 造を開始させるたけでなく、この抗体はＦＭＤＶ又は他のピコルナビールスによ る感染から寄主動物を守るのに十分量で作られる。寄主の保護は、後述するよう な生じた抗体を中和するレベル及び／又は中和指数により評価できる。

本発明はまた、担体の総て又は一部が抗原性である抗原を考慮する。すなわち、 別異の担体部分を用いることも用いないこともできる。抗原性担体にＦＭＤＶ単 一特異性合成抗原決定因子ペプチドを結合して形成された合成抗原ならびにその ような合成抗原の製造法は、本発明の特別の態様である。

一般にこの合成抗原は、免疫的にＦＭＤＶの抗原決定因子に対応する又はほぼ対 応するところのＦＭＤＶ単一特異性合成抗原決定因子ペプチドのようなピコルナ ビールス関連ペプチドを作る段階、別途の合成段階において合成決定因子を薬理 学的に許容できる担体とカップリングする段階により形成されることができる。

ワクチンの製造方法としては、ＦＭＤＶＶＰ、蛋白質の特定の決定因子部分の抗 原的に複製又は実質的複製であるＦ）４ＤＶ単一特異性合成抗原決定因子ペプチ ドを合成することを包含する。この合成ペプチドは、常に必要という訳ではない が担体と結合されることができて、抗原的性質はＦＭＤＶ単一特異性抗原決定因 子ペプチドのそれであって、薬理的に許容できる希釈剤と共に寄主動物に導入さ れるとＦＭＤビールスに対する抗体の製造を開始するところの抗原を生じる。

抗体製造の方法としては、上述のワクチンが寄主に注射され、蛋白質抗原に対し て寄生で生じた抗体を寄主体液から集めて、蛋白質抗体の存在を検出する慣用の 診断後に詳細に述べるように本発明のワクチン製造及び抗体製造において多くの 物質を用いる多くの手順があるが、本発明は何らかの特別の段階又は剤又は条件 に限定されるものではなく、むしろ本発明は概念的には上述したようなものであ り、請求の範囲で特定性をもって定義されているものである。

■、ペゾチド合成 下記で述べるペプチドは公知の手順で合成された。

ドは、特記なき限ｂ−’＝ゾチドのカルボキシ末端で典型的に付加されるシステ ィン残基を介して蛋白質担体ＫＬＨにカップリングされる。蛋白質担体へのペプ チドの合成的結合段階は、特記なき限り、Ｌｉ’ｅｕら、Ｂｉｏｃｈｎｍｉｓｔ ｒｙ。

７ｇ：乙ｑｏ〜乙ｑ’７　（／９７９）に記載の一般的手順て従って、担体、！ ＝Ｎ−マレイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＭＢＳ ）との間の反応生成物の二重結合への７ステイン硫黄原子の付加によって実施き れる。

位置／’Ｉ／〜／乙０における０１ｋＶＰ工のアミノ酸配列（第１図）を持つペ プチドを合成し、アミン末端とカルボキシ末端の両者でシスティン（Ｃｙｓ　） 残基を付加（）Ｃｙｓ被ゾチド）することにより、低分子量の、たぶん環状のペ プチドが作られた。

次て１０ミリグラムのこのジＣｙｓ　＜ゾチド（非酸化形のＣｙｓ残基を含む） をビーカー中で、０．１Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液２．！；ＯＩ＋Ｉｔに溶 解した。溶解したジＣｙｓ　＜ゾチドを次に、溶液を温和に約／ｇ時間攪拌する ことによって空気酸化した。この期間の終了時にＥｌ１ｍａｎ反応は遊離のメル カプタンの不存在を示した［　Ｅｌｌｍａｎ、　Ａｒｃｈ。

得た溶液を凍結乾燥した。このようにして作った乾燥物質を以下では環状ペプチ ドと呼ぶが、これは、酸化されたシスティン残基すなわちノスルフィド結合を含 む７スチン残基によりアミン末端をカルボキシ末端と結合されていると考えられ る○１ｋＶＰエキャプンッドの位置／り／〜／乙０について前述したアミノ酸配 列を持つ。また二重１４）　ノＣｙｓ　ｄｆチドが互に結合されて、環状ペプチ ドを形成することもできる。

また二つのポリマー状被グチドは、二つの一′！！プチド末端で非酸化Ｃｙｓ残 基を含む上述の被フ０チド（）Ｃｙｓベノチド）から作られ、ベグチドアミド結 合によりこれら末端に結合される。これらポリマー状ペプチドは、以下でポリマ ー状イプチドＡ及びＢと呼ばれる。

ポリマー状ペプチドＡは、ノＣｙｓ被プチドを前述の重炭酸アンモニウム緩衝液 に／−当り！ｒＴｎｔｊの濃度で溶解して作られた。上述したような空気酸化は 、Ｅｌ１ｍａｎ反応によれば遊離のメルカプタンを持たない物質を作った。反応 溶液は酸化後に粒状物質を含まず、凍結乾燥されて、乾燥状態のポリマー状ぜプ チドＡを得た。

ポリマー状ＲゾチドＢは、ポリマー状イプチドＡ及び環状ペプチドと同じ緩衝溶 液中で同じ酸化条件で作った。

しかし、ここでは酸化の間に用いたジＣｙｓ−！！プチドの濃度は、緩衝溶液／ 、　、、２　ｆｆ１１！当り２３．り■であった。酸化反応後にＥｌ１ｍａｎ反 応によれば遊離のメルカプタンはなく、シかし少量の沈澱物が反応混合物中に観 察された。この反応混合物を凍結乾燥して、沈澱物を含むポリマー状硬プチドＢ を回収した。

上述で作った乾燥固体（環状ペプチド及びポリマー状被ゾチドＡ及びＢ）の各々 は、更に精製することなく用いられた。ワクチンはこれら乾燥固体がら、−接種 当り１０θマイクログラムのペプチドを与えるのに十分な濃度に完全フロイント 補剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）中にそれを懸 濁して作られた。

■　免疫化 Ａ　接種 ここで用いるワクチンは、表示した量の４ゾチドを単独で、直鎖状又は環状で、 酸化されたシスティン残基（シスチン）を介して結合された個々のＲ７″チドの ポリマーとして、又は担体に結合された形で含んだ。ペプチドの表示量は、担体 が用いられる場合には担体重量を除いたペプチドの重量を云う。

ワクチンは寸た、生理学的に許容できる希釈剤たとえば水又は食塩水を含み、ま た典型的には補剤をさらに含んだ。完全フロイント補剤（ＣＦＡ）及び不完全フ ロイント補剤（ｌ　ＦＡ）は業界で良く知られた物質であり、いくつかの供給源 から市販されている。植物が作ったグリコシドであるサポニンもまた、Ｂｅｒｇ ｈａｕｓｅｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　（オハイオ州、シンンナテイ 市）からり％固形分溶液として市販されている周知の補剤であり、本発明では水 酸化アルミニウムと共に用いた。

ワクチン貯蔵溶液が、ＩＦＡ又はＣＦＡを用いて下記のよってして作ったニー接 種当りの望む一！！ゾチド量を与えるのに十分な合成ペプチド、ポリマー状４ゾ チド又は補剤の量を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）Ｋ溶解した。

次に同体積のＣＦＡ又はＩＦＡをペプチド溶液と混合して、ペプチド、水及び補 剤を含む、水：油の比が／：／であるワクチンを作った。混合物を次に均一化し て、ワクチン貯蔵溶液を作った。

ワクチン貯蔵溶液が、サポニン−水酸化アルミニウムを用いて下記のようにして 作られた：水酸化アルミニウムを／−当り７０■の量で、塩化ナトリウムｏ、　 ｇｓ％　水溶液に懸濁した。訳］に希釈後に一接種幽り望むペプチド量を与える に十分な合成ペプチド、ポリマー状被プチド又は補剤の量を、水酸化アルミニウ ム懸濁物と混合し、２〜３時間水酸化アルミニウム粒子上に吸着させる。

このように作られた懸濁物／部を次に、予め希釈したサポニン溶液７部で希釈し て、サポニンを０．　／、２３重量係含むワクチン貯蔵溶液とした。

先て引用したＢｉｔｔｌｅら、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９ｇ　：　３０〜．３３＜ ７９ｇ２年７月）に述べられるような酵素を結合した免疫吸着剤評価（ＥＬ　Ｉ 　ＳＡ　：　ｅｎｚｙｍｅ　−ｌ　１ｎｋｅｃｌ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ　）によって、予備的なスクリーニング評価を行った。そこではＱｆ チド−アンチにフ０チド抗体免疫反応が測定された。

誘起された抗体と生きているビールス粒子の間の免疫反応によるビールス不活性 化を測定するビールス中和指数測定もまた、Ｂｉｔｔｌｅらの記載のように行わ れた。

本発明において用いられた方法及び得られるＦＭＤＶの研究に関する結果のより 以上の詳細１ｄ３ｉｔｔｌｅらの文献に記載されている。

Ｂ、％定のＦＭＤビールスに類似する啄プチドに対する抗体 ＦＭＤＶタイ７６０、サブタイプ／、２トレイ７　ＫａｕｆｂｅｕｒｅｎのＶＰ 工の種々の（プチド領域に対する反応を表／に示す。これらのデータは、慣用の やり方でラビノ）Ｋおける抗体反応をまとめたものであり、免疫化に用いられた ペプチドのアミノ酸配列【類似するアミノ酸配列を含むＦＭＤビールスの中和を 示す。（やり方の例の詳細は、Ｌｅｒｎｅｒら、米国特許出願５ｆ３ｒｉａｌ　 ｌａ　２’１ｇ、’　Ｏ１９゜７９ｇ／年ｓ月２７日出願及び前出のＢｔｔｔｌ ｅらを参照）表　／ 個々のラビットにおける種々のペプチドに対する抗体反応／’ｌ−３２（０，９ ２ターグ／　疋０．左 （１）数字は、合成ペプチドのアミノ酸残基配列がほぼ対応するところのＯｌｋ 　ＶＰよ　キャブジッドのアミン末端から始まる、アミノ酸残基位置を云う。

（２）　これらのデータを得るために用いた手順の詳細は前出のＢｉｔｔｌｅの 文献を参照。

表／において／’ｌ／〜／６０領域のアミノ酸残基を持つペプチドについての中 和指数は各々３．９及び３．７より犬きく、一方、領域、２００〜．２／３のペ プチドについての指数は各々３−３及び３．３であると見い出されたことが強調 される。指定した／’Ｉ／〜／乙０及び２００〜２／３のアミノ酸残基位置にほ ぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合成ペプチドに両者ともビールスを中和する 。しかし、アミノ酸残基位置／グ／〜／乙０の配列にほぼ対応する本発明の被７ °チドの中和指数は、示した指数より実際に大きかった。中和指数における実際 の差の程度は、後述の表ｑに、ラビットに接種した同じペプチドの別の比較（そ こではより鋭敏な中和終点決定が行われた。）について示されている。

抗原の一回の接種が、中和性抗体を動物において作シ、そしてそれを守るのに有 効であることが確認された。表２は、標準的やり方（前出のＬｅ　ｒｎｅ　ｒら の特許出願及びＢｉｔｔｌｅらの文献参照）で行われたモルモットにおける結果 をまとめたものである。光λは抗原の効果を示し、またＶＰ□蛋白質の７’ｌ／ 〜／乙０領域の極めて驚ろくべき抗原的性質を示す。

約／、！又はそれ以上の中和指数は、動物がビールスに対して保護されたことを 示す。

合成ペプチドの接種による口蹄疫ピ ールヌに対するモルモットの保護 ／グ／−／乙０　．２０　Ａｔ（ＯＨ）３　。１１３／グ２００　．４１（ＯＨ ）３２７　３／、３２０　Ｆｒｅｕｎｄ　ｓ　２　／　／／’１．２００　Ｆｒ ｅｕｎｄ’　ｓ’　＞　３．．３　’ｌ／’１２００−２／３　２θ　Ａｔ（Ｏ Ｈ）３／、／　／／３．２０θ　Ａｔ　（ＯＨ）　３０．７　．２／ｌＩコθ　 Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ’　／、／　０／’１２００　Ｆ　ｒｅｕｎｄ　’　ｓ’　 ０．３　０／’１（１）　表／の脚注参照 （２）７匹の動物からの血清をまとめたものの中和活性。前出のＢｉｔｔｌｅら の文献参照 （３）保護された動物数／実験した動物数（４）完全フロイント補剤 上述のデータは、○１ｋＶＰ□キャブ／ノドのアミノ酸残基位置／グ／〜／乙０ のアミノ酸配列を持つ特に好ましい波プチドは、このキャッジノド蛋白質のため の抗原活性を持つ旨を前出のＳｔｒｏｈｍａｉｅｒらにより予言された位置／ダ 乙〜／、１０ぜゾチドのどちら側のアミノ酸残基をも含むことを示す。また、位 置／’ｌ／〜／乙０ｇ）０１ｋ　配列を持つペプチドは、前出のｓｔｒｏｍａ： ｅｒ　らにより不活性な非誘起性のペプチドであると予言されたアミノ酸残基配 列（／弘／〜／９５．及び／Ｓ汐〜／乙０）を含む。

上述の表／及びスの結果は、アミノ酸残基配列のどこに中和性抗体があり、どこ では生じないかて関するＳｔｒｏｈｍａｉｅｒらの予言が正しくないことを示し ている。後記の表３において、０１ｋＶＰ□の位置／ｌｌ／〜／乙０のアミノ酸 残基配列を持つ本発明の特に好寸しいＲプチドを、Ｏｌｋ　ＶＰ□の位置／１〜 ／−＜−３の配７ｉ１Ｊを持つＳｔｒｏｈｍａｉｅｒらのペプチドと比べた結果 は、本発明の４ゾチドがＳｔ　ｒｏｈｍａｉｅｒ　らが予言したペプチドよりも 、中和性抗体製造において約／、　０００〜約ｉｏｏ、　ｏｏｏ倍活性であるこ とを示している。この結果の平均値はまた、Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒらのペプチド は寄主動物を守るのに十分量の抗体の製造を誘起せず（／、／〜／、５の中和指 数）、一方、本発明のペプチドは大量の保護性抗体を与える（１１．３〜ニア又 はそれ以上の中和指数）ことを示している。

表　３ 個々のラビットにおける種々のペプチドに対する抗体反応１／ｌｌ／−／Ａθ　 ０　〉９．３　２７Ｃ／グ／−／乙０’　０　３．３　＞ダ、３（２）抗体反応 及びビールス中和手順は表／の記載と同様に実施。

（２）表／の脚注１参照 （３）そのアミノ酸残基配位が抗原４ゾチド製造のために用いられ、それに対し て中和が測定されるビールスの血清タイプ。

（４）担体と結合するＣｙｓ残基は、他のペプチドのようにカルボキシル末端に ではなくアミン末端にある。

（５）血清タイプＡ１サブタイプ１０、ストレイン乙／ＦＭＤＶ。

（６）前出のＳｔ　ｒｏｈｍａ　ｉ　ｅ　ｒらにより活性であると予言されたア ミノ酸残基領域。

上の表のデータはまた、Ｏｌｋ　ＶＰ工の位置／３０〜／乙／の配列を持つ３２ 個のアミノ酸ペプチドは中和性抗体を作るにおいて不活性であることを示してい る。ＣＩ’ｌ／〜／乙０　と表示したＫＬＨ−ペプチド抗原に関するデータは、 中和性抗体製造は、そのベグチド末端が担体に結合されている一！！グチドの機 能ではないことを示している。

Ｃ０抗原−２７″チドと異種ＦＭＤビールスとの交叉反応性 本発明の抗原ペプチドは、前述したように単一特異性である。しかしこのペプチ ドはまた、そのアミノ酸配列が所与のペプチドの特定のアミン配列とは異種であ る（　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　）ところのビールス血清タイプと種々の量の 交叉反応性（ｃｒｏｓｓ　−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　）　を持つ。すなわち、こ のペプチドはまた、種々の程度に長詩異性でもある。

下記の表グのデータは、各配列について二匹のラビットを免疫化するために用い られた０１ｋＶＰ工の、各々／ダ／〜／乙０及び２００〜２／３のアミノ酸位置 の配列を持つ抗原ペプチド複合体に対する、生じた抗体の交叉反応性を示す。中 和指数は、同種ビールス（Ｏｌｋ）及び異種のタイ７’Ａ及びＣビールスに対し て測定された。これらのデータは、合成抗原ペプチドの接種によシ作られた血清 の血清タイプ特異性が、全ビールスに対する血清において見られるそれとよく似 ていることを示す。交叉中和は、第１図に示されるような異る血清タイプの間の 配列の類似性を反影していると考えられる。

ＦＭＤビールスに対する中和指数（１０Ｂ□。）１／’Ｉ／−／ＡＯグ、　３　 −０．　／　／、　／／’ｌ／−／ＡＯ５乙、、、？　／、９　２．３２０θ− ２／３　ユ９　−０．７　／、りＪＯ−コ／３　３．３　０．３　／、　５（１ ）　ビールス中和の手順は表／の記載と同じ（２）　Ｔ＋ｔｐｔｎｇｅｎ　タイ プ０、サブタイプ／、ストレインＫａｕｆｂｕｅｒｅｎ （３）　タイプＣ１サブタイゾ３、ストレイン１ｎｃＩａｉａｌ（４）　タイプ Ｃ１サブタイゾ１０、ストン４フ６フ表１１はまた、そのアミノ酸残基配列が各 々０１にの位置／１１．／〜／乙０及び２００〜２／３　にほぼ対応する合成ペ プチド間の、０１ｋに対する中和指数の大きな差違を示している。

すなわち、上の表のデータにおいて、そのアミノ酸残基配列がＯｌｋの位置、２ ００〜２／３にほぼ対応し、前出のＳｔ　ｒｏｈｍａ　ｉ　ｅ　ｒらによって免 疫的に活性であると予言されたペプチドは、類イυ条件下の同じぜプチドについ て弄／で示したのと同様の中和指数値を与えた。しかし、そのアミノ酸残基配列 が０１にの位置／’ｌ／〜／乙０にほぼ対応する本発明の一！′グチドについて 観察された中和指数は約／〜約３単位高く、これは中和における約７０〜約／、 　０００倍の改善に相当する。

Ｄ　シスチン結合されたペプチドからの抗体三種のシスチン結合されたペプチド （環状ペプチド、ポリマー状にゾチドＡ及びＢ）を含むワクチンの貯蔵溶液を、 前述したように不完全フロイント補剤を用いて作った。これらワクチンは、−接 種当り７００μ？のペプチドの濃度を与える。モルモットにおける一接種の予備 的結果は、三つの総てのワクチンについて約２３〜３．０の中和指数（ｌｏｇよ 。）の範囲を示した。平均中和指数は約２左でアリ、シヌチンジスルフィド結合 されたペプチドの各々はＯｌｋ　Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖに対して寄主を保護することを 示している。

その配列がＯｌｋＦＭＤＶの約／り／〜約／乙０　のアミノ酸残基配列にほぼ対 応するモノマー状非複合体被プチドの典型的中和指数値は、約０．５である。従 ってこの結果は、担体は口蹄疫に対して動物を守るために必要とされないことを 示している。

■　担体及び補剤 Ａ９代替の担体 上述の結果ｍ、ＫＬＨ−ベグチド複合体十生理的に許容できる希釈剤たとえば水 ならびに補剤たとえば完全フロイント補剤（ＣＦＡ）、、不完全７０インド補剤 （ＩＦＡ）及び／又は水酸化アルミニウムの接種を用いて得られた。

にＬＨは動物で用いるのが許容される担体であるが、しかしそれは商業的規模で 用いるためには全く高価である。大豆凝集素、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卯 アルブミン、ビーナツツ凝集素、破傷風トキソイド及びポリ−Ｌ　−ＩＪシンを 含む代替の担体の使用も実験した。

上述の結果が、ペプチドのアミン末端又はカルボキン末端に付加された付加的シ スティン（Ｃｙｓ　）残基を介してにＬＨ分子に抗原硬ノチドを結合することに より得られた。次にＣｙｓ残基は、前出のＢｉｔｔｌｅらの記載のように、にＬ ＨとＮ−７レイミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシコ・・り酸イミドエステル（Ｍ ＢＳ）の反応生成物と反応させられた。下記の結果においては、ＭＢＳとグルタ ルアルデヒドの両者が結合剤として用いられた。グルタルアルデヒドによるＫＬ ）−１及びＢＳＡへの合成橡ゾチドの結合は、Ａｖｒａｍｅａｓ　、　１ｍｍｕ ｎｏｃｈｅｍ’１ｓｔｒｙ　、　乙　：／３−！；２（／ヲ乙９）の一般的方法 に従って行われた。

表りの結果は、０１ｋＦＭＤＶ　ＶＰエキャプシノドのアミノ酸配列を持つ本発 明の＜　７’　／ド（被グツド乙り）ヲＭＢＳを用いて表示の担体に結合するこ とにより得られた。ワクチンは、不完全７０インド補剤で作られた。

７００μ２　の被グチドを与えるのに十分な複合体を含む一接種を、六匹のモル モットの各々に皮下投与した。表示の４プチド抗体力価は、前出のＢｉｔｔｌｅ らのＥＬＩＳＡ法を用いて接種後ｑ週間で得たる個の値の平均である。

種々の担体と結合されたペプチド６夕に対する抗体反応−！！プチド乙汐（担体 なし）３０ ビーナツツ凝集素　３０ 卯アルブミン　ｌｌ。

大豆凝集素　〈１０ 破傷風トキノイド　乙０ 牛血清アルブミン　／３０ 上の結果は、いくつかの担体もまたＫＬＨと同様に活性であシ、一方、牛血清ア ルブミンは優れた抗体力価を与えることを示している。

予備的研究によると、被デチド乙Ｓ及び破傷風トキソイドを結合剤としてのグル タルアルデヒドと共に用いると一接種で極めて良好な抗体反応を与えた。これら 結合反応のために、／、２５−のリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ、。

１））Ｉ　７．．２　）中の、２佐狗のペプチド４Ｓ及びΩ乙■の破傷風トキソ イドを含む溶液を作った。この溶液をゆっくり攪拌しながら、ＰＢＳ中に０．３ ｇ％のグルタルアルデヒドを含む溶液／、乙ゴを加えた。この混合物を室温で約 ／ｇ時間攪拌し、分子量／２θθ０の分割の透析チューブで水に対して透析し、 次に凍結乾燥して１１３ｍｇの乾燥した複合体を得た。

Ｂ、補剤 補剤系もまた、上述のベゾチド乙りを結合した担体を用いてテストした。聚６に 示す結果は、にＬＨとＢＳＡの間の担体を変えることの効果、ＭＢＳとグルタル アルデヒドの間の結合剤を変えることの効果、及び不完全フロイント補剤（ｌ　 ＦＡ）とサポニン−水酸化アルミニウム（表乙ではサポニンと示す）の間の補剤 を変えることの効果を示す。６匹のモルモットの各々に、１００μタ　の被グチ ド乙汐と補剤を含むワクチンをグ週間の間隔を置いて２度皮下接種した。結果は 、４四の動物の平均値であシ、表３の結果と同様にまとめる。

５／ Ｒゾチド乙Ｓに対するモルモットの抗 体反応：担体、結合剤及び補剤の比較１ＫＬＨＭＢＳ　サポニン　２Ｌ？　グ、 ２３．タ　−２夕５　１０２０　１０乙０　ダ００ にＬＨＭＢＳ　ＩＦＡ　３．／　３．汐　２左　−／λ３　１０．２’ｌ　タタ ０　グ３に−’１３０　）１．’ｌＯ／’ｌ夕 ＢＳＡＭＢＳ　ＩＦＡ　−−−− −乙２０　３’ｌＯ／７０ ＫＬＨグルタルアノにビヒド　サポニン　２５　＞’１．７　’１．０　＝５０ 　９乙０５１０り乙　／２ｇθ ＫＬＨグルタルアルデヒド　ＩＦＡ　２ｇ　３．２　／、７　−／２　３に乙　 ／９０　６汐 ＢＳＡ　グルタルアノにピヒド　サポニン　−−ｍ−−７０，２’ｌ　＞ｇｏｏ 　’ＩｇＯ ＢＳＡ　グルタルアルデヒド　ＩＦＡ　〜　−−−−＜１０ｇ／θ （１）　見出しの「免疫化後の時間」の下の各ワクチンの上段のデータは中和指 数（ｌｏｇ□。）値であり、下段のデータはＥＬＩＳＡ法で得たペプチド抗体力 価データである。データは前出のＢｉｔｔｌｅらの記載のようにして得た。

上のデータは、被プチドがグルタルアルデヒドとＭＢＳのいずれで結合されるか 、また担体がにＬＨとＢＳＡのいずれであるかに拘らずに、サポニン−水酸化ア ルミニウムが不完全７０インド補剤（ｌ　ＦＡ）よりも高くかく持続する抗体反 応を与えることを示している。

下記の表７のデータは、上述の方法を用いて、ＫＬＨに結合された一！！ノチド 乙Ｓが二つの補剤系の一方と共にワクチンとして用いられた時の抗体力価反応及 び中和結果を示す。

各ワクチンについてデータの第１行は中和指数（ｌｏｇよ。）値であり、第２行 はＥＬＩＳＡ法で得たにプチド抗体カルモットの抗体反応二二つの補剤の比較ｌ 　ＦＡ　＞１０２グ　１０．２’ｌ　、２．５−４０　／−ざ０Ａｔ（ＯＨ）３ ２００　サポニ７２　〉６．３　＞、３．９　＞３．７　．３．３〉７０２グ　 ９乙０　２’ＩＯ’ＩｇＯ１０００サポニン２　タ、３　＞３．９　＞３．９　 ３．！ｆ；７乙ｇ０　．２グ０　２００　２グ０ （１）前出のＢｉｔｔｌｅらの表／の下に記載のように三つの補剤の系を用いる 投与物中の浸フ０チド量（２）　第０．／ダ及び２７日に皮下接種されるす、１ ＝＝ン−水酸化アルミニウム中の投与のベン０チド量上の結果は、三つの補剤の 系を含むワクチンよりも長期間に亘ってより多い抗体量を与えることを示してい る。

捷り、サポニン−水酸化アルミニウム中で投与された二つの投与の間の少しの差 も判る。

表と及び９のデータは、混血の牛（Ｃａｔｔｌｅ　）と豚において、ぜプチド乙 、ｆｆ−ＫＬＨ複合体（ＭＢＳで結合）とザボニノー水酸化アルミニウムを含む ワクチンの多数回接種に対する反応を示す。

これらの結果は、二つのタイプの動物が、保護されたと考えられるレベル捷で抗 体を作ることにより合成抗原にグチドに反応したことを示す。

各表において、各動物に対するデータの第１行は中和指数（］○ｇよ。）であシ 、第氾行はＥＬＩＳＡ法で得た被プチド抗体力価である。

表　ｇ 被ゾチド、４＆−ＫＬＨ複合体に対する牛の抗体反応１−　＞３／、ＸＩ　＞５ ／、Ｚ＋　’７ｇＯ／、２０　＜１０　９乙０（１）　ワクチンはＭＢＳでにＬ Ｈに結合された被プチド乙左より成り、−投与量当り、サポニン−水酸化アルミ ニウム中の、２Ｔｎｇの波プチドを与え、投与は第０，３及び２６週に皮下投与 された。

被グチド乙５−ＫＬＨ複合体に対する豚の抗体反応１／ＡＯ／、２０　’ＩｇＯ ／２０　ｇｏ、２　／、Ｓ　２３　−　−　− ２１１．０．２グ０　ダｇ０　３０　１０（１）　ワクチンはＭＢＳでＫＬＨに 結合された梗グチド乙により成り、−投与量当り、す？ニンー水酸化アルミニウ ム中の／　ｍｑの被ゾチドを与え、第０゜３、及びコ乙週に皮下投与された。

牛についての表どの上述の結果ハ、４７月の効能促進剤接種が中和性抗体のメモ ＩＪ　−Ｂ細胞製造を起こすという既往性反応を示している。

次に、一般的意味において本発明の一局面は、従来のワクチンの免疫化効果の総 てを持ち、しかし競争的又（ｄ相互関連的な免疫的副作用を全く持たないＦＭＤ ワクチンの製造法である。

本発明の合成抗原被ゾチドによる接種に関する上述の結果は、各データ群につい て唯一っの配列の被プチドを用いて実施された。表３のデータは、ある程度の交 叉反応性及び多特異性が観察されたことを示している。

本発明の別の態様において、同じ属内のビールスの少くとも一つの異るストレイ ンに対して又は同じ属内の異る複数の血清タイプ又はストレインに対して各々単 一特異的である本発明の４プチドの多数を用いる接種により交叉反応性及び多特 異性が得られる。すなわち、そのアミノ酸残基配列がタイプＯ１ｋ及びタイプＡ １サブタイプ／θ、ストレイン乙／　ＣＡ１０．ＡＩ）の両者のアミノ酸残基位 置約／’ｌ／〜約／乙０てほぼ対応する本発明の被プチドを含むワクチンを用い る接種は、タイプＯ１ｋ及びＡ１０．ＡＩの両者に対する保護を与える。

同様に、以下で説明するポリマー状被プチドたとえばポリマー状啄ゾチドＡ及び Ｂは、その繰返し単位がほぼ等量で存在し、０１ｋ及びＡ１０．ＡＩの各々の約 ／’Ｉ／〜約／乙０　のアミノ酸残基位置にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持 つところのコポリマー状被プチドとして作られることができる。

■、ボＩＪ　、ｔ−ビールスに関係する合成Ｓ７’チド約２θ個のアミノ酸残基 を含む合成波ゾチドのいくつかが作られた。これらの配列の四つは、約乙／〜約 ｇ０及び約１ｇ２〜約２０７のアミノ酸位置の領域においてタイプ／Ｉｖ１ａｈ Ｏｎｅｙ及び５ａｂｉｎ　ポリオビールス及びタイプ３　Ｌｅｏｎ　ビールスの ＶＰ□キャゾシソド蛋白質のアミノ酸配列にほぼ対応する。タイプ／ポリオビー ルスのＭａｈｏｎｅｙとＳａｂ　ｌ　ｎ　のストレインのＶＰエアミノ酸残基配 列は、上述の領域で同じである。

この四つの合成ペプチドの配列を第２図に示す。この四つの配列は以下では、左 から右へかつアミン末端からカル？キシ末端の方向に下記のようにＰＰ／及びＰ Ｐ２と表記される本発明の二つの合成イノチド配列として記載される： ＰＰ／　：　ＶａｌＧｌｎＴｈｒＡｒｇＨｉｓＶａｌＶａｌＧｌｎＨｉｓ（Ａｒ ｇ）ＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒ（Ｔｈｒ）　ｌ　１ｅＧｌｕ ｓｅｒＰｈｅ、及びＰＰ、２　：　ＳｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌ ｙＴｈｒ（Ａｌａ）ＡｌａＰｒｏＡｌａＡｒｇｌｌｅｓｅｒＶａｌＰｒｏＴｙｒ ＶａｌＧｌｙｌｌｅ（Ｌｅｕ）ここで上述の配列の各々におけるカッコ付きのア ミノ酸残基は各々独立に、カッコの直属の隣接するアミノ酸残基すなわちアミノ 末端により近いアミノ酸残基と代ることができる。対比の目的のために、ＰＰ／ アミノ酸残基配列は（以下で定義するように）、ポリオタイプ／及び３ＶＰ□キ ヤｆ／ノドの約乙／〜約ｇｏの位置のアミノ酸残基配列にほぼ対応すると見られ ることができ、一方、ＰＰ２アミノ酸残基配列はポリオビールスタイプ／及び３ のＶＰエキヤシジッドの約／ｇ、２〜約２０７の位置のアミノ酸残基配列にほぼ 対応する。

上述のＰＰ／及びＰＰ、２アミノ酸残基配列の各々は、本発明の少くとも四つの ペプチドを表す。各領域の四つの合成ペプチドは、下記のアミノ酸配列を持ち、 上記の順に各々ＰＰ／ａＸＰＰ／ｂ、ＰＰ／ｃ、ＰＰ／ｄ　、ならびにＰＰ、２ ａ、　ＰＰ、２ｂ、　ＰＰ、２ｃ及びＰＰ２ｄと呼ぶ：Ｐ　Ｐ　／　ａ　：　Ｖ ａｌＧＩｎＴｈｒＡｒｇＨｉｓＶａｌＶａｌＧｌｎＨｉｓＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳ ｅｒＧＩｕＳｅｒＳｅｒ、ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅＰ　Ｐ　／　ｂ　：　Ｖ ａ　ｌＧＩｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ｌＶａ　ＩＧ　ｌ　ｎＡｒｇＡｒｇＳ ｅｒＡｒｇＳｅｒＧ　１ｕＳｅｒＳｅｒ　ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅＰ　Ｐ　 ／　ｃ　：　Ｖａ　ＩＧ　ｌｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ｌＶａ　１ＧｌｎＨ ｉ　ｓＡｒｇｓｅｒＡｒｇｓｅｒＧｌ　ｕＳｅｒＴｈｒ　ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒ ＰｈｅＰ　Ｐ　／　ｄ　：　Ｖａ　ＩＧＩ　ｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ＩＶ ａ　ＩＧ　ｌ　ｎＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌ　ｕＳｅｒＴｈｒ　ｌ　 １ｅＧｌｕｓｅｒＰｈ’ｅＰ　Ｐ　２　ａ　：　Ｓｅｒ　ｌ　１ｅＰｈｅＴｙｒ ＴｈｒＴｙｒＧｌｙＴｈｒＡｌ　ａＰｒｏＡｌ　ａＡｒｇｌ　ｌ　ｅＳｅｒＶａ ｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙｌｌｅＰ　Ｐ　２　ｂ　：　Ｓｅｒ　ｌ　１ｅＰｈ ｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌ　ｙＡｌ　ａＡｌ　ａＰｒｏＡｌ　ａＡｒｇ　ｌ　ｌ 　ｅＳｅｒＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙｌ　ｌｅＰ　Ｐ　２　ｃ　：　Ｓｅ ｒ　ｌ　ｌ　ｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧ　ｌ　ｙＴｈｒＡ　ｌ　ａＰｒｏＡ ｌ　ａＡｒｇ　ｌ　１ｅｓｅｒＶａ　１ＰｒｏＴｙｒＶａ　ＩＧＩ　ｙＬｅｕＰ 　Ｐ２　ｄ　：　Ｓｅｒ　ｌ　ｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙＡｌａＡｌ ａＰｒｏＡｌａＡｒｇｌ　１ｅｓｅｒＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙＬｅｕ■ 、実験手順及び接種 ＦＭＤＶ関連ペプチドに対して前述し、またＢｉｔｔｌｅらにより開示された手 順に従って、第２図の四つの合成ペプチドの各々を合成し、またポリオタイプ／ ＶＰ□キャブンノドの追加的位置に対応するいくつかの追加的ペプチドを合成し た。先に述べた手順に従って、ＭＢＳにより担体としてのＫＬＨに結合して複合 体を形成するためにカルボキン末端Ｃｙｓ残基が付加された。その配列がタイプ ／キャブジッド蛋白質に対応する複合体を、前述のＢｉｔｔｌｅ　らの表／の下 に記載される一投与当りのペプチド量及び三投与−三補剤系を用いてワクチンと した。ラビットを、接種される寄主動物として用いた。

加え屹しブ／ポリオビールスによる感染に対して保護された単層細胞培養物を含 む５０係の静止状続の培養物管を与えるであろう抗体血清希釈度を測定すること によって、効力測定を行った。Ｂ５Ｃ−／細胞が、５％胎児牛血清中のし一７５ 媒体で生長された。

培養細胞単層が形成された後に、この管に生きているＳａｂ　ｉｎタイプ／ポリ オビールス粒子及び接種したラビットからの抗血清の所定量を接種した。接種さ れた培養細胞は次に、その後コルｇ日間適当な制御手段を用いて試験された。

ポリオビールス粒子は、−投与量が、各測定シリーズを行う前に測定されたとこ ろの、同様に単層培養された細胞を感染して５０％殺すのに十分な量（ＴＣＩＤ ５ｏ）であるところの組織培養感染投与量（ＴＣＩＤ：ｔｉｓｓｎｅ　ｃｕｌｔ ｕｒｅ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｄｏｓａｇｅ　）の倍数として接種された。これ らの測定のための最小ＴＣＩＤ５０はＳｏである。すなわちポリオビールス粒子 のＴＣＩＤ５０のｓθ倍が接種のために用いられた。慣用のやり方で抗血清力価 を得るために、ｌ：ｇ、ｉ：ｉ６、ｌ二３２、ｌ：乙ユ、／：７２ｇ及び／：２ Ｓ乙の血清希釈度で、ＳＯ１／θ０．９００及び１０ＯＯＴＣＩＤ　の倍数を用 いた。

少くとも四つの単層培養物含有する管゛を、各血清−ビールス希釈ごとに用いた 。前述した接種スケジュールに従って、−又は二匹のラビットに種々の担体結合 ペプチドを接種した。この測定結果を下の表１０に示す。

培養細胞における種々のペプチドからのポリオタイプ／の抗体中和力価 ｂｉ−ｇｏ　ｑｇ　、２’７　ｉｇ ／ｇ２−２０／　ダ０．３コ、２７．２Ｓ／３．６２０／／、／３２０２−．２ ．２２ ２’ｌ’１−２１．、’ｌ　／３、−−ｍ−、−一一一、−一一一、−２６５− ２ｇ５　−− ユｇろ一３０／　／６、／３１０．ｇ　−１−一−−２−（１）数字は、合成ペ プチドのアミノ酸残基配列がほぼそれに対応するところの、Ｍａｈｏｎｅｙタイ プ／ＶＰ□キャブジッドのアミン末端からのアミノ酸残基位置を云う。

（（２）力価は、各ＴＣＩＤ倍数のために５０条保護を与えるのに必要な血清希 釈度として与えられる。従ってどの力価は、血清の７〜ｇの希釈度が必要な保護 を与えることを意味する。

（３）　この表におけるダッシュの存在は、力価が／：ｇより小さいことを示す 。二つの力価が示されているのは、表示したペプチドを含むワクチンで二匹のラ ビットが接種されたことを示す。

上の表は、ポリオタイプ／ＶＰキャブジッドに二つの抗原決定因子領域があるこ とを示す。この決定因子領域は、各々約ろ／〜約ｇ０、約１ｇ２〜約、２０／の アミノ酸残基位置にある。またこのデータは、位置約１ｇ２〜約２０／にほぼ対 応するペプチドが他のペプチドよりも、高いビールス濃度において保護を与えた ことを示している。

■、ピコルナビールスに関連する合成ペプチドＦＭＤＶ及びポリオビールス抗原 キャブンツド蛋白質についての上述の結果は、二つの特定の属、ＦＭＤＶ及びポ リオビールのみでなく一般にピコルナビールス科に関するより巾広い発明の二つ の特別の態様を示している。

このより巾広い発明は、その抗原キャブ／ノド蛋白質のアミン末端からアミノ酸 残基配列長の約６０〜約７Ｓ％で見られるところの抗原ピコノシナビールスキャ ブ／ソド蛋白質領域にアミノ酸残基配列が少くとも対応するところの約、２．０ 個のアミノ酸残基配列を各々含む合成抗原ペプチドに、関する。この合成ペプチ ドは、末端カルボキシル基又はα−アミン基に起因する電荷を除き、生理的ｐＨ 値におい℃中性又はより好ましくは正の正味のイオン電荷を持つ。正味の中性又 は正の電荷の存在は、生理的ｐＨ値における電気泳動測定、又はアミノ酸残基配 列の決定と個々のアミノ酸残基のｐＫａ値の知見から容易に決定できる。

上述の合成ペプチドは、単独で、ポリマー（ペプチド単位は酸化したンスティ／ 残基により互に結合される）として、又は担体に結合されて複合体として、生理 的に許容できる希釈剤たとえば水又は補剤と共にワクチンを作るために使用する ことができ、該ワクチンは寄主に有効量で導入されると、該ペプチドがそのキャ プンノド蛋白配列に対応又はほぼ対応するところのピコルナビールスと反応して 、との寄主をこのピコルナビールスから守る抗体の製造を誘起することができる 。この合成ペプチドは、単独で、ポリマーとして又は複合体として、その配列が Ｆ　Ｍ　Ｄ　Ｖ　ＶＰＩキャブジッドのアミン末端から約／３０〜約／６０の位 置のアミノ酸残基配列に対応又はほぼ対応するところの、約、２０個のアミノ酸 残基を含むペプチドのために上述したように又は後述するように使用できる。

抗原性ピコルナビールスキャプンノドの活性な、抗体を誘起する領域を調べるに おいて、それに対して中和性抗体が生じるであろうＦＭＤＶ　ＶＰＩの一つの決 定因子領域は該キャブ７ソドのアミン末端から約７３０〜約／乙θのアミノ酸残 基位置に対応することに留意すべきである、このＶＰ１キャブジットは、引用蛋 白質として０１にビールスＰｌを用いると、アミン末端からカルボキシル基端ま で合計約２７３個のアミノ酸残基を含む。

すなわち、中和性抗体決定因子が始まるところの蛋白質領域は、アミン末端から その蛋白質のアミノ酸残基配列を下って約６０係（／３０／；ｌ／ＥＸ１００％ ＝６７係）Ｋ位置する。この中和性抗体製造決定因子領域は、アミン末端からア ミノ酸残基配列の約り５係に轟る約／ろ０のアミノ酸残基位置で終る。ＦＭＤＶ 　ＶＰｌ　キャブ／ノドの約／り／〜約／乙０のアミノ酸残基位置にほぼ対応す るより好ましいペプチドについては、この中和性抗体製造決定因子領域は、アミ ノ酸残基全配列の約ろ乙〜約９５％に自る、アミン末端からの距離に存在する領 域内にある。

上述のタイプ／ポリオビーフしのデータを検討すると、その配列がアミン末端か ら約／ｇ、２〜約２０７のキャブンノドアミノ酸残基位置の領域にほぼ対応する ペプチドを含む複合体がこのビールスに対する中和性抗体の主な製造者である。

これにより合成ペプチドは、タイプ／ポリオビールスの中和性抗体製造決定因子 領域を区画する。

タイプ／ポリオビールスの抗原キャブ／ノドは、その配列中に合計３０．２個の アミノ酸残基を含む。従ってりイブ／ポリオビールスの中和性抗体製造決定因子 は、前述のように計算すると、アミン末端からその抗原キャツ。

／ラドのアミノ酸残基配列の約６０〜約６６チの領域に位１する。

第１図及び第２図のアミノ酸残基配列及び容易に入手できる適当なｐＫａデータ を検討すると、生理的ｐＨ値で正のイオン電荷を持つ、各配列内の残基（Ａｒｇ Ｘ１ｙ５及びＨｉｓ　ｌの数は、一つの配列を除く他の総ての配列において、そ のｐＨ値で負の電荷を持つ残基（ＡＳＤ及びＧｌｕ　）の数を上回る。この一つ の配列、ＦＭＤＶタイプＡ１サフ゛タイプｌＯ、ストレインＡＩ　（Ａ１０．６ ／）の配列は中性のイオン電荷を持つ。しかし、約ｉｑｉ〜約ｌ乙Ｏのアミノ酸 残基位置にほぼ対応するＡ１０キヤブジツドの特に好ましい領域は正味の正の電 荷を持つことに留意しなければならない。

本発明の合成抗原ペプチドは典型的には、末端アミン及び／又はカルボキシル基 により生じるイオン電荷を除いて、正味で中性又は正の電荷を持つ。好ましくは これらペプチドは、正味で正のイオン電荷を持つ。このようなペプチドはまた、 好ましくは水溶性である。しかし、合成抗原ペプチド上の正味で中性ないし正の 電荷は、ペプチドの抗原性にとって、このペプチドのアミノ酸残基配列がアミン 末端からその配列長の約６０〜７５％の間に存在する抗原中和性抗体誘起キャブ ジッドとも対応するという事実はどは重要でないことは明らかである。

■．診断 本発明の方法は、検出されるべき生体に対する抗体を持つこと、又は検出される べき生体上の決定因子をまねた合成抗原を持つことが必要な診断テストたとえば 免疫テストの準備において用いることができる。そのような診断法は、たとえば 酵素免疫テスト、放射免疫テスト、螢光免疫テスト、及び抗体又は抗原が成る検 知しつるしるしを付される他の方法を包含する。

たとえば、Ｖｏ　ｌ　ｌ　ｅｒ　ら、’Ｅｎｚｙｍｅ　ｌｒｎｍｕｎｅ　Ａｓｓ ａｙｓ　ｉｎＨｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　、　Ｖｏｌｕｍｅ　Ｓ 　３、ｐｐ．５５−６５（／ｑ）６）に概説される二重抗体法を用いて、ＥＬＩ ＳＡテストが診断テストの調製において使用できる。

二重抗体ＥＬＩＳＡ法は、上述の抗ペプチド抗体力価データ及び前出のＢｉｔｔ ｌｅ　らの表／のデータを得るにおいて使用された。このＥＬＩＳＡ法の詳細は 、前出のＢｉｔｔｌｅ　らの表／の下に記載されている。

ピコルナビールス抗原の存在をテストするための本発明の斬新系は、生理的に活 性な形で存在する本発明のペプチドに対して生じた抗体、及び免疫反応の存在を 指示する手段を含む。抗体は、血清、尿又は組織抽出物のような体成分と混合さ れて、ピコルナビールス抗原と免疫反応して免疫反応物を形成し、そして指示手 段がこの免疫反応を知らせる。

たとえば体成分がＥＬＩＳＡテストのくぼみ部分（ｗｅ　ｌ　ｌ　Ｉでコーティ ングされ、本発明の抗体たとえばラビットで生じたものを接種され、以下公知法 を追打する。何らかの免疫反応しなかった抗体をすすぎ去った後に、第１のタイ プの抗体に対して生じた、酵素を結合されｆｃ第二の抗体たとえばアルカリフォ スファターゼを結合して含むやぎ一抗ラビット抗体を混合し、そしてＥＬＩＳＡ ＜＃Ｙみに接種する。第２の抗体の過剰分をすすぐと、本発明の抗体に結合され た、フォスファターゼを結合したやぎー抗ラビット抗体がＥＬＩＳＡ＜ぼみ内に 残る。続いて酵素培養基たとえばｐ−ニトロフェニルホスファートを混合すると 、免疫反応物が形成されたことを示す、従ってピコルナビールス抗原が体成分中 に存在したことを示す信号が得られる。

放射性元素たとえば　１２５１を、接種手段を与えるために本発明の抗体に結合 することができる。ここではたとえば、体成分は試料管内で予めコーティングさ れ、次に放射性抗体を接種され、過剰の抗体を管からすすぎ出す。

すすいだ後に管に残った放射性が、免疫反応物が形成されたことのしるしとなる 。

本発明の別の態様は、先述したような体成分中のピコルナビールス抗原の存在を テストする診断系を考慮している。この系は、競合評価において特に有用でおり 、第一の反応物と第二の反応物とを別々の容器に入れて含む。

第一の反応物は、生理的に活性な形の本発明の合成抗原ペプチドを含む。第二の 反応物は、ペプチドに対して生じたような、合成ペプチドと免疫反応する生理的 に活性な形の抗体を含む。後述のようなペプチドと抗体の間の免疫反応の存在を 指示する手段は、別々の容器の一方に、たとえばホスファターゼを結合したやぎ 一抗ラビット抗体及びその培養基中に、又は放射性元素が抗体に結合されてｂる 抗体と共に含まれる。

テストされるべき体成分の所定量の存在下に第１と第λの反応物の所定量を混合 すると、指示手段により知らされる量の免疫反応を生じる。この免疫反応の量は 、体成分中にピコルナビールス抗原があると免疫反応の既知量と異る。

実際には体成分は抗体を予め接種され、この成分は次にＥＬＩＳＡ＜ぼみの壁に 結合されているペプチドを接種される。抗体−ピコルナビールス抗原複合体を除 くためにくぼみをすすぐと、ペプチドと抗体の免疫反応物が残り、この存在と量 は指示手段で検出される。

すぐ上で説明した競合テストのような多くの診断系にオイては、全体の完全な、 生理的活性抗体を用いることは必要ない。むしろ、抗体分子の生理的に活性な遺 伝型を含む、抗原を結合する認識部分のみが必要であろう。

遺伝型を含む抗体部分の例は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２として知られるもので あり、これらは典型的な抗体全体に対する周知の酵素反応により作られる。

全体の完全な抗体、Ｆａｂ　、Ｆｆａｂ’）２部分及び抗体の遺伏型を含む部分 は、本明細書で「遺伝型含有ポリアミドＪと呼ぶ。「遺伝型含有ポリアミド」と いう言葉は請求の範囲で使用されており、診断用製品又は方法で有用な分子の群 を包括する。しかし、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２抗体部分が診断法又は診断用製 品の遺伝型含有ポリアミドとして使用できるが、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ′）部分の 製造がもし追加的反応及び血清の精製を必要とするならばその故にのみ、全体の 完全な抗体の使用が通常好ましい。

■、方法及び従来技術 本発明に独特の方法及び物質は、考慮下にある特定の手ＩＩηを引用しながら説 明される。しかし一般に、用いられる実験室技法、方法及び物質は、分子生物学 及び生理学で一般に用いられるものである。

興味ある一般的物質及び技法についての参照のために特に、ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｉ Ｎ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　、　Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　、　Ｓ、　Ｐ、及びＫａｏ ｌａｎ　、Ｎ、Ｏ，、Ｅｄｉｔｏｒｓ　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　、　ＨＡＮＤＢＯＯにＯ Ｆ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤＰｒｅｓｓ　、　Ｎ、Ｙ、、　Ｎ、Ｙ、 を引用しておく。

下記の文献は、従来知られた特定の進歩及び技術、及び現在の技術水準を開示し ている。

文献 ；１．　０ｓｋａｒｓｓｏｎ、　Ｍ、　Ｋ、　、　Ｅｌｄｅｒ、　Ｊ、　Ｈ，、 Ｇａｕｔｓｃｈ、　Ｊ、　Ｗ、　。

３、Ｇａｕｔｓｃｈ、Ｊ、Ｗ、、Ｅｌｄｅｒ、Ｊ、Ｈ，，５ｃｈｉｎｄｌｅｒ、 Ｊ、。

’ｌ　Ｊａｍｊｏｏｎ、Ｇ、Ａ、、Ｎａ５ｏ、Ｒ，Ｂ、ａｎｄＡｒｌｉｎｇｈａ ｕｓ、Ｒ，Ｂ、。

Ｖｉｒｏｌ、りｇ、　／／−３’ｌ（／９り７）３　Ｆａｍｕｌａｒｉ、Ｎ、Ｃ ，、Ｂｕｃｈｈａｇｅｎ、Ｄ、Ｌ、、に１ｅｎｋ、　Ｈ，Ｄ、　、　ａｎｄＦｌ ｅｉｓｓｎｅｒ、　Ｅ、　、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２０．、　、ＳＯ／−３０ ｇ　（／９７４）。

乙　Ｗｉ　ｔ　ｔｅ、　Ｏ，Ｎ、　、　Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ−ＡｃＪｅｙ、　Ａ 、　ａｎｄ　Ｗｅ　ｉ　ｓｓｍａｎ。

’Ｚ　Ｆａｎ、Ｈ，ａｎｄ　Ｖｅｒｍａ、１．〜ｔ、Ｊ、Ｖｉｒｏ１．．２乙、 　ｌｌｂｇ−ｑｑｇｇ　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、、５ｈｉｎｎｉｃｋ、Ｔ 、Ｍ、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ。

Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｖｅｒｍａ、　１．　Ｍ、　、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒ　ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、４４．　ｉ ｎ　ｐｒｅｓｓ（／９７５’）。

９　５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、、５ｈｉｎｎｉｃｋ、Ｔ、ｆｖ’Ｌ、Ｖｅｒ ｍａ、１．Ｍ、ａｎｄＬｅｒｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　１ｎＰｒｅｓｓ（１９ｇ０） 。

／ｌ　Ｐｅｄｅｒｓｏｎ、Ｆ、Ｓ、ａｎｄＨａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、３３゜３ゲタ−，３６Ｓ（／りｇθ）。

／２．　Ａｔ１ａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｇｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、５゜Ｓｕｃ＋Ｊ、Ｍ、Ｏ，Ｄａｙｈｏｆｆ、　ｅｄ、 、　Ｎａｔｌ　、Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｒｅｓ。

Ｆｏｕｎｄ、、ｐｕｄ　、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，（／９７ｇ）。

／３．　Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ、Ｏ，、Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｒ，Ｍ、ａｎｄ　０ｒ ｃｕｔｔ、Ｂ、Ｃ，。

ｐρ・３！；、２．　ｏｐ、ｃ　ｉ　ｔ。

／左　Ｅｌｄｅｒ、Ｊ、Ｈ，、Ｇａｕｔｓｃｈ、Ｊ、Ｗ、、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｆ、 Ｃ，、Ｌｅｒｎｅｒ。

Ｒ，Ａ、、Ｈａｒｌｅｙ、Ｊ、Ｗ、ａｎｄ　Ｒｏｗｅ、Ｗ、Ｐ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、ＳＡ、？＆、１１ｔ６７乙−ｘｉ−ｔ、ｇｏ（ｉｑり ７）。

／Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ、　Ｒ，Ａ、　、　Ｊｅｎｓｅｎ、　Ｆ、　Ｃ，、Ｋｅｎｎ ｅ　Ｉ、　Ｓ、　Ｊ、　、　Ｄｉｘｏｎ。

コθ　Ｌｉｕ、Ｆ、、Ｚｉｎｎｅｃｋｅｒ、Ｍ、、Ｈａｍａｏｋａ、Ｔ、ａｎｄ 　Ｋａｔｚ。

２／　にａｔｚ、Ｄａｖｉｃｌ　Ｈ，、Ｌｌ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、乞／９ １．６６ｇ。

Ｍａｒｃｈ　’ｌ、／９ｇＯ。

２．２．　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、／３４’：、２０／−、２θ３（／９？／） 。

８、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、／３９：　／’ｌ’ｌろ−／’Ｉｆ、、３　（／ ９７４）。

、３１　Ｈｕｍｏｈｒｅｙ、　Ｊ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｈｉ　ｔｅ、　Ｒ，Ｇ、、 　Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒＳｔｕｄｅｎｔｓ　ｂｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 、Ｂｌａｃｋｗｅｌ　ｌ、０ｘｆｏｒｄ（／９７０）。

３＋２　にａｔｚ、Ｄａｖｉｄ　Ｈ，ａｎｄ　Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆ、Ｂａｒｕ ｊ。

３乙　Ｈｏｗａｒｄ、Ｊ、Ｃ，、Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｇ、Ｗ、、Ｇａ　ｌ　ｆ　ｒ ｅ’　、Ｇ、。

３７　Ｈａｒｒｍｅｒ　ｌ　ｉｎｇ、　Ｇ、Ｊ　、、　ＨａｒＴｍｅｒ　ｌ　ｉ ｎｇ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｌｅｍｋｅ、　Ｈ，。

ｌｒｒｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｇ　：　’１３３（／９りｇ）。

３ワ　Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｇ、、＋ｑａｔｕｒ ｅ　、２Ｓｂ：　１１９３１１７　Ｇｅｆｔｅｒ、Ｍ、Ｌ、、Ｍａｒｇｕｌｉｅ ｓ、Ｄ、Ｈ，ａｎｄ　５ｃｈａｒｆｆ、Ｍ、Ｄ、。

ＩＩｓ、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、Ｈｉｌａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、ｌＪ、ｓ、Ｐａｔ ｅｎｔＮｏ、’Ｉ、　／９６．ツ’＞Ｓ、Ａｐｒｉｌ　／９ｇＯ。

’Ｉｌｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ　、２０９．Ｎｏ、’１４１乙３．ｐｐ、／３／９ −１４１３ｇ（９−１４ｌ３’ｏｅｒ／ヲｇθ−ｅｎｔｉｒｅ　ｎｕｍｂｅｒｒ ）。

１１７、Ｄａｖｉｓ、Ｂ、Ｄ、、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｒ，Ｅｉｓｅｎ、Ｈ，Ｎ、 、Ｇ１ｎ５ｂｅｒｔ。

Ｈ−Ｓ−１Ｗｏｏｄ、　Ｗ−Ｂ　、Ｊ　ｒ、＋　ａｎｄ　ＭｃＣａ　ｒ　ｔ　ｙ 　−ＩＶＬ　。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｘｐｅｒｉｒｎｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒ ｅｓｓ、ＮｅｗＰｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ。

５／Ｗｕ、Ｒａｙ（Ｅｄ、　）、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ、５ｉｄｎｅｙ　Ｐ、、　ａ ｎｄ　Ｋａｐｌａｎ。

Ｎａｔｈａｎ○、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｇｅｎｅ ｒａｌｌｙ　ａｎｄＶｏｌ、ろｇ、　’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ″ｉｎ 　ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

３２、　Ｃｏｏｐｅｒ、Ｔｅｒｒａｎｃｅ　Ｇ、、　Ｔｈｅ　Ｔｏｏｌｓ　ｏｆ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｖ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、／９り７゜３３、 ５ｅｌａ、Ｍｉｃｈａｅｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　／ろ乙　／３１．Ｓ−／、３り’ ＆（／９６ｑ）。

Ｗ　Ａｒｎｏｎ、Ｒ，、Ｅｌｃｈａｎａｎ、Ｍ、、５ｅｌａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ａ ｎｆｉｎｓｅｎ。

Ｃ，Ｂ、、Ｒｒｏｃ、Ｎａｔ　１．ハｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ａｇ：　 ／’ＢＯ３１ｙ、　５ｅｌａ、Ｍ、、Ａｒｎｏｎ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｃｈａｉｔｃ ｉｋ、Ｓ、９、υ、Ｓ。

Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　ＩＩ、０７３．／９’ｌ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　２／、　 ／９’７ｇ。

５７　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、、　ａｎｄ　Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，、Ｗ、、Ｕ、Ｓ、、 　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ。

乞コ３り、２２４ｔ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　２．　／９ｇＯ。

３ｇ、Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ，Ａ、、５ｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、、Ｇ、　ａｎｄＳｈ ｉｎｎｉｃｋ、Ｔ、Ｍ。

Ｃｌ９ｇ１）Ｃｅ１１２３：　１０９−／１０゜５９、Ｗｉ　１ｓｏｎ、　ｌ　 、Ａ、、　５ｋｅｈｅ１．　Ｊ、Ｊ−ａｎｄ　Ｗｉ　ｌｅｙ、　Ｄ、Ｃ。

（／９ｇ／ｌ、Ｎａｔｕｒｅ　２ｇｑ：　３６６−３７３゜ｂＯ，５ｕｔｃｌｉ ｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ、、　５ｈｉｎｎｉｃ、に、丁、Ｍ、、　Ｇｒｅｅｎ、　Ｎ、 、　Ｌｉｕ。

６／、にｌｅ　ｉｄ、　Ｄ、Ｇ、、　ＹａｎＳｕｒａ、　Ｏ，、５ｒｎａｌ　Ｉ 、　Ｂ、、、　Ｃｌｏｗｂｅｎｋｏ。

Ｄ、　、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｄ、Ｍ、、　Ｇｒｕｂｍａｎ、Ｍ−Ｊ　、、　Ｍｃｋ ｅｒｃｈｅｒ、　Ｐ　、ｏ　、。

Ｍｏｒｇａｎ、Ｄ、Ｏ，、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、ａ、Ｈ，、Ｂａｃｈｒａｃｈ、 Ｈ，し・。

５ｃｉｅｎｃｅ　２／ＩＩ：　／／、２５−／／、２９（／９．！ｒ／ｌ。

乙、２．　ＣＥＬＬ　ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａ　ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩＶＥ　ＴＲ ＥＡＴＩＳＥ。

Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｐｒｅｓｃｏｔｔ、Ｄ、Ｍ、、Ｅｄｓ、、 ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、／９クク　ｅｔ、ＳｅＱ。

乙３．　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＧＥＮＥ、３ｒｄ 　Ｅｄ、、Ｗａｔｓｏｎ。

ｊ、肌、Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｉａｍｉｎ、Ｉｎｃ、、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ＣＡ　 、／９フク。

乙４ｔ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ 　ＤＮハ“Ｗ、Ｈ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　／’ ？’７ｇ乙３　Ｎｏｆｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｐ、、Ｈｅ１ｎｚ、Ｓ、、Ｋｕｏｏ ｅｒ、Ｈ，Ａ、。

Ｋｅｌ　ｌｅｒ、Ｗ、、ＵＫ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌ　１ｃａｔ　ｉｏｎ　Ｇ Ｂ　、２　０り９　２ｇｇＡ、ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　、２０　Ｊａｎ、１９ｇ２ ゜ろ乙　にｕｐｏｅｒ、Ｈ，、Ｋｅｌ　ｌｅｒ、Ｗ、、Ｋｕｎｚ、Ｃ，、Ｆｏｒ ｓｓ、Ｓ　、。

５ｃｈｏ　ｌ　ｌｅｒ、　Ｈ，、Ｆｒａｎｚｅ、　Ｒ１，Ｓｔｒｏｈｍａ　ｉ　 ｒ、　Ｋ−。

Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、ｏ、Ｉ　Ｚａｓｌｏｖｓｋｙ、Ｖ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｈｏｆ ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ。

Ｐ、Ｈ，、’Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ｍａｉｏｒ　ａｎｔｉｇ ｅｎ　ｏｆ　ｆｏｏｔａｎｄ　ｍｏｕｔｈ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉｒｕｓ　ａｎ ｄ　ｅｘｏｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｅ。

Ｃｏ１１．、”　Ｎａｔｕｒｅ　２ｇ９：　ＥＳＳ−５３９（／９ｇ／）　。

ろ７　ＷａＩ　ｔｅｒ、Ｇ、、５ｃｈｅ　ｉｄｔｍａｎｎ、に、、Ｃａｒｂｏｎ ｅ、Ａ、。

Ｓｃｉ　、１ＪＳＡ　り？：　Ｓ／９’？−３Ｘ）０（１９ｇ０）。

６ｇ　Ｆｒａｃａｓｔｏｒｉｕｓ、Ｈ，ＤｅＣｏｎｔａｑｉｏｎｅ　ｅｔ　Ｃｏ ｎｔａｇｉｏｓｉｓｍｏｒｂｉｓ　ｅｔ　Ｃｕｔａｔｉｏｎｅ、Ｌｉｂｒｉ　ｉ ｉｉ、（１５４’ろ）ろ９．　Ｋｉｎｇ、、Ａ、Ｍ、Ｑ−＋Ｌｌｎｄｅｒｗｏ□ ｄ＋Ｂ○、、ＭｃＣａｈｏｎ、Ｄ、。

９ｇ０（／９ｇ／）。

りθ　Ｃｏｏｐｅｒ、Ｐ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｑｙ　１０ ．　／乙５−１ｇ。

りｌ　Ｗｉ　ｌｄ、Ｔ、Ｆ、、Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ、Ｊ、Ｎ−ａｎｄ　Ｂｒｏｗ ｎ、Ｆ、、Ｊ、Ｇｅｎ、り＋２．　Ｌａｏｏｒｔｅ、Ｊ、、Ｇｒｏｓｃｌａｕｄ ６．Ｊ＋、、Ｗａｎｔｙｇｈｅｍ　Ｊ、、　ａｎｄＲｏｕｚｅ、Ｐ、、Ｃ，ｒ、 ｈｅｂｄ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、５ｅａｎｃ、Ｐａｒ　ｉｓ、、２フろ　。

３３り９−３’ｌＯ／　（／９７．？）。

り３．　Ｂａｃｈｒａｃｈ、Ｈ，Ｌ、、Ｍｏｏｒｅ、Ｄ、Ｍ、、Ｍｃｋｅｒｃｈ ｅｒ、Ｐ、Ｄ、ａｎｄり’Ａ　Ｋａａｄｅｎ、Ｏ，Ｒ，、Ａｄａｍ、に−Ｈ，ａ ｎｄ　Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒ、に、。

Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ　、３’ｌ、３９り一’１００Ｖ９フク）。

’７５　Ｍｅｌｖｅｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ｒｏｗｌａｎｄｓ、　Ｄ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂ ｒｏｗｎ、　Ｆ、。

７７　Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ、Ｊ、Ｃ，、Ｈａｒｒｉｓ、Ｔ、Ｊ、Ｒ，、Ｒｏｗｌ ａｎｄｓ、Ｄ、Ｊ。

ａｎｄ　Ｌｏｗｅ、　Ｐ、Ａ、Ｇｅｎｅ（ｉｎ　ｐｒｅｓｓｌ　。

７ｇ、Ｋｕｒｚ、Ｃ，、Ｆｏｒｓｓ、Ｓ、、Ｋｕｐｏｅｒ、Ｈ，，５ｔｒｏｈｒ ｎａｉｅｒ、Ｋ。

ａｎｄ　５ｃｈａｌｌｅｒ、Ｈ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｑ、 ／９／ｑ−）９．　Ｓｔｒｏｈｍａｉｅｒ、に、、Ｆｒａｎｚｅ、Ｒ，ａｎｄ　 Ａｄａｍ　に−Ｈ，Ｐｒｏｃ　。

５ｔｈ　Ｉｎｔ、ｃｏｎｇｒｅｓｓ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ （／９ｇ／）ｇＯ，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、Ｒ，Ａ、、Ｃｈａｎｇ、Ｗ、Ｃ，ａｎｄ 　Ｌｉ、Ｃ，Ｈ，。

３ろ−グろ（／９り９）。

Ｘ、結論 Ｌｅｒｍｅｒ　らは永年の間ＦＭＤＶについて研究し、そしてその開被らはＦＭ ＤＶのための最適の特定の抗原決定因子ペプチド片を特定したと考えたが、実際 には想定された抗原的活性部分はＦＭＤＶに対する抗体製造を誘起せず、又は少 しのみあるいは実用的でない・よ〜うな低レベルで抗体製造を誘起することを見 い出したにすぎない。

我々は、前述のＳｔｒｏｈｍａｉｅｒ　らが彼らのｖＰＴｈｒ（Ｐ□ＩＦＭＤＶ 血清タイプ０遺伝子の抗原的に活性な部分に関しである推論をしたこと及びＫｌ ｅｉｄらがＶＰ　（ＶＰ工）ＦＭＤ■血清タイプＡ１サブタイプ／２遺伝子のヌ クレオチド配列を決定したことＣ５ｃｉｅｎｃｅ　、　２　／　ＩＩ　：　／　 ／、２５〜／／２ｑ（／９ｇ／　）］に着目し、た。もちろん、ヌクレオチド配 列からどのペプチド部分が抗原性であるかを決めることは不可能であり、とぐに どのペプチド部分がＦＭＤＶビールスのための最適な抗原性を持つかを予言する 、あるいは推測することさえ不可能であった。すでに先に説明したように、Ｓｔ ｒｏｈｍａｉｅｒ　らにより予言された０１ｋＶＰ□　キャブジッドの抗体誘起 性領域は、本発明の比較的長い領域よりもずっと活性が低く、また予言された領 域は、保護を作る抗体を誘起しない領域を包含していたことが判った。

無数のペプチドが合成され、担体たとえばＫＬＨに結合され、得た抗原は動物に 注射された。次に動物からの抗体をＦＭＤＶに攻撃させ、抗体が感染性生体に対 する抗体を誘起するにおいて抗原的に有効であるかどうか音測定した。

約７３０〜約／ろ０のキャブジッド位置の領域にあるそのような比較的小さなペ プチド部分、たとえば約／り／〜約７６０の位置に対応する配列のような約２゜ 個の残基の長さのペプチドが極めて抗原性であるということは、全く予期せぬ発 見であった。もちろん、他により活性な抗原性ヌクレオチド配列がＦＭＤＶ遺伝 子にあるかどうか全決定することは、それの存在を予言すべき理由はないが、不 可能である。この発見に従うＶＰキャブシソドア３０−／６０アミノ酸残酸残基 外らの約２θ個のアミノ酸残基配列は、全く予期せぬことにまた全く驚くべきこ とに、最適であり、たぶん最上であるように見える、−又は二（またはたぶん三 ）個のアミノ酸残基を加え又は取り去って、ＦＭＤＶ単一特異的な合成抗原決定 因子ペプチドを与える。

ワクチンの全く予期できなかった活性及び効力を失うことなしに正確なペプチド 構造からどの程度変更することができる刀−１あるいは抗原のどの決定因子がＦ ＭＤ単一特異性合成抗原決定因子なのかは今のところ判らない　しかし、実験か ら本発明の特徴を失うことなしに（１）ペプチドは少しのアミノ酸単位だけ長く することができる、（２）少くとも／又はコ、たぶんり又は５個までの置換を行 うことができる及び（３）ペプチド配列は僅が、たぶんコ又は３、または７個ま で短縮できることが知られている。このような非本質的変更は原則的に、上述し た概念及び行われた発見からそれることなしに可能であることが知られている。

すなわち、そのような少しの変化は、　□本発明の単なる均等的変化であると見 られるべきである。

我々の結果は、／３０〜／６ｏ領域たとえば／４１／〜／６０領域の約２θ個の アミノ酸残基により構成される合成ペプチドの一回の接種が、ビールスに対して 保護するに十分なビールス中和性抗体を誘起することを明らかに示している。こ のペプチドにより可能な保護は、キャブジッド蛋白質ＶＰよ（これがビールス粒 子の破壊により作られたか又はＥ、ｃｏｌｉ　細胞の絞り出しにより作られたか には無関係に）により免疫化して得られる最良の結果よりも数オーダー良好であ る。実際に、小さな遊離のペプチドは　ビールス粒子中で取る類似のコンフォメ ーションを取ることができ、このことは、それが不適当にたたまれたＶＰ工中で 隣り合うアミノ酸残基により拘束される場合にはたぶんそうはならないことが考 えられる。別の説明としては、ＶＰ工の免疫支配領域がビールス中では埋め込ま れていて、中和のためには不適当であるのかも知れない。

本発明の合成ペプチドの明瞭な利点の一つは、−回の接種により保護的抗体反応 を誘起するその作用である。

−回接種に対するこの良好な反応は、実地における口蹄疫に対する免疫化の成功 はワクチンが一回接種による保護的反応をなすために十分に活性であるかどうか に依存する故に、極めて重要である。実際に、牛及び豚による予備研究によると 、この合成ペプチドはこの動物種をこの疫病に対して保護するに十分な抗体反応 を誘起できる。

工業的適用 本発明の抗原の診断及び治療−の応用、そのワクチン及び抗体製造は、大きな工 業的、経済的価値がある。豚、牛及び人を含む動物は、口蹄疫及びポリオのよう なピコルナビールスが起す病気の猛威から保護されることができ、従って食料の 供給、重要なことには人のための蛋白質の供給が増し、かつ人が工具になる危険 から救うことができる。

上述の説明は本発明を説明するものであって、限定するものではない。数値的変 化、修正＋ｄ、本発明の新規な概念及び真の精神から離れることなく可能である 。本明細書で例示した特定のペプチド、抗体、その組成及び使用に関して、いか なる限定も意図するものではなく、また推論されるべきでもないことを理解すべ きである。本発明は、後記の請求の範囲により定義される。

第１図 ４ｆｌｉ！１３０〜１６０＋＝＃＋４６８ｍｎＦＭＤＶ　ＶＰ１＃ｖ）”Ｊ−ｙ ドＳａＷのγミノ凸（ダ咲城酋乙ラリ １３０　１４０ ０１ｋ　ＴｙｒＡｓｎＧＩｙＧＩｕＣｙｓＡｒｇＴｙｒＡｓｎＡｒｇＡｓｎＡｌ ａＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕｏｌｃ　ＴｙｒＡｓｎＧＩｙＧＩｕＣｙｓＡｒｇＴ ｙｒＳｅｒＡｒｇＡｓｎＡｌａＶａｌＰｒｏＡｓｎＶａｌＡｌｏ　ＴｙｒＡｓｐ ＧＩｙＴｈｒＡｓｎＬｙｓＴｙｒＳｅｒＡｌａＳｅｒＡｓｐＳｅｒ　−−Ａｒｇ Ａ１２　ＴｙｒＡｓｎＧＩｙＴｈｒＡｓｎＬｙｓＴｙｒＳｅｒＡ［ａＳｅｒＧＩ ｙＳｅｒＧＩｙ　−ＶａｌＡ２４　ＴｙｒＡｓｎＧｌｙＴｈｒＳｅｒＬｙｓＴｙ ｒＡＩａＶａｌＧＩｙＧｌｙＳｅｒＧＬｙ　−ＡｒｇＡ２７　ＴｙｒＡｓｎＰｈ ｅＴｈｒＡｓｎＬｙｓＴｙｒＳｅｒＡｓｎＧＩｙＧｌｙＧＩｎ　−−Ａｒｇ１５ ０　１６０ ０１ｋ　ＡｒｇＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧＩｎＶａｌＬｅｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａ ｌＡＩａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒ。

０１ｃ　ＡｒｇＧＩｙＡｓｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬｅｕＡＩａＧＩｎＬｙｓＶａ ｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒ。

Ａ１０　ＳｅｒＧＩｙＡｓｐＬｅｕＧＩｙＳｅｒｌｌｅＡＩａＡｌａＡｒｇＶａ ｌＡｌａＴｈｒＧｌｎＬｅｕＰｒ。

Ａ１２　ＡｒｇＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧＩｙＳｅｒＬｅｕＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａ ｌＡｌａＡｒｇＧＩｎＬｅｕＰｒ。

Ａ２４　ＡｒｇＧＩｙＡｓｐＭｅｔＧＩｙＴｈｒＬｅｕＡＩａＡＩａＡｒｇＶａ ｌＶａｌＬｙｓＧＩｎＬｅｕＰｒ。

Ａ２７　ＡＩａＧＩｙＡｓｐＭｅｔＧＩｙＳｅｒＬｅｕＡｌａＡｌａＡｒｇＶａ ｌＡｌａＬｙｓＧｌｎＬｅｕＰｒ。

Ａ７９　ＡｒｇＧｌｙＡｓｐＭｅｔＧｌｙＳｅｒＬｅｕＡＩａＡｌａＡｒｇＶａ ｌＡｌａＬｙｓＧＬｎＬｅｕＰｒ。

Ｃ３ＡｒｇＧｌｙＡｓｐＬｅｕＶａｌＨｉｓＬｅｕＡＩａＡｌａＡＩａＨｉｓＡ ＩａＡｒｇＨｉｓＬｅｕＰｒ。

イ４６１〜８２乃ごび　１８２〜２０１１でおゆるポリオビールス■Ｐ１キイブ ヅッド蚤亡１曖の１ミノ西気デ（犠配列１ ダイブＩ　ＶａｌＧｌｎＴｈｒＡｒｇＨｉｓＶａｌＶａｌＧＩｎＨｉｓＡｒｇＳ ｅｒＡｒｇＳｅｒＧＬｕＳｅｒｌｙＡＴ３　ＶａｌＧＩｎＴｈｒＡｒｇｌ−１ｉ ｓＶａｌＶａｌＧｌｎＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧＬｕＳｅｒ０ Ｓｅｒ　ＩＩ　ｅ　Ｇ　ＩｕＳｅｒ　ＰｈｅＴｈｒｌｌｅＧＩｕＳｅｒＰｈｅ ８２ タイプＩ　５ｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧ、ＬｙＴｈｒＡＩａＰｒｏ ＡＩａＡｒｇｌｌｅＳｅｒタイ１”３　ＳｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒ ＧＩｙＡＩａＡｌａＰｒｏＡｌａＡｒｇＩｌｅＳｅｒ０１ ＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌ　ＧＩｙｌＬｅＶａｔＰｒｏＴｙｒＶａｌ　ＧＩｙＬ ｅｕ国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ／抗原性ピコルナビールスキャブジッド蛋白質のアミノ末端から、そのアミノ酸 配列長の約乙θ〜約７ｓ％に等しい距離だけ離れて位置している、抗原性ピコル ナビールスキャブジッド蛋白質上の領域のアミノ酸残基配列に対応する約、２０ 個のアばノ酸残基の配列を含む合成抗原ペプチドであって、該ペプチドは、キイ ホールアオガイのヘモチアニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとし ての有効量で寄主８動物だ導入されると、該ピコルナビールスと免疫反応して該 ピコルナビールスにより起こされる感染から寄生を守るところの抗体の製造を寄 生において誘起することができる合成ペプチド。 ユ　末端被ブチドアミノ及び／又はカルビキシル基のイオン電荷を除いて、正味 の正のイオン電荷を持つ請求の範囲第１項に記載の合成ペプチド。 ３　ピコルナビールスが口蹄疫ビールスである請求の範囲第１項に記載の合成ペ プチド。 弘　ピコルナビールスがポリオビールスである請求の範囲第１項に記載の合成ペ プチド。 タ　アミノ末端から約７３０〜約／ＡＯの位置の口蹄疫ビールスｖＰ□　キャブ ジッド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応する約２０個のアばノ酸残基の配列を含 む合成抗原ペプチドであって、該ペプチドは、キイホールアオガイのヘモチアニ ン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての有効量で寄主動物に導入 されると、該口蹄疫ビールスと免疫反応してこのビールスにより起こされる感染 から寄生を守るところの抗体の製造を寄主において誘起することができる合成４ プチド。 乙　ペプチドのアミノ酸残基配列が、アばノ末端がら約／’Ｉ−／〜約／ＡＯの 該ＶＰ１　キャブジッド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応する請求の範囲第３項 記載の合成４プチド。 ７　ペプチドのアだノ酸残基配列が、左から右へかつアはノ末端からカルボキン 末端の方への方向に記載して下記 ＴｙｒＡｓｎ　（Ａｓｐ又はＴｈｒ）Ｇｌｙ（Ｐｈｅ）Ｇｌｕ（Ｔｈｒ）Ｃｙｓ （Ｓｅｒ又はＡｓｎ又はＴｈｒ）Ａ’ｒｇ（Ｌｙｓ又はＴｈｒ）ＴｙｒＡｓｎ（ Ａｌａ又はＳｅｒ又はＴｈｒ）Ａｒｇ（Ｖａｌ又はＡｌａ又はＡｓｎ又はＴｈｒ ）ＡＳｎ（Ｇｌｙ又は５ｅｒ） Ａ＋ａ（Ａｓｐ又はＧ　ｌ　ｙ）Ｖａ　ｌ　（Ｓｅ　ｒ又はＧｌｎ又はＸ）Ｐｒ ｏ（Ｇｌｙ又はＹ）　Ａｓｎ　（Ｚ）Ｌｅｕ　（Ａ　ｒｇ又はＶａｌ）Ａｒｇ（ Ｓｅｒ又はＡｌａ）Ｇ、１ｙＡｓｐ　−Ｌｅｕ　（Ｍｅ　を又はＰｈｅ）Ｇｌｎ （Ｇｌｙ）Ｖａｌ（Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＨｉｓ）Ｌｅｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧ ｌｎ（Ａｌａ又はＰｒｏ）Ｌｙｓ　（Ａｒｇ又はＡｌａ）Ｖａｔ　（Ｈｉｓ）Ａ ｌａ（Ｖａｌ）Ａｒｇ（丁ｈｒ又はＬｙｓ）Ｔｈｒ（Ｇｌｎ又はＨｉｓ）Ｌｅｕ ｐｒ。 （ここでカッコ内のアξ）酸残基Ｘ％Ｙ又は２の各々は個々に、カッコの直属に 隣接するアミノ酸残基と代ることができ、そして イブチドアξノ酸残基配列内のＸ及び／又はＹ及び／又はＺは独立に、カッコの 直属に隣接するアξノ酸残基の位置におけるアばノ酸残基の不存在を示し、それ Ｋよってペプチド鎖長が各々１１ユ又は３個のアミノ酸残基の分だけ短縮される 。）より成るアばノ酸残基配列の群の一員のアミノ酸残基配列に対応する請求の 範囲第Ｓ項記載の合成ペプチド。 ｇ　−！！プチドのアミノ酸残基配列が、左から右へかつアばノ末端からカルボ キシ末端の方向に記載して下記Ｖａｌ（Ｓｅｒ又はＧｌｎ又はＸ）Ｐｒｏ（Ｇｌ ｙ又はＹ）Ａｓｎ　（Ｚ）Ｌｅｕ（Ａｒｇ又はＶａｔ）Ａｒｇ（Ｓｅｒ又けＡｌ ａ）　（ＧｌｙＡｓｐＬｅｕ（Ｍｅｔ又はＰｈｅ）Ｇｌｎ（Ｇｌｙ）Ｖａｌ　（ Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＨｌｓ）Ｌｅｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧｌｎ（Ａｌａ又はＰ ｒｏ）Ｌｙｓ　（Ａｒｇ又はＡｌａ）Ｖａｌ　（Ｈｉｓ）Ａｌａ（Ｖａｌ）Ａｒ ｇ（Ｔｈｒ又はＬｙＳＩＴｈｒ（Ｇｌｎ又はＨｉｓ）ＬｅｕＰｒ。 （ここでカッコ内のアｉ）酸残基Ｘ、Ｙ又はＺは個々に、カッコの直属に隣接す るアミノ酸残基と代ることができ、そして ペプチドアζノ酸残基配列内のＸ及び／又はＹ及び／又はＺは独立に、カッコの 直属に隣接するアばノ酸残基の位置におけるアばノ酸残基の不存在を示し、それ によって各々１．ユ又は３個のアばノ酸残基の分だけイプチド鎖が短縮される。 ）より成るアミノ酸残基配列の群の一員のアミノ酸残基配列に対応する請求の範 囲第Ｓ項記載の合成ペプチド。 ９　ペプチドのアばノ酸残基配列が、左から右へかつアはノ末端からカルボキシ ル末端の方向に記載して下記（１１ＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｒＢＧｌｙＡＳ ｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬｅｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅ ｕＰｒｏ　；（２）　ＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｙＳｅｒｌ　 ｌｅＡｌａＡｌａＡｌｇＶａ　ｌ　Ａ　ｌ　ａＴｈ　ｒＧ　ｌ　ｎＬｅｕＰ　ｒ ｏ　、及び（３）　ＳｅｒＧｌｙＶａｌＡｒｇＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｙＳｅｒ ＬｅｕＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｌａＡｒｇＬｅｕＰｒ。 から成るアミノ酸残基配列の群の一員のそれに対応する請求の範囲第Ｓ項記載の 合成ペプチド。 １０　アばノ末端から約４／〜約ｇ０の位置の、ｆ　ＩＪオビールスｖＰ□　キ ャブジッド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応する約２０個のアミノ酸残基の配列 を含む合成抗原ペプチドであって、該ペプチドは、キイホールアオガイのヘモチ アニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての有効量で寄主動物に 導入されると、該ポリオビールスと免疫反応して該ビールスにより起こされる感 染から寄主を守るところの抗体の製造を寄主において誘起することができる合成 Ｒプチド。 ／／被プチドのアミノ酸残基配列が、左から右へかつアミン末端からカルボキシ 末端の方向に書いてＶａ　ＩＧ　ｌｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓＶａ　ｌＶａ　ＩＧ 　ｌｎＨｉ　ｓ　（Ａｒｇ）ＡｒｇＳｅ　ｒＡｒｇｓｅｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒ（ Ｔｈｒ）　ｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅ（ここでカッコ内のアζ）酸残基の各々 は、個々にカッコの直属に隣接するアミノ酸残基と代ることができる。）より成 るアミノ酸残基配列の群の一員のそれに対応する請求の範囲第１０項記載の合成 ペプチド。 ／２　ペプチドのアミノ酸残基配列が、左から右へがつアばノ末端からカルボキ シ末端の方向に書いて（１１ＶａｌＧｌｎＴｈｒＡｒｇＨｉｓＶａｌＶａｌＧｌ ｎＨｉｓＡｒｇＳｅｒＡｒＢＳｅｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒｌ　１ｅＧｌｕｓｅｒＰ ｈｅ　；（２ン　Ｖａ　ｌ　Ｇ　ｌ　ｎＴｈ　ｒＡ　ｒ　ｇＨｉ　ｓＶａ　ｌ　 Ｖａ　ｌ　Ｇ　ｌ　ｎＡ　ｒｇＡ　ｒ　ｇｓｅ　ｒＡ　ｒ　ｇＳｅ　ｒＧｌｕＳ ｅｒＳｅｒｌｌｅＧｌｕＳｅｒＰｈｅ　；（３）　ＶａｌＧｌｎＴｈｒＡｒｇＨ ｉｓＶａｌＶａｌＧｌｎＨｉｓＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｕＳｅｒＴｈｒｌ 　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅ　：　及び（４）　ＶａｌＧｌｎＴｈｒＡｒｇｌ−１ ｉｓＶａｌＶａｌＧｌｎＡｒｇＡｒｇＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧ　ｌ　ｕＳｅ　ｒＴ ｈ　ｒ　ｌ　ｌ　ｅＧ　ｌ　ｕＳｅ　ｒＰｈｅより成るアミノ酸残基配列の群の 一員のそれに対応する請求の範囲第１０項記載の合成にプチド。 １３　アミン末端から約１ｇ２〜約コθ／の位置のポリオビールスＶＰ１　キャ ブジッド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応する約２０個のアミノ酸残基の配列を 含む合成抗原ペプチドであって、該ペプチドは、キイホールアオガイのヘモチア ニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての有効量で寄主動物に導 入されると、該ポリオビールスと免疫反応して該ビールスにより起こされる感染 から寄生を守るところの抗体の製造を寄主において誘起することかできる合成ペ プチド。 ／グ　ペプチドのアばノ酸残基配列が、左から右へかつアミン末端からカルボキ シ末端の方向に書いて５ｅｒｆ　１ｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙＴｈｒ　 （Ａ　ｌ　ａ）Ａ　１ａＰｒｏＡ　ｌａＡｒｇｌ　１ｅＳｅｒＶａｌＰｒｏＴｙ ｒＶａｌＧｌｙｌ　１ｅ（Ｌｅｕ）（ここでカッコ内のアξ）酸残基の各々は個 々にカッコの直属に隣接するアミノ酸残基と代ることができる。）より成るアミ ノ酸残基配列の一群の一員のそれに対応する請求の範囲第１３項記載の合成ペプ チド。 ／Ｓ　ペプチドのアミノ酸残基配列が、左から右へがつアミン末端からカルボキ シ末端の方向に書いてｆｌ、ｌ　ＳｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙ ＴｈｒＡｌａＰｒｏＡｌａＡｒｇｌｌｅＳｅｒ　−ＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧ ｌｙｌ　１ｅ（２）　ＳｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙＡｌａＡｌ ａＰｒｏＡｌａＡｒｇｌｌｅＳｅｒ　−ＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙｌ　１ ｅ（３）　ＳｅｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙＴｈｒＡｊａＰｒｏＡ ｌａＡｒｇｌｌｅＳｅｒ−ＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙＬｅｕ（４）　Ｓｅ ｒｌｌｅＰｈｅＴｙｒＴｈｒＴｙｒＧｌｙＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａＡｒｇｌｌ ｅＳｅｒ−ＶａｌＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｙＬｅｕより成るアミノ酸残基の群の 一員のそれに対応する請求の範囲第１３項記載の合成ペプチド。 ／乙　抗原性ピコルナビールスキャプシソド蛋白質のアミン末端から、そのアミ ノ酸配列全長の約乙θ〜約７５ｇ）に等しい距離だけ離れて位置している、抗原 性ピコルナビールスキャグシノド蛋白質上の領域のアミノ酸残基配列に対応する 約２０個のアミノ酸残基配列を各々が含む多数の抗原ペプチドより成る繰原し単 位を持つ抗原ポリマーであって、ここで該ペプチドは、キイボールアオガイのヘ モチアニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての有効量で寄主動 物に導入されると、該ピコルナビールスと免疫反応して該ビールスにより起ｇ乙 こされる感染から寄主を守る抗体の製造を寄主におし・で誘起することができる ものであり；該イプチド繰瓦し単位は酸化されたシスティン残基により互に結合 されてポリマーを形成しているところのポリマー。 ／り　結合している酸化されたシスティン残基は、ペプチド繰返し単位の重合の 前に、アミド結合によってにプチドの各々のアミノ末端及びカルボキン末端に非 酸化形態で結合されたものである請求の範囲第１４項記載のポリマー。 ７ｇ　多数のペプチドの各々が、ピコルナビールスの一つの属の二以上のストレ インのアミノ酸残基配列に対応するアばノ酸配列を含んでいる請求の範囲第１乙 項記載のポリマー。 ｌｑ　抗原性ピコルナビールスキャブジッド蛋白質のアミノ末端から、そのアミ ノ酸配列全長の約６０〜り３％の距離に位置している、抗原性ピコルナヒ゛−／ レスキャゾシツド蛋白質の領域のアミノ酸残基配列に対応する約、２０個のアば ノ酸残基の配列を含む環状抗原ペプチドであって、ここで該ペプチドはキイホー ルアオガイのヘモチアニン担体に結合されて複合体とされて、ワクチンとしての 有効量で寄主動物に導入されると、該ピコルナビールスと免疫反応して該ビール スにより起こされる感染から寄主を守る抗体の製造を寄生において誘起すること ができるものであり；該ペプチドの末端は酸化されたシスティン残基により結合 されて環を形成しているところの環状ペプチド。 ２０　結合している酸化されたヅステｆン残基は、ペプチドの環化の前に、アミ ド結合によってペプチドの各々のアミノ末端及びカルボキン末端に非酸化形態で 結合されたものである請求の範囲第１ｑ項記載の環状ペプチド。 、２／　酸化されたシスティン残基によって結合された少くとも二つのペプチド を含む請求の範囲第１ｑ項記載の環状ペプチド。 、２，２　抗原性ピコルナビールスキャブジッド蛋白質のアミノ末端から、その アはノ酸配列全長の約４０〜７５チに等しい距離に位置している、抗原性ピコル ナビールキャブジッド蛋白質の領域のアミノ酸残基配列に対応する約、２０個の アミノ酸残基の配列を含む合成抗原ペプチドの有効量及び生理的に許容できる希 釈剤を含む、ピコルナビールスによる感染に対するワクチンであって、該ワクチ ンが寄生動物に導入されると、上記ピコルナビールスと免疫反応してこのビール スにより起こされる感染から寄主を守る抗体の製造を寄主において誘起できるも のであるワクチン。 ユ３　合成ペプチドが、末端ペプチドアξノ基及び／又はカルビキシル基のイオ ン電荷を除いて、正味で正のイオン電荷を持つ請求の範囲第、２２項記載のワク チン。 、２４　ピコルナビールスが口蹄疫ビールスである請求の範囲第２２項記載のワ クチン。 ２タ　ペプチドのアばノ酸残基配列が、アミン末端から約／’Ｉ／〜約ｌ乙０の 位置の口蹄疫ビールスのｖＰｌキャゾシツド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応す る請求の範囲第、２弘項記載のワクチン。 ２４　ピコルナビールスがポリオビールスである請求の範囲第、２２項記載のワ クチン。 ２７　ペプチドのアミノ酸残基配列が、アミノ末端から約７ｇ２〜約２０／の位 置のポリオビールスのＶＰｌキャグゾツド蛋白質のアミノ酸残基配列に対応する 請求の範囲第２Ａ項記載のワクチン。 ２ｇ　生理的に許容できる希釈剤が、水及び補剤から成る群の一員である請求の 範囲第、２２項記載のワクチン。 ２９　合成ペプチドが担体に結合されている請求の範囲第２．２項記載のワクチ ン。 ３０　担体が、キイホールアオガイのヘモチアニン、大豆凝集素、牛血清アルブ ミン、卵アルブミン、ビーナツツ凝集素、破傷風トキゾイド、ポリーＬ−リシン 及びポ！ｊ−Ｌ　−（Ｌｙｓ：Ｇｌｕ　）より成る群から選ばれる請求の範囲第 ２．２項記載のワクチン。 ３／　合成ペプチドがポリマーの繰返し単位の形で存在し、このペプチド繰返し 単位は酸化されたシスティン残基によって互に結合されてポリマーを形成してい る請求の範囲第２２項記載のワクチン。 ３．２　合成−？グチドが環状形で存在し、このペプチドの端は酸化されたシス ティン残基によって結合されて環を形成している請求の範囲第２２項記載のワク チン。 ３３　抗Ｗ性ピコルナビールスキャデシノド蛋白質のアミン末端から、そのアミ ノ酸残基配列全長の約６０〜約７５憾に等しい距離に位置している、抗原性ピコ ルナビールスキャプシノド蛋白質上の領域のアミノ酸残基配列に対応する約２０ 個のアミノ酸残基の配列を含む合成抗原ペプチドに対して寄主動物中で生じたと ころの、ピコルナビールス科のビールスに対スル抗体。 ３４１　サラＫ、ピコルナビールスの一つの属の少くとも二つのストレインと免 疫反応してこのストレインにより起こされる感染から寄主を保護することができ る請求の範囲第３３項記載の抗体。 ３夕　左から右へかつアミン末端からカルボキン末端の方向に書いて ｖａ　ＩＧ　ｌ　ｎＴｈｒＡｒｇＨｉ　ｓｖａ　ｌＶａ　ｌＧｌ　ｎＨｌｓ　（ Ａｒｇ）ＡｒｇＳｅ　ｒＡ　ｒｇｓｅ　ｒＧｌｕＳｅｒＳｅｒ　（Ｔｈｒ）　ｌ 　１ｅＧｌｕｓｅｒＰｈｅ（ここでカッコ内のアミノ酸残基の各々は個々に、カ ッコの直属に隣接するアご）酸残基と代わることができる。）より成るアミノ酸 残基配列の一群の一員のそれに対応するアミノ酸残基配列を持つ抗原４プチドに 対して生じた請求の範囲第３３項記載の抗体。 ３乙　左から右へかつアミノ末端からカルボキン末端の方向に書いて ｙａｌ（Ｓｅｒ又はＧｌｎ又はＸ）Ｐｒｏ（Ｇｌｙ又はＹ）Ａｓｎ（Ｚ）Ｌｅｕ （Ａｒｃ又１ｔ”ｈ　Ｖａｌ）Ａｒｇ（Ｓｅｒ又はＡｌａ）ＧｌｙＡｓｐＬｅｕ （Ｎｅｔ又はＰｈｅ）Ｇｌｎ（Ｇｌｙ）Ｖａｔ　（Ｔｈｒ又はＳｅｒ又はＨｉｓ ）Ｌｅｕ（ｌ　１ｅ）ＡｌａＧｌｎ（Ａｌａ又はＰｒｏ）Ｌｙｓ　（Ａｒｇ又は Ａｌａ）Ｖａｌ　（Ｈｉｓ）Ａ＋ａ（Ｖａｔ）Ａｒｇ（Ｔｈｒ又はＬｙｓ）Ｔｈ ｒ（Ｇｌｎ又はＨｉｓ）ＬｅｕＰｒ。 （ここでカッコ内のアば）酸残基Ｘ、Ｙ又はＺの各々は個々に、カッコの直圧に 隣接するアだノ酸残基と代ることができ；そして −１！ゾチドアミノ酸残基配列中のＸ及び／又はＹ及び／又は２は独立に、カッ コの直圧に隣接するアミノ酸残基の位置におけるアミノ酸残基の不存在を示し、 それによって−！！グチド長は各々／、コ又は３個のアミノ酸残基の分だけ短縮 される。）より成るアばノ酸残基配列の一群の一員のそれに対応するアミノ酸残 基配列を持つ抗原波グチドに対して生じた請求の範囲第３３項記載の抗体。 ３７　左から右へかつアεノ末端からカルボキシ末端の方向に書いて （１）　ＶａｌＰｒｏＡｓｎＬｅｕＡｒｇＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｎＶａｌＬｅ ｕＡｌａＧｌｎＬｙｓＶａｌＡｌａＡｒｇＴｈｒＬｅｕＰｒｏ　；（２）　Ｓｅ ｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙＡｓｐＬｅｕＧｌｙＳｅｒｌ　ｌｅＡｌａＡｌａＡｒｇＶ ａｌＡｌａＴｈｒＧｌｎＬｅｕＰｒｏ　、及び（３）　ＳｅｒＧｌｙＶａｌＡｒ ｇＧｌｙＡｓｐＰｈｅＧｌｙＳｅｒＬｅｕＡｌａＰｒｏＡｒｇＶａｌＡｌａＡｒ ｇＬｅｕＰｒ。 より成るアミノ酸残基配列の群の一員のそれに対応するアはノ酸残基配列を持つ 抗原イゾシドに対して生じた請求範囲第３３項記載の抗体。 ３ｇ　生理的に活性な形での請求の範囲第３３項の抗体ならびに免疫反応の存在 を指示するための手段を包含し、該抗体は添加混合されたピコルナビールス抗原 と免疫反応して免疫反応物を形成し、該指示手段がこの免疫反応を知らせるとこ ろの、ピコルナビールス抗原の存在のテスト用の診断系。 ３９　指示手段が酵素を結合した第二の抗体を含み、この第二の抗体は上述の第 一の抗体に対して生じられたものであり、免疫反応物中に存在する第一の抗体に 結合しそして加えられた培養基と結合酵素との反応を測定することにより免疫反 応を知らせるところの請求の範囲第３ｇ項記載の診断系。 ｌｌＯ指示手段が該抗体に結合された放射性元素を含み、免疫反応が放射性元素 を含有する免疫反応物の沈澱を起こすところの請求の範囲第３ｇ項記載の診断系 。