JP2002533125A - 改変ｈｉｖｅｎｖポリペプチド - Google Patents

改変ｈｉｖｅｎｖポリペプチド

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Abstract

(57)【要約】 改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドが開示される。この改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも開示される。このＥｎｖポリペプチドは、ＣＤ４結合領域の少なくとも一部を曝露するように改変される。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する診断方法が提供される。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する処置もまた提供される。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用する予防の方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、概して改変されたＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）ポリペプチドに関
する。このポリペプチドは、被験体における免疫応答（例えば、細胞性免疫応答
または保護的免疫応答）を生成するための免疫薬剤として有用である。より詳細
には、本発明は、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐｌ２０、ｇｐｌ４０または
ｇｐｌ６０）に関し、ここで、ネイティブβシート立体配置の少なくとも１つが
改変されている。本発明はまた、これらのポリペプチドを用いて、広汎なＨＩＶ
サブタイプにたいする免疫応答を惹起する方法に関する。 （発明の背景） ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）（ＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬ
Ｖ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも呼ばれる）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およ
び関連する障害の病因因子である。（例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ、
ら、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｇａｌｌｏら（１
９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：５００−５０３；Ｌｅｖｙら、（１９８４）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：８４０−８４２；Ｓｉｅｇａｌら、（１９８１）、Ｎ
．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５：１４３９−１４４４を参照のこと）。ＡＩＤ
Ｓ患者は、通常、長期の無症状期間を有し、続いて、免疫系および中枢神経系の
進行的退縮が起こる。このウイルスの複製は、高度に制御されており、そしてそ
のＣＤ４陽性ヘルパーサブセットのＴリンパ球の潜伏性感染および溶解性感染の
両方が、組織培養物において生じる（Ｚａｇｕｒｙら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３１：８５０−８５３）。ＨＩＶ−１の分子研究によって、このウイル
スは多数の遺伝子をコードすることが示されている（Ｒａｔｎｅｒら、（１９８
５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７−２８４；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏ
ｒら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：４８４〜４９２）。これには、３
つの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）が含まれ、これらは、すべての
レトロウイルスに共通している。他のレトロウイルス（特に、ＨＩＶ−２および
サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（以前にはＳＴＬＶ−ＩＩＩと称された））の
ウイルスゲノムからのヌクレオチド配列もまた、これらの構造遺伝子を含む（Ｇ
ｕｙａｄｅｒら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：６６２−６６９；Ｃｈａ
ｋｒａｂａｒｔｉら、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ）。
【０００２】 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０
ｋｄの糖タンパク質である（ｇｐｌ６０）。この宿主のウイルス感染の間、ｇｐ
ｌ６０は、宿主細胞のプロテアーゼによって切断されて、ｇｐ１２０および膜内
在性タンパク質であるｇｐ４１を形成する。このｇｐ４１の部分は、ビリオンの
二層膜に固定されるが、他方で、ｇｐ１２０セグメントは、まわりの環境へと突
出する。ｇｐｌ２０およびｇｐ４１は、より共有結合的に会合しており、そして
遊離のｇｐ１２０は、ビリオンおよび感染した細胞の表面から遊離され得る。
【０００３】 図１に示すように、ｇｐ１２０コアポリペプチドの結晶学的研究によって、こ
のポリペプチドが特定の発散性の構造を有する主要な構造へと折り畳まれる（フ
ォールリングされる）ことが示された。内側のドメイン（Ｎ末端およびＣ末端に
対して内側）は、２つのヘリックス、二鎖の束（小さな５鎖のβサンドウィッチ
を末端〜近位末端において、および突出部を遠位末端において有する）によって
特徴付けられ、この遠位末端からは、Ｖ１／Ｖ２ステムが発散する。外側のドメ
インは、固定された（ｓｔａｋｅｄ）二重のバレルであり、これは、内側ドメイ
ンの側面に沿って存在し、その結果、外側のバレルおよび内側の束の軸は、ほぼ
並行である。遠位内側ドメインと遠位外側ドメインとの間には、４鎖のブリッジ
ングシートが存在し、これは、内側ドメイン、外側ドメインおよびＶ１／Ｖ２ド
メインと接触しているがそれらとは異なる独特のミニドメインを有する。このブ
リッジングシートは、４つのβ鎖構造（β１、β２、β２１、β２０、図１に示
す）から構成される。このブリッジング領域は、図１において、内側ドメインに
わたって主に広がっているように見受けられ得るが、その外側のドメインのいく
らかの表面残基（例えば、Ｐｈｅ３８２）は、ブリッジングシートに達して、そ
の疎水性コアの部分を形成する。
【０００４】 ブリッジング領域のβシート立体配座の基本ユニットは、β鎖である。このβ
鎖は、１ターンあたり２．０残基で、あまり厳密ではないコイルドヘリックスと
して存在する。β鎖立体配座は、βシートに組み込まれたときのみに安定である
。ここで、最適な幾何的条件に近い水素結合が隣接するβ鎖上のペプチド基の間
で形成される場合に、その鎖の双極子モーメントもまた、好ましく整列される。
同じ鎖の隣接する残基からの側鎖は、そのシートの反対側の側面から突出し、そ
して互いに相互作用はしないが、その骨格および隣接する鎖の側鎖とは有意な相
互作用を有する。βシートについての一般的な説明については、例えば、Ｔ．Ｅ
．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓおよびＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐ
ａｎｙ、１９９３）；およびＡ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、１９７５を参照のこと
）。
【０００５】 ｇｐ１２０ポリペプチドは、宿主細胞への侵入を媒介する際の装置である。最
近の研究によって、ｇｐ１２０へのＣＤ４の結合が、共同レセプター（例えば、
ケモカインレセプター）に結合することおよびその細胞へのそのウイルスの続い
ての侵入を可能にするＥｎｖにおける立体配座変化を誘導することが示された（
Ｗｙａｔｔ、Ｒ．、ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：７０５−７１１；Ｋ
ｗｏｎｇ、Ｐ．、ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：６４８−６５９）。図
１を再び参照すると、ＣＤ４は、ｇｐ１２０の外側ドメイン、内側ドメインおよ
びブリッジングシートの界面において形成される窪みに結合している。
【０００６】 ｇｐ１２０ポリペプチドの免疫原性もまた、研究された。例えば、ＨＩＶ−１
に感染した個体は、通常、インビトロアッセイにおいてそのウイルスを中和し得
る抗体を発生させ、そしてこの応答は、ｇｐ１２０糖タンパク質の第三の可変ル
ープにおける線状の中和性決定基に対しておもに指向される（Ｊａｖａｈｅｒｉ
ａｎ、Ｋ．、ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：６
７８６−６７７２；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、Ｍ．、ら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．６２：２１０７−２１４４；Ｐｕｔｎｅｙ、Ｓ．ら（１９８６）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３４：１３９２−１３９５；Ｒｕｓｈｅ、Ｊ．Ｒ．、ら（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３１９８−３２０２．）。
しかし、これらの抗体は、概して、ＨＩＶ−１の限定され多数の株のみを中和す
る能力を示す（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｔ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：９７０９９７１３；Ｎａｒａ、Ｐ．Ｌ．ら（１９
８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２６２２−２６２８；Ｐａｌｋｅｒ、Ｔ．Ｊ．、
ら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：１９３
２−１９３６）。ヒトにおけるＨＩＶ感染の経過の後期において、より広い範囲
のＨＩＶ−１単離体を中和し得る抗体が出現する（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓ
ｉ、Ｆ．ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２０：８６８−８７１；Ｒｏｂｅｒ
ｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、Ｍ．、ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１６
：７２−７４；Ｗｅｉｓ、Ｒ．、ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）
３１６：６９−７２；Ｗｅｉｓ、Ｒ．、ら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）３２４：５７２−５７５）。
【０００７】 Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら（１９９８）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓ １４ （１３）：１１２９−３９によって最近行われた研究に
よって、以下が示されている：ＣＣＲ−５共同レセプターを利用してウイルス侵
入をするＨＩＶ−１SF162ウイルスからの可変領域２の欠失によって、そのウイ
ルスは、血清によって媒介される中和に対して高度に感受性になった。このＶ２
欠失ウイルスはまた、クレードＢ ＨＩＶ−１単離体に感染した患者のみならず
、クレードＡ、Ｃ、ＤおよびＦのＨＩＶ−１単離体に感染した患者から得られる
血清によっても中和された。しかし、可変領域１の欠失は、効果がなかった。Ｌ
ＡＩ単離体ＨＩＶ−１IIIBからの可変領域１および２の欠失もまた、モノクロー
ナル抗体による中和に対する感受性を増したことを示した。この抗体のエピトー
プは、Ｖ３ループ、ＣＤ４結合部位および保存されたｇｐ１２０領域内に存在す
る（Ｗｙａｔｔ、Ｒ．、ら（１９９５）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９：５７２３−５７
３３）。ＬＡＩ株からのＶ１／Ｖ２およびＶ３の領域における欠失を有するＨＩ
Ｖ−１ウイルス（これは、ウイルス侵入についてＣＸＣＲ４共同レセプターを使
用する）を使用したウサギの免疫原性研究は、Ｅｎｖが抗体の中和を惹起する能
力の改善を示さなかった（Ｌｅｕら（１９９８）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈ
ｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．１４：１５１−１５５）。
【０００８】 さらに、ほとんどの感染した個体において見出される、あるサブセットの広汎
に反応性の抗体は、ｇｐ１２０とＣＤ４との結合を妨害する（Ｋａｎｇ、Ｃ．−
Ｙ．、ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：
６１７１−６１７５；ＭｃＤｏｕｇａｌ、Ｊ．Ｓ．、ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３７：２９３７〜２９４４）。他の抗体は、Ｅｎｖに対してＣＤ４
が結合した後に、そのケモカインレセプター結合領域に結合すると考えられてい
る（Ｔｈａｌｉ ら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９７８−３９８８）
。ＨＩＶ感染の経過の間に生成される中和抗体が恒常的な抗ウイルス効果を提供
しないという事実は、部分的に、「中和逃避」ウイルス変異体の発生、および病
因を伴う宿主の免疫系における一般的現象に起因し得る。対照的に、初期のＨＩ
Ｖ−１曝露に対する既存の中和抗体の存在は、保護的効果を有するようである。
【０００９】 成功するワクチンが、多様なＨＩＶ−１株に対して強力で、広汎な中和抗体応
答を誘導し得るべきであると広汎に考えられている。（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉお
よびＥｖａｎｓ（１９９９）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔ．１５（８）：
６８９−６９８；Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ．、Ｐ．、ら（１９９４）Ａｎｎ．Ｉ
ｎｔ．Ｍｅｄ．８：６０３−６１１；Ｈａｙｎｅｓ、Ｂ．、Ｆ．、ら（１９９６
）Ｓｃｉｅｎｃｅ；２７１：３２４−３２８．）。中和抗体は、侵入するビリオ
ンに付着することによって、標的細胞に対するその感染性を減少または妨害さえ
し得、そして組織培養物の細胞間のウイルスの蔓延を妨害し得る（Ｈｕ ら（１
９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：４５６〜４５９；Ｂｕｒｔｏｎ、Ｄ．、Ｒお
よびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、Ｄ．（１９９７）ＡＩＤＳ １１（補遺Ａ）：５８
７−５９８）。しかし、上記のように、ｇｐ１２０に対して指向される抗体は、
一般に、異なるＨＩＶ株に対する広汎な抗体応答を示す。
【００１０】 現在、ワクチン開発の焦点は、体液性免疫の観点から、ウイルス侵入に重要で
あると考えられているＣＣＲ５ケモカイン共同レセプターを利用する初代単離物
の中和に向けられている（Ｚｈｕ、Ｔ．、ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
１：１１７９〜１１８１；Ｆｉｏｒｅ、Ｊ．、ら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
；２０４：２９７−３０３）。これらのウイルスは、一般に、ＣＸＣＲ４共同レ
セプターを使用するＴ細胞株に適合された株よりも、抗体中和についてはるかに
より耐性であるが、両方とも、特定の広汎かつ強力に作用するモノクローナル抗
体（例えば、ＩｇＧｌｂｌ２，２Ｇ１２および２Ｆ５）によってインビトロで中
和され得る（Ｔｒｋｏｌａ、Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６６０
９−６６１７；Ｄ’Ｓｏｕｓａ ＰＭ．ら（１９９７）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．１７５：１０６２−１０７５）。これらのモノクローナル抗体は、それぞれ
ＣＤ結合部位、グリコシル化部位、およびｇｐ４１融合ドメインに指向される。
しかし、ワクチン接種によって適切な特異性の抗体を誘発する方法が知られてい
ないという問題が残存する。所定の単離物からのｇｐ１２０糖タンパク質によっ
て惹起された抗体（Ａｂ）は、一般に、類似の（通常は同じの）ＨＩＶ−１サブ
タイプからの密接に関連するウイルスのみを中和し得る。
【００１１】 上記アプローチにもかかわらず、例えば、ワクチンとして投与されるときに、
複数のＨＩＶ株およびサブタイプに対して、被験体において免疫学的応答（例え
ば、中和抗体および／または保護抗体）を惹起し得るＥｎｖ抗原についての必要
性が残存する。本発明は、これらおよび他の問題を、改変されたＥｎｖポリペプ
チド（例えば、ｇｐ１２０）を提供して、ＣＤ４結合部位内またはその付近にエ
ピトープを曝露させることによって解決する。
【００１２】 （発明の要旨） 本発明に従って、改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドが提供される。特に
、欠失および／または変異は、、ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドにおいて１つ以上
の４−β反平行ブリッジングシートにおいて作製される。このようにして、十分
な構造が残されて、例えば、ｇｐ１２０のポリペプチドの正確な折り畳みを可能
にし、なおも、充分なそのブリッジングシートが除去されてＣＤ溝が曝露され、
それによって、免疫応答がＥｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０）のＣＤ結
合部位内またはその付近におけるエピトープに対して生成することを可能にする
。
【００１３】 １つの局面において、本発明は、改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを包含し、ここで、このポリペプチドは、少なくとも
１つの改変された（例えば、欠失または置換された）アミノ酸残基が、ＨＸＢ−
２についての残基４２１〜４３６に対応する領域（例えば、図６〜２９（配列番
号３〜２６）において示される構造）において欠失されている。特定の実施形態
において、そのポリヌクレオチドはまた、ポリペプチドＨＸＢ−２（例えば、Ｖ
１／Ｖ２）の残基１２４〜１９８に対応する領域を欠失しているか、またはＨＸ
Ｂ−２に対して、残基１１９〜１２３、および１９９〜２１０に対応する領域に
おいて少なくとも１つのアミノ酸が欠失もしくは置換されている。他の実施形態
において、これらのポリヌクレオチドは、ブリッジングシートの小ループの少な
くとも１つのアミノ酸（例えば、ＨＸＢ−２についてのアミノ酸残基４２７−４
２９）が欠失もしくは置換されたＥｎｖポリペプチドをコードする。本発明のポ
リヌクレオチドによってコードされる改変されたポリペプチドのアミノ酸配列は
、任意のＨＩＶ改変体（例えば、ＳＦ１６２）に基づき得る。
【００１４】 別の局面において、本発明は、ＨＸＢ−２に関して４２１〜４３６に対応する
領域において欠失した、少なくとも１つの改変された（例えば、欠失または置換
された）アミノ酸残基（例えば、小さなループ領域（例えば、ＨＸＢ−２に対し
て、アミノ酸残基４２７−４２９）において１つのアミノ酸の欠失または置換）
を有する、免疫学的に改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを包含する。これ
らのポリペプチドは、ＨＸＢ−２に対してほぼアミノ酸残基４２０とアミノ酸残
基４３６との間の少なくとも１つのアミノ酸の改変（例えば、欠失または置換）
を有し得、そして必要に応じて、Ｖ１および／またはＶ２領域の欠失または短縮
を有し得る。本発明の、この免疫原性の改変されたポリペプチドは、任意のＨＩ
Ｖ改変体（例えば、ＳＦ１６２）に基づき得る。
【００１５】 別の局面において、本発明は、上記の改変されたＥｎｖポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドのいずれかを含むワクチン組成物を包含する。改変された
Ｅｎｖポリペプチドおよび必要に応じてアジュバントを含む、ワクチン組成物も
また、本発明に包含される。
【００１６】 さらに別の局面において、本発明は、被験体において、免疫応答を誘発する方
法を包含する。この方法は、１以上の上記のポリヌクレオチドまたは構築物を、
その被験体において免疫応答を誘導するに充分な量で投与する工程を包含する。
特定の実施形態において、この方法はさらに、その被験体にアジュバントを投与
する工程を包含する。
【００１７】 別の局面において、本発明は、免疫応答を、被験体において誘導する方法を包
含する。この方法は、上記の任意の改変されたＥｎｖポリペプチドおよびアジュ
バントを含む組成物を被験体に投与する工程を包含する。その組成物は、その被
験体において免疫応答を誘発するに充分な量で投与される。
【００１８】 別の局面において、本発明は、被験体において免疫応答を誘発する方法を包含
する。この方法は、以下の工程を包含する： （ａ）プライム刺激工程において上記のポリヌクレオチドのいずれかを含む第
一の組成物を投与する工程、および （ｂ）ブースタとして、上記の改変されたＥｎｖポリペプチドのいずれかを含
む第二の組成物を、その被験体において免疫応答を誘導するに充分な量で投与す
る工程。特定の実施形態において、その第一の組成物、その第二の組成物、また
はその第一およびその第二の組成物の両方は、さらに、アジュバントを含む。
【００１９】 本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に照らし、当業者には
容易に明らかである。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該分野の技術範囲内の、タン
パク質化学、ウイルス免疫学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法
を使用する。そのような技術は、文献に充分説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｓおよびＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ、１９９３）；Ｎｅｌｓｏｎ Ｌ．Ｍ．ａｎｄ Ｊｅｒｏｍｅ Ｈ．Ｋ
．ＨＩＶ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ｖｏｌ．１７，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８９
）；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ；ａｎｄ ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＢｏｙｄ、Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ｖｏｌｕｍｅｓ １
−ｐｒｅｓｅｎｔ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
、１９９９）を参照のこと。
【００２１】 本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合に、単数形「ａ
」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうでないとその内容が明らかに示さない限
りは、複数形も包含することに留意しなければならない。従って、例えば、「ａ
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」との言及は、２つ以上のポリペプチドの混合物を含
む、等々である。
【００２２】 （定義） 本発明の記載において、以下の用語が用いられ、そして以下に示されるように
定義されることが意図される。
【００２３】 用語「ポリペプチド」、および「タンパク質」が、本明細書中に交換可能に使
用され、アミノ酸残基の任意のポリマーを示す。この用語は、ペプチド、オリゴ
ペプチド、二量体、多量体などを含む。このようなポリペプチドは、天然の供給
源に由来され得るか、または合成され得るか、または組換え的に産生され得る。
この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル
化、リン酸化など）を含む。
【００２４】 本明細書中で定義されるようなペプチドは、一般に、２０個の天然アミノ酸（
Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇ
ｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅ
ｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ
（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＶａｌ（Ｖ））か
らなり、そして任意のいくつかの公知のアミノ酸アナログ（天然に存在するアナ
ログおよび合成されるアナログの両方）（例えば、ホモイソロイシン、アサロイ
シン、２−（メチレンシクロプロピル）グリシン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−
（プロップ−１−エニル（ｐｒｏｐ−１−ｅｎｙｌ））システイン、ホモセリン
、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ホモアルギニン、３−（３−カルボ
キシフェニル）アラニン、シクロヘキシルアラニン、ミモシン、ピペコリン酸、
４−メチルグルタミン酸、カナバニン、２，３−ジアミノプロピオン酸などであ
るが、これらに限定されない）もまた含み得る。本発明における使用を見出すポ
リペプチド因子のさらなる例は、以下に示される。
【００２５】 ポリペプチドまたはタンパク質の「幾何」または「三次構造」により、タンパ
ク質の全体の３−Ｄ立体配置が意味される。本明細書中に記載されるように、幾
何は、例えば、結晶学研究により、または一次構造および二次構造を成すアミノ
酸間の相互作用に基づく幾何を予測する種々のプログラムまたはアルゴリズムを
使用することにより決定され得る。
【００２６】 「野生型」ポリペプチド、ポリペプチド因子またはポリペプチド薬物により、
天然に存在するポリペプチド配列、およびその対応する二次構造が意味される。
「単離された」または「精製された」タンパク質またはポリペプチドは、そのタ
ンパク質が通常天然において関連する生物体全体から、分離および解離されるタ
ンパク質である。この用語は、種々のレベルの純度のタンパク質を示すことが明
らかである。代表的に、精製されたタンパク質を含む組成物は、その組成物中の
総タンパク質の少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０〜５０％、よ
り好ましくは少なくとも約７５〜８５％、および最も好ましくは少なくとも約９
０％またはそれ以上が、問題のタンパク質であるものである。
【００２７】 「Ｅｎｖポリペプチド」により、エンベロープタンパク質に由来する分子が意
味され、好ましくはＨＩＶ Ｅｎｖに由来する分子を意味される。ＨＩＶ−１の
エンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質である（ｇｐ１６０）
。宿主細胞のウイルス感染の間、ｇｐ１６０は、宿主細胞プロテアーゼにより切
断され、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質（ｇｐ４１）を形成する。このｇ
ｐ４１部分は、ビリオンの膜二重層に固定され（そしてそれを架橋（ブリッジ）
する）、一方ｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境へ突出する。ｇｐ１２０とｇ
ｐ４１との間には共有結合はないので、遊離ｇｐ１２０が、ビリオンおよび感染
された細胞の表面から放出される。Ｅｎｖポリペプチドはまた、ｇｐ１４０ポリ
ペプチドを含み得る。Ｅｎｖポリペプチドは、単量体、二量体または多量体とし
て存在し得る。
【００２８】 「ｇｐ１２０ポリペプチド」により、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域に
由来する分子が意味される。好ましくは、ｇｐ１２０ポリペプチドは、ＨＩＶ
Ｅｎｖに由来する。ｇｐ１２０の一次アミノ酸配列は、およそ５１１個のアミノ
酸であり、約６０，０００ダルトンのポリペプチド中心（ｃｏｒｅ）を有する。
このポリペプチドは、Ｎ結合型グリコシル化により広範に改変され、１２０，０
００ダルトンまでその分子の見かけ上の分子量を増加する。ｇｐ１２０のアミノ
酸配列は、５個の超可変領域ドメインが点在する５個の比較的保存されたドメイ
ンを含む。ＨＩＶ−１HXB-2（これから先「ＨＸＢ−２」）系統のｇｐ１２０一
次配列における１８個のシステイン残基の位置およびｇｐ１２０配列におけるお
よそ２４個のＮ結合型グリコシル化部位のうちの１３個のＮ結合型グリコシル化
部位の位置は、全てではないがほとんどのｇｐ１２０配列にとって共通である。
超可変領域ドメインは、広範なアミノ酸置換、挿入および欠失を含む。このバリ
エーションに関わらず、全てではないがほとんどのｇｐ１２０配列は、ウイルス
性レセプターＣＤ４に結合するそのウイルスの能力を保存する。「ｇｐ１２０ポ
リペプチド」は、１つのサブユニットまたは多量体の両方を含む。
【００２９】 Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）は
、βシートを形成する４つの逆平行β鎖（β−２、β−３、β−２０およびβ−
２１）からなる「ブリッジングシート（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｓｈｅｅｔ）」を含
む。２つのループ（Ｖ１およびＶ２）が、１対のβ鎖（β−２およびβ−３）か
ら突出する。このβ−２シートは、ＨＸＢ−２に関して、ほぼアミノ酸残基１１
９（Ｃｙｓ）〜アミノ酸残基１２３（Ｔｈｒ）で生じ、一方β−３は、ほぼアミ
ノ酸残基１９９（Ｓｅｒ）〜アミノ酸残基２０１（Ｉｌｅ）で生じる。「Ｖ１／
Ｖ２領域」は、ＨＸＢ−２に関して、ほぼアミノ酸１２６位（Ｃｙｓ）〜残基１
９６（Ｃｙｓ）で生じる（例えば、Ｗｙａｔｔら、（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．６９：５７２３−５７３３；Ｓｔａｍａｔａｔｏｓら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．７２：７８４０−７８４５を参照のこと）。「小さいループ」構造が、第
２対のβ鎖（β−２０およびβ−２１）から突出し、これはまた、本明細書中で
「ブリッジングシートの小さいループ」といわれる。ＨＸＢ−２において、β−
２０は、約アミノ酸残基４２２（Ｇｌｎ）からアミノ酸残基４２６（Ｍｅｔ）に
のび、一方β−２１は、約アミノ酸残基４３０（Ｖａｌ）からアミノ酸残基４３
５（Ｔｙｒ）にのびる。改変体ＳＦ１６２において、Ｍｅｔ−４２６は、Ａｒｇ
（Ｒ）残基である。「小さいループ」は、ＨＸＢ−２に関して、約アミノ酸残基
４２７（Ｔｒｐ）からアミノ酸残基４２９（Ｌｙｓ）にのびる。ブリッジングシ
ート、小さいループ、およびＶ１／Ｖ２を示すｇｐ１２０の代表的な図が、図１
において示される。さらに、選択された改変体のＥｎｖポリペプチドｇｐ１６０
のアミノ酸配列のアライメントは、ＨＸＢ−２に関して、図２Ａ〜Ｃにおいて示
される。
【００３０】 さらに、本明細書中に定義されるような「Ｅｎｖ ポリペプチド」または「ｇ
ｐ１２０ポリペプチド」は、本明細書中に記載される正確な配列を有するポリペ
プチドに限定されない。実際、ＨＩＶゲノムは、絶えず変化する（ｃｏｎｓｔａ
ｎｔ ｆｌｕｘ）状態であり、そして単離物間で比較的高い程度の可変性を示す
いくつかの可変ドメインを含む。この用語は、同定されたＨＩＶ単離物、ならび
に新しく同定された単離物、およびこれらの単離物のサブタイプのいずれか由来
のＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドを含むことは、容易に明らかであ
る。構造特徴の説明は、ＨＸＢ−２に関して本明細書中に与えられる。本開示お
よび本技術の教示を考慮して、当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば
、ＢＬＡＳＴおよび本明細書中に記載の他のプログラム）または構造特徴の同定
およびアライメント（例えば、β−シート領域を同定し得る本明細書中に記載の
「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用して、他のＨＩＶ改変体（例
えば、単離物ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶ−１SF162、ＨＩＶ−１sf170、Ｈ
ＩＶLAV、ＨＩＶLA1、ＨＩＶMN、ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4）、多様なサ
ブタイプ（例えば、サブタイプ、Ａ〜Ｂ、およびＯ）に由来する他のＨＩＶ−１
系統、ＨＩＶ−２系統および多様なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２UC1および
ＨＩＶ−２UC2）、ならびにサル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）（例えば、Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編 １９９８）；Ｆｕｎｄａｍｅ
ｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋ
ｎｉｐｅ編 １９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｆｉｅｌｄｓ、ＢＮ、Ｄ
Ｍ Ｋｎｉｐｅ、ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ、編集者、１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ
ｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｐｈｉａ、ＰＡ；（これらのウイルスおよび他
の関連ウイルスの説明のために）を参照のこと）における対応する領域を決定し
得る。改変されたＥｎｖポリペプチドの実際のアミノ酸配列は、任意のＨＩＶ改
変体に基づき得る。
【００３１】 さらに、用語「Ｅｎｖ ポリペプチド」（例えば、「ｇｐ１２０ポリペプチド
」）は、ネイティブな配列に対するさらなる改変（例えば、さらなる内部欠失、
付加および置換）を含むタンパク質を含む。これらの改変は、部位特異的変異誘
発を介するように、意図的（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ）であり得るか、または自然
に生じる変異事象を介するように、偶発的であり得る。従って、例えば、Ｅｎｖ
ポリペプチドが、ワクチン組成物において使用される場合、その改変は、免疫学
的活性（すなわち、そのポリペプチドに対する抗体応答を誘発する能力）が失わ
れるようでなければならない。同様に、ポリペプチドが診断的目的のために使用
される場合、そのような能力は保持されなければならない。
【００３２】 従って、「改変Ｅｎｖポリペプチド」は、これはブリッジングシート部分の全
てまたは一部、および必要に応じて可変領域（Ｖ１ならびにＶ２）を、欠失もし
くは置換するように操作されている、Ｅｎｖポリペプチド（例えば、上で規定さ
れるようなｇｐ１２０）である。一般に、改変されたＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２
０）ポリペプチドは、ＣＤ４結合部位を露出するために十分なブリッジングシー
トを除去されるが、正確な折りたたみ（例えば、正確な幾何）を可能にするのに
十分な構造を残す。従って、β−２０領域およびβ−２１領域（ＨＸＢ−２に関
して、約アミノ酸残基４２０と約アミノ酸残基４３５との間）に対する改変が、
好ましい。さらに、β−２領域およびβ−３領域（約アミノ酸残基１１９（Ｃｙ
ｓ）と約アミノ酸残基２０１（Ｉｌｅ）との間）に対する改変およびＶ１ループ
領域およびＶ２ループ領域に対する改変（例えば、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ
））がまた、作製され得る。全ての可能なβ−シートおよびＶ１／Ｖ２の改変が
本明細書で例示されるわけではないが、他の破壊的（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）改
変体もまた、本明細書により包含されることが理解されるべきである。
【００３３】 通常、このような改変されたポリペプチドは、タンパク質を発現する生物が培
養される、増殖培地中への分泌を可能にする。しかし、本発明の目的のために、
このよなポリペプチドはまた、細胞内で回収される。増殖培地への分泌は、多く
の検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む）、およびウ
ェスタンブロットおよび免疫沈降アッセイのような免疫学的技術（例えば、１９
９６年２月１５日に公開された国際公開番号ＷＯ ９６／０４３０１において記
載されるような）を使用して、容易に決定される。
【００３４】 ｇｐ１２０または他のＥｎｖポリペプチドは、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体
と関連するように細胞の成分と関連して、細胞内で見出される場合、あるいは可
溶性細胞画分に存在する場合のいずれかで、「細胞内に」産生される。本発明の
ｇｐ１２０および他のＥｎｖポリペプチドはまた、十分な量のポリペプチドが細
胞内に存在する場合に限り、増殖培地に分泌され得、それらは本明細書中に記載
される技術を用いて、細胞溶解物から精製され得る。
【００３５】 「免疫原性」ｇｐ１２０または他のＥｎｖタンパク質は、少なくとも１つのエ
ピトープを含む分子であり、その結果、この分子は、このタンパク質が投与され
る個体において、免疫学的反応を惹起し得るか、または診断の状況において、問
題のＨＩＶに対する抗体と反応し得る。
【００３６】 「エピトープ」により、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上
の部位が意味され、このようなエピトープを含む分子を、免疫学的反応を惹起し
得るようにするか、または生物学的サンプルに存在するＨＩＶ抗体と反応し得る
ようにする。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可
能に使用され得る。エピトープは、そのエピトープに特有の空間的構造で、３以
上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのような
アミノ酸からなり、そしてより通常には、少なくとも８〜１０のこのようなアミ
ノ酸からなる。アミノ酸の空間的な構造を決定する方法は、当該分野で公知であ
り、例えば、Ｘ線結晶構造解析、および２次元核磁気共鳴が挙げられる。さらに
、所定のタンパク質中のエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して
（例えば、疎水性研究の使用および部位指向的血清学により）、容易に達成され
る。Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８
４）８１：３９９８−４００２（迅速にペプチドを合成し、所定の抗原における
免疫原性エピトープの位置を決定する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，
８７１号（抗原のエピトープを同定するための手順および化学的に合成するため
の手順）；およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
（１９８６）２３：７０９−７１５（所定の抗体に高い親和性を有するペプチド
を同定する技術）もまた参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、１つの
抗体が別の抗体の標的抗体への結合をブロックする能力を示す単純な免疫アッセ
イで、同定され得る。
【００３７】 本明細書中で使用される場合、「免疫学的応答」または「免疫応答」は、Ｅｎ
ｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドがワクチン組成物中に存在する場合の、
このＥｎｖポリぺプチドに対する体液性および／または細胞性の免疫応答の、被
験体における発生である。これらの抗体はまた、伝染性を中和し、そして／また
は抗体−補体もしくは抗体依存性細胞の細胞障害性を媒介し、免疫宿主に保護を
提供する。免疫学的反応性は、当該分野で周知の標準的な免疫アッセイ（例えば
、競合アッセイ）で決定され得る。
【００３８】 アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一
般的に、「類似性」は、適切な位置における２つ以上のポリぺプチドの正確なア
ミノ酸対アミノ酸の比較を意味し、ここでアミノ酸は、同一であるか、または類
似の化学的特性および／または物理的特性（例えば、電荷または疎水性）を有す
る。次いで、いわゆる「同一性パーセント」が、比較されるポリぺプチド配列の
間で決定される。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は
また、当該分野で周知であり、そしてその遺伝子（通常ｃＤＮＡ中間体を介する
）のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する工程およびそれらによりコードされ
るアミノ酸配列を決定する工程、ならびにこれを第２のアミノ酸配列と比較する
工程を包含する。一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列または
ポリぺプチド配列の、それぞれ正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ
酸対アミノ酸の一致をいう。
【００３９】 ２つ以上のポリヌクレオチド配列を、それらの「同一性パーセント」を決定す
ることにより比較し得る。２つ以上のアミノ酸配列を、同様にそれらの「同一性
パーセント」を決定することにより比較し得る。２つの配列（核酸配列またはペ
プチド配列のいずれでも）の同一性パーセントは、一般に、２つの整列した配列
の間の正確なマッチの数をより短い配列の長さで割り、そして１００を掛けた数
として記述される。核酸配列の近似の整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａ
ｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：
４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより与えられる。こ
のアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）
、（第５補遺）３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
，ＵＳＡにより開発され、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により標準化されたスコア
リングマトリックスを使用して拡張され、ペプチド配列と使用し得る。核酸配列
およびペプチド配列のためのこのアルゴリズムの手段は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、ＢｅｓｔＦｉｔ
ユーティリティーを適用して、提供される。この方法のためのデフォルトのパラ
メーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａ
ｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩか
ら入手可能）に記載される。配列間の同一性パーセントおよび類似性パーセント
を計算するための他の同程度に適切なプログラムは、一般的に当該分野で公知で
ある。
【００４０】 例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対する同一性パーセントは、６
つのヌクレオチド位置のデフォルトのスコアリング表およびギャップペナルティ
を用いる、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの同一性アルゴリズムを使用して
、決定され得る。本発明に関連する同一性パーセントを確立するための他の方法
は、エディンバラ大学が著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳ
ｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配給される、
プログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージの使用である。この一組のパッケージ（Ｓ
ｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム）は、スコアリング表（例えば、１２
のギャップ開放ペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャ
ップ）に使用されるデフォルトパラメーターに使用され得る。作製されたデータ
から、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセント
およびパーセント類似性を計算するための他の適切なプログラムは、一般に当該
分野で公知である（例えば、整列プログラムＢＬＡＳＴ、これはまた、デフォル
トのパラメーターを用いて使用され得る）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡ
ＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉ
ｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂ
ｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵ
Ｍ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ
＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，Ｇ
ｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ
。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る
：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡ
ＳＴ。
【００４１】 当業者は、正確な検索パラメーターを容易に決定し、上記のプログラムで所定
の配列に使用し得る。例えば、この検索パラメーターは、問題の配列のサイズに
基づいて変化し得る。従って、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個の連
続するヌクレオチドを有する単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで（ｉ）
Ｘ個の連続するヌクレオチドは、本明細書中に記載される任意の配列由来のＹ個
の連続するヌクレオチドと、少なくとも約５０％の同一性を有し；（ｉｉ）Ｘは
Ｙに等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチド
まで、好ましくは８ヌクレオチド以上５０００ヌクレオチドまで、より好ましく
は、１０〜１２ヌクレオチド以上および５０００ヌクレオチドまで、ならびにな
おより好ましくは１５〜２０ヌクレオチド以上、本明細書中に記載される全長配
列に存在するヌクレオチドの数（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照の
こと）までであり、上記の範囲内に含まれる全ての整数値を含む。
【００４２】 本発明の合成発現カセット（および精製したポリヌクレオチド）は、本発明の
配列が問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列として使用される場合、本明細書中に記載され
る合成発現カセット配列（例えば、請求項に係る配列または本発明の他の配列）
に対して、約８０％〜１００％、８０〜８５％よりも高い、好ましくは９０〜９
２％より高い、より好ましくは９５％より高い、そして最も好ましくは９８％よ
り高い配列（これらの記載される範囲に含まれる全ての整数値を含む）同一性を
有する、関連するポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】 コンピュータープログラムはまた、特定のポリぺプチドがβシートのような構
造を形成する可能性を決定するために有用である。本明細書中に記載されるこの
ようなプログラムの１つは、タンパク質およびポリぺプチドの二次構造の計算お
よび推測のための「ＡＬＢ」プログラムである。さらに、タンパク質の二次構造
は、一次アミノ酸配列から、例えば、タンパク質結晶構造および結晶構造に関す
るタンパク質配列の整列（例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇ
ｒｏｕｐ Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｐ．Ｑ．，Ｃａｎａｄａから入手可能
なＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ
）プログラムを使用する）を使用して、推測され得る。二次構造を推測する他の
方法が、例えば、Ｇａｒｎｉｅｒら、（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．２６６：５４０−５５３；Ｇｅｏｕｒｊｏｎら、（１９９５）Ｃｏｍｐｕ
ｔ．Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：６８１−６８４；Ｌｅｖｉｎ（１９９
７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０：７７１−７７６；およびＲｏｓｔら、（１
９９３）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２３２：５８４−５９９に、記載される。
【００４４】 相同性はまた、相同な領域間の安定な二重鎖を形成する条件下のポリヌクレオ
チドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いる消化、
および消化されたフラグメントのサイズ決定により決定され得る。２つのＤＮＡ
配列、または２つのポリぺプチド配列は、これらの配列が、上記の方法を使用し
て決定されたように、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約８０％〜
８５％、好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５
％〜９８％の配列同一性を示す場合に、互いに「実質的に相同」である。本明細
書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定のＤＮＡ配列またはポリぺ
プチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。実質的に相同なＤＮＡ配列
は、例えば、特定の系に規定されるストリンジェントな条件下でのサザンハイブ
リダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条
件の規定は、当該技術に含まれる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ，前出を参照のこと。
【００４５】 「コード配列」または選択されたタンパク質を「コードする」配列は、適切な
調節配列の制御下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボでポリぺプチド
に転写され（ＤＮＡの場合）そして翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列であ
る。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボ
キシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列は、ウイルスのヌク
レオチド配列由来のｃＤＮＡならびに合成ＤＮＡ配列および半合成ＤＮＡ配列な
らびに塩基アナログを含む配列を含み得るが、これらに限定されない。転写終結
配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。
【００４６】 「制御エレメント」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位
、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサーな
どをいい、これらは集合的に、宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を
提供する。所望の遺伝子が、転写され得、そして翻訳され得る限り、これらの制
御エレメントの全てが、常に存在するとは限らない。
【００４７】 ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮ
Ａに転写し、次いでこれがコード配列にコードされるポリぺプチドに翻訳される
場合、制御エレメントは、細胞においてコード配列の「転写を指向する」。
【００４８】 「作動可能に連結される」とは、そのように記載された構成要素が、それらの
通常の機能を実行するように構成される、エレメントの配置をいう。従って、コ
ード配列に作動可能に連結される制御エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼが存在
する場合に、コード配列の発現に影響し得る。制御エレメントは、コード配列の
発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続的である必要はない。従
って、例えば非翻訳で転写されない配列の介入が、例えば、プロモーター配列と
コード配列の間に存在し得、そしてプロモーター配列は、なおコード配列に「作
動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４９】 核酸分子を記述するために本明細書中で使用される場合、「組換え」とは、ゲ
ノム起源、ｃＤＮＡ起源、半合成起源、または合成起源のポリヌクレオチドを意
味し、これは、その起源または操作により：（１）天然では結合されるポリヌク
レオチドの全てまたは一部と結合されず；そして／または（２）天然では連結さ
れるポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結される。タンパク質または
ポリぺプチドに関して使用される場合、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオ
チドの発現により産生されるポリぺプチドを意味する。原核微生物または単細胞
体として培養された真核生物細胞株を示す、「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」
、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および他のこのような用語は、交換可
能に使用され、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡのレシピエント
として使用され得る細胞、または使用されてきた細胞をいい、そしてトランスフ
ェクトされた元の細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶然または故意の
変異に起因して、元の親と形態学的に、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ補体にお
いて、必ずしも完全に同一であり得るわけではない。関連する特性（例えば、所
望のポリぺプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる
親と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれ
、そして上記の用語に包含される。
【００５０】 「脊椎動物被験体」は、脊索動物亜門の任意のメンバーを意味し、このメンバ
ーとしては、ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーのような非ヒト霊長類および
他の類人猿およびサルの種を含む）；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマの
ような家畜；イヌおよびネコのような飼いならされた動物；マウス、ラットおよ
びハムスターのような齧歯類を含む研究用動物；ニワトリ、七面鳥およびアヒル
、ガチョウなどの他のキジ類のトリのような飼いならされたトリ、野鳥および猟
鳥を含むトリが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は特定の世代を
意味しない。従って、成体および新生の個体が包含されるように意図される。
【００５１】 本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、個体から単離された
組織または流体のサンプルをいい、これらとしては、例えば、血液、血漿、血清
、糞物、尿、骨髄、胆汁、骨髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、（皮膚、気道、
腸管、および尿生殖器管の）外分泌物、胃上皮および胃粘膜由来のサンプル、涙
、唾液、乳、血球、器官、生検材料、ならびにインビトロの細胞培養構築物のサ
ンプルもまた挙げられるが、これらに限定されない。インビトロの細胞培養構築
物（例えば、組換え細胞、および細胞構成成分）としては、培養培地における細
胞および組織の増殖から生じた馴化培地が挙げられるが、これらに限定されない
。
【００５２】 用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出し得る分子をいい、これら
としては、放射性同位体、蛍光体、化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ
ｒ）、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イ
オン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）などが挙げられ
るが、これらに限定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲で蛍光を示
し得る物質またはその部分をいう。本発明を用いて使用され得る標識の特定の例
としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサ
スレッド、ルミノール、アクラジマム（ａｃｒａｄｉｍｕｍ）エステル、ＮＡＤ
ＰＨ、α−β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびウレアーゼが挙げられるが、これら
に限定されない。
【００５３】 （概観） 本発明は、改変Ｅｎｖポリぺプチド分子（例えば、糖タンパク質（「ｇｐ」）
１２０）に関する。特定の理論に制限されることなく、ＣＤ４結合部位が、外部
ドメインと内部ドメインとＶ１／Ｖ２ドメインとの間で変化するために、Ｅｎｖ
に対する免疫学的応答を生じることが、困難であったことは、明らかである。従
って、Ｖ１／Ｖ２ドメインの欠失は、ウイルスを、ＣＤ４部位に指向されるモノ
クローナル抗体による中和に対して敏感にさせ得るが、ＣＤ４結合ドメインの大
部分を覆う架橋（ブリッジング）シートは、抗体の応答を妨げ得る。従って、本
発明は、それらの大体の全体的な構造を維持するが、ＣＤ４結合ドメインを露出
する、Ｅｎｖポリぺプチドを提供する。これにより、ＣＤ４結合部位またはその
近傍のエピトープに対する免疫応答（例えば、抗体応答）の生成を可能にする。
【００５４】 本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態は、組合せら
れ得る。
【００５５】 （βシートのコンフォメーション） 本発明において、βシート構造の位置は、ＨＸＢ−２結晶化Ｅｎｖタンパク質
の３−Ｄ（結晶）構造（実施例１Ａを参照のこと）と比較して同定された。この
構造に基づいて、全ジオメトリーを維持する置換基および／または切り出しを有
し、一方でＣＤ４結合部位を露出するポリペプチドをコードする構築物を設計し
た。特に、ＨＸＢ−２の結晶構造は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｄａｔａｂａｓｅ
からダウンロードされた。Ｓｙｂｙｌ分子モデルパッケージの生体分子モジュー
ルのＬｏｏｐ Ｓｅａｒｃｈ特性のデフォルトパラメータを使用して、全体の３
級構造をさらに維持するβ鎖間のネイティブなループを置換し得るアミノ酸の相
同性および適合が決定された。次いで、改変されたＥｎｖポリペプチドをコード
する構築物を設計した（実施例１．Ｂ）。
【００５６】 従って、改変されたＥｎｖポリペプチドは、代表的に、ＣＤ４溝を露出するよ
うに除去された十分の架橋（ブリッジング）シートを有するが、Ｅｎｖ糖タンパ
ク質の正しい折り畳みを可能にするのに十分な構造を有する。例示的な構造が、
以下に記載される。
【００５７】 （ポリペプチドの産生） 本発明のポリペプチドは、当該分野で周知の任意の数の方法で産生され得る。
【００５８】 １実施形態において、ポリペプチドは、当該分野で周知の組換え技術を使用し
て産生される。このことに関連して、オリゴヌクレオチドプローブは、Ｅｎｖ（
例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドゲノムの公知の配列に基づいて発明され得、
そしてＥｎｖ遺伝子のためのプローブ遺伝子ライブラリーまたはｃＤＮＡライブ
ラリーに使用され得る。次いで、この遺伝子は、標準技術を使用してさらに単離
され得、そして例えば、制限酵素を利用して、全長配列の所望の部分で遺伝子を
切断する。同様に、このＥｎｖ遺伝子は、フェノール抽出のような公知の技術を
使用してこの遺伝子を含む細胞および組織から直接単離され得、さらに配列を操
作して、所望の切断を生じる。ＤＮＡを得るため、および単離するために使用す
る技術の説明について、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
【００５９】 改変された（例えば、切断および／または置換された）ポリペプチドをコード
する遺伝子は、公知の配列に基づいて、合成的に産生され得る。このヌクレオチ
ド配列は、所望の特定アミノ酸配列のための適切なコドンで設計され得る。完全
配列は、一般に、標準方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築
され、そして完全コード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａ
ｔｕｒｅ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３
：１２９９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１
；Ｓｔｅｍｍｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ１６４：４９−５３を参照のこと。
【００６０】 組換え技術を手軽に使用して、Ｅｎｖポリペプチド遺伝子をコードする遺伝子
をクローン化して、次いで、この遺伝子は、適切な塩基対の置換によってインビ
トロで変異誘発され得、その結果、所望のアミノ酸のためのコドンを得る。この
ような変化は、１塩基対ほどの小さな変化を含み、単一のアミノ酸の変化に影響
を与え得るか、またはいくつかの塩基対の変化を含み得る。あるいは、不適性な
二重鎖の溶融温度より低い温度で、親のヌクレオチド配列（一般に、ＲＮＡ配列
に対応するｃＤＮＡ）にハイブリダイズする不適性なプライマーを使用する際に
、この変異は、影響され得る。比較的狭い制限内でプライマー長および塩基組成
を維持することによって、そして中心に配置された変異塩基を維持することによ
って、このプライマーは、特異的に作製され得る。例えば、Ｉｎｎｉｓら（１９
９０）ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８を参照のこと。プ
ライマーの伸長は、使用するＤＮＡポリメラーゼ、クローン化された産物、変異
ＤＮＡを含むクローンに影響され、これらは、選択されるプライマー伸長鎖の分
離によって誘導される。選択は、変異プライマーをハイブリダイゼーションプロ
ーブとして使用して達成され得る。この技術は、多発生点変異を発生するために
適用可能であり得る。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９を参照のこ
と。
【００６１】 所望のタンパク質のコード配列が、一旦、単離されるかまたは合成されると、
この配列は、発現のために任意の適切なベクターまたはリプリコンにクローン化
され得る。本明細書中の教示から明らかであるように、改変されたポリメラーゼ
をコードする広範の種々のベクターは、種々の組み合わせで、失欠または変異を
有するＥｎｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結する
発現構築物を作製することによって産生され得る。従って、特定の失欠したＶ１
／Ｖ２領域をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現のために宿主
細胞中に導入される小さなループ領域および構築物中に失欠または置換基を有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結され得る。この
ような組み合わせの非制限例は、実施例に記載される。
【００６２】 多数のクローンベクターは、当業者に公知であり、そして適切なクローンベク
ターの選択は、重要な選択である。クローニングのための組換えＤＮＡベクター
および形質転換しえる宿主細胞の例には、以下が挙げられる：バクテリオファー
ジλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ
．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性バクテリア）、ｐＧＶ１１０６（グラ
ム陰性バクテリア）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性バクテリア）、ｐＭＥ２９０（
非−Ｅ．ｃｏｌｉグラム陰性バクテリア）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ
６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、
ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）、ならびにウシパピローマウイルス（哺乳動物の細胞）。一般にＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；
Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、前出を参照のこと。
【００６３】 バキュロウイルス系のような昆虫細胞発現系がまた使用され得、当業者に公知
であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉ
ｎ第１５５５号（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系
のための物質および方法は、特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）のキット形態で市販されている。
【００６４】 植物発現系をまた使用して、改変されたＥｎｖタンパク質を産生し得る。一般
に、このような系は、植物細胞を異種遺伝子でトランスフェクトするためにウイ
ルスベースのベクターを使用する。このような系の記載について、例えば、Ｐｏ
ｒｔａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）５：２０９−２２１；および
Ｈａｃｋｌａｎｄら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）１３９：１−２２を
参照のこと。
【００６５】 ワクシニアベースの感染／トランスフェクション系のようなウイルス系（Ｔｏ
ｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅ
ｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記
載される）はまた、本発明での使用を見出す。この系において、細胞が、バクテ
リオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードする組換えワクシニアウイルス
組換えでインビトロでまずトランスフェクトされる。このポリメラーゼは、Ｔ７
プロモーターを有するテンプレートを転写する場合でのみ優れた特異性を示す。
感染後、細胞は、Ｔ７プロモーターで駆動される目的のＤＮＡでトランスフェク
トされる。組換えワクシニアウイルスから細胞質内で発現されるポリメラーゼは
、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、次いで、ＲＮＡは、宿主翻
訳機によってタンパク質に翻訳される。この方法は、高レベルで一過性の大量の
ＲＮＡの細胞質産物、およびその翻訳産物を提供する。
【００６６】 この遺伝子は、プロモータ、リボソーム結合部位（バクテリアの発現のため）
、および必要に応じてオペレータ（まとめて、「制御」エレメントと本明細書で
は呼ぶ）の制御下に置かれ得、所望のＥｎｖポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列は、この発現構築物を含むベクターによって形質転換される宿主細胞において
ＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列
を含んでいても、含まなくてもよい。本発明において、天然に由来のシグナルペ
プチドまたは異種配列の両方が、使用され得る。リーダー配列は、翻訳処理後、
宿主によって除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４
、４２５，４３７号；同４，３３８，３９７号を参照のこと。このような配列に
は、ＴＰＡリーダーおよびミツバチメリチンシグナル配列が挙げられるが、これ
に限定されない。
【００６７】 他の調節塩基配列はまた、宿主細胞の成長に関連するタンパク質配列の発現の
調節を可能にすることが所望される。このような調節塩基配列は、当業者に公知
であり、例としては、化学的な刺激または物理学的な刺激に応答して、遺伝子の
発現をオンまたはオフにする調節塩基配列が挙げられ、これらは、調節化合物の
存在を含む。調節エレメントの他の型はまた、ベクター（例えば、エンハンサー
配列）中に存在し得る。
【００６８】 コントロール配列および他の調節配列はまた、ベクターへの挿入の前にコード
配列に結合され得る。あるいは、このコード配列は、発現ベクターに直接クロー
ン化され得、このベクターは、既にコントロール配列および適切な制限部位を含
む。
【００６９】 いくつかの場合において、コード配列を改変することが必要であり得、この結
果、適切な配向でコントロール配列に結合；すなわち適切なリーディングフレー
ムを維持し得る。変異体またはアナログは、タンパク質をコードする配列の一部
の失欠によって、配列の挿入によって、および／または配列内の１以上のヌクレ
オチドの置換によって調製され得る。部位指向性変異誘発のようなヌクレオチド
配列を改変するための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００７０】 次いで、発現ベクターを使用して、適切な宿主細胞を形質転換する。多数の哺
乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、以下のようなＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販の不死化さ
れた細胞株が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃｈｉｎｉｓｅハムスター
の卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスターの腎（ＢＨＫ）細胞、
サルの腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｖｅｒ
ｏ２９３細胞、ならびに他の細胞。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓ
ｐｐ．）は、現在の発現構築での使用を見出す。本発明において有用である酵母
宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃ
ａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉ
ｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌ
ｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉ
ｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターでの使用ための昆虫細胞とし
ては、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏ
ｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃ
ｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
【００７１】 発現系および選択される宿主に依存して、本発明のタンパク質は、目的のタン
パク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換される宿主
細胞を増殖させることによって産生される。適切な増殖条件の選択は、当該分野
の技術内である。
【００７２】 １実施形態において、形質転換された細胞は、ポリペプチド産物を周囲の媒体
に分泌する。特定の調節塩基配列は、例えば、組織プラスミノゲン活性化因子（
ＴＰＡ）リーダー配列、γ−インターフェロンシグナル配列または公知の分泌タ
ンパク質由来の他のシグナルペプチド配列を使用して、タンパク質産物の分泌を
増強するためにベクター中に含まれ得る。次いで、この分泌されたポリペプチド
産物は、例えば、標準精製技術（例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフ
ィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー
、免疫沈降など（これらに限定されない））を使用して、本明細書中に記載され
る種々の技術により単離され得る。
【００７３】 あるいは、形質転換された細胞を、化学的、物理的、または機械的手段を使用
して破壊させ、さらに細胞を溶解させ、Ｅｎｖポリペプチドを実質的にインタク
トで保持する。細胞内タンパク質がまた、例えば、界面活性剤または有機溶媒の
使用によって、成分を細胞壁または細胞膜から取り除くことによって得られ得、
これにより、Ｅｎｖポリペプチドの漏出が生じる。このような方法は、当業者に
公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａ
ｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、１９９０）に記載される。
【００７４】 例えば、本発明での使用のために細胞を破壊する方法としては、超音波処理（
ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎまたはｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）；攪拌；液体抽
出または固体抽出；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧衝撃；トリプ
シン、ノイラミニダーゼおよびリゾチームのようなプロテアーゼを含む溶解酵素
での処理；アルカリ処理；胆汁酸塩、ドデシルスルフェートナトリウム、Ｔｒｉ
ｔｏｎ、ＮＰ４０およびＣＨＡＰＳのような界面活性剤および溶媒の使用が挙げ
られるが、これらに限定されない。細胞を破壊するために使用される特定の技術
は、主に選択の方法であり、ポリペプチドが発現される細胞型、培養条件、使用
される任意の前処理に依存する。
【００７５】 この細胞の破壊後、細胞の細片を一般に遠心分離で除去し、そして標準的な精
製技術（カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排
除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティーク
ロマトグラフィー、免疫沈降など（これらに限定されない））を使用して、細胞
内で産生されるＥｎｖポリペプチドをさらに精製する。
【００７６】 例えば、本発明の細胞内Ｅｎｖポリペプチドを得るための１方法は、抗−Ｅｎ
ｖ特異的抗体を使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーまたはレクチ
ンアフィニティークロマトグラフィーによるようなアフィニティー精製を含む。
特に、好ましいレクチン樹脂は、以下から誘導される樹脂（これらに限定されな
い）のようなマンノース部分を認識する樹脂である；Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉ
ｖａｌｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＧＮＡ）、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＣＡまたはレンチルレクチン）、Ｐｉｓｕｍ ｓａ
ｔｉｖｕｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＳＡまたはペアレクチン）、Ｎａｒｃｉ
ｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＮＰＡ）
およびＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＡＵＡ）。適切
なアフィニティー樹脂の選択は、当該技術分野内である。アフィニティー精製後
、このＥｎｖポリペプチドは、例えば、上記の任意の技術によるような当該分野
で周知の従来の技術を使用してさらに精製され得る。
【００７７】 Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）複合体を、それ自体または他のタンパク質のい
ずれかを用いて産生することが、所望され得る。このような複合体は、例えば、
Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）および／または所望の複合体の他のポリペプチド
をコードする構築物で同時トランスフェクトする宿主細胞によって、容易に産生
される。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかで、すな
わち分離ベクターを使用することによってか、またはＥｎｖおよび他の遺伝子の
両方を有する単一のベクターを使用することによって達成され得る。単一のベク
ターを使用して実施した場合、両方の遺伝子は、単一のセットのコントロールエ
レメントによって駆動され得るか、あるいは、遺伝子は、個々のコントロールエ
レメントによって駆動される個々の発現カセットのベクター上に存在し得る。発
現後、タンパク質は、同時に結合する。あるいは、複合体は、精製形態または準
精製形態のいずれかで別個に産生された個々のタンパク質を共に混合することに
よってか、あるいはさらにタンパク質を発現する宿主細胞が培養された培養培地
を混合することによって形成され得る。このような複合体の記載について、国際
出願番号ＷＯ９６／０４３０１（１９９６年２月１５日刊行）を参照のこと。
【００７８】 比較的小さなポリペプチド（すなわち、約５０アミノ酸長まで）は、例えば、
ペプチドの分野の当業者に公知である任意のいくつかの技術によって化学的に都
合良く合成され得る。一般に、これらの方法は、成長するペプチド鎖に対して、
１以上のアミノ酸の配列付加を使用する。通常、１級アミノ酸のアミノ基または
カルボキシル基のいずれかは、適切な保護基によって保護される。次いで、保護
されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合の形成を可能にす
る条件下で、不活性固体支持体に付着され得るか、または適切に保護された相補
的な（アミノまたはカルボキシ）基を有する配列中で次のアミノ酸を付加するこ
とによって溶液中で利用され得るかのいずれかである。次いで、保護基は、新し
く付加されたアミノ酸残基から除去され、次いで、次の（適切に保護された）ア
ミノ酸を付加する。所望のアミノ酸を適切な配列中に連結した後、任意の残りの
保護基（および任意の固体支持体（固相合成技術を使用した場合））を、経時的
または同時的に除去し、最終のポリペプチドを提供する。この一般的な手順の単
純な改良によって、１以上のアミノ酸を、例えば、（キラル中心をラセミ化しな
い条件下で）保護されたトリペプチドを適切に保護したジペプチドと連結し、脱
保護後ペンタペプチドを形成することにより、一度に成長鎖に付加することが可
能である。。例えば、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏ
ｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ １９８４）およびＧ．Ｂａ
ｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，編者Ｅ．Ｇｒｏｓｓお
よびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，第２巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）３〜２５４頁（固相ペプチド合成技術）；ならびにＭ
．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）およ
びＥ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻（古典的な溶液合成）を参照の
こと。
【００７９】 代表的な保護基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレ
ニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ
−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ
）；ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシ
カルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボ
ニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニ
ルなどが挙げられる。
【００８０】 代表的な固体支持体は、架橋重合体支持体である。これらは、ジビニルベンゼ
ン架橋スチレンベースの重合体（例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチル
スチレン共重合体、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレン共重合体およびジ
ビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレン共重合体）を含み得る。
【００８１】 本発明のポリペプチドアナログはまた、他の方法（例えば、同時多数ペプチド
合成の方法により）により化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−
５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照のこと。
【００８２】 （診断およびワクチンの適用） 細胞内で産生された本発明のＥｎｖポリペプチド、その複合体、またはこれを
コードするポリヌクレオチドは、多くの診断および治療の目的のために用いられ
得る。例えば、このタンパク質およびポリヌクレオチドまたはこのタンパク質に
対して生成された抗体を、種々のアッセイに用いて、ＨＩＶの感染もしくは疾患
の状態の診断において、または免疫化に対する応答の尺度として助けとなる生物
学的サンプル中の反応性抗体および／またはＥｎｖタンパク質の存在を決定し得
る。
【００８３】 Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）ポリペプチドと反応性である抗体の存在、およ
び逆に、Ｅｎｖポリペプチドに対して惹起された抗体と反応性である抗原は、標
準的な電気泳動技術および免疫アッセイ（例えば、競合アッセイ、直接反応アッ
セイ、またはサンドイッチ型アッセイ）を含む免疫診断技術を用いて検出され得
る。このようなアッセイとしては、以下を含むがこれらに限定されない：ウエス
タンブロット；凝集試験；酵素標識免疫アッセイおよび酵素媒介免疫アッセイ（
例えば、ＥＬＩＳＡ）；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射免疫アッセイ；免
疫電気泳動；免疫沈降など。この反応は、一般的に顕示標識（例えば、蛍光、化
学発光、放射活性、または酵素標識もしくは色素分子、あるいは抗原と抗体との
間の複合体の形成または抗原と反応した抗体を検出するための方法）を含む。
【００８４】 固体支持体（例えば、ニトロセルロース）は、膜またはマイクロタイターウェ
ル形態でのアッセイにおいて用いられ得る；ポリ塩化ビニル（シートまたはマイ
クロタイターウェルにおいて）；ポリスチレンラテックス（ビーズまたはマイク
ロタイタープレートにおいて）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン
膜；活性化ビーズなど。
【００８５】 代表的に、固体支持体はまず、生物学的サンプル（またはｇｐ１２０タンパク
質）と反応し、洗浄され、次いで抗体（または抗体が含まれていると推測される
サンプル）が添加される。洗浄して任意の非結合リガンドを除去した後、二次結
合体部分が、適切な結合条件下で添加される。その結果、二次結合体は、この結
合リガンドと選択的に会合し得る。次いで、二次結合体の存在は、当該分野で周
知の技術を用いて検出され得る。代表的に、二次結合体は、この抗体リガンドに
対して惹起された抗体を含む。多くの抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、当
該分野で公知である（例えば、市販のヤギ抗ヒトＩｇまたはウサギ抗ヒトＩｇ）
。本明細書中での使用のためのＩｇ分子は、好ましくは、ＩｇＧ型またはＩｇＡ
型であるが、ＩｇＭもまた、いくつかの例において適切であり得る。このＩｇ分
子は、当業者に公知の方法により検出可能な酵素標識（例えば、特に西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼおよびウレアーゼ）に容易に結合し得る。次いで、適切な酵素の
基質を用いて、検出可能なシグナルを生じる。
【００８６】 あるいは、「二抗体サンドイッチ」アッセイを用いて、本発明のタンパク質を
検出し得る。この技術において、固体支持体をまず、Ｅｎｖ（例えば、ｇｐ１２
０）に対して惹起された１つ以上の抗体と反応させ、洗浄し、次いで試験サンプ
ルに曝露させる。抗体を再度、添加して、そしてこの反応を、直接呈色反応かま
たは標識二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼまたはウレアーゼで標識された抗免疫グロブリン）のいずれかを用いて可視
化される。
【００８７】 アッセイはまた、溶液中で行われ、その結果このウイルスタンパク質およびこ
れに対する抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。次いで、この沈降した複合
体は、例えば、遠心分離によりこの試験サンプルから分離され得る。この反応混
合物を多くの標準的な方法（例えば、上記した免疫診断方法）のいずれかを用い
て分析して、抗体抗原複合体の存在または非存在を決定し得る。
【００８８】 上記のように産生された改変されたＥｎｖタンパク質、またはこのタンパク質
に対する抗体は、上記のような免疫アッセイを行うために、適切な説明書および
他の必須の試薬とともにキットに提供され得る。このキットはまた、用いられる
特定の免疫アッセイに依存する、適切な標識および他のパッケージされた試薬お
よび材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的な免疫アッセイ（例
えば、上記のアッセイ）は、これらのキットを用いて、行われ得る。
【００８９】 Ｅｎｖポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
はまた、ワクチン組成物（例えば、予防ワクチン（すなわち、感染を予防するた
め）または治療ワクチン（感染後のＨＩＶを処置するため））において、個々に
または組み合わせて用いられ得る。このワクチンは、１つ以上の改変されたＥｎ
ｖタンパク質（またはこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列）（例えば
、１つよりも多いウイルス単離物由来のＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）タンパク
質）の混合物を含み得る。このワクチンはまた、他の抗原および免疫調節試薬（
例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン（Ｉ
Ｌ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−
１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１βおよびＲＡＮＴＥＳを含
むが、これらに限定されない）と併せて投与され得る。このワクチンは、ポリペ
プチドとしてか、あるいは代替的にウイルスベクター（例えば、レトロウイルス
ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）または非ウ
イルスベクター（例えば、リポソーム、核酸またはタンパク質で被覆された粒子
）を用いて裸の核酸ワクチン（例えば、ＤＮＡ）として投与され得る。このワク
チンはまた、タンパク質および核酸の混合物を含み、次いで、これは同様のビヒ
クルまたは異なるビヒクルを用いて送達され得る。このワクチンは、所望の効果
を達成するために１回よりも多く投与され得る（例えば、「プライム（初期）」
投与に続いて１回以上の「ブースト」）。同様の組成物が、プライム投与および
１回以上のブースト投与として投与され得る。あるいは、異なる組成物が、プラ
イム投与およびブースト投与のために用いられ得る。
【００９０】 このワクチンは、一般的に例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノー
ルなどの１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」を含む。さら
に、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤）、ｐＨ緩衝物質などが、このよう
なビヒクル中に存在し得る。
【００９１】 キャリアは、必要に応じて存在し、これは、この組成物を受け入れる個体に対
して有害な抗体の産生をキャリア自体が誘発しない分子である。適切なキャリア
は、代表的には、大きな、ゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多
糖、ポリ酪酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、脂質凝集
体（例えば、油溶滴またはリポソーム）、および不活化ウイルス粒子）である。
このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、Ｅｎｖポリペプチドは、
細菌トキソイド（例えば、ジフテリア、テタノス、コレラなど由来のトキソイド
）と結合体化され得る。
【００９２】 アジュバンドをまた用いて、ワクチンの有効性を増強し得る。このようなアジ
ュバンドとしては、以下を含むがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩
（明礬）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウ
ムなど）；（２）水中油型乳濁液処方物（他の特定の免疫刺激薬因子（例えば、
ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うかまたは
伴わない）を包含する。例えば、（ａ）５％ スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅ
ｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−
ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではない）を含み、Ｍｏｄｅｌ
１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）の
ような微小流体化器を用いてμｍ未満の粒子へと処方されたＭＦ５９（国際出願
ＷＯ９０／１４８３７）；（ｂ）μｍ未満のエマルジョンへと微小流体化され
たか、またはボルテックスして、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかの
いずれかである、１０％ スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０、５％ プル
ロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと
）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％ スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ
８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（Ｔ
ＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ TM ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉTMアジュバント
系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）
；（３）サポニンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎTM）（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）を使用し得るか、
またはそれから粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体））を生成し得る
；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュ
バント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、
ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；（６）コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）
、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）（詳細には、ＬＴ−Ｋ６３（リシ
ンが、６３位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（アル
ギニンが、７２位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９
（セリンが、１０９位の野生型アミノ酸に対して置換されている）、ＰＴ−Ｋ９
／Ｇ１２９（リシンが、９位の野生型アミノ酸に対して置換されており、そして
グリシンが、１２９位で置換されている））のような細菌ＡＤＰ−リボース化毒
素の無毒化変異体（例えば、国際出願 ＷＯ９３／１３３０２および同 ＷＯ９
２／１９２６５を参照のこと）；ならびに（７）その組成物の有効性を増強する
ための免疫刺激因子として作用する他の物質。
【００９３】 ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグ
ルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ
−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−
Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−Ｐ
Ｅ）などを含むが、これらに限定されない。
【００９４】 代表的に、ワクチン組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして、注射
可能なように調製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として
適切な固体形態もまた調製され得る。この調製物はまた、上記に議論されたよう
に、アジュバント効果の増強のために乳化され得るかまたはリポソーム中にカプ
セル化され得る。
【００９５】 このワクチンは、改変されたＥｎｖタンパク質、もしくはこのタンパク質の複
合物、またはこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および必要な場合
、任意の他の上記の成分の治療的有効量を含む。「治療的有効量」とは、このワ
クチンが投与される非感染個体、感染個体または曝露されていない個体において
保護性免疫学的応答を誘導する改変されたＥｎｖ（例えば、ｇｐ１２０）タンパ
ク質の量を意味する。このような応答は、一般的に、被験体の分泌免疫応答、ワ
クチンに対する細胞媒介免疫応答および／または抗体媒介免疫応答における発達
を生じる。通常、このような応答としては、１つ以上の以下の効果が含まれるが
、これらに限定されない：免疫学的クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ
、ＧまたはＭ）のいずれかからの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増
殖；免疫学的細胞への活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの供給
；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の拡
大。
【００９６】 好ましくは、有効量は、疾患の症状の処置または予防をもたらすのに十分であ
る。この正確な必要量は、数ある因子のなかでもとりわけ、処置する患者；処置
される個体の年齢および一般的な状態；抗体を合成する個体の免疫系の能力；所
望される保護の程度；処置される状態の危篤度；選択される特定のＥｎｖポリペ
プチドならびにこの投与形態に依存して変化する。適切な有効量は、当業者によ
り容易に決定され得る。「治療的有効量」は、慣用的な試みを通して決定され得
る比較的広い範囲内にある。
【００９７】 一旦処方された核酸ワクチンは、上記されたように、ウイルスベクターを伴っ
てかまたは伴わないで、従来の注射器かまたは遺伝子銃（例えば、Ａｃｃｅｌｌ
（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））のいずれかを用いる注入により
達成され得る。表皮の細胞へのＤＮＡの送達が、特に好ましい。なぜなら、投与
のこの様式は、皮膚関連リンパ細胞へのアクセスを提供し、そしてレシピエント
におけるＤＮＡの一次的な存在に備えるからである。核酸および／またはペプチ
ドの両方は、皮下、表皮、真皮、粘膜内（例えば、鼻、直腸および膣）、腹腔内
、静脈内、経口的または筋肉内のいずれかに注入し得る。投与の他の様式は、経
口的投与および肺投与、坐薬、針なし注入、経皮的塗布および経皮的塗布（ｔｒ
ａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ）を含む。投薬量の取り扱いは、単一な投薬計画かまたは複合的な投
薬計画であり得る。核酸の投与はまた、ペプチドまたは他の物質の投与と併用さ
れ得る。
【００９８】 本発明は、その好ましい特定の実施形態とともに記載されているが、この説明
ならびに以下の実施例は、例示であることを意図し、そして本発明の範囲を制限
しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点および改
善は、本発明に関連する当業者には明らかである。
【００９９】 （実験） 以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実
施例は、例示の目的のみのために示され、そして、いずれにしても本発明の請求
の範囲を制限することを意図しない。
【０１００】 使用される数字（例えば、量、温度など）に関する精度を保証する試みがなさ
れたが、幾分かの実験誤差および偏差は、もちろん許容されべきである。
【０１０１】 （実施例１） （Ａ．１．Ｂｅｓｔ−Ｆｉｔおよび相同性検索） ＨＸＢ−２ ｇｐ １２０の結晶構造を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベース
（ＣＯＭＰＬＥＸ（ＨＩＶ ＥＮＶＥＬＯＰＥ ＰＲＯＴＥＩＮ／ＣＤ４／ＦＡ
Ｂ）１５−ＪＵＮ−９８ １ＧＣ１ ＴＩＴＬＥ：ＨＩＶ−１ ＧＰ１２０ Ｃ
ＯＲＥ ＣＯＭＰＬＥＸＥＤ ＷＩＴＨ ＣＤ４ ＡＮＤ Ａ ＮＥＵＴＲＡＬ
ＩＺＩＮＧ ＨＵＭＡＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ）からダウンロードした。ｇｐ １
２０のβ鎖３、２、２１および２０は、ＣＤ４結合部位付近にシートを形成する
。鎖β−３およびβ−２は、Ｖ１／Ｖ２ループによって連結される。鎖β−２１
およびβ−２０は、別の小ループによって連結される。鎖β−２とβ−２１との
間の界面におけるＨ結合は、タンパク質の「下」半分のドメイン間の連結（へリ
ックスα１をＣＤ４結合部位に結合する）にすぎない。このβシートおよびこれ
らのループは、ＣＤ４結合の間にただ暴露されるいくつかの抗原（例えば、中和
抗体を生成し得る抗原）をマスクする。
【０１０２】 ＣＤ４結合部位において十分なβシートを除去して、抗原を暴露するが、十分
なタンパク質を残して、正しい折り畳みを可能にする構築物を設計した。小ルー
プに対する改変およびＶ１／Ｖ２ループの任意の欠失を特に標的にした。以下の
３つのタイプの構築物を設計した：（１）４−鎖βシート全体を作製する数の残
基をインタクトのままにするが、１つ以上の残基を置換する、ポリペプチドをコ
ードする構築物；（２）切除された少なくとも１つのβ鎖の少なくとも１つの残
基を有するポリペプチドをコードする構築物；または（３）切除された少なくと
も１つのβ鎖の少なくとも２つの残基を有するポリペプチドをコードする構築物
。従って、合計６個の異なるターンが、これらの鎖の末端を再結合するために必
要であった。
【０１０３】 最初に、小ループ中の残基（残基４２７〜４３０、ＨＸＢ−２に関する）およ
び連結したβ鎖（β−２０およびβ−２１）を、ＧｌｙおよびＰｒｏ（βターン
で共通）を含むように改変した。次いで、これらの配列を、標的として使用して
、各検索で整合した。その標的の構造は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋの既知のタンパク質と一致した。特に、５残基のターン
（Ｎ末端の重複単一残基、２残基の標的ターン、およびＣ末端の２つの重複残基
）は、このデータベースで検索した。言い換えると、これらの改変ループは、野
生型タンパク質のβシート構造を維持する構造を支持できなければならない２残
基のターンを付加する。Ｓｙｂｙ１分子モデリングパッケージのＢｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒモジュールのＬｏｏｐ Ｓｅａｒｃｈフィーチャで、デフォルトパラメー
ターを使用して、計算を行った。各場合において、構造のみに基づく２５のベス
トフィットを評価し、それらのいくつかを相同性について選択し、そしてフィッ
トさせた。
【０１０４】 さらに、どの改変が行われて、ほとんどのＶ１／Ｖ２ループ（残基１２４−１
９８、ＨＸＢ−２に関して）を除去し、タンパク質の構造をインタクトにしたま
まにするかも決定した。小ループの場合と同様に、１つ以上の残基を、β−２鎖
（ＨＸＢ−２の残基１１９〜１２３）、β−３鎖（ＨＸＢ−２の残基１９９〜２
０１）またはβ−２およびβ−３の両方から切除する構築物をまた設計した。こ
れらの構築物について、既知のループを検索して、ペンタマー（Ｎ末端側由来の
２つの残りの残基、２残基のターンおよびＣ末端残基を含む）の構造を整合した
。これらの検索について、Ｇｌｙ−Ｇｌｙが、少なくとも１つのＣ末端置換を伴
う挿入として好ましかった。
【０１０５】 （Ａ．２．小ループ置換） １つの局面において、ネイティブ配列を、ＣＤ４結合部位を暴露するが、タン
パク質の構造全体を比較的変えないままにする残基で置換した。小ループ置換に
ついて、一致する標的は、ＡＳＮ４２５−ＭＥＴ４２６−ＧＬＹ４２７−ＧＬＹ
４２８−ＧＬＹ４３１であった。この検索結果を、表１にまとめる。
【０１０６】 表１：小ループの検索（Ａｓｎ４２５〜Ｇｌｙ４３１）
【０１０７】
【表１】 これらの結果に基づいて、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（＃７）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（＃１２
）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ（＃７）をコードする構築物が推奨された。
【０１０８】 Ｖ１／Ｖ２ならびにβ−２およびβ−３の１つ以上の残基がまた、必要に応じ
て、本発明の改変ポリペプチドにおいて欠失されるため、Ｖ１／Ｖ２ループの構
造と一致する既知のループもまた検索した。一致する標的のＶ１／Ｖ２ループは
、Ｌｙｓ１２１−Ｌｅｕ−１２２−Ｇｌｙ１２３−Ｇｌｙ１２４−Ｓｅｒ１９９
であった。いくつかの著しく一致したものを表２に示す。
【０１０９】 表２：Ｖ１／Ｖ２ループの検索（Ｌｙｓ１２１〜Ｓｅｒ１９９）
【０１１０】
【表２】 これらの検索に基づいて、Ｖ１／Ｖ２の代わりにＧｌｙ−Ａｓｎをコードする
構築物が推奨された。
【０１１１】 （Ａ．３．１つのさらなる残基の切除） わずかに切り取られた小ループについて、もう１つの残基を、各β鎖から切り
取り、βシートをわずかに短くした。一致する標的は、ＩＬＥ４２４−ＡＳＮ４
２５−ＧＬＹ４２６−ＧＬＹ４２７−ＬＹＳ４３２であった。結果を表３に示す
。
【０１１２】 表３：１残基だけ短縮したβシートの検索（Ｉｌｅ４２４〜Ｌｙｓ４３２）
【０１１３】
【表３】 これらの検索は、以前の切除より大きな変化および劣った適合を示し、Ｐｒｏ
−ＶａｌまたはＰｒｏ−Ｌｅｕコード構築物は非常に類似していた。従って、Ａ
ｌａ−Ｐｒｏコード構築物が推奨された。
【０１１４】 欠失したＶ１／Ｖ２および切除されたβ−２またはβ−３からのさらなる残基
を有するｇｐ１２０ポリペプチドをコードする配列をまた検索した。Ｖ１／Ｖ２
ループの、一致した標的は、ＶＡＬ１２０−ＬＹＳ１２１−ＧＬＹ１２２−ＧＬ
Ｙ１２３−ＶＡＬ２００であった。いくつかの著しく一致したものを表４に示す
。
【０１１５】 表４：Ｖ１／Ｖ２ループの検索（Ｖａｌ１２０〜Ｖａｌ２００）
【０１１６】
【表４】 Ａｌａ−Ｐｒｏ（例えば、＃７）をコードする構築物が推奨された。
【０１１７】 （Ａ．４．さらなる切除） なおさらなる切除において、さらなる残基を、β−２０およびβ−２１鎖から
切り取り、βシートをさらに短くした。一致した標的は、ＩＬＥ４２３−ＩＬＥ
４２４−ＧＬＹ４２５−ＧＬＹ４２６−ＡＬＡ４３３であった。著しく一致した
ものを表５に示す。
【０１１８】 表５：２つの残基だけ短縮されたβシートの検索（Ｉｌｅ４２３〜Ａｌａ４３
３）
【０１１９】
【表５】 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（例えば、＃３）（これは、１００％相同性を有する）が推奨
された。
【０１２０】 欠失したＶ１／Ｖ２領域、ならびにβ−２、β−３から切除された少なくとも
２つの残基、またはβ−２およびβ−３から切除された少なくとも１つの残基を
コードする配列をもまた、検索した。一致すべき標的は、ＣＹＳ１１９−ＶＡＬ
１２０−ＧＬＹ１２１−ＧＬＹ１２２−ＩＬＥ２０１であった。著しい一致を表
６に示す。
【０１２１】
【表６】 両方の構築物が使用され得ることが、決定された。
【０１２２】 （Ｂ．１．改変されたＥｎｖポリペプチドをコードする構築物） 上記のように、４−β逆平行鎖から突出しているネイティブなループを切除し
、そして１〜３残基の屈曲で置き換えた。このループを、全体のβ鎖を放出する
ために置き換えるか、または連結された鎖の各末端から１つ以上のアミノ酸をト
リミングすることにより切除した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ
ａｔａ Ｂａｎｋを検索することにより決定する場合、同じ骨格の相対位置を維
持する屈曲（例えば、β−２０およびβ−２１の三次構造）で、鎖の末端を再結
合した。
【０１２３】 表７Ａは、上記の実施例１．Ａ．において決定される場合、この研究に対して
推奨される可変領域１および２の短縮型の要約である。
【０１２４】
【表７Ａ】 以前に記したように、本発明の構築物によりコードされるポリペプチドは、Ｈ
ＸＢ−２に関して番号付けられるが、これらの例示的な構築物によりコードされ
るポリペプチドの特定のアミノ酸残基は、ＳＦ−１６２に基づく。従って、例え
ば、ＨＸＢ−２中のアミノ酸残基１９５は、セリン（Ｓ）であるが、野生型ＳＦ
１６２配列を有するポリペプチドをコードしている構築物の場合は、この位置で
アスパラギン（Ｎ）を有する。表７Ｂは、株ＨＸＢ−２と株ＳＦ１６２との間の
アミノ酸配列における、ちょうど３つのバリエーションを示す。残基およびアミ
ノ酸番号における差異を含む、ＨＸＢ−２およびＳＦ１６２の全体の配列を、図
２（配列番号１および２）のアラインメントにおいて示す。
【０１２５】
【表７Ｂ】 β−２０鎖、β−２１鎖および小ループにおける欠失を含む構築物をまた、構
築した。これらの領域の短縮型をコードする構築物を、表８に示す。表８におけ
る構築物は、ＨＸＢ−２に相対して番号付けられるが、非改変アミノ酸配列は、
ＳＦ１６２に基づく。従って、この構築物は、ＨＸＢ−２に関して４２６と番号
付けられたアミノ酸の位置で、ＳＦ１６２において見出されるような、アルギニ
ン（Ａｒｇ）をコードする（表７Ｂをまた、参照のこと）。 野生型（ＳＦ１６２）からの変化を、表８Ｂ中の太字で示す。
【０１２６】
【表８】 β鎖の１つおよびそれらの組み合わせの各々ついて、表７および表８において
示される欠失構築物を構築する。これらの欠失を、サブタイプＢ株（例えば、Ｓ
Ｆ１６２、ＵＳ４、ＳＦ２）、サブタイプＥ株（例えば、ＣＭ２３５）およびサ
ブタイプＣ株（例えば、ＡＦ１１０９６８またはＡＦ１１０９７５）のような異
なるＨＩＶ株由来のＥｎｖ形態（ｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０）に
おいて試験する。ＳＦ１６２に関する例示的な構築物を図に示し、そして表９に
要約する。上の図２および表７Ｂに記されるように、結合シート領域において、
ＨＸＢ−２のＭｅｔ４２６がＳＦ１６２ではＡｒｇであるので、ＳＦ１６２のア
ミノ酸配列は、ＨＢＸ−２とは異なる。表９において、Ｖ１／Ｖ２は、Ｖ１／Ｖ
２領域における欠失をいい、＃ｂｓｍは、架橋シートの小ループにおける改変を
いう。
【０１２７】
【表９】 表９に具体的に示される改変に加え、Ｖ１／Ｖ２の欠失の組み合わせおよび架
橋シートの小ループの改変はまた、本発明の範囲に含まれる。本明細書に記載さ
れる、本発明の異なる実施形態の種々の形態はまた、組み合わせられ得る。
【０１２８】 最初のスクリーニングを、ＣＯＳ−７細胞、ＲＤ細胞および／または２９３細
胞中の一過性の発現後に行う。発現されるタンパク質を、イムノブロット、ＥＬ
ＩＳＡにより分析し、そしてＣＤ４結合部位および構造の統合性を決定するため
に、ｇｐ１２０上の他の重要なエピトープに対するｍＡｂへの結合について分析
する。これらをまた、ＣＤ４結合アッセイにおいて、そしてさらに、例えば、患
者の血清またはｍＡｂ４４８Ｄ（Ｇｌｕ３７０およびＴｙｒ３８４に方向付けら
れる欠失により変更されないＣＤ４結合の溝の領域）を用いて、中和抗体の結合
について試験する。
【０１２９】 これらの新規なＥｎｖ糖タンパク質の免疫原性を、げっ歯類および霊長類にお
いて試験する。この構造物は、ＤＮＡワクチンもしくはアジュバントタンパク質
ワクチンとして、または組み合わされた様式で投与される。これらのワクチン接
種の目的は、広範に反応性の中和抗体応答をアーカイブ（ａｒｃｈｉｖｅ）する
ことである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、結晶学的研究によって決定されるところの、ＨＩＶ−１HXB-2Ｅｎｖ
ｇｐ１２０ポリペプチドの三次構造の模式図である。
【図２】 図２Ａ〜Ｃは、ＨＩＶ改変体ＳＦ１６２のアミノ酸配列（「１６２」で示す）
（配列番号２）、ＳＦ２、ＣＭ２３６およびＵＳ４との、野生型ＨＩＶ−１HXB2 のＥｎｖ ｇｐ１６０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）の整列を示す
。矢印は、この領域が、改変されたポリペプチドにおいて欠失または置換されて
いる領域を示す。黒点は、保存されたシステイン残基を示す。星印は、ｇｐ１２
０における最後のアミノ酸の位置を示す。
【図３】 図３Ａ〜Ｊは、Ｖ１／Ｖ２欠失を有する改変されたＥｎｖポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の整列を示す。これらの配列によっ
てコードされる改変されていないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１６２残基に対応
するが、ＨＸＢ−２に関連付けられて番号付けている。
【図４】 図４Ａ〜Ｍは、小ループにおいて欠失もしくは置換を有する改変されたＥｎｖ
ポリペプチドをコードするポリペプチドのヌクレオチド配列の整列を示す。これ
らの配列によってコードされる改変されていないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１
６２残基に対応するが、ＨＸＢ−２に対して番号付けている。
【図５】 図５Ａ〜Ｎは、Ｖ１／Ｖ２欠失およびさらに小ループにおける欠失もしくは置
換の両方を有する改変されたＥｎｖポリペプチドをコードするポリペプチドのヌ
クレオチド配列の整列を示す。これらの配列によってコードされる改変されてい
ないアミノ酸残基は、野生型ＳＦ１６２残基に対応するが、ＨＸＢ−２に対して
番号付けている。
【図６】 図６は、Ｖａｌ２０−Ａｌａ２０４と称する構築物のヌクレオチド配列を示す
（配列番号３）。
【図７】 図７は、ＶａＩ１２０−Ｉｌｅ２０１と称する構築物のヌクレオチド配列を示
す（配列番号４）。
【図８】 図８は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号５）。
【図９】 図９は、Ｌｙｓｌ２１−Ｖａｌ２００と称する構築物のヌクレオチド配列を示
す（配列番号６）。
【図１０】 図１０は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号７）。
【図１１】 図１１は、Ｖａｌｌ２０−Ｔｈｒ２０２と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号８）。
【図１２】 図１２は、Ｔｒｐ４２７−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号９）。
【図１３】 図１３は、Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１０）。
【図１４】 図１４は、Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列
を示す（配列番号１１）。
【図１５】 図１５は、Ａｒｇ４２６−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１２）。
【図１６】 図１６は、Ａｒｇ４２５−Ｌｙｓ４３２と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１３）。
【図１７】 図１７は、Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１４）。
【図１８】 図１８は、Ｉｌｅ４２３−Ｍｅｔ４３４と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１５）。
【図１９】 図１９は、Ｇｌｎ４２２−Ｔｙｒ４３５と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号１６）。
【図２０】 図２０は、Ｇｌｎ４２２−Ｔｙｒ４３５Ｂと称する構築物のヌクレオチド配列
を示す（配列番号１７）。
【図２１】 図２１は、Ｌｅｕ１２２−Ｓｅｒ１９９；Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１８）。
【図２２】 図２２は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９；Ａｒｇ４２６−Ｌｙｓ４３２と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号１９）。
【図２３】 図２３は、Ｌｅｕｌ２２−Ｓｅｒｌ９９；Ｔｒｐ４２７−Ｇｌｙ４３１と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２０）。
【図２４】 図２４は、Ｌｙｓｌ２１−Ｖａｌ２００；Ａｓｎ４２５−Ｌｙｓ４３２と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２１）。
【図２５】 図２５は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２２）。
【図２６】 図２６は、Ｖａｌｌ２０−Ｉｌｅ２０１Ｂ；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称
する構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２３）。
【図２７】 図２７は、Ｖａ１１２０−Ｔｈｒ２０２；Ｉｌｅ４２４−Ａｌａ４３３と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２４）。
【図２８】 図２８は、Ｖａ１１２７−Ａｓｎｌ９５と称する構築物のヌクレオチド配列を
示す（配列番号２５）。
【図２９】 図２９は、Ｖａｌｌ２７−Ａｓｎｌ９５；Ａｒｇ４２６−Ｇｌｙ４３１と称す
る構築物のヌクレオチド配列を示す（配列番号２６）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ハートッグ， カリン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608， エミリービル， ホートン ストリート − アール440 4560， カイロン コ ーポレイション (72)発明者 マーティン， エリック アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608， エミリービル， ホートン ストリート − アール440 4560， カイロン コ ーポレイション Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA06 DA02 EA04 GA11 HA01 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 DA01 DA27 MA05 NA05 NA14 ZB091 ZB092 ZC551 ZC552 4C085 AA03 BA69 CC21 DD21 DD62 DD63 EE01 EE06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA05 DA86 EA22 EA29 FA74

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコードするポリヌ
    クレオチドであって、該ポリペプチドは、ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比して
    番号付けられた残基４２０〜４３６に対応する領域において、野生型と比較して
    少なくとも１つのアミノ酸が欠失または置換されている、ポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ＨＸＢ−２と対比して番号付けられた残基１２４〜１９８に
    対応する前記領域が、野生型と比較して欠失されており、そして少なくとも１つ
    のアミノ酸が、ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比しての残基１１９〜１２３およ
    び残基１９９〜２１０に対応する領域において野生型と比較して欠失または置換
    されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比しての残基４２７〜４２９
    に対応する領域における少なくとも１つのアミノ酸が、野生型と比較して欠失ま
    たは置換されている、請求項１または２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチ
    ド。
  4. 【請求項４】 前記改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドの前記アミノ酸
    配列が、ＳＦ１６２株に基づいている、請求項１または２のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 ＨＸＢ２（配列番号１）と対比しての残基４２０〜４３６に
    対応する領域において、野生型と比較して少なくとも１つのアミノ酸が欠失また
    は置換されている、免疫原性の改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチド。
  6. 【請求項６】 ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比しての残基４２０〜４３６
    に対応する領域において１つのアミノ酸が欠失している、請求項５に記載のポリ
    ペプチド。
  7. 【請求項７】 １つ以上のアミノ酸が、ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比し
    ての残基４２０〜４３６に対応する領域において欠失している、請求項５に記載
    のポリペプチド。
  8. 【請求項８】 ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比しての残基４２０〜４３６
    に対応する領域において、少なくとも１つのアミノ酸が置換されている、請求項
    ５に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】 ＨＸＢ−２（配列番号１）と対比してのアミノ酸残基４２７
    〜４２９に対応する領域において、少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失または
    置換されている、請求項５に記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 前記ポリペプチドのＶ１およびＶ２領域が短縮されている
    、請求項５〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 前記改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドのアミノ酸配
    列が、ＳＦ６１２株に基づいている、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のポ
    リペプチド。
  12. 【請求項１２】 免疫応答を刺激するのに有用な構築物であって、該構築物
    は、転写および翻訳を調節する制御配列、制御配列によって調節されるコード配
    列、エンハンサー、ポリアデニル化配列を含み、ここで、該コード配列は、図６
    に示されるヌクレオチド配列（配列番号３）；図７に示されるヌクレオチド配列
    （配列番号４）；図８に示されるヌクレオチド配列（配列番号５）、図９に示さ
    れるヌクレオチド配列（配列番号６）、図１０に示されるヌクレオチド配列（配
    列番号７）、図１１に示されるヌクレオチド配列（配列番号８）、図１２に示さ
    れるヌクレオチド配列（図９）、図１３に示されるヌクレオチド配列（配列番号
    １０）、図１４に示されるヌクレオチド配列（配列番号１１）、図１５に示され
    るヌクレオチド配列（配列番号１２）、図１６に示されるヌクレオチド配列（配
    列番号１３）、図１７に示されるヌクレオチド配列（配列番号１４）、図１８に
    示されるヌクレオチド配列（配列番号１５）、図１９に示されるヌクレオチド配
    列（配列番号１６）、図２０に示されるヌクレオチド配列（配列番号１７）、図
    ２１に示されるヌクレオチド配列（配列番号１８）、図２２に示されるヌクレオ
    チド配列（配列番号１９）、図２３に示されるヌクレオチド配列（配列番号２０
    ）、図２４に示されるヌクレオチド配列（配列番号２１）、図２５に示されるヌ
    クレオチド配列（配列番号２２）、図２６に示されるヌクレオチド配列（配列番
    号２３）、図２７に示されるヌクレオチド配列（配列番号２４）、図２８に示さ
    れるヌクレオチド配列（配列番号２５）、および図２９に示されるヌクレオチド
    配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、構築物。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖポ
    リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ワクチン組成物。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドをコー
    ドするポリヌクレオチド構築物を含む、ワクチン組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項５〜１１のいずれか１項に記載の改変されたＥｎｖ
    ポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
  16. 【請求項１６】 アジュバントをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか
    １項に記載のワクチン組成物。
  17. 【請求項１７】 前記ポリヌクレオチドが、請求項１〜４のいずれか１項に
    記載の改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコードする、免疫応答を刺激す
    るためのポリヌクレオチドの使用。
  18. 【請求項１８】 前記ポリヌクレオチドが、請求項１２に記載の改変された
    ＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドをコードする、免疫応答を刺激するためのポリヌク
    レオチド構築物の使用。
  19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが、請求項５〜１１のいずれか１項に記
    載の改変されたＨＩＶ Ｅｎｖポリペプチドを含む、免疫応答を刺激するための
    ポリペプチドの使用。
  20. 【請求項２０】 免疫応答を誘導するための医薬の調製における、請求項１
    〜４または１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
    ド構築物の使用。
  21. 【請求項２１】 免疫応答を誘導するための医薬の調製における、請求項５
    〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
  22. 【請求項２２】 アジュバントを投与する工程をさらに含む、請求項１７〜
    ２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、また
    はポリペプチドの使用。
  23. 【請求項２３】 被験体において免疫応答を刺激するための第１および第２
    の組成物の使用であって、 （ａ）プライミング工程において、請求項１〜４または１３のいずれか１項に
    記載の改変されたｅｎｖポリヌクレオチドを含む第１の組成物を投与する工程、
    および （ｂ）ブースト工程において、該被験体に、請求項１〜４または１３のいずれ
    か１項に記載の改変されたＥｎｖポリヌクレオチドを含む第２の組成物を投与す
    る工程、 を包含する、使用。
  24. 【請求項２４】 被験体において免疫応答を刺激するための第１および第２
    の組成物の使用であって、 （ａ）プライミング工程において、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の改
    変されたＥｎｖポリペプチドを含む第１の組成物を投与する工程、および （ｂ）ブースト工程において、該被験体に、請求項５〜１２のいずれか１項に
    記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第２の組成物を投与する工程、 を包含する、使用。
  25. 【請求項２５】 被験体において免疫応答を刺激するための第１および第２
    の組成物の使用であって、 （ａ）プライミング工程において、請求項１〜４または１３のいずれか１項に
    記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第１の組成物を投与する工程、およ
    び （ｂ）ブースト工程において、該被験体に、請求項５〜１２のいずれか１項に
    記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第２の組成物を投与する工程、 を包含する、使用。
  26. 【請求項２６】 被験体において免疫応答を刺激するための第１および第２
    の組成物の使用であって、 （ａ）プライミング工程において、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の改
    変されたＥｎｖポリペプチドを含む第１の組成物を投与する工程、および （ｂ）ブースト工程において、該被験体に、請求項１〜４または１３のいずれ
    か１項に記載の改変されたＥｎｖポリペプチドを含む第２の組成物を投与する工
    程、 を包含する、使用。
  27. 【請求項２７】 第１の組成物または第２の組成物が、さらにアジュバント
    を含む、請求項２３〜２６に記載の使用。
  28. 【請求項２８】 前記第１および第２の組成物が、アジュバントをさらに含
    む、請求項２３〜２６に記載の方法。
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