PT94266A - Processo para a preparacao de um imunogenio conjugado para sida - Google Patents

Description

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Ο Sindroma da Xmunodeficifncia Adquirida (AIDS) ê a manifestação clínica da infecção aparente de células T auxiliares («heiper») CD4 e de outras células alvo do vírus da imunodefic®n--· cia humana (HIV), também anteriormsnte referido como vírus T-linfotróoico humano tipc? 1.11. CHTLV-III), vírus associado a linfoadenopatia (LAV) ou vírus relacionado com AIDS íARv) (daqui em diante colsctivamente designado «HIV»). AíDS è uma deficifncia transmissívelda imunidade celular caracterizada por infecçSes oportunisticas e algumas doenças malignas» Uma doença semelhante, complexo relacionado com AIDS (ARO * partilha muitas das caracte-risticas epidemiológicas e anormal idades imunes da AIDS, e muitas vezes precede as manifestações clínicas da AIDS»

Uma vacina contra AIDS e/ou ARO é um tratamento profilático ideai para a prevenção dos efeitos debilitantes da infseção por HIV, Os requerentes descobriram um imunoqénio útil para tal vacina» 0 imunogénio à luís conjugado covalente do proteossoma da membrana externa ÍOmp) e um ou mais fragmentos do env»lucro de HIV»

Huitos detalhes da função genética e estructura do virião do HIV não foram ainda elucidados» Mo entanto, certas características gerais já emergiram» é um vírus de RMAcom um genoma totalizando cerca de 9 quilobases <kb)? a sua sequfncis de nucleotídeos contem sete grelhas de leitura principais abertas (ORFs) correspondendo aos genes oaa. pol e env» vi f» tafc» rsv e nef» Ds genes gao» pol e env codificam respectivamente as subuni-datíes do nuclscy.de» enzimas virais tais coso transcriptase reversa ou prolsass e sutounidades da superfície externa» 0 gene vif codifica um facior ds infecciosidatís virai, o qual é uma proteína envolvida no aumento de transmissão célula-a-célula dos viriões sem afectar o processa de asmulação» 0 gene tat codifica uma pequena proteína necessária à infecciosidade virai mas o mecanismo não é claro. Q gene rev regula a expressão das proteínas virais dos genes qaq». gol e snv. possivelmente pela facilitacão do transporte de RNA não totalmente «spliced». 0 gene nef codifica uma proteína virai encontrada no citoplasma celular e pode modular o sistema de sinalização celular do hospedeiro e servir como um silenciador da transcrição. As repetiçSes terminais na sequ@nc.ta de nucleotídeos são comuns a muitos reirovírus tais como d H1V s são necessárias á raplicação virai e integração no cromossoma do hospedeiroa Discussões msis recentes sobre a natureza geral da esiructura genómica9 repiicaçlo a regulação do HIV podem ser encontradas em Rat.ner? L= et ai.» «Hurnan T--Lymphotropic Retroviruses»=, em 05Brien , S. J. <ed» > Genetic Maps 1987 Cold Spring Harbor 1987 ppe 124-129? Franchini,, H. Senes & Dev 2S 1Θ55 (1988)„

As tentativas para desenvolver uma vacina para evitar a infecção com HíV de um modo geral tfm-se concentrado na indução de anticorpos neutralizantss específicos do vírus» Foi definida uma região da proteína do revestimento externo do HIV <gpi20> que está envolvida na geração de tais anticorpos ISoudsmit et ai»9 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85„ 4478 (1988)? Ho et ai.- ? J. Virol. Μ. 2Θ24 < 1987) | Hatsushita st ai., «3» Virol. 62 5 2107 (1988) ? Palker et ajU =, Proc» Natl» Acad. 8ci» USA 85. 3198 (1988)¾ Rusche st £.1,..= == Proc» Natl. Acad» Sei» USA 35== 3198 (1988)¾ Skirmsr st aI =, == J. Virol. 62v 4195 (1988)1. No entanto tentativas feitas para usar a proteína do revestimento externo virai Intacta ou fraeçass dela para induzir facilmente níveis significativos ds anticorpos neutralizantes mostraram-se inglórias EBarsnan et ai.»» Proc. Natl = Acad. Sei» USA 85=, 52©# (1988)¾ Hu et al. , Fature 558. 721 (1987)? Lasky et ai«9 Science 535» 1392 (1986)? Putney st ajU 9 Science 554== 1392 (1986) f Robev et ajU ;s Proc» Natl» Acad. Sei» USA 83 7Θ23 (1936)? Rusche st al.»» Proc» Watl» Acad» Sei» USA 84 j, 6924 (1987)1== * τ

Os requerentes descobriram um conjugado útil comes imuriogénio par AIDS. 0 conjugado induz uma resposta substancial de anticorpos neutralizantes específicos de HIV in vivo* 0 conjugado consiste essencialmente num determinante de neutralisa-çId principsal tía Hív covalentemente ligado ao proteossoma purificado da membrana externa de Meisseria,, AIDS é uma doença ds um vírus com um conjunto de carasterísticas únicas. 0 próprio HIV tem como alvo o sistema imune§ ele possui uma transcriptase reversa capaz ds reconhecer progénie altamente mutagenizada? ele escapa ao sistema imune e tem uma superfície hipervariávelna regilo (snv)= Consultar5 e.g= Hilleman? M. R», Vaccine ò9 175 i1988)? Barnes? D»M» 9 Science 240719 C198S)„ Face a estas características nlc se previa nem se esperava que os conjugados deste invento servissem como vacina contra AIDS.

IIIEVE......PESCRliSig......PO IMVEMTP

Feptídsoís) sintéticoís)? representando um determinante principal de neutralização CHHtB) do vírus da imunodeficifncia humana (HíV) ,, foram sintetizados quimicamente e conjugadas com proteossoma da membrana externa (Omp> de Malssaria meningitidis. 0 conjugado resultante MNiD-Omp» quando inoculado em animais tíe testes. induziu de imediato níveis elevados ds anticorpos neutra- 1 izantes de H1V«, 0 conjugado é útil como um imunogênio prático para a indução de uma resposta imune biologicamente importante contra HIV,

ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES conjugação

CDujUC

O r:-:!'í\í f* Γ}

Sind rocia da imunodefic§ncia adquirida Complexo relacionado com AIDS 0 processo de ligação covalente de 2 moléculas uma è. outra5 contendo um ou mais determinantes iinunológicos,, e-g** fragmentos do envólucro de HIV e Osisp Resultado de conjugaçãoP também conhecido como um conjugado aniigénico ou conjugado imunolcgico Termo genérico para o presumível sgsnte etiológico de AIDS s/cu ARC? também referido comes as estirpes HTL.V~I I ΐ ;; LAV e ARv Principal determinante de neutralização do HIV Protecsssama da membrana externa

Proteína rscoís binante

Um poiipeptideo ou oligopeptádeo expresso par DMA estranho nua sistema de expressão rscomfoinanie eucariótico ou procsriótica

Sistema de expressão recombinante

Uma célula contendo um DMA estranho t

expressando un»a proteína estranha ou um oliçopeptideo estranho Símbolo de Símbolo de Ncps completo três letras y.«>ã________lidill® Alanina Ala H Arginina Arg R Asparapina As-n N Acida aspártica HSp D fisn s/ou As p HS K B Cisteina Cis C Blutamina f31n 0 Acido glutSmico 61u E Bln e/ou Blu 61x Z Θ1icina 611 G Histitíina His H IsoXeuc iria 1 Is I Lsucina Leu t Lisina Lis K nstionins Met M Fanilaianiria Fen F Prolina Pro P Ssrina Ser s Treonina Tre T Triptafano Trp w Tirosina Tir Y vaiina Vai V Os termos «proteína»5 «peptideo». «oligopeptídeo» «polipepfcídeo» e seus plurais sao usados indiscriminadamenfcs para referir compostos químicos tendo sequências de aeinoácidos de *

cinco cu asais resíduos. «Aminoácida» refere-se a qualquer um dos Ξ® aminoácidos comuns para os quais existem codões naturais e estio enumerados na tabela de aminoácidos dada atrás.

Guando surge qualquer variável (e.g. J,: ? C? Bs etcp) mais do que uma vez em qualquer constituinte ou na Fórmula IIs a sua definição para cada ocorrência è independente da sua definição em todas as outras ocorr@nc.ias. Também5 combinações de substituintes e/ou variáveis slo permitidas apenas se tais combinações resultarem em compostos estáveis.

BESSB1C3P.. DETALHADA DO......INVENTO 0 presente invento proporciona uma vacina eficac contra AIDS ou ARC e compreende um conjugado antigénico da fórmula (liHtn ) /\y\j í Π·“: Γ; > T .. n ^ · ondes MNtB é o principal determinante de neutralização de HI¥S o qual é um polipsptídso de uma ou mais sequências de aminoácidos§ n indica o número de polipeptídeos de MNtD covalentemente ligados a O/ηρ e é l-S^s •^VA indica ligação covalente f

Omp é o proteossoma da membrana externa do microorganismo LMiigEia 0 conjugado destina-se a fins imunológicos. Ele serve coma um novo e átil antigénía para o tratamento ou prevenção de híd8 ou ARC. Ele é o principal constituinte de uma vacina contra AIDS5 a ser usada antes ou após exposição para evitar ou tratar infecçlo ou doença causada por HIV. «

Um exempla de uuti conjugada da fórmula I é <NNTRKSIRIGRSPSRAFVTIBKIBN)? ^-ϋαφ,^ o qual é Qmp ligado covalerv-· a ·«!* temente a um fragmento psptidico de H1V (isolado A Ϊ13, ver abaixo) com uma média de 353 fragmentos peptidicos de HJVpars cada Omp» 0 número 3,3 indica o grau de suhstituçlo ou o número de polipeptídeos.

Outro exemplos facilmente ocorrerlo aos familiarizados com imunologia» Ver também as ilustrações do Exempla 3Β*

Pincipal Determinante de Neutralizacao do Hlv 0 determinante imunológica que confere especificidade aos anticorpos neutral isentes de HIV neste invento é o principal determinante de neutralização (abreviado MNtD)„ 0 pricipal determinante de neutralização deste invento é definido imanologi·-caraente como qualquer determinante peptídico que d® reaceaa imunológica cruzada com um ou ma is dos peptídeos que possuidores de sequências da Tabela seguintes

lãbeLiJL YNKRKRXHISPORAFYTTKNIIGTI do isolado MN* NNTTRSIΗIGPGRAFYATGDIϊBDΪ do isolado SC ou NNTRKSIRIGRSPSRAFVT18KISN do isolado IIIB. A reacçSo imunológica cruzada pode ser medida por qualquer método convencional s e^g*, neutralização de vírus? aglutinaçloj radioisiunoensaioj imunoensaio ligado a enzimas ou imunidade mediada por células. > ί

A sequtricia da proteína ΙΠΒ descrita atrás tem um espectro mais estreito de determinantes de reaciividatíe cruzada do que a ssqufncia das proteínas MN ou SC π Assis é também vantajosamente usado como parte de um «cocktails de conjugados antigs-nicos compreendendo conjugados de Omp covalentemente ligados aos peptídeos íiNtD de ma is de usa sequência» é prática cossuia e convencionai em imunologia determinar o «cocktail» adequado de conjugados antigsnicos avaliando as caracteristicas da resposta de anticorpos neutralizantes3 incluindo determinação do título e reactividade cruzada com polipeptídeos seleccionados pelos investigadores»

Como alternativa,, o MNtD pode ser definido numa outra realização como qualquer psotítíea tendo uma sequSncia de 44 aminoácidos ou menos» mas pelo menos 5 aminoácidos de comprimento» da fórmula 1 ondas

está ausente ou é clstsinas está ausente ou é qualquer peptídeo até 19 aminoácidos de comprimentos é glicinas é prolina5 lsueina5 alanina glutamina ou serinaj s sstâ ausente ou é qualquer polipeptideo até 2® aminoácidos de comprimentos ou um seu sal farmacfuticamente aceitável»

Tal como todas as outras sequlncias proteicas ou peptídicasnos seus formatos padrSo? a sequ§ncia da fórmula II ê lida com o extremo amina no lado «esquerdo»® o extremo COOH no lado «direito»» Uma realização preferida da fórmula 11 ê quando K é prolina»

Uma outra realizaçSo preferida da fórmula II ê quando X è prolina* C está presente duas vezes* J, e estio presentes«

Uma outra realizaçSo preferida da fórmula II é qualquer uma das três sequências de aminoácidos da Tabela 1=

Por exemplo* MNtD de acordo com a fórmula 13 pode ser qualquer das sequências conhecidas e isoladas que se seguem* tal como estio apresentadas na Tabela II seguinte. * %

ΓuS \Z.QjLI '·/-¾ ^erVCl~ . s»A.K

de MNt’y MN CTRPNYNK RK R IHIGPGR AFYTTKNIIGTIRQAHC SC -----N-T TR S ---------A-GD--D---- WMJ3 D---DIA -R - ----------- GE-R-N----- WMJ1 ----N-V -R H ---------- GE-R-N---- WMJ1.5 -----N-V -R -H ---------YGE-R-N--- CC ------N T- KG -------V—ARR-D--- CHILDES -----N-T — S --------I-A-AR---D----- WMJ3.3 ---DIA - -R ---------YG---N----- J.GOUD 1 ----N-T — S --------A-QK-K---- 6587-4 ---YS-V -N - ---------H-R-T-DM---R- WMJD ----- NV- R-H -------- GE-R-N--- CHILDES ----NT—S -------I-A-AR---D----- J.GOUD 2 -----N-T — s -N----G-A-GQ--N------ BAL --N-T — S -S------GE--D-- SF2 ---N-T — s -Y-----H—GR--D—K-- SF4 ---N-T — s í 1 0 1 H 1 1 I RJS4.26 --κ -I -H M------A-GG-M-D- NY5 -N-TK - G -A--TL-AREK--D- 2321 -M---N-T — S -S----FA-GD-D-- JWK264 --N-T - -S -WSVH—GE-V-D—- 6587-7 N- YT— G---I-AIGD--D-- IIIB(BHIO) ---NT —SIR -QR--V-IGK- -NM-- 6587-3 —N-TRA-LS - - S—A-R—V- WMJ-2 ----—N VR -S LS---R- RE--1-- WMJ2.3 ----N VR -S LS----RYRE-1---- RF ---N-T — S -TK----VI-A-GQ--D—K--- CDC42 ----NT — VTL--VW--GE-L-N---- CDC451 ----HT — - VTL----VW--GE-L-N-----

Designaclo Oficial

Sequência de Aminoácidos Z3 RUTZ LAV-MAL SF33 SF170 LAVELI' Z6 JY1

---GSD-KI-QS λ----— A-GG--G--- Y-NI—GTHVG-V---I-A-N—K-SGN G- NT- -6 —F---Q-L---G-V-D—R-Y- - -N -R -R -TS---KVL--GE-D—K-Y- -N-T — S GT-- -A---QNT- Q- TP—L- QSL---RSRSI- NT-QSTP - -L- Q-L---RGRTKI- ----D—IT-QSTp - -L_ q_L---T_K_D. NOTAs Os traços na Tabela 11 Indica® que a substituição é a mesma definida pela letra da primeira linha» Uma letra é uma substituição apenas para aquela linha» Assim, por exemplo, as três primeiras sequências de aminoácidcs das quatro primeiras isolados são, respectivamente, CTR, CTR, DTR, CTR,

Será entendido que os novos produtos do presente invento englobam uma gama de sequências psptidicas de H1V, preparadas por sistemas de ay, pressão recombinan tes ou métodos sintéticos ou ambos» Por exemplo, as variações por substituição conservadora na sequência de aminoácidos ou peptídica dc HIV Edefinido como séries na Tabela i de Taylor* W = Re, u„ fel= Biol. 183» 233 (1.986)3 geral mente nio resultarão em qualquer modificação substancial ou nova dos princípios ou prática do presente invento» Como alternativa, dslsçlo(Ses) dentro das regiões peptidicas da fórmula ΪΙ são abrangidas pelas presentes vacinas, Podem ainda ocorrer outras variações nos sistemas de expressão recosnbinantes e incluem, por exemplo, modificações pós-tradução, processamento proteolitico, atíenilação, carboxilação, glicasila-çlo, hidroKilação, metilaçlo, fosforilação ou miristoilação. Será

entendido que MNtD ou seu fragmento ou variante neste pedido inclui qualquer uma das variações ou fracções da sequência de arainoácidos* obtido por substituição* deleção* processamento pás-tradução desvio da grelha de leitura ou outro processo* desde que o MNtD resultante* seu fragmento ou variante* dê reacção imunológioa cruzada com pelo menos um dos peptídeos apresentados na Tabela I atrás. Ainda* está estipulado que MNtD* seu fragmento □u variante* tem 5 ou roais aminoácidos de comprimento»

Com fins ilustrativos* uma realização do presente invento á um conjugado covalente de Omp s o determinante tem a sequência peptídica de YNKRKRIΗISP8RAFYTTKNIISTI (do isolado MN).

Uma outra realização do presente invento á um conjugado covalente de Omp e o determinante tem a sequência peptídica de NNTTRSIΗIGPSRAFYA78DI1SDI (do isolado SC).

Uma outra realização do presente invento ê um conjugado covalente de Omp e o determinante tem a sequência peptídica de NMTRKS1RIQRSPGRAFVTϊ8K1ΘΝ (do isolado IIIB).

Ainda* uma outra realização do presente invento é um conjugado covalente de Omp e o determinante tem a sequência peptídica consensos LMESVEINCTRPPMNNTRKSIΗ1SPSRAFYTTGRIISDIRQAHC. Esta sequência consertsus contem o sminoácido preferido em cada posiçlo da combinação dada na Tabela II«

Ainda* uma outra realização do presente invento é um conjugado covalente de Omp e o determinante tem a sequência peptídica de NNTRKSIH18P8RAFYTTGRIIGDI * a qual é um fragmento da sequência consensus do parágrafo anterior*

Outras raaiizações do presente invento são conjugados covalentes de Omp e qualquer fragmento da secuincia conssnsus, desde que o fragmento tenha 5 ou roais arolnoácidos de coropriroento»

Preparação do Principal Determinante de......Neutralização Síntese.....Q.rqlniça de MMtDs

Existem métodos padronizados s convencionais para a síntese rápida e precisa de peptideos longos em suportes de fase sólida» A síntese em fase de solução á gera!mente usada apenas para certos peptideos rnais pequenos» A síntese em suportes de fase sólida ou síntese em fase sólida, por conveniência é sfectuada num sintetizador de peptí-daos automático de acordo com e»g,3 Kent, S- et ai., «rlodern Msthods for the Chemical Bynthesis of Biologicallv Active Pepti-des», sm AI italo, K. et. ajU , Ceds) . Synthetic Peotides in Biolcgy and......Medicine, Elsevier 1985, pp„ 29-57= Em vez disto pode ser usada a síntese manual em fase sólida, seguindo as técnicas clássicas de Werrifield, como descrito, por exemplo, em Msrrifisld, R. B» 9 J» Am» Chem. Soe, 85, 21249 <Í963), ou modificações melhoradas conhecidas» A síntese de peptideos em fase sólida pode também ser sfectuada pelo método Fmoc, c qual emprega base muito diluida para remover o grupo protector Frooc» A síntese-condensação de segmentos ê ainda uma variante da síntese orgânica de peptideos dentro do âmbito das técnicas do presente inventa»

Ma síntese orgânica de peptideos, os aminoácidos protegidos são condensados para formar ligações amida ou peptídi™ cas com o extremo H de um peptídeo em crescimento» A condensação é qera!senis efectuada pelo método do carbodiimida usando rsagsn··· tes tais como diciclo-ftexilcarbodiiinida ou N-etil SN1-*í#-diníetil“ aminopropilIcarbodiiiriida* Outros métodos de formação da ligação affiida ou peptídica incluem, mas não estão limitados a vias de sintsss usando um cloreto ácido, acida, anidrido misto ou éster activado» Os suportes de fase sólida comuns incluem resinas de polistireno ou ds poliamida» A seieeçao de grupos protectores de cadeias laterais amina é, em parte, baseada nas condições ds acoplamento particulares, em parte pelos componentes de aminoácidos e peptídeos particulares envolvidos na reacção» Tais grupos protectores da função amina normalmente empregues incluem os conhecidos na área, par eKsmpla substiiuintes protectores de uretano tais coma bensilosicarbonilo <carbobenzoKÍ), p-metoKicarbobenzoKi, p-nitro-carbabensoMÍ, t—butilonicarbonila e similares» Prefere—se usar t-butoKicarbonilo (BOC) para a protscção do grupo €-amina, em parte devido ao grupo protector BOC ser fácilmente removida par ácidos relativamente fracos como seja o ácido trif1uoroacético (TFAJ ou cloreto ds hidrogénio em acetato de etila* O grupo OH de Tre e Ser pode ser protegido pelo grupo Bcl (bencilo) e a grupo €-amina ds Lis pode ser protegido pela grupo isQpropoKicarbonilo ílPOC) ou pelo grupo 2-clorofoenziloKi-earbonilo <2—Cl—CBZ)» 0 tratamento com HF ou hidrogenação catalítica sao tipicamente empregues para a remoção de IPOC ou ds 2-C1-C8Z.

Para a preparação de «cocktails» de peptídeos estreita-mente relacionadas, consultar, s»g»P Houghton 3 R„ A=, Proc. Natl» Acad, Sei» USA 82, 5131 (1985)= 16

Β = bxpessag de MNtD diurn...Sistema......ds......Expressão......RecofflbinMlM feste momento a preparação de células expressando um gene estranho é uma tecnologia relativamente hem estabelecida* Tais células actuaní como hospedeiros e incluam E« coli * B,. subtil is* leveduras* fungos,, células vegetais ou células animais* Os vectores de expressão para muitas destas células foram isolados e caractericados e slo usados como materiais de partida na construção* através de técnicas de DMA rscombinante convencionais* de vectores tendo uma inserção de DMA estranha com interesse* Qualquer DMA é estranho se nlo deriva naturalmente das células hospedeiras usadas para expressar a inserção ds DMA* A inserção de DMA estranho pode ser expressa em plasiiiidsos extra-cromossómicos ou após integração totalmente ou em parte noís) cromossomaCs> ds célula hospedeira ou pode de facto existir n® célula hospedeira como uma eomhinqaçlo de mais de uma forma molecular* A escolha da célula hospedeira s vector ds expressão para a expressão de um DMA estranho pretendido depende largamente da disponibilidade da célula hospedeira s de quanto é fastidiosa* se a célula hospedeira suportará a replicaçSo do vector ds expressão s ainda ds outros factores facilmente avaliados pelos faiai 1 iarizados com a matéria* A tecnologia dos sistemas ds expressão recombinaniss procarióticos é já antigo e convencional* A célula hospedeira típica é E» cplin A tecnologia está exsmplifiçada em compêndios tais como Wu* R Cetí) Meth* Ensymol* 68 (1979) e Maniatis* T* et âl« ogIi£Mlãi:-.......ÇlonlnQ.gS. Laboratory, Manual Cold Spring Harbor 1982* A inserção ds DMA estranho com interesse compreenda qualquer sequência de DMA codificadora do fragmento ds MNtD ou sua variante* incluindo qualquer sequência sintética com esta

capacidade codificadora ou qualquer sequência destas clonada ou suas combinações* Por exemplo* o peptídeo HNtB codificado e expresso por uma sequência ds DNA totalmente recombinante está contemplado neste invento.

Os vectorss úteis psra a construção de sistemas de expressão eucarióticos para a produção de MNtD recombinante compreendem a sequência de DMA de MMiD5 seu fragmento ou variante,; operacionalmente ligado aos referidos vectores com as sequências de DMA de activação da transcrição adequadas,, tais como um promotor e/ou promotor. Outras caracteristicas típicas podem incluir sítios de ligação ao ribassoma adequadoss codSes de terminação,; potenciadores ? terminadores ou elementos de replica-ção= Estas caracteristicas adicionaispodem ser inseridas no vector no sitio ou sitios adequados através tís técnicas ds «splicings adicionais tais como a digestão com sndonuclease de restrição e ligação.

Os sistemas de expressão em levedura,, os quais são uma variedade das sistemas de expressão reconsbinantes eucarióticos5 geralmente utilizam Saccharomvces cerevisiae como espécie de eleição para a expressão de proteínas reconsbinantes. S = cerevisiae e leveduras semelhantes possuem promotores bem conhecidos úteis na construção de de sistemas de expressão em levedura. incluindo mas não estando limitado a SAP491. SAL10« ADH5 s o factor de conjugação alfa.

Os vectores de levedura úteis para a construção de sistemas de expressão recombinantes em levedura para a expressão de MNtD inclueiii. mas não sstao limitados a? vectores vai-vem5 plasmídeos cosíiiidsosj plasmídeos quiméricos e os possuidores de sequências derivadas dos plasmídeos círculos ds 2 micron.

A inserção da sequência de DMA adequada codificadora de MHtD? seu fragmento ou variante., nestes vectores resultará em principio num sistema de exprsssio recombinante em levedura para MNiD em que o vector modificado ê inserido na célula hospedeira adequada, par transformação ou outros métodos..

Os sitemas de expressão recombinantss para mamíferos são um outra meio de produção os MNtD recombinante para os conjugados deste invento* Em geral, uma célula hospedeira de mamífero pode ser qualquer célula que seja eficazmente clonada em cultura de tecidos* Células hospedeiras de mamífero úteis para fins da construçãode um sistema de expressão recombinante em mamífero incluem* mas não estio limitadas a células VERO, MIH3T3, ΘΗ3, COS5 células Cl27 murinas ou células L de murganho* Os vectores de expressão em mamífero podem ser baseados em vectores de vírus, vectores piasmídeos que podem ter replições de SV40, BPV ou outros replições virais ou vectores sem um repliclo para células animais* Discussões detalhadas sobre vectores de expressão em mamíferos podem ser encontrados nos compêndios de Glovsr, D* M» <ed) «DMA Clonings A Praticai Approach», 1RL 1985, Vols,= 1 e II* MKtu recombinante pode possuir modificações estruturais adicionais e desejáveis não partilhadas pelo mesmo psptídso obtido por síntese orgânica, tais como aosnilação, carboxi1ação? glicosilaçlo, hxdroxilaçSo, metilaçãoi* fosforilaçlo ou miristoi-laçSo* Estas caractsrísticas adicionais podem ssr escolhidas ou preferidas conforme o caso, através da escolha adequada do sistema de expressão recombinante* Por outro lado, SUMtD recombi-nante pode ter a sua sequência prolongada através da síntese orgânica da secção A atrás..

Purificação do Proteossoma da Membrana......ir.xterna .g.suas ..Vterlan tss 0 potencisdor imunolágico do presente invento é purificado a partir do proteossoma às, membrana externa (Omp) cie Neissiria.» 0 prataossosta da membrana axtama pode ser preparado a partir de qualquer espécie dos cocos gram-negativos conhecidos cosa Meisseria, incluindo mas nao estando limitado a N» fflenlnqitidis» &. lactamiça, N. sicça, N, flavascsris, N. subflava s M« mucosa. As preparações preferidas sSo derivadas de meninqitidiSn a,g.5 dos grupos A, B ou C. A mais preferida é Omp do grupo B de N. msningittdis. 8So conhecidos vários métodos para a purificação de Qmp? qualquer um deles senda adequado para a preparação ds quantidades úteis de Omp para conjugação com MNtD» C-. Frasch descreveu a lavagem de células de M. msninqitidis em soluções salinass seguido de tratamento com detergente. por exemplo desaxicolato» vsr5 por exemplo., C. E, Frasch et al„? J.. Exp» Hed B 140, 87 (Íf74)i C. E. Frasch J. Bact. 127. 973 (1976)| e C. E.

Frasch st al„, ã. Exp, Hed» 147, 629 (1978/= 7. B. Helting formulou um outro método conhecido que emprega extração tíirecta com detergentes de células de N. meninoitidis sem sal. Consultar por exemplo, T= B. Heliing et -al., Acta Path. Microhial. Scand. Seat. C. 89, 69 /1981) s Patente U.S. 4,271,147. Çmlu^a_çM_dje_W.NtP ,.e, Omp._Pjara_,Fprmar affiftJ3LJai&-.LÍgãSggS......Cpvalentss Formadoras de Conjugado

Os conjugados antigénicos de HNtD e Omp slo úteis para a vacinação contra AIDS ou ARC. Tais conjugados têm pelo menos

uma ligação cavalente entre α antigénio HNtD e Omp s tipicamente t§'m mais do que um MNtD covalentemsnte ligado a cada Omp = MNtD e Omp são preparados separadaments» depois ligados por agentes ds ligação cruzada inespecíficos? espaçadores monoqe-néricos ou espanadores higsnéricos» Métodos para a ligação cruzada inespscífica inc1usm5 mas não estão limitados a reacção com glutaraldeidoy reacção com N-et i1~N?(3-dimeti1aminopropi1 > -carbodilmida, com ou sem mistura com um veiculo succinilado-oxidação cosii periodaio dos sufastiiuinfces glicosilados seguido de acoplamento a grupos amima livres de um veículo proteico na presença de boro—hidreto de sódio ou de cianoboro-hidceto de sódxop diazotizaçlo ds grupos assina aromáticos seguido ds acoplamento aos resíduos das cadeias laterais ds tiresina da proteínas reacção cora cora isocianatos? ou reacção de anidridos mistos= Ver ds um geral5 Briand» J .Ps et al», J. Ima» Meth» 785 5E? (1985) =

Estss métodos ds ligação cruzada inespscífica slo convencionais e bem conhecidos nos protocolos típicos de preparação de conjugados para fins imunológicoSa

Numa outra realização do invento são preparados conjugados formados cora ura espaçador monogenérico= Estss espaçadores são bifuncionais e necessitam da funcionalizaçlo de de apenas um dos elementos do par ds reacçlo a ser conjugado antes ds se dar a conjugação» A título ilustrativo? não liieitants» um exemplo de um espaçador monogenérico envolve o acoplamento do polipeptídeo MNtD a um extremo da molécula faifunoional di—hidrazida de ácido adipico na presença de carbodiimida» Presumívelmente uma hidrszi--· na diacilada forma-se com grupos carboxilo livres de ácido aspârtico ou glufâasico do MNtD» Efectua-se então a conjugação através de uma segunda reacção de acoplamento com Omp na presença

de carbodiimida» Para processos sentei hantesP consultar por exemplo3 Schneerson* Ru et al = * 3» Εκρ, Med= 152=, 3òi (1986)= Um outro exemplo de ura espaçador monogenérico está descrito em Fuji!» Nu et alu Int» 3» Peptide Protein Rss» 26, 121 (1985)»

Numa realização preferida da inventa as conjugados de Osp e MNtD são formados com um espaçador bigenéríco como no Exempla 3» Estes espaçadores slc formados após cada u?n dos elementos do par de reacção a ser conjugado, Omp e MNtD? é funcionalisado com um espaçador bifuncional» A conjugação ocorre quando cada elemento funcionalizado do par reage com o elemento oposto para formar uma ou ma is ligações covalentas estáveis == Consultar por exemplo? liarburg* S = et sl»* 3» Am» Chern» Soe = 168·, 5282-5287 <19Sò) e Marburg S« et al» ? Patente U«S« 4?é95?ó24* publicada em 22 de setembro de 1987? aqui incidido como referên-c ia»

Os espaçadores biqenéricos são os preferidos para a preparação de conjugados em vacinas humanas uma v&z que a reacção de conjugação está bem caracterizada s ê facilmente controlada»

Os protocolos experimentais imunológicas típicas s convencionais proporcionam uma síntese pronta e fácil de conjugadas antigénicos dentro da Smbita da presente inventa, incluindo a conjugação de Omp com virtualmente qualquer grau de substituição pretendido de virtua1mente qualquer pepfcídeo. Os produtos heterogéneos da rescção de conjugação são facilmente separáveis? se necessário* por uma variedade de técnicas de cromatografia em coluna adequadas» tormu 1 ação de.vacinas A forma do imunogénio dentro da vacina assume várias configurações moleculares» Uma única espécie molecular do conjugada antigénica ÍMNtD) -íOmp) será por vezes suficiente como antigénio útil e adequado piara a prevenção ou tratamento de AIDS ou ARC» Outros antigênios na forma ds «cocktails» slo também vantajosos s consistem numa mistura de conjugados que diferem por exemplo no grau de substituição Cn) ou na sequ©ncia ds aminoàci-dos de MNtD ou em ambos,.

Um vector? veiculo ou adjuvante pode ser adicionado como veicula imunológica ds acordo com ensaios imunológicas convencionais»

Os adjuvantes podem ou não ser adicionados durante a preparação das vacinas deste invento» AIum á o adjuvante típica e preferido nas vacinas humanas9 especialmente na forma ds um gel de hidróxido da aluminio iixotrópicQj viscoso e homogéneo» For 3KSiaploç uma realização do presente invento è a vacinação profilática de pacientes com uma suspensão ds adjuvante slum como veiculo e um «cocktail»de (MNtD) -QMP como a série seleccionads n de imunogénios ou antigênios»

As vacinas deste invento podem ser eficazmente administradas em per iodos de pré—exposição s/ou pós-exposição., em combinação com quantidades eficazes dos anfci-virais anti-AXDS, imunomoduladoreSp antibióticos ou vacinas da Tabela III Lfontes narkst tetter, 3® de Nov» ? 19S7? p = 26-27f Benetic Enoineering

News Jan» i98S3 VoX = 8S pa

Nome da Droqa TABELA II1" A. âltivirais Fabricante Indicado AL-721 Ethigen ARC5 PGL BETASERDN Triton Biosciencss AIDS; ARC5 KS (interferio beta) CARRI3YN Carrington Labs (polisanoacatato) CYTOVENE Syntex u-iiv Cganciclovir) DDC Hoffmann-La Roche AIDS5 ARC ídidesoxitidina) F03CARWET As t r a Ai# Inf por HIV, ífosfonoformato retinite por cl i-sód ico) CMv HPft-23 Rhone-Poulsnc Sante Infseção por HIV ORNIDYL Merreli ucm íeflornitina>

^Abreviaturas? AIDS (Bindroma da Imunodefieiincia Adquirida) p ARC (complexo? relacionadc» com AIDS) g CMv (Citomegalovírus., o qual provoca uma infecçlo oportunistica resultando em cegueira ou morte nos pacientes com ÃIDS)p HIV (Vírus da Imunodeficifncia Humana5 anteriormente designado LAV, HTLV-III ou ARV)p KS

Noa-ijs. da DrogaPEPTIDE T < sequfncia octapeptidica) RETCULOSE Cnucleofosfoprotsína) IR í sitíovudina>

Fabriçante lodififisllg

Península Labs 1TV3 RIFABUTIW Cansamicina Ln 427? <trimetrenato)

Advanced Virai AIDS, AHU Research Burroughs Wellcome AIDSs ARC avançada AIDS pediátrico !<Ss HIV as-simp. HIV menos grave envolvimento neurológico Adria Labs ARC

Warner-Lambert VIRAZOLE (ribavirina)

Usno rins Chem AIDs,;i AHC Industry Viratak/ICW AIDS,ARC> !<3 WELLFERON (interferia alfa)

Wurrooghs Sflsllcoma KSs Hlv, 6ã

comh, cam RETROvlR

27 -

LâÈEÍ£ãíite Upjohn

Morna da Dropa ABPP C bropiriffiina)

IMí£S&M

AIDS avançado, «S AMPLIBb.N DuPant (RIMA desemparelhado> HEM Research <Anticorpo an t i - interferão alfa humano)

Advanced Biothsrapy AlD3s ARC5 !<S

Concepts

Factor Estimulador ds Colónias ÍGM-CSF) CL246 ·,738 < CL.246 ? 73Θ)

IMUTHIOL ídiatil ditia carba/nato)

Sando? tíeneties Instituto

American Cynamid I mreq iierieuK Instituis

AIDS? ARC 5 HIV, KS

AIDS, ARC, PBL, K3 AIDS, ARC, PBL, KS AIDS,, ARC IL.--2 iinterleuquina-2)

Ngms da Droga ÍL--2 (interleuquina~2> rabricante Haffmann-La Roche ImmunsM Indicação AIDS, KS INTROM-A (interferia alfa) Sc her ing-Plough KS ISOFRINOSINE (inosina pranobex) Usmpart Phsrmaceuticals ARC ? PSL, pacientes HIV--seroposi tivos (metionina encefalina) ΤΝΪ Pbarmacauticals AIDS» ARC M7P-PE (Hiurami 1 -tri peptá deo > Ciba—Geigy s ..'.-n K. o ΤΗΥΙΊΟΡΕΜΤΙΝ (TP-5> CcQSípQSto tíi~i 1CD ) Ortho Pharmacauticals Infecçãa por HIV ROFERON (interferia alfa) Haffmann-La Rache KS íeritropoistina recombinants) Ortho PharmaceuticaXs anemia grave associada a AIDS e terapia com KETRUVIK TREXAN fnaitrsKona) DuPont AIDS, ARC TWF ífactor de tumoral) tíeiisutech ARC, so necrose comhinaçSo co?3 interferio gama C. ÔQMbiótiços

PEMTftM 3ΘΘ LyphoMed PCP

Cisotionato de psntamidina) D= Vacinas

Gag Merck AIDS, ARC

Será entendido que o âmbito de combinaçSes das vacinas deste inventa com antivirais? imunomoduladoress antibióticos ou vacinas contra AíDS3 não está limitado à lista na Tabela scima? mas inclui em principia qualquer combinação com qualquer composição farmacêutica útil no tratamento de AIDB== As vacinas contra AIDS ou HIV deste inventa incluem vacinas a serem usadas antes ou após exposição para prevenir ou tratar a infecçlo por HIV, e são capazes cie produzir uma resposta imune especifica do imunogénio»

Preparação ds Psoticleos Sniéticcs

A =. 0 oligopeptídea NNTRKSIRIQRGP8RAFVT18KIBN? também conhecido como RPi35s foi sintetizado por técnicas convencionais ds fase sólida num sintetizador automático ds pclipept£dsos3 de acordo com K®ni3 S. et al„9 «Modern Methods for ihe Chemical Synthesis of Biologically Activs Peptides» sm Alitalos K, et ai s, Ceds)5 Svnthetic Peptides in Biology and Medicineg Elsevier 1985, pp,29-57. 0 peptídeo foi fixado a um suporte ds metilbsnzidril--· amina através do extremo COGH beta do ácido aspártico. A clivagem com HF como passo final resultou em asparagina CGOH-temiinaI B. Sintetizaram-se também outros peptídeos ds acordo com a Tabela seguintes

Derivada do Isolada

NMTRKSITKSPSRvΪ YftTSQIISDIN YNKRKRIΗISP6RAFYTTKIMIIBTIN KNNTTRSIΗ Ϊ SPSRAFYATSDIIGDIN KNMVRRSLSI8P8RAFRTREIISIIRN NNTRKSIHISP8RAFYTT8Rí ISDIN NNTRKSIΗI8L8RAFYTT8RIISDIN NMTRKSIΗΣ 8A8RAFYTT8RII6DIN NNTRKS ϊ ΗISSSRAFYTT8RII8DÍN NMTRKS ϊΗ ϊSGSRAFYTT8RIISDIN

Variante i variante 2 variants 3 variante 4 Variante 5

Exemplo 5

Extracção a Purificação da Oto ft = Primeiro Método

Todos os materiais* reagentes e equipamento foram esterilizados por filtração* autoclavagem ou óxido de etileno, conforme adequado? ao longo do trabalho usaram-se técnicas assépticas» 300 g (peso seco) de pasta de células de rteningococos grupes Bi 1 inactivadas por fenol a Θ = 5% foi suspenso em 12ΦΦ ml de água destilada e depois dispersos por agitação magnética durante 2© minutos á temperatura ambiente» As células suspensas foram sedimentadas a 2Θ ΦΦΘ xg durante 45 minutos a 5“C»

Para a extraeção* as células lavadas foram suspensas em 1500ml ds tampão ®31 M Tris* ©*@1 m EDTA pH 8*5 com dssoxicoiatc; ds sódio a ®y5% (tampão TED) e hamogsnizado com um haiaogeniξador Sorvall de 5ΘΘ ml durante 3 a 60 segundos» A suspensão resultante foi transferida para dez frascos Erlenmeyer (500 ml) para axtrac-ção num banho maria com agitação durante 15 minutas a 5óuC» 0 extracto foi esntrifugado a 20 &ΦΦ xg durante 90 minutos a 5“C s o sobrenadar*te viscoso foi foi decantado (volume = 150© mil» 0 fluido decantado estava muito túrbido s foi novamente centrífuga-do para clarificar sais a 20 000 xg durante 90 minutos a 5U,C« 0 fluido sobrenadante centrifugado duas vezes foi guardado a 5'"SC»

Os sedimentos de células extraídas foram ressuspensos em Ι5Θ0 ml de Tampão TED» A suspensão foi extraída durante 15 minutos a Séi^C s novaments centrifugada a 2® ΘΘΘ xg durante 9© minutos» Os fluídos de sobrsnadants que continham Omp purificado foram decantados (volume ™ 15ΘΘ ml> e guardado a 5UC» B» Segundo Hétodo

Todo o material, reagentes, equipamento e filtros foram sster.iliscados pela calor, filtração ou óxido de stilsnc» Foi SKcepçSo a ultracentrifuga Κ--Ξ que foi limpa com uma soluçlo de formalina a ©,5%=, Resguardos da fluxo laminar proporcionaram protsccao com esterilidade durante a ligaçlo dos equipamentos. As técnicas assépticas forain seguidas durante todas as operações. Entre os passos fez-se o armazenamento da proteína a 2-8wC= Fez-se uma filtraçio estéril por 0,2 micron imed iatamente antes da diafiltraçSo final para assegurar a esterilidade do produto»

Dois lotes de 6ΘΦ litros de IMelsseria aenincitidis foram fermentados e ísortos com fenol a €>,5%, depois concentrados até aproximadamsnte 25 litros usando duas membranas de fillraçSo tangencial de 0,2 micron em polipropileno de 10 pés quadrados. 0 caldo concentrado foi então diafiltrado com 125 litros de tampSo de lavagem de células (Cloreto de Sédio ©?11 Fosfato de Sédio Dibásico 17,ó mH, Cloreto da Amónio 23,3 mH, Cloreto de Potássio i,34 mM, ajustado a pH 7 com Ácido Fosfórico a 85% seguido de Sulfato de Magnésio Hepta-hidrato 2,03 mH).

Para a extracçlo adicionou-se a pasta de células um volume igual de tamplo TED 2K <®,2 M Tris, 0,02M EDTA ajustado a pH 8,5 com HC1 concentrado seguido da adição de desoxicolato as sódio),, r pasta resultante foi aquecida a 36 i 3^0 e mantida a esta temperatura durante 3® minutos para completar a extraccaa de Omp das células»

Para posterior purificação, a pasta de células extraídas foi centrifugatía a 3Θ ΘΘΘ xg (18 0©θ rpm) no modo de fluxo em «um passo» numa ultrasentriíuga K e colhida a corrente de sobre— nadante. 0 sobrenadarte de baixa velocidade foi concentrado para

lô litros através de duas membranas de fibras ocas autoclaváveis em polisulfona de micron s colhido num frasco de 18 litros esterilizado» 0 equipamento de filtração foi lavado duas vezes com 4 litros de tamplo TED C@»1M Tris3 ®5®1γ! EDTA» ajustado a pH 8sS ccjiR HC1 concentrado,, seguido da adição ds dssoKicolato de sódio para ®»5%) que foi combinado com o material retido» 0 material retido foi subdividido em duas ou trãs partes iguais» Cada uma das partes foi centrifugada a 8® 00Φ ug (35 &&Θ rpm} durante 3© minutos» A proteína Ousp foi sedimentada e a maior parte das proteínas soláveis* ácidos nucleicos s endotcxinas ficaram no sobrensdsnts» 0 sobrenadante foi rejeitado,, fi proteína sedimentada foi ressuspertsa por recirculação de tampão TED a 55 ± 5“C através do rotor» As primeiras ressuspensões a alta velocidade foram combinadas s sujeitas a uma segunda centrifugação a baixa velocidade,, A segunda centrifugação a baixa velocidade serviu para assegurar a remoção dos detritos celulares residuais da corrente ds produto» 0 sobranatíants da segunda centrifugação a baixa velocidade foi subdividido em duas ou trfs partes iguais» A cada uma das fracçSes foi dado duas centrifugações consequtívas de alta velocidade» Todas as centrifugações de alta velocidade foram realizadas nas mesmas condições e cada uma serviu para purificar mais a proteína Omp»

Para a filtração estéril e diafiltraçao final» as terceiras ressuspsnsõss de alta velocidade foram diluídas com um volume igual de tampão TED e filtradas através de um filtro de acetato de celulose ds 0,,2 micron,, Quando todas as fracçSes estavam filtradas fez-se uma passagem com 8 L de tampão TED pelo sistema de filtração» 0 filtrado e a lavagens foram combinados s concentrados para 3 litros numa membrana ds fibras ocas autoclavável em polissulfona de ®s1. micron,, 0 material foi então diafil-trado com 15 litros de água apirogánica estéril» 0 material retido foi colhido num frasco de 4 litros juntamente com uma

lavagem de 1 litro para dar o produto final= A suspensão aquosa •final foi guardada a 2-S^C como Omp purificado, C» Terceiro Método

Qmp foi purificado a partir dos extratos de θ,2 M LiC 1-0,,1M Na Acetato9 pH 5S8S por ultracentrifugaçSo., seguindo o método as C„ E., Frasch st aju ? J. Exp, Med„ 14Θ,, 87-1Θ4 Ci974>? aqui incluído como refertncia» pvpHPi f) ~

A» Prepararao do conjugado peptídeo RP13S (NNTRKSIRIGRGP6RAFVTI8KI6N?-Omp (conjugado «RP155-Qmp») A proteína de membrana externa N-acstil-hoiBOcistamini·- lada (Omp) ds N„ meninoitidis derivada de 59 mg de Omp (purificada pelo Método B do Exemplo 2) foi preparada pelo método de csntrifugacão descrito em Marburg» S» et ajU ? J= Am, Chain, Soc = 108s5282 i1986>. Este material (cerca de 50 mg) reagiu a pH 8 Cc>55 ml de tampão Θ,,ΙΙί P0^> com 9 ,,8 mg de RP135 N-y-bromoacetilado íXiofilicado) sob N,, durante 10 horas à temperatura ambiente, A mistura de reaeçlo foi diluida para ΙΘ ml com H.,,0 s centrifugada durante 2 h« a 4UC e 43 00Φ rpm» 0 sobrenadante foi removido e o sedimento rassusosn-sc, usando um homogenisador de tecidos Dounce? em 10 ml de H20„ Esta suspensão foi novamente centrifugada (como atrás) © d sedimento ressuspenso em 9S5 ml ds f-UO, Uma centrifugação a baixa velocidade durante i minuta numa centrífuga clínica removeu um material insolúvel floculento» Um ensaio ds Lafciry para proteína do sobrenadante deu um um valor ds 370 gg de proteína/ml (um rendimento de aproaimadamsnte 5%) e uma análise de aminoàcitíos Spinco deu uma ração

dos S-carboximetil-homo-císteina/1isina de A análise valores de aminoàcidos indica que o grau de substituição é de aproxiiiiadamente 3=3 peptídeos por raonóraero de proteína» Rendimento;; 3„7 mg do conjugado CRPÍ.35}^ daqui em diante «conjuga- C* 5 ·~: do RP1.35~0mp». B. Preparado.,Je Outros Conjugados de ...Peptidaos

Seguindo o método do Exemplo 3ã obtiveram-se os conjugados de peptídeos que ss seguem» iNMTRK8ITKSPGRVIYAT8GII8DIN)e-Omp? í YNKRKRIΗ Ϊ GPGRAFYTTKNϊ18!ϊ N) â-Omp , < KNNTTRS XHISPSRAFYATSDIISDIN)t-Omp, (KNNVRRSLS18P8RAFRTREΣ1611RN)p-Omp s CNMTRKSIΗI8PSRAFYTT8RIISDIN),A~Omps CNNTRHSϊ Η XGLGRAFYTTGRIIGDIN>A ^-Omp, iNNTRKSí ΗIGA8RAFYTT8R11GDIN)~ -Omp, í NNTRKSIΗ18S8RAFYTT8RIí GDIN) / Λ-Orno. Ή- 5 v EXEMPLO 4

Protoç_olo_.....para.....Inoculação de Animais com o Conjugado RP135-Qmp

Usou-se alum como adjuvante durante a série de inoculações» 0 inóculo foi preparado dissolvendo o conjugado RP135~0rap em soro fisiolágico numa concentração final de conjugado ds 1©0 pg/ml» Alum pré—formada Cgel de hidróxido ds alumínio) foi adicionado á solução para um nível final de 500 pg/ml de alumínio» O conjugado foi deixado adsorver ao gel ds alum durante duas horas à temperatura ambiente» Após adsorçlo» o gsl com o conjugado foi lavado duas vezes com soro fisiológico e ressuspenso em soro fisiológico para uma concentração ds proteína ds 1&Θ pg/ml»

Macacos vsrdss africanos foram inoculados individual-rasnte com quatro doses de 100 pg do conjugado RP135--0mp absorvido a aluo. Cada dass foi injectad® intramuscular-mente» As dosa foram administradas com intervalos de um ou cinco mases Csemana 0„ 4? S e 28)» Os animais foram sangrados em intervalos de duas ou quatro semanas« A partir do sangue colhido preparou-se soro para testar o desenvolvimento de anticorpos específicos como descrito nos exemplos subsequentes»

hXi-nPLQ O

Análise dos. Soros cara.....Anticarpos_Jq8.., Anti-Peptidso

Cada amostra de soro foi analisada por ensaio imuncsad-servente ligado a encima (ELISA)B As placas de microtitulacSo em polistirano foram revestidas com €>,5 pg por cavidade do peptideo sintético (nSo conjugado com Omp) em soro fisiológico tamponado com fosfatas íPBS) a 4'JC. Cada uma das cavidades foi então lavada com com PBS contendo @,©3% de TWEEN-2© (PBS-T)» 0 soro a testar, diluido seriadamente com PBS-T, foi adicionado ès cavidades contendo o peptídso e deixadc* reagir com a peptídso adsorvido durante uma hora a 36^0« Após lavagem com PBS-T, adicionou-se soro de cabra antí-IgB humana conjugado com fosfatas® alcalina ás cavidades a testar s deiKou-se reagir durante uma hora a 3ó°C« As cavidades foram então extensivamente lavadas em PBB—T. Cada uma das cavidades recebeu p-nitrofenilfosfata a 0,1% em distanolamina — ΓΓ* a 10%, pN V?8P contendo ô^SmM MgCl^éH^O» A reacçSo prosseguiu á temperatura ambiente durante 30 minutos, altura e® que foi parada pela adição de 3,0 M NaOH»

Quanto maior a interseção dos anticorpos no soro a testar com o peptídso substracto, maior é a quantidade de fosfatas® alcalina ligada á cavidade» A encima fosfatas® medeia a + i

cisSo de p-niirofeniXfosfato para dar uma espécie molecular que absorvâ lua num comprimento de onda de 4Φ5 nm« Portantos existe uma relação dirscis entre a absorvSncia a 4Θ5 nm de luz no finai da reacçSo de ELISA a a quantidade de anticorpo ligado ao peptí- d@Qn

Todos os macacos inoculados com o conjugado peptídso--Gmp íRP135”-0mp) apresentaram anticorpos capazes de se ligarem espscificainsnts ao pspt£dsos. conforme indicado psio Titulo anti--RPÍ35 da Tabela Pu

Tabela ft ftyalias,ÍQ^BicÍ.ãl··.......^^,,,Ι^υη,ορβηΐΓ,ΜίΜ^!·

Titulo Anti-RP1352 âa.i®âL.# Ináculo 8sm Φ s»era 2 Ssgi 4 §SíR...Íi 182 RP135- <2® <20 500 2500^ 161 Omp <20 <20 100 2540'“ 162 iAluffl) <20 100·"“ <20 2500" '163 <20 <20 26 500‘"= 171 Peptideo <2Θ <2® <2® <2Θ 635 .-1=, RP Loop’ <2® <20 <20 <20 ©36 <Hlura> <20 <2@ <20 <2® IS® <2® <20 <20 <20 “Mas semanas Θ e 4 Cassim como nas semanas 8 e 28) a colhs-u-ss -sangue ds cada um dos animaiss depois injectou-se intr&muscularmente com o imunogènio conjugado RP135-0mp de acordo com o exemplo 4= '“Inverso do titulo de ELISA por diluição terminal usando o peptideo RPÍ35 como substrato ds revestimento das placas de mierotitulação» "".inverso do título de neutralização do vírus por diluição limita nestes dias = 1Θ ou 2Θ» A __ 'SequSncia Cdo peptideo testemunha KP loop) = CTRPNNNTRKSIRIGRGPGRAFVT ΣGK1GNMRQAHC.

Análise d© Boros quanto á Actividade que Neutraliza Especifica-mente a Infecciosidade da HIV A actividade de neutralização do viros foi determinada com um ensaio descrito por Rohertson et a3U ? J« Virol« Methods 20; 193-202 (1938)= 0 ensaio mede a actividade neutral izs.nte especifica de HIV no soro a testar» 0 ensaio baseia-se na observação de que células MT-4? unta linha celular linfóide T humana, são facilmente susceptíveis à infecção com HIV e, após um período de replicação virai, slo mortas como resultado da infecção, 0 soro a testar foi tratado a íjó"C durante 6Θ minutos antes do ensaio» Este tratamento ê necessário para eliminar inibitíores inespecificos da repiicaçlo do HIV, 0 soro tratado peio calor, diluido seriadamente em meio de cultura de tecidos RPMΣ-1o4©, foi misturado com uma dose infecciasa padrão de HIV» A dose tinha sido determinada antes do ensaio como contendo a quantidade ma is pequena de vírus necessária piara matar todas as células S1T-4 na cultura do ensaio após um período ds 7 dias» A mistura soro-vírus foi deixada interactuar durante uma hora a 374"0= Ela foi então adicionada a Ι,Θ xlO’"' células ΜΪ-4 suspensas eir» meio de crescimento RPIiI-ió4® suplementado com as soro fetal bovino» As culturas foram incubadas a 37“C numa atmosfera de 5% de C02 durante 7 dias*

Ho final do período ds incubação adicionou—se a cada cultura um corante metabólico, DTT. Este corante é amarelo a olho nu» Na presença de células vivas, o corante é prade^-esMo aietabó— licamente para dar uma espécie molecular que dá uma côr azul a olho nu» 0 HIV neutralizado não pode replicar-se nas células alvo MT—·4 e portanto não mata as células» Assim, a neutralização 41 positiva é avaliada pelo desenvolvimento de côr azul após adição do corante metabólico»

Todos os macacos inoculados com o conjugado 0mp-RPI35 desenvolveram uma actividade especifica neutralicante da HIv5 conforme indicado pelas colheitas de sangue com asterisco da Tabela A»

Ainda fazendo uma avaliação continuada dos mesmos macacos \182s 161 ? 162 a 163) observou-se substancial actividade neutralizarits do HIV conforme mostrado na Tabela 8« As injscçSes de memória também induziram uma renovaçlo do titulo neutralizai!-te»

Todos os macacos inoculados com o conjugado 0®p—RPi35 desenvalveram uma actividade específica neutralizamte do HIV» conforme indicado? pelas colheitas de sangue assinaladas com asterisco na Tabela A»

Ainda fazendo uma avaliaçlo continuada dos mesmos macacos <I823 1615 162 e 163) observou—se substancial actividade neutralizante do HIV conforme mostrado na Tabela B= -tabela. B.

Avaliação Continuada dos Animais Inoculados com RP135~0mp título ds Actividads? de Animal ...1 ^g®miu_.MlllnÊÇMÍâCÍsÍ ELISA - anti"RP135A Neutralização^ 0 <20 <10 2 <20 <10 4 500 <10 6 . 2500 10 8 2500 20 10 2500 320 12 500 80 16 100 80 20 20 10 24 20 <10 28 20 <10 30 2500 i320 0 <20 <10 2 <20 <10 4 100 <10 6 2500 20 8 2500 10 10 2500 40 12 500 10 16 100 <10 20 20 <10 24 20 <10 28 20 <10 30 2500 80 0' <20 <10 2 100 10

Titulo tía

Actividads da feoimiJI· ELISA anti~RPi55^ Neutralizado'-’ 4 <20 <10 2500 20 500 10 2500 320 500 40 100 40 20 <10 20 <10 20 <10 2500 320 <20 <10 <20 <10 20 <10 500 20 500 10 500 80 100 160 <20 40 100 <10 20 <10 100 <10 2500 80 6 8 10 12 16 20 24 28 30 163 o 2 4 6 8 10 12 16 20 24 28 30

"'"Cada animal foi inoculado com 1ΘΘ mg do conjugado, adsorvido a alufflj per doss;, As desses foram administradas intramuscu 1 ansente nas semanas 4, δ s 28= v mvsrso do titulo de ELISA por diluição tmai usando o peptidso RP135 como substrato de revestimento das placas da sTs i c r o t i t lã 1 aç ao « "'Inverso do titulo as neutralização do vírus por diluição final n

Se? bem que a especificaçSo precedente ensine os princípios da presente invento, sendo os sMempIos dados com fins ilustrativos, será entendido que a prática deste invento engloba todas as variações, adaptações ou modificações habituais, que estão dentro- do âmbito das reivindicações que se seguem e seus equivalentes.

Claims (4)

1. iã,= - Processo para a preparação de um conjugado sntigénicog caractsrizada par compreender as passos des a) Ss fornecer usas quantidade de um ou maís determinantes d® neutralização principais do HÍVf b) Se fornecer uma quantidade de proteossoma purificado da membrana externa de rfeisserlas c) Se ligar covalentemente a quantidade do passo Ca) com a quantidade do passo Cb) ds modo a fornecer um conjugado ant.1 génico;i estando o principal determinante de neutralização do HIV ligado covaientemente ao proteossoma purificado da membrana externa de ^alagaria. 2a= Processo de acordo com a Reivindicação ís carsc- isrizado por o referido conjugado antigénica ser da fórmulas (MNtD)n/vV(Omp) onde s MMtD á o principal determinante de neutralização de HIVS o qual á um polipsptideo tíe uma ou ma is sequências de aminoácidos;; n indica o número de polipeptídeos ds MMtD covalentemente ligados a Omp e é 1-5Θρ

   indica ligação covalente % Omp & a protsossoma purificado da membrana externa de Neisseria. ou um ssu sal fariBaceuticamen ta aceitáveldando o referido KM ti) rsacçlo imunológica cruzada com um ou ma is dos seguintes peptí-dsos s YNKRKRIΗISPSRAFYTTKWϊISTI NMTTRSΪΗΙ8PGRAFYATSDϊIGDI ou MNTRKSIRIQRSPSRAFVTI8KISW 3ã» ~ Processo tíe acordo com a Reivindicação i? carsc-iarizado por o referido conjugado antigénico ssr da fórmulas (MNtD)n/vA (0mp) onde; KNtD é o principal determinante de neutralização de HIV? o qual á um poiipepiídeo de uma ou mais sequfnczas ds aminoácidos; n indica o número de polipeptídeos de MNtD cova 1 entesnente ligados a Orap s é 1~·5Θρ

   indica ligaçSo covalente g Omp â o proteossoms purificado da membrana externa de Neisseria. cu um seu sal i&rmstc:euticamente aceitável, sendo o referido KNtD um polipeptídeo com uma sequfncia de 44 asinoácidos ou menos, mas tendo pelo menos 5 aminoácidas de comprimento9 da fórmulas C~J—B—K —B—J C Í. Z. está ausente ou à cisteinap

   J, está ausente ou é qualquer peptideo até 19 aminoácidos cie comprimentos 0 é glicinap X é pralins? leucina„ alanina glutamina ou serinap e J,-, está ausente ou ê qualquer poli peptideo até 2© asninoácidos <C. de ccmρr isYien to „ 4ã« - Processo de acordo com a Reivindicação 3, carac-terizado por no referido conjugado antigénieo X ser pralina» 51» - Processo de acordo com a Reivindicarão 35 carac-terisado por na referida conjugado antigénico X ser prolina, C estar presente duas vezes e d_. e estarem ambos presentes» éâ= - Processo de acordo com a Reivindicação 3S carac-terisado por no referido conjugado antigénico MNtD ser ainda definido como qualquer um dos equivalentes isolados de MNtD, seu fragmento ou variante., tende? o referido MNtD» seu fragmento ou variante 5 ou ma is aminoácidos de comprimento e dando rsacçao imunológica cruzada com um ou roais dos seguintes peptídeoss YNKRKR1Η18PSRAFYTTKN í IGIl 5. NNTTRSϊΗISP8RAFYATSDIIGDI ou NNTRKSIRIQRSPGRAFvTI8KISN« 7â„ - Processo de acorde? com a Reivindicação 3» carácter i sado por no referido conjugado antigénico MNtD ser ainda definido coroe? qualquer uns dos equivalentes isolados de MNtD da Tabela IIs

   f-sfftostras ds liQuivâlsnts? i.SDiSDO‘» O Ώ Cíárj,**t! Ί H-~ *«.*»— 4mf v.i -... I i ·,.. v.i -«ϊ *z. Ir-mUA iUiãL. MN CTRPNYNK RK R IHIGPGR AmTKNIIGTIRQAHC SC ----N-T TR S — --A-GD--D- WMJ3 D--DIA -R - — --- GE-R-N---- WMJ1 -----N-V -R H -----— -- GE-R-N--- WMJ1.5 -----N-V -R -H ~!--- -- YGE-R-N-- CC ------N T- KG — -V—ARR-D-- CHILDES -----N-T — S — -I-A-AR---D----- WMJ3.3 ---DIA - -R — 1 1 1 1 1 1 í 1 cl) >« 1 J.GOUD 1 ----N-T — S — -A-QK-K--- 6587-4 ---YS-V -N - — —H-R-T-DM---R- WMJD ---- NV- R-H — --- GE-R-N-- CHILDES ----NT—S — -I-A-AR---D----- J.GOUD 2 -----N-T — S -N---- -G-A-GQ--N------ BAL --N-T — S -s---- ————GE--D----- SF2 ----N-T — s -Y----- —B—GR--D—K--- SF4 ---N-T — S -Y--- —H—GR-D—K-- RJS4.26 --K -I -H M---- -A-GG-M-D- NY5 -N-TK - G -A-- TL-AREK-D- 2321 -M---N-T — S -S-- —FA-GD-D- JWK264 -N-T - -S -WSVH—GE-V-D- 6587-7 1 1 G-- -I-AIGD-D- IIIB(BHIO) ---NT *—SIR -QR- —V-IGK- -NM- 6587-3 —N-TRA-LS - - S—A-R—V- WMJ-2 ----—N VR -s LS-- ——R— RE-1-- WMJ2.3 ----N VR -s LS--- — RYRE-1-- RF ---N-T — s _TK---- VI-A-GQ--D—K--- CDC42 ---NT — - VTL-- VW--GE-L-N-- CDC451 ---HT — — VTL---- VW--GE-L-N---- Designação Oficial Sequência dg. Agl.Hqáçidqs Z3 -GSD-KI-QS -R----KV— A-GG- - G--- RUTZ Y-NI—GTHVG-V--I-A-N—K-SGN 1AV-MAL 1 1 0 1 « H 1 1 o —F---Q-L- G-V-D—R-Y- SF33 -N -R -R -TS---KVL-GE-D—K-Y- SF170 --N-T — S GT--Q-A-GD--D-Y- LAVELI -A---QNT- Q- TP—L- QSL--RSRS1-G- Z6 ---NT-QSTP - -L- Q-L-RGRTKI-G- JY1 -- D—IT-QSTP — —L— Q—L— T—K—D----Y— € NOTAs Os traços na Tabela IIindicam que a substituição ê a mesma definida pela letra da primeira linha» Uma letra é uma substituição apenas para aquela linha. Assim* por exsmplo? as três primeiras sequências de amincácidos dos quatro primeiros isolados sScu respectivamente,: CTRS CTRS DTR. CTR» 8ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 25 carac-1 terizado por o referido conjugado antigênico ser um conjugado cavalenis de Omp de Nsisseria e do determinante tendo a sequência peptidica de YMKRKRIΗISPBRAFYTTKN11GTI Cdo isolado MN). 9IL -· Processo da acordo com a Reivindicação 2* carac-· terisado por o referido conjugado antigênico ser um conjugado cavalente de Omp de Nsisseria e do determinante tenda a sequência peptidica de NNTTRB1ΗϊBPBRAFYATBD116DI (do isolado SC). ίθϋ= - Processo de acordo com a Reivindicação 2S caracteriaadD por o referido conjugado antigênico ser um conjugada cavalente de Omp de Neisseria a do determinante tendo a -X sequência peptídica da NN í‘RKSIKIQRBPSRAKV1 IbKiiiM (da isolada ΪΪ1Β). iiã = -· Processo de acorda cam a Reivindicação 2S caracterizado por α referida conjugado antigénico ser um conjugado covalente de Omp de Nexsseria e do determinante tendo a sequência peptídica consensus LNESvE INCTRPPNNNTRKSIΗ16P6RAFYTTBRII8DIRQAHC * 12ã=, - Processe? de acorde? com a Reivindicação 2.-caracterizado por d referido conjugado antigénico ser um conjugado covalente de Omp de Neisseria s de um determinante de 5 ou mais aminoácidas coe a sequência peptídica consensus= 131« - Processo de acordo com a Reivindicação 25 caracterizado por no referido conjugado antigénico a ligação covalente entre MNtD e Omp consistir essencialmente nu® espaçador bigenêrico» Í4â« - Processo de acordo com a Reivindicação 3? caracterizado por no referido conjugada antigénico a 1igaçlo cova lente entre HiMtD e Omp consistir essencial mente num espaçador bigenérica= 15§.» ~ Processo de acordo com as Reivindicações 1-14 = caracterizado por se preparar o referida conjugado antigénico em combinação com qualquer um dos antivirais* imunomoduladores, antibióticas ou vacinas da Tabela 111=

   1 S l30 i S i 11 ΑΙ.-721 Ethigen ARC. PGL BETASEROX Triton Bíosciences AIDS, ARC, KS (interferao beta) - CARRIS^X Carrington Labs ARC (polimanoacetato) CYTOVENE Syntex < .>v - xV CMV (ganciclovir) DDC Hoffmann-La Roche AIDS, ARC (didesoxitidina) Inf por HIV, retinite por CMV FOSCARNET Astra AB ('f osf onof ormato di-sódico) HPA-23 Rhone-Poulenc Sante Infecção por HIV ORNIDYL Merrell Dow PCP % (eflornitina) 1 Abreviaturas: AIDS (Síndroma da Imunodeficiência Adquirida); ARC (complexo relacionado com AIDS); CMV (Citomegalovírus, o qual provoca uma infecçSo oportunistica resultando em cegueira ou morte nos pacientes com AIDS); HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana, anteriormente designado LAV, HTLV-III ou ARV); KS (Sarcoma de Kaposi); PCP (Ppneumonia por Pneumonocystis carinii, uma infecção oportunistica); PGL (linfadenopatia persistente generalizada ) . Ν, Wofflís. da Droga Fabricante Indicaclq PEPTIDE T Península Labs AIDS C sequfncia octapeptidica) RETCULOSE Advanced Virai AIDSs ARC C nucIsofosfoproteína) Research IR burroughs Weiicome AlDS? AHC (sidovudina) avançado AIDS pediátrico KS? HIV assimp, HIv senos grave envol viinsnto neurológico RIFABUTÍN Adria Labs ARC íansasicina LM 427) (trinistrexato) Warner-Lambert PCP UA©01 Ueno Fins Chem AIDS? ARC Industry VIRAZOLE Viratek/ICN AIDSPARC5 KS (ribavirina) WELLFERON Burroughs Wellcome KS5 HIVp ©m (interferSo alfa) cofiib» c:am RETRQVIR ZGVIRAX Caciclovir) Burroughs Wellconie

   AIDSj ARC, em comh = com RETROV í R

   B- liBUQQ^oduiadores MSOl®.....,d§ Droga ABPP (bropirimina) i-afcr icants Upjohn IndicacSo AIDS avançado, !<B ftMPLIGEN ÍRNA desamparelhado) DuPont HEM Research hHC, Γ·14"ηί í Uí:~. <Anticorpo anii-inierfecâo alfa humano) Advanced Biatherapy Concepts AIDS, ftRC* KS Factor Estimulador de Colónias (GM-CSF) Bandos Benetics Instituis AIDS, KS ARC? Hl 7 5 01.240,730 (CL.246 5 738) American Cynamid AIDS IMPRES-1 I cnrgQ AIDS, KS arc5 PBL ? T^1PQ?TR..-.’7 I mrea AIDS, KS ARC, PGL, IMUTH10L ídietil dítio carbamaio) MerieuK Instituis AIDS, ARC IL--2 (:Lnterleuquina~2> ftome da Droga IL--2 (ir»terleuquina-2> INTRON-A (interferão alfa) ISOPRINOSIME (inosina pranoben) (iBstionina sncsíalina) MTP-PE (muramil-tripeptídeo) THY110PENTÍN íTP-5) (composto tá.mico) ROFERQN íinterfsrso alfa) (eritropoietina racombinants) Fabricante. Hoffmann~La Roche ImffiuneK Schering-Plough Mewport Pharniaceuticals TM í Pharmaceuticals Ciba-8eigy Ortho Pharmacsuticals Hoffmann-La Rochs Ortho Pharmãceuticals Indicaclo AIDS, KS ARC, PSLP pacientes HIv--seroposi tivos AIDS, ARC ínfecçSa por H1V anemia grave associada a AIDS e terapia com RETROVIR TREXAN CnsitrsKona) TMF (fsetor de tamoral) Benentech AKC, em necrose combinação com intsrfarao gama c. êoMàléticos PEíMTft-M 3@0 (isoiionato tí© pentamidina) 3ao Merck AIDS* ARC iòâ» - Procssso ds acordo com as Reivindicações 1“35 9-í45 caracterizado por no referido conjugada antigénico α referido Gmp derivar de Meissería msningitidis. 17ã» - Processa de acorda coe a Re ivind icação 1 ? caracterizado por o referido conjugado antigénico consistir essenciaImente em (RPi35)^ ^-Omp tendo uma ligação covalente consistindo num sspaçadar biqenêrica» sendo a referido Omp purifiçado a partir de Neisseria meninoitidis·., ISãr ~ Processa para a preparação de um «Cocktail» de conjugados antigénicos consistindo essencialmente numa mistura de qais da que uma espécie molecular dos conjugados antigénicos de acordo com as Reivindicações 1—14 ou 17» !9ã» - Processa para a preparação de uma vacina contra SlDA;i caracterizado por se incluir na referida vacina um conjugada antigénico do principal determinante de neutralização da HIV ligado eovaIsntemente ao proiossoma purificado da membrana externa de Meisseria. sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunológicos veiculo ou vector adequado, sendo a

   \

   5Q referida vacina para ser usada antes s após a sxposiçlo para prevenir ou .tratar infecçSo ou doença devida a HIV, sendo a referida vacina capas de induzir anticorpos nsu trai i cantes específicos para HIV« 2Θ§„ - Processo de acordo com a Reivndicaçlo 195 caractsrizatío por o conjugada antigénica ser da fórmulas (MNtD)nxv\ (Omp) andes MWtD é o principal determinante de neutralizaçSo de HIV5 o qual à um polipeptídeo de uma ou raais sequências da aminaécidosf n indica o número de polipeptídeos de HMtD' cova1ent ements ligados a Omp e á 1~56§ λλ/ indica ligaçSo covalente ρ Omp é o proteossoma purificado da membrana externa de Nelsssrla=, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, dando o referido MNtD reacçlo imunológica cruzada com um ou mais dos seguintes pepti-deos s YNKRKRIHI6P6RAFYTTKNIIBT1, NNTTRSIHIGP8RAFYATGDII6DI ou NNTRKSIRIORBPBRAFVT Ϊ BK ϊSN. 2il5c - Processo de acordo com a RsivndicagSo 19 y caracterizado por o conjugado antigênico ser da fórmulas

   (MNtD)n'vA<0mp) onde 5 MMtD è o principal determinante de neutralização de HIV, o qual ê um polipaptídeo de uma ou mais sequências de amincsácidoss n indica o número de polipeptídeos de HNtD cova1entemente ligados a Omp © ê 1~5Θ§ ______________ ΛΑ indica ligação covalente | Omp â o protsGssasa purificado da membrana externa de Nsisseria« ou um seu sal farmaceuticaments aceitável ? sendo o referido MNtD um polipeptídeo com uma sequência de 44 aminoécitíos ou menos5 mas tendo pelo menos 5 aminoácidos de comprimento7 da fórmulas 0 =j ,e O J0 C está ausente ou é císteinag J., está ausente ou é qualquer peptídeo até 19 aminoácidos de comprimentos S é glioinaj X ê prolina5 leucina-;! alanina glutamina ou serina= a ãn está ausente ou é qualquer polipeptídeo até 2© aminoácidos de comprimento» 22iU - Processo de acordo com a ReivindicaçSto 21 ? caracterizado por X ser prolina» 231 =

   Processa de acordo coe a Reivindicaçlo 21s caracterizade por X ser prolina5 C estar presente duas vezes e J., e -j.-j sstars;;· ambos presentes» 241= ~ Processo de acordo com a Reivindicaçlo 21, caracterizado por MNtD ssr ainda definido como qualquer um das equivalentes isolados de MWtDg seu fragmento ou variante? tendo o referido MNtD9 seu fragmenta ou variante 5 ou roais aroinaácidas tie comprimento e dando reacçSo irounolágics cruzada com um eu mais dos seguintes peptidsoss ynkrkrihispgrafyttkniioti, NMTTRS íΗ16P6RAFYATGD11BD ϊ ou ΝΜΎRKS1R1ORGPSRAFVTIBKíBM. 251= - Processo de acordo com a Reivindicaçlo 21= caracterizado por MNtD ser ainda definido como qualquer um dos equivalentes isolados de HNtD da Tabela II? anteriorments referida·.
2. 261. - Processo de acordo com a Reivindicação 2®. caracterizado por o conjugado antigénico ser um conjugado covalsnte de Offlp de Meisseria e do determinante tendo a sequência peptidica de YNKRKRΣΗ18P8RAFYTTKWIΙΘΤΙ (do isolado MN).
3. 271. - Processo de acordo cocn a Reivindicaçlo 2®s caractsrizado por o conjugada antigénico ser um conjugado cova-lente de Qmp de Mslsseria e do determinante tendo a sequência peptidica de NNTTRSIH!6PSRAFYAT8DII8DI (do isolado SC).
4. 281. - Processo de acordo com a Reivindicaçlo 2®s conjugado caracierizado por α conjugado antigénico ser um

   covalente d© Orap ds Nslsseria e do determinante tendo a sequência paptidica de NNTRKSIRIQRSPBRAFVTISKIGIM (da isolado IIIBK 291« ~ Processo ds acordo com a Reivindicação 2&, caracterizado por o conjugado antigénico ser um conjugado cova-lente de Ornp ds Nslsseria e do determinante tendo a sequência paptidica consensos LNESVEI^TRPFNNNTRKSIHI8PSRAFYTTBRIISDIRQAHC» 3®s« - Processo de acordo cora a Reivindicação 2Θ* caracterizado por o conjugado antigénico ser um conjugado cova-lente de Ornp de Nsisssria e de um determinante de 5 ou m-ais aminoácidos com a sequência paptidica consensus, 3iã« - Processo ds acordo com a Reivindicação 2Θ, caracterizado por a ligação covalente entre MNiD e Omp consistir essencialmente num espaçador biqenérico» 321» - Processo ds acordo com a Reivindicação 219 caracterizado por a ligação covalente entra MNtD e Orap consistir essenc iaimente num espaçador bigenérico» 331« - Processo ds acordo cora as Reivindicações 19--32 ? caracterizado por se preparar uma vacina contra SIBA* em combinação com qualquer um dos sntivirais? imunomoduladores3 antibióticos ou vacinas da Tabela III ? anteriormente referida» 341« - Processo de acordo cora as Reivindicações 19-21f 2ò-32f caracterizado por o referido Qap derivar ds Meisseria 351« - Processo ds acordo com a Reivindicação 19* caracterizado por o conjugado antigénico consistir essencialmente· em (RPl35)-^ ^-Omp tendo uma ligação cova lente consistindo num 62 espaçador bigenérico, sendo o referido Omp purificado a partir de N til seria aeninaitidis·. 3ò§» - Processo de acordo com as Reivindicações 19---21, 26-3Θ ou 35, caractarizado por se obter uma vacina contra SIDA compreendendo um «cocktail» ds conjugados antigénicos consistindo essencialmenta numa mistura ds mais do que uma espécie molecular dos referidos conjugados antigénicos» 37ã« ~ Processa para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição um conjugado antigénico do principal determinante ds neutralização do HIV ligada covalentemente so arotossoma purificado da membrana βκterna de Neisseria. sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunológico, sendo a referida composição útil como uma vacina capaz de produzir anticorpo neutralizante específico para HIV em mamíferos» 33ã„ - Processo ds acordo com a Reivindicação 37» caracterizado por o conjugado antigénico ser da fórmulas (Omp) onde ã MNtD è o principal determinante de neutralizaçlo de H1V, o qual ê um polipeptídso de uma ou mais sequências de aminoácidosH n indica o número de polipeptideos de MNtD covalentemente ligados a Omp e é l-5®s ----------------- /'W indica ligaçlo cova len te ?; Omp & o proteossoma purificado da membrana skterna de Neissaria» ou. um ssu sal farmaceuticamente aceitável* danda o referida MNtD reacçSo imunológica crusada com um ou mais dos seguintes pepti— d aos s YNKRKRIHISPBRAFYTTKNIIGTI, NNTTRSϊΗ1SPSRAFYATGDIIBDI ou NNTRKSIRIORGPGRAFVTIGKIBM= 39â= --· Processo de acordo com a Reivindicação 37* caracterizaclo por o conjugado sntigénico ser da fórmula o onaen MNtD é o principal determinante de neutralização de MV* o qual é um polipeptidea de uma ou mais sequências da acinoâcldoss n indica o número de polipeptídeos de MNtD covalentemente ligados a Omp s â 1~5Θ§ indica ligação covalente s Omp é o proteossoma purificado da membrana skterna de Meisseria., ou um seu sal farmacsuticamente aceitável, sendo o referido MNtD um polipeptidea com uma sequência de 44 aminoácidos ou menos* mas tendo pelo menos 5 aminoácidos de comprimento* da fórmulas C—J ϊ ·~8—)(— C- C está ausente ou é cisteinap 64

   J, está ausente ou é qualquer peptídeo até 19 arâinoácidos de comprimentop G é glicinas λ ê prolinan leucinsii alanina glutamina ou serinan s 3,, está ausente du ê qualquer polipeptideo até 2® aminDácidos de comprimento» 4&§ = - Processo tie acordo com a ReivindicaçSo 3'9„ caractsrizado por X ser prolina » 4i§ = ~ Processo de acordo com a ReivindicaçSo 39? caracterizado por K ser proiinag C estar presente duas vezes e J1 a estarem ambos presentes» 42ã» ™ Processo de acordo com a ReivindicaçSo 39» caracterizado por MNtD ser ainda definido como qualquer uns dos equivalentes isolados de HNtDs seu fragmento ou variante5 tendo o referido s1NiDs seu fragmento ou variante 5 ou mais aminoácidos de comprimento e dando reacção imunológica cruzada com um ou raais das seguintes psptidsoss YMKRKRIΗISPGRAFYTTKN118T Ϊ, NNTTRSIΗIGP8RAFYATSDII8DI ou NNTRKSIRIDRGPGRAFVTISKISN» 43s» - Processo de acordo com a ReivindicaçSo 395 caracterizado por MNtD ser ainda definido como qualquer um dos equivalentes isolados de MNtD da Tabela II., anteriormenfce referida » 44s= -- Processo de acordo com a ReivindicaçSo 33 5 caracterizado por o conjugado antigénico ser um conjugado covalente ds Omp de Meisseria e de um determinante tendo a sequência peptídica ds YMKRKRIΗXBPGRAFYTTKNϊIBTI (do isolado MN). 45§ = - Processo de acordo coo a Reivindicação 38 ;s caracterizado por o conjugado antígénico ser um conjugado cova-lente d® Oi»p ds Meisseria e ds um determinante tendo a sequência peptídica ds NNTTRSIHIBPBRAFYATBBÃIGDI (do isolado SC). 4ésL - Processa de acorda com a Reivindicação 38 caracterizado por o conjugado antigênico ser um conjugado cova-lente ds Omp de Meisseria e de um determinante tendo a sequência peptídica ds NNTRKSZRIGRBPGRAFVTIBKIBM Cdo isolado IIIB). ΙΙΪΒΚ 47â. - Processo ds acordo com a Reivindicação 38 = c-aractsrizado por o conjugado antigênico ser um conjugado cova-lente ds Omp ds Meisseria s ds um determinante tendo a sequência peptídica consensas LNEBVEINCTRPPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTBRII8BIRQAHC. 48â= - Processo ds acorda com a Reivindicação 38 3 caracterizado por o conjugado antigênico ser um conjugado cova-lente de Omp de Meisseria s de um determinante ds 5 ou mais sminoácidos com a sequência peptídica consensos„ 49-1 = - Processo ds acordo com a RsivindicaçSo 36* caracterizado por a ligação covalente entre MNtD e Omp consistir essencia1mente num espaçador bigenérieo. 5®s = - Processo ds acordo com a Reivindicação 39= caracterisado por a ligação covalents entre MMtD e Omp consistir essencialmente num espaçador bigenérieo* 5iâ. - Processa ds acordo com as Reivindicações 37--5®3 caracterisado por se preparar uma composição farmacêutica em

   combinação com qualquer um das antivirais^ imunomoduladores, antibióticos ou vacinas da Tabela III9 anteriormente referida. 52â» ~ Processo de acordo com as Reivindicações 37--39=, 44-505 caracterieado por o referido Omp derivar de Neissaria 0®niQSÍ£idis· 53â« - Processo de acordo com a Reivindicação 37, csracterizado por se preparar urna composição farraacfutica consistindo sssencialmente am CRPISS)^, ^-Omo tendo uma ligaçSo cova- *-.s a O lente consistindo num espaçador bigenêrico, sendo o referido Omp purificado a partir de Nsisssria roeninqitidisa 54¾ „ - Processo de acordo com as Reivindicações 37-39. 44-48 qu. 53, caracterizada por ss preparar uma composição farma-cSutica compreendendo usn «cocktail» de conjugados antigénicos consistindo essencialmente numa mistura de sisais do que uma espécie molecular dos referidos conjugados antigénicos. 5Sã. - Método de vacinação contra SIDA? caractsrizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacfutica compreendendo um conjugado antigénico do principal determinante de neutralisaçao do Hlv ligado covalente— mente ao protossoma purificado da membrana externa de Naissaria =, sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunológico adequado5 e estando a gama de dosagem compreendida entre 50 mg a 500 mg por inoculação. 5óã. - Método de vacinação contra ARC3 caractsrizado por compreender a administração de unia quantidade eficaz de uma composição farmacfutica compreendendo um conjugado antigénico do principal determinante-de neutralizaçlo da HIV ligada cavalente-msnte ao protossoma purificado da membrana externa de Meisseria. 67 senda o referido conjugado misturado com um adjuvante imunológico adequado? e estando a gama de dosagem compreendida entre 50 mg a SOO mg por inoculação» 571« ~ Método para a prevenção da infseção par HIv? caraeterizada por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado antigénico do principal determinante de neutralização do HIV ligado covalsniemente ao protossoma purificado da membrana externa de Msissarla, sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunolégico adequado? e estando a gama de dosagem compreendida entre 5© mg e 5©© mg por inoculação» 581» - Método para d tratamento de 3IDA? caractsrizado por compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um conjugada antigénico do principal determinante de neutralização do HIV ligado covalente-mente ao protossoma purificado da membrana εκ terna de Meisseria,; sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunolégico adequado? s estando a gama de dosagem compreendida entre 5© mg a 5Θ© mg por inoculação» 591» - Método para o tratamento de infseção por HIV? caracterizado por compreender a administracães de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um conjugado antigénico do principal determinante de neutralização do HIv ligado covalentemente ao protossoma purificado da membrana e;íterna de Neisseria» sendo o referido conjugado misturado com um adjuvante imunolégico adequado? e estando a gama de dosagem compreendida entre 5© mg e 5Θ© mg por inoculação» 6©1=, - Métodos de acordo com as reivindicaçSes 54-59? caracterizados por o referida conjugado ser da fórmula (MNtD)n/vA (°mP) QHtiSS HIMiD á d principal determinante ds neutralização de HIV? o qual á um polipeptideo ds uma ou mais ssqufnelas ds aminoácidosρ n indica d número de polipeptideos ds MNtD covalentemente ligados a Qmp s é 1-5Φρ (V indica ligaçao covalente p Omp é o proteossama purificado da membrana externa de Neisssria. ou um seu sal farmaceuticamente aceitávels dando o referido MMtD rsaeção imunelógica cruzada com um ou mais dos seguintes pepti— dSOSii YNKRKRIHlBP8RAFYTTKW Ϊ1011 = NNTTRSIΗ Σ SPSRAFYATGD11BDI ou WNTRKSIR.1QRSPSRAFVTISKI6N. éll= - métodos ds acordo com as reivindicações 54-5?,, caracterizados por o referido conjugado ser da fórmula (MNtD)n^vv(Omp> onde? liNtD é o principal determinante de neutralização de H2V* o qual é um polipepfci.dsa ds uma ou mais sequências ds afliinoácidosp n indica o número de polipeptideos de MNfcD covalentemente ligados a Omp s ê l--5ôs indica ligação covalente § Omp é g proteossoma purificado da membrana externa de Neisseria. ou um seu sal farmaceuticaroente aceitávelP sendo o referido HNtB um (3Dl.ipepti.deo com uma sequ@nc.ia de 44 aminoécidos ou menos* mas tendo pelo menos 5 aminDácidos de comprimento,, da fórmulas —Η—X—K —J C J. c?ndss C está ausente ou â cisteina§ JL está ausente ou é qualquer peptídeo até 19 aminoácidos de comprimentos G á glicinag X é pralinaj leucina*, alanina glutamina ou serinag s =j._, está ausente ou é qualquer polxpeptídeo até 20 aminoácidDS de comprimento* 62â* - Métodos de acordo com a reivindicação èi * caractarisaflos por X ser prolina. 63§* - Métodos de acordo com a reivindicação èl? caracteri zados por X ser prolina? C estar presente duas vsses ® J., e estarem ambos presentes. I. 64ã» - Métodos de acordo com a reivindicação èl, caracterizados por MNtB ser ainda definida coroo qualquer um dos equivalentes isolados de MNiP* seu fragmento ou variantes tendo o referido MNtD5 seu fragmenta ou variante 5 ou tsais aminoácidos de comprimento e dando reacç-ão irounológica crusada coai u.m ou mais dos seguintes peptídeoss * ι «:

   YNKRKRIHI8PGRAFYTTKNXΪ6ΤΊ , WNTTRSíHIBPGRAFYATBDIϊΘυϊ ou IMMTRKS Σ R ϊ QRSPSRAFVT ί SK18Μ. 651 = - Métodos de acordo coe a reivindicação 61 y caracterizados par MNiD ser ainda definido como qualquer um dois equivalentes isolados de MNiD da Tabela II5 anteriorsnenfce referida = 661 = ~ Métodos tíe acordo coo a reivindicação 6® = carac ter izsdos por a conjugado ser um conjugado cova lente de Osip de Neisseria e do determinante tendo a sequfncia peptidica de YNKRKRIΗISPSRAFYTTKNI ϊ 8TI ído isolado MN). 671 = — Métodos de acordo com a reivindicação 66 5 caracterizados por o conjugada ser um conjugado covalente de Omp de Neisseria e do determinante tendo a sequência peptidica de MNTTRSIΗ10PGRAFYATGDXXSDI Cdo isolado SC). 681 = - Métodos de acordo com a reivindicação 66 = caracterizados por o conjugado ser um conjugado covalsnts de Omp de Neisseria e do determinante tendo a sequfncia peptidica de NMTRKSIRΣQRSP6RAFVTIGKISN <do isolado IIIBL 691= - Métodos de acordo com a reivindicação é@? caracteriçados par o conjugada ser um conjugado covaiente de Omp de Neisseria e do determinante tendo a sequfncia peptidica consensus LNESVEINCTRPPNNNTRKSIΗI6PGRAFYTT6RIIGDIRQABC= 701= — Métodos de acordo com a reivindicação 66 ? caracterizados por o conjugado ser um conjugado covaiente de Omp de Neisseria e de um determinante de 5 ou mais aminoácidos com a ssqufnc:ia pspiidica consensus κ

   71â» - Métodos de acordo com a reivindicação csrsctsrissdos por a ligação covalante entre HNtD e Omp consistir essencialmsnte num espaçador bigenérico» 72§= ··' Métodos do acordo com a reivindicação 61 ? caracterizados por a ligação cova lente entra MNiD e Ooip consistir essencialmento num espaçador bigenérico, 73â» - Métodos ds acordo com as reivindicações 55-59? caracterizados por o conjugado sntigénico consistir essencialmen-is em CRPJ.35>_ -p-Omp tendo uma ligação covalenta consistindo num S «w* espaçador bigenérico5 sendo o referido Omp purificado a partir de Ne.isse.ria meninjitidis 74ã.. - Métodos ds acordo com as reivindicações 55~59;; caracterizados por a referido conjugado ser administrado em combinação com qualquer um dos antivirais,. imunomodulaeíorssP antibióticos c?u vacinas da Tabela III5 anteriormersts referida» 75§„ - Métodos de acordo com a reivindicação 61» caracterizados por o referido conjugado ser administrado em combinação com qualquer um dos antivirais5 imunomoduladores3 antibióticos ou vacinas da Tabela Ϊ11» anteriormente referida» 76ã» -· Métodos de acordo com as reivindicações 55-5?» caracterizados por a referido conjugado consistir assencialmenie em <RP135>^ -.-Omp tendo uma ligação covalente consistindo num espaçador bigenárico, o referido Omp sendo purificado a partir de Meisseria meningitidis» sendo o referido conjugado administrado em combinação com qualquer um dos antiviraiss imunomoduladores, antibióticos ou vacinas da Tabela ΣIIs anteriorments referida» 77ã» ” Métodos de acordo coo as reivindicações 5Θ-59. caracterizadas por o referido conjugado compreender um «cocktail» de conjugados aniigénicas consistindo essencialmente numa mistura da mais do que uma espécie molecular dos referidos conjugados antigénicos» Lisboa» 5 de Junho de 1ν9Θ

   Agante Oíiciãl da Prapriedaie Industrial HUA VICTOH COR0ON. 10-A, 1/ 1200 Lfâao*