PT100090A - Metodo de preparacao de uma composicao capz de libertar um agente biologicamente activo para um alvo, e de encapsulacao do referido agente em esferas da proteina vp6 - Google Patents

Description

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Titular: UNIVERSITY OF SASKATCHEWAN

Epiqrafe: "MÉTODO DE DIRECCIONAMENTO E LIBERTAÇÃO DE FARMACOS"

MEMÓRIA DES C R I T I V A

Campo do Invento

Este invento relaciona-se, de forma geral, com os novos métodos de direccionamento e libertação de fármacos. Mais particularmente, o presente invento diz respeito à aplicação de esferas de rotavirus VP6 na libertação de fármacos.

Antecedentes do Invento

As recentes evoluções da biotecnologia têm permitido o desenvolvimento de novas abordagens à preparação e dispensa de agentes terapêuticos e diagnósticos. Reveste-se de particular importância a capacidade de direccionar fármacos e outros agentes para tecidos, células ou organitos subcelulares, usando sistemas transportadores de forma a aumentar a selectividade do fármaco e reduzir a toxicidade. Os sistemas actualmente em uso utilizam, para atingir este objectivo, macromoléculas, polímeros sintéticos e partículas. No entanto, a maior parte dos sistemas é limitada pela quantidade e gama de fármacos que pode ser incorporado no complexo, assim como pela incapacidade, por parte do fármaco, de se direccionar para células seleccionadas e actuar a este nivel. 1

Adicionalmente, o veiculo inclui frequentemente componentes tóxicos e podem sobrevir problemas técnicos durante a preparação do complexo fármaco-veiculo.

Um dos métodos de libertação de substâncias terapêuticas compreende a utilização de um fármaco, ou de um agente citotóxico, conjugado com um anticorpo especifico de um tipo de célula de modo a formar um imunoconjugado. 0 conjugado liga-se a células que possuam um antigénio de superfície contra o qual o anticorpo é dirigido. No entanto, estes sistemas de libertação apresentam diversos inconvenientes. E muitas vezes necessário que sejam libertadas para a célula alvo grandes quantidades de fármaco para que seja obtida a resposta desejada. Tais quantidades são frequentemente impossíveis de obter devido ao limitado número de antigénios de superfície celular e o moléculas de fármaco que podem ser ligados a qualquer anticorpo. Adicionalmente, a actividade citotóxica de um imunoconjugado é frequentemente dependente da sua captação e internalizaçâo pela célula alvo. No entanto, a maioria dos imunoconjugados não são internaiizados e, se internaiizados, o fármaco ou o agente citotóxico são muitas vezes degradados pelo lisossoma celular. Finalmente, as células, tal como as células tumorais, são com frequência heterogéneas no que respeita à expressão de antigénios, e células antigénio-positivas poderão dar origem a descendência antigénio-negativa. Assim, numa dada população de células tumorais, existirá um determinado número de células que não possuem o antigénio para o qual um imunoconjugado particular é especifico. Têm sido igualmente utilizadas microesferas de 2 proteinas para a administração de fármacos. Estas microesferas são formadas através da combinação do agente terapêutico particular com a proteina de veiculo, misturando o complexo com óleo para a formação de micelas. Estas micelas são estabilizadas através da utilização de agentes quimicos de ligações cruzadas. No entanto, o passo final de estabilização pode inactivar o fármaco. Têm sido usados lipossomas numa tentativa de ultrapassar estes problemas. Os lipossomas são vesículas microscópicas formadas a partir de constituintes lipidicos naturais, tais como os fosfolipidos. Os lipossomas podem capturar no seu interior agentes farmacologicamente activos para subsequente libertação. Para uma revisão geral da tecnologia dos lipossomas, ver Gregoriadis, G., Liposome Technology (CRC Press, Roca Baton, FLA, 1984); Gregoriadis, Trends in Biotechnoloqy (1985) 3:235. 0 uso de lipossomas para a libertação de agentes antitumorais e antivirais tem sido sugerido por diversos investigadores. Por exemplo, Fidler et al., Câncer Research (1982) 42^:496-501, descreve a utilização de linfoquinas de muramildipéptido (MDP) encapsuladas em lipossomas para a activação dos macrófagos do hospedeiro, que por sua vez destroem as metástases do pulmão e dos nódulos linfáticos.

Straubinger et al., Câncer Research (1988) £8:5237 5245, examina a citotoxicidade in vitro do metotrexato-σ-aspartato e do 5-fluoroorotato, encapsulados em lipossomas, face a uma linha celular de cancro do ovário humano, e expõe que a encapsulação destes fármacos em lipossomas permite a libertação 3 intracelular dos fármacos para as células.

Koff et al., Infection and Immunity (1983) 42:1067-1072, descreve a utilização do factor de activação de macrófagos, encapsulado em lipossomas, para a activação de macrófagos contra células infectadas pelo HSV-2. 0 Pedido de Patente Inglesa No. GB 2.146.525 A descreve a utilização de lipossomas com porfirinas ligadas à camada mais externa. Os lipossomas transportam fármacos anticancerigenos e factores de activaçâo de macrófagos.

Finalmente, a Patente Norte-Americana No 4.650.674 descreve composições sinergisticas incluindo um interferão e um factor de necrose tumoral, e refere que a composição pode ser encapsulada em lipossomas para injecção directamente sobre o tumor.

Se bem que o uso de lipossomas, como sistema de libertação de fármacos, minora alguns dos problemas acima descritos, esta técnica de libertação de fármacos sofre de diversas limitações. Especificamente, não existe ura meio eficaz para direccionar os lipossomas para o local desejado de acçâo do fármaco. Adicionalmente, os lipossomas exibem uma fraca estabilidade durante o armazenamento e utilização, e existem problemas inerentes ao fabrico e à produção era grande escala de lipossomas. Numa tentativa de ultrapassar estes problemas, os investigadores tém ensaiado a libertação de substâncias utilizando particulas virais. Por exemplo, a WO 91/06658, publicada em 16 de Maio de 1991, descreve o uso de vectores retrovirais transportando sequências de RNA que codificam para o factor de necrose tumoral, interleuquina 2 e múltiplas proteínas 4 'Ν de resistência a fármacos. A cápside interna do rotavirus inclui pelo menos três proteínas designadas por VP1, VP2 e VP6. A proteina VP6, de 45 kD, possui interesse no contexto presente. A VP6 é eficaz como proteina transportadora de haptenos ou antigênios ligados à sua superfície (ver a Patente Norte-Americana No 5.071.651, aqui incorporada integralmente para referência). Podem ser ligados antigênios proteicos, peptidicos ou glucidicos à superfície da proteina VP6, através de péptidos de ligação ou de reacções quimicas. 0 veiculo VP6 encontra utilidade como sistema apresentador de antigênios na libertação de antigênios para o sistema imunológico, com o fim de provocar uma resposta traduzida pela produção de anticorpos.

No entanto, a libertação de antigênios pode ser limitada pela dimensão da substância ligada, e poderá ser indesejável a colocação de certas moléculas à superfície da esfera de VP6, tais como as que direccionariam a esfera para todas as células apresentando um receptor para essas mesmas moléculas. Assim, a encapsulaçâo de uma substância desejada poderia superar esta falta de selectividade. 0 presente invento proporciona um meio para a encapsulaçâo de agentes terapêuticos no interior de esferas de VP6, com a finalidade de atingir uma libertação mais eficiente para células, organitos celulares e órgãos.

Sumário do Invento 0 presente invento baseia-se na descoberta de que a VP6 se direcciona rapidamente para, se liga a, e é englobada por 5

Mol. Immunol. monôcitos e macrófagos. Redmond, M.J., et al.r (1990) (em Press). Este invento baseia-se igualmente na descoberta de que a proteína da cápside interna do rotavirús, VP6, pode ser usada para a encapsulação de agentes terapêuticos. Assim, as substâncias a ser libertadas para células alvo podem ser encapsuladas em esferas de VP6, causando um aumento da concentração do agente libertado para as células. Adicionalmente, poderão ser ligados outros agentes de direccionamento às esferas de VP6, os quais direccionarão as esferas para outros tecidos e tipos celulares, de forma a que os agentes biologicamente activos encapsulados no interior das esferas possam agir localmente.

Neste contexto, e numa das suas formas de realização, o presente invento é dirigido a uma composição que possui a capacidade de libertar o agente biologicamente activo para um alvo. A composição possui um agente biologicamente activo encapsulado na proteina VP6. Poderá estar presente à superfície das esferas um agente direccionador, que terá por finalidade dirigir a composição para um tipo celular particular.

Numa outra forma de realização, o presente invento é dirigido a um método de encapsulaçâo de tua agente biologicamente activo em esferas da proteina VP6, sendo este método caracterizado por: (a) mistura da proteina VP6 não estruturada em esferas com o dito agente biologicamente activo; e (b) formação das esferas estruturadas da proteina VP6, encapsulando desta forma o dito agente biologicamente activo.

Ainda numa outra forna de realização, o presente invento diz respeito a um método de libertação de um agente 6 biologicamente activo para um grupo seleccionado de células, numa mistura de células. 0 método compreende a combinação da mistura de células com as composições acima descritas.

Estas e outras formas de realização do presente invento ocorrerão prontamente aos peritos na técnica, quando baseados na exposição que se segue.

Descrição Detalhada do Invento A execução técnica deste invento utilizará, excepto quando de outra forma indicado, as técnicas convencionais de imunologia, quimica de proteinas, biologia molecular, microbiologia e tecnologia do DNA recombinante, as quais são conhecidas dos peritos na técnica. Estas técnicas estão descritas em detalhe na literatura. Ver, e.g., Handbook of Experimental Immunoloqy, Vols. I-IV (Eds. D.M. Weir e C.C. Blackwell, 1986, Blackwell Scientific Publications); Methods in Enzymoloqy (Eds. S. Colowick e N. Kaplan, Academic Press, Inc.); Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); Olyqonucleotide Synthesis (Ed. M.J. Gait, 1984); e DNA Cloninq, Volumes I e II (Ed. D.N. Glover, 1985).

Todas as Patentes, Pedidos de patente, e Publicações anteriormente ou subsequentemente mencionadas são aqui incorporadas para referência. A. Definições

Durante a descrição do presente invento, serão utilizados os termos que se seguem, os quais se pretende definir 7

como abaixo indicado.

Por "proteina VP6" pretende-se significar a que é reconhecida pela técnica como a principal proteina virai da cápside interna de qualquer espécie ou estirpe da familia Reoviridae, ou uma proteina funcionalmente equivalente ou substancialmente homóloga, tal como adiante definido. Ver, e.g., Kapikian et al., em Virology (Eds. B.N. Fields et al., 1988). Exemplos de estirpes de rotavirus a partir dos quais a proteina VP6 pode ser isolada e utilizada no contexto do presente invento incluem, mas não de forma limitativa, o SA11 do simio, o rotavirus D humano, o rotavirus UK bovino, o rotavirus Wa ou W humano, o rotavirus DS1 humano, o rotavirus rhesus, o agente "0", o rotavirus NCDV bovino, o rotavirus S2 humano, o rotavirus KUN humano, o rotavirus 390 humano, o rotavirus P humano, o rotavirus M humano, o rotavirus Walk 57/14 humano, o rotavirus Mo humano, o rotavirus Ito humano, o rotavirus Nemoto humano, o rotavirus YO humano, o rotavirus McM2 humano, o rotavirus MMU18006 do macaco rhesus, o rotavirus CU1 canino, o rotavirus Taka felino, o rotavirus H2 equino, os rotavirus St. Thomas no 3 e no 4 humanos, o rotavirus Hosokawa humano, o rotavirus Hochi humano, o rotavirus SB2 procino, o rotavirus Gottfried porcino, o rotavirus SB1A porcino, o rotavirus OSU porcino, o rotavirus Hl equino, o rotavirus Ch.2 da galinha, o rotavirus Ty.l do peru, o rotavirus C486 bovino, e estirpes deles derivados. Assim, a proteina VP6 a utilizar no presente invento inclui a VP6 de qualquer estirpe de rotavirus, tanto do subgrupo I como do subgrupo II ou de qualquer subgrupo ainda ndo identificado, assim como os rotavirus de qualquer dos serotipos 1-7 ou de quaisquer serotipos ainda n3o 8

identificados. Deverá ser considerado que a proteina VP6 a utilizar no presente invento poderá ser produzida por via recombinante, tomando-se como base as sequências destas proteinas isoladas. A sequência nucleotidica que codifica para a VP6 e a sequência de aminoácidos da VP6 são já conhecidas para diversas estirpes de rotavirus. Existe uma grande homologia entre as estirpes.

Duas sequências de DNA ou de proteina são "substancialmente homólogas" quando pelo menos cerca de 85% (de preferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%) dos nucleótidos ou aminoácidos se complementam numa extensão definida da molécula. O termo "funcionalmente equivalente" refere-se a sequências de um análogo da proteina VP6 definindo uma cadeia que produzirá uma proteina capaz de encapsular um agente biologicamente activo, e de libertar esse agente para o tipo desejado de célula alvo, de forma equivalente à da sequência nativa. São aqui descritos ensaios, bem conhecidos da técnica, para a determinação de tais equivalentes funcionais. Assim, as proteinas VP6 aqui utilizadas não necessitarão de possuir uma sequência de aminoácidos idêntica à das proteinas nativas.

Por "exercendo um efeito sobre um grupo seleccionado de células" quer-se significar, de forma geral, a activação ou a inactivação de células especificas, o retardamento ou a interrupção do crescimento ou diferenciação celular, a destruição activa de células particulares ou de bactérias, virus, fungos ou parasitas no interior de células, ou a mutagenização do material 9 d c genético presente no interior de células, ou todos os casos acima. 0 efeito variará dependendo do agente biologicamente activo que estiver presente e das células que servirão de alvo. Por exemplo, se se encontrarem encapsuladas citoquinas n, as esferas de VP6, os monócitos e os macrófagos, os alvos naturais da VP6, serão activados e a função celular de fagocitose será acentuada. Assim, o sistema imunológico de um indivíduo ao qual sejam administradas as composições do presente invento será estimulado. Esta estimulação, por seu turno, poderá manifestar-se no combate a infecções virais, bacterianas, parasiticas e fúngicas, assim como no retardamento ou interrupção do crescimento de células tumorais, ou em outro tipo de alteração da função imunológica. Se estiverem presentes outros agentes direccionadores na esfera de VP6, tal como um anticorpo que reaja com um antigénio presente â superfície de uma célula tumoral, e um agente citotóxico se encontrar encapsulado na esfera de VP6, o agente citotóxico poderá ser libertado directaraente para as células cancerosas. 0 efeito pretendido é um efeito citotóxico que suspenderá ou diminuirá o crescimento das células tumorais. Adicionalmente, podem ser seleccionados como alvo, tecidos e tipos celulares específicos, tais como o fígado, baço, coração, rim, pulmão, células intestinais, eritrócitos, ou outras células do sistema imunológico hematopoiético, tais como as células T, células B, células da medula óssea ou outras células progenitoras, monócitos, macrófagos, células NK ou neutrófilos, sendo o direccionamento proporcionado pela ligação à esfera de VP6 de agentes que se sabe migrarem para estas células, tais como proteínas virais, e semelhantes. Um efeito de tal direccionamento 10

é o de iniciar o sistema imunológico local para atenuar a infecção ao nivel do local celular particular. São igualmente contempladas outras respostas locais, tal como acima apresentado.

Será prontamente evidente, com base no acima exposto, que os termos "grupo seleccionado de células" ou "alvo" abrangem diversos tipos celulares, incluindo células do sistema imunológico hematopoiético tais como monócitos, macrófagos, células T, e neutrófilos, assim como células tumorais, ou outros órgãos, tipos celulares ou tecidos específicos, tais como células hepáticas ou células da mucosa intestinal. Adicionalmente, o "grupo seleccionado de células", com as quais a substância encapsulada se combina e exerce a sua acção, poderá fazer parte de uma população celular mista tanto in vitro como in vivo.

Um "agente biologicamente activo" será um agente capaz de exercer um efeito, tal como acima descrito.

Por "libertação para um alvo" pretende-se significar a libertação do agente encapsulado para uma célula ou tecido alvo, como acima descrito, e em que o agente pode actuar localmente. Dependendo da natureza do agente terapêutico e/ou qualquer porção direccionadora ligada à esfera de VP6, o agente poderá ou reagir directamente com receptores celulares de superfície ou ser internalizado pela célula ou tecido alvo.

Por "encapsulado" pretende-se designar a retenção do agente biologicamente activo no interior das esferas de VP6. Especificamente, é formada uma partícula esférica à volta da substância desejada. Em contraste com os anteriores sistemas transportadores utilizando a VP6 para a libertação de antigénios de superfície, o presente invento não depende de sequências de 11 % ligação ou interacções proteina-proteína para "ancorar" o agente activo aos receptores da molécula de VP6. Assim, o termo "encapsulado" não contempla sistemas em que a substância activa se encontra ligada aos receptores da proteina VP6 através destes mecanismos.

Os termos "polipéptido" e "proteina" são aqui utilizados intermutavelmente, e são usados no seu sentido mais lato, i.e., para designar qualquer polimero composto por aminoácidos (um dipéptido ou uma molécula maior) unidos através de ligações peptidicas. Assim, os termos abarcam oligopéptidos, fragmentos de proteínas, análogos, mutantes, proteinas de fusão e semelhantes. 0 termo "nativo", aplicado a proteinas e polipéptidos, refere-se a proteinas ou polipéptidos recuperados a partir de rotavirus ou de células infectadas por rotavirus. Assim, o termo inclui proteinas de rotavirus de ocorrência natural e seus fragmentos. Por polipéptidos "não nativos" pretende-se indicar polipéptidos produzidos por métodos de DNA recombinante ou por sintese directa. Polipéptidos "recombinantes" serão os polipéptidos produzidos através de técnicas de DNA recombinante; i.e., produzidos a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno codificando para o polipéptido desejado.

Uma composição contendo A está "substancialmente livre" de B quando pelo menos cerca de 85% em peso do total de A + B , na composição, é formado por A. De preferência, A compreende pelo menos cerca de 90% em peso do total de A + B na composição, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%, ou até 99% em peso. 12 B. Métodos gerais A descoberta de que diversas substâncias podem ser encapsuladas em esferas de VP6 de rotavirus constitui o ponto central do presente invento. A encapsulação é conseguida através de uma reacção simples, que requer pouco tempo e que permite que uma grande diversidade de agentes sejam incorporados na proteina VP6. 0 presente invento não requer o uso de agentes de ligação ou de interacções proteina-proteina, já que o agente terapêutico se encontra encapsulado no interior da esfera, e não ligado aos receptores de superfície da VP6. Desta forma, uma maior variedade de substâncias pode ser libertada de forma eficiente através do uso de esferas de VP6.

Os agentes biologicamente activos que podem ser encapsulados pelas esferas de VP6 incluem, mas não de forma limitativa, as citoquinas, como o interferão (IFN), alfa, beta e gama; factores estimuladores de colónias, como o CSF de granulócitos-macrófagos (CSF-GM), o CSF de macrófagos (CSF-M), o CSF de granulócitos neutrofilicos (CSF-G), B PA, multi-CSF, HCGF, MCGF, e PSF (ver, e.g., Metcalf, Science (1985) 229:16), factor estimulador de colónias de células primitivas (CSF-PC), factor inflamatório de macrófagos, factor de necrose tumoral (TNF); e interleuquinas tais como a IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 , IL-10, IL-11 (ver, e.g., Ann. Rev. Immunol.,

Vols. 1-8). 0 presente invento é particularmente útil na libertação de moléculas de baixa solubilidade, tais como as citoquinas produzidas por via recombinante. A encapsulação destes agentes em VP6 permite ultrapassar este problema.

Muitas outras moléculas conhecidas da técnica 13 encontrarão utilidade quando encapsuladas na proteina VP6. Como exemplos de classes de tais moléculas, usualmente macroraoléculas, apontam-se os polipéptidos, os hidratos de carbono e os ácidos nucleicos, incluindo os análogos nucleosidicos e nucleotidicos. As proteínas, glicoproteinas e péptidos podem incluir hormonas, glucagon, factores de crescimento semelhantes a insulina, hormona do crescimento, hormona estimuladora da tiróide, prolactina, inibina, secretina, neurotensina, colecistoquinina ou seus fragmentos, calcitonina, somatostatina, hormonas timicas, neurotransmissores e bloqueadores, factores de libertação de péptidos (e.g., encefalinas), factor de libertação da hormona do crescimento, assim como fragmentos de proteínas, tais como a calmodulina, a enterotoxina estável ao calor e a enterotoxina lábil ao calor da E.coli, a toxina da cólera; e enzimas, tal como a proteina quinase do virus do sarcoma de Rous. Substâncias adicionais incluem hormonas esteróides, tais como a testosterona, estradiol, aldosterona, endorostenediona, ou fragmentos destas. Os exemplos de nucleótidos incluem fragmentos polinucleotidicos, locais de restrição de enzimas, e nucleótidos ciclicos (e.g., a adenosina monofosfato ciclica). Os exemplos de carbohidratos e complexos de carbohidratos incluem cápsulas bacterianas ou exopolisacáridos (e.g., do Hemophilus influenzae B), os antigénios bacterianos do core associados ao lipido A (e.g., de espécies de Pseudomonas), antigénios do grupo sanguíneo (e.g., os antigénios ABO), e glicolipidos. Os exemplos de lipidos incluem ácidos gordos, derivados do glicerol, prostaglandinas (e.g., a prostaglandina E2) e lipopéptidos (e.g., o leucotrieno B4). As moléculas de 14 interesse poderão igualmente incluir alcalóides, tais como a vindolina, a serpentina e a catarantina, assim como vitaminas contendo grupos funcionais -OH, NH, SH, CHO ou COOH.

Uma grande diversidade de agentes terapêuticos, incluindo agentes citotóxicos, mutagéneos, agentes antibacterianos, antivirais, antifúngicos e antiparasiticos encontrarão igualmente utilidade no âmbito do presente invento, incluindo estes agentes, de forma não limitativa, os fármacos ricina, ciclosporina A, estreptomicina, anfotericina B, aflatoxina, vincristina, doxorubicina, propranolol, porfirinas, aciclovir e AZT. A quantidade e tipo de substância que pode ser eficazmente encapsulada pela esfera de VP6 é determinada em parte pela dimensão da esfera de VP6, em parte pelas caracteristicas fisicas e químicas da esfera de VP6, e em parte pelas caracteristicas da substância que nela irá ser encapsulada.

Especificamente, o diâmetro da partícula de VP6 é de -22 3 aproximadamente 70 μπι, com um volume máximo de 1,8 x 10 m. A superfície da esfera parece ser perfurada por 132 canais de 40 a 65 angstroms em diâmetro (Jeager et al., J. Cell Biol. (1990) 110:2133-2144)♦ Deste modo, enquanto que moléculas que possuam secções transversais inferiores a 20 angstroms poderão escoar-se da esfera, moléculas diferentes escoar-se-ão a taxas diferentes.

Assim, moléculas pequenas que sejam retidas em quantidades suficientes para permitir uma libertação eficiente encontrarão utilidade no âmbito do presente invento. Adicionalmente, certas moléculas mais pequenas são também retidas no interior da esfera devido a interacções hidrofóbicas entre as moléculas e as 15

superfícies perfuradas. Assim, de forma geral, substância que possuam uma massa molecular de pelo menos cerca de 200 daltons, de preferência cerca de 500 daltons, e mais preferencialmente de cerca de 10.000 daltons, encontrarão utilidade no presente invento. No entanto, outros agentes que se encontrem fora destes limites poderão igualmente ser passíveis de encapsulaçâo se possuírem as propriedades hidrofóbicas adequadas. Alternativamente, as moléculas pequenas, tal como a BSA, poderão ser polimerizadas ou complexadas de forma a obterem-se moléculas de mais elevado peso molecular, assegurando-se assim a sua retenção na esfera de VP6. Um técnico de pericia média poderá prontamente determinar se uma substância particular pode ser eficazmente encapsulada, tendo em conta os exemplos aqui apresentados. A proteína VP6 a utilizar no presente invento poderá ser preparada por qualquer de diversos métodos. Assim, a proteína VP6 pode ser isolada a partir de partículas virais de cápsula única obtidas in vitro, através de técnicas Standard de tratamento com cloreto de cálcio (CaCl2) ou cloreto de litio (LiCl). Ver, e.g., Almeida et al., J. Med. Virol. (1979), 4^:269-277; Bican et al., J. Virol. (1982) £3:1113-1117; Gorziglia et al., J. Gen. Virol. (1985) 66^:1889-1900; Ready et al., Viroloqy (1987) 157:189-198. Alternativamente, a proteína VP6 pode ser produzida por técnicas de DNA recombinante, que estão extensamente descritas na literatura. Ver, e.g., Sambrook et al., supra; e DNA Cloninq, supra.

Poderão obter-se sequências codificantes de DNA, codificando para o polipéptido VP6, a partir de mRNA VP6. Ver, 16

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Estes et al., supra; Both et al.7 J. Virol. (1984) 51:97-101; Cohen et al., Viroloqy (1984) 138:178-182. Alternativamente, poderá ser preparada por sintese, em lugar de clonagem, uma sequência de DNA codificando para a proteina VP6. A sequência de DNA pode ser concebida de forma a possuir os codões apropriados para a obtenção da sequência de aminoácidos da proteina virai. Em geral, serão seleccionados codões preferidos para o hospedeiro pretendido se a sequência se destinar a ser usada para expressão. A sequência completa é reunida a partir de oligonucleótidos justapostos preparados por métodos Standard e reunidos para formar uma sequência codificante completa. Ver, e.g., Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984), 223:1299; Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Uma vez preparada ou isolada uma sequência codificante para a proteina virai, esta poderá ser clonada em qualquer vector ou replicon apropriado. São conhecidos, pelos peritos na técnica, diversos vectores de clonagem, e a selecçâo de um vector de clonagem apropriado é uma questão de escolha. Os exemplos de vectores de DNA recombinante para clonagem, e de células hospedeiras que estes vectores podem transformar (entre parêntesis), incluem o bacteriófago lambda (E. coli), o pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bactérias gram-negativas), pGV1106 (bactérias gram-negativas), pLAFRl (bactérias gram-negativas), pME290 (bactérias gram-negativas excluindo a E. coli), pHVl4 (E. coli e Bacillus subtilis) pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), yCpl9 (Saccharomyces) e o virus do papiloma bovino (células de mamifero). Ver, genericamente, DNA Cloninq , Vols. I e II, supra; 17

e Sambrook et al., supra. A sequência que codifica para a proteina VP6 pode ser colocada sob o controlo de um promotor, de um local de ligação ao ribossoma (para expressão em bactérias) e, opcionalmente, de um operador (elementos aqui referidos colectivamente como de "controlo"), de forma a que a sequência de DNA codificando para a proteina VP6 seja transcrita para RNA, na célula hospedeira transformada por um vector que contenha esta construção de expressão. A sequência codificante pode ou não conter um péptido de sinal ou uma sequência leader. Em bactérias, por exemplo, a proteina virai é, de preferência, produzida pela expressão de uma sequência codificante que contém uma sequência leader, a qual é removida pela bactéria hospedeira durante o processamento pós-traducional. Ver, e.g., as Patentes Norte-americanas Nos. 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397. E construído um vector de expressão de forma a que a sequência codificante particular esteja localizada no vector juntamente com as sequências reguladoras apropriadas, sendo o posicionamento e a orientação da sequência codificante, relativamente às sequências de controlo tal que a sequência codificante é transcrita sob o "controlo" das sequências de controlo (i.e., a RNA polimerase que se liga à molécula de DNA ao nivel das sequências de controlo transcreve a sequência codificante). As sequências de controlo podem ser ligadas à sequência codificante previamente à inserção num vector, tal como os vectores de clonagem acima descritos. Alternativamente, a sequência codificante pode ser clonada directamente num vector de expressão que contenha já as sequências de controlo e um local de 18 restrição apropriado. São já conhecidos da técnica diversos vectores procarióticos de expressão. Ver, e.g., as Patentes Norte-americanas Nos. 4.440.859; 4.436.815;.4.431.740; 4.431.739; 4.428.941; 4.425.437; 4.418.149; 4.411.994; 4.366.246; 4.342.832; ver também os Pedidos de Patentes Inglesas GB 2.121.054; GB 2.008.123; GB 2.007.675; e o Pedido de Patente Europeia 103.395. São igualmente conhecidos os vectores de expressão em leveduras. Ver, e.g., as Patentes Norte-americanas Nos. 4.446.235; 4.443.539; 4.430.428; ver também os Pedidos de Patentes Europeias 103.409; 100.561; e 96.491.

As células de insecto, e os vectores adequados para utilização nestas células, são particularmente úteis para a expressão da proteina VP6 do presente invento. Tais sistemas são bem conhecidos da técnica, e incluem, por exemplo, vectores de transferência para expressão em insectos construídos a partir de um baculovlrus, o virus da poliedrose nuclear da Autoqrapha californica (AcNPV). Estes vectores de expressão utilizam tipicamente o promotor virai forte do gene da poliedrina para controlar a expressão de genes heterólogos. Os métodos de introdução de DNA heterólogo no local desejado do baculovlrus são conhecidos da técnica (ver, e.g., Smith, et al., Mol. and Cell Biol. (1983) 3:2156-2165; Luckow e Summers, Viroloqy (1989) 17:31; Estes, et al., J. Virol. (1987) ¢[1:1488-1494, e o Pedido de Patente Europeia 273.366. A inserção pode ser efectuada, por exemplo, a nivel de um gene tal como o gene da poliedrina, através de recombinaçâo homóloga. A inserção poderá igualmente processar-se a nivel do local de restrição de uma enzima, 19 construído no gene de baculovirus desejado. Poderão também ser usadas nestes sistemas de expressão sequências codificando para péptidos de sinal, uma vez que estes péptidos são reconhecidos pelas células de insecto e causarão a secreção do produto expresso para o meio de expressão.

Dependendo do sistema de expressão e do hospedeiro seleccionado, a proteina virai é produzida por células do hospedeiro em crescimento, transformadas por um vector de expressão tal como acima descrito, sob condições que permitam a expressão da proteina. A proteina é então isolada a partir das células hospedeiras e purificada. Se o sistema de expressão secretar a proteina para o meio de crescimento, a proteina poderá ser purificada directamente a partir do meio isento de células. Se a proteina não fôr secretada, ela será isolada a partir de lisados celulares. A selecção das condições apropriadas de crescimento e dos métodos de recuperação são bem conhecidas da técnica. A proteina VP6 purificada exibe um polimorfismo estrutural. Especificamente, estão presentes em muitas das amostras, hexâmeros e pequenas redes hexagonais. Entre os valores de pH de cerca de 5 e cerca de 9, formam-se partículas tubulares, moderadamente estáveis a alterações de temperatura e de força iónica. A formação destas partículas é completamente reversível. A um pH de cerca de 4,0, poder-se-ão formar partículas esféricas assemelhando-se a um virus de uma só cápsula. Uma estrutura única, sob a forma de folhas, composta por uma rede de malhas estreitas, é formada em amostras que sofram alterações de pH de cerca de 6,0 para cerca de 4,0. Estes resultados demonstram a 20 importância das interacçdes proteina-proteina na estruturação do rotavirus.

Tais interseções proteina-proteina estarão provavelmente envolvidas no fenómeno observado de que certos péptidos se podem ligar à VP6, na sua forma monomérica, ou a diversas estruturas oligoméricas formadas a partir de monómeros da VP6, tais como os tubos e esferas estruturados in vitro. A ligaçao é mediada por um (uns) local(ais) de ligação especifico(s) na VP6.

Após ter sido realizado o isolamento, a sintese, ou a produção recombinante da proteina VP6, a proteina não estruturada é combinada, através de uma reacção simples, com o agente terapêutico desejado, e é formada uma particula esférica à volta do agente. Geralmente, a reacção envolve a mistura do agente terapêutico com uma preparação de VP6, a um pH que esteja fora do intervalo ao qual são formadas as partículas esféricas. Poderão formar-se partículas assemelhando-se a virus de uma única cápsula a um pH de cerca de 4,0 ou superior. Assim, o agente a ser encapsulado pode ser adicionado a uma preparação de VP6 a um pH inferior ou igual a cerca de 4,0. O pH da solução é então alterado para cerca de 4,0 ou superior, usando qualquer meio adequado, tal como a troca de tampão ou a diálise. Qualquer porção de agente que tenha permanecido fora das esferas pode ser separada das partículas por técnicas simples de purificação, tais como a centrifugação ou a ultrafiltração. O material livre pode ser usado em ciclos adicionais de encapsulação.

Ao pretender-se a libertação do agente encapsulado para um tipo celular particular, poderão ligar-se agentes 21 direccionadores específicos, à superfície da VP6. Por exemplo, anticorpos que reajam com antigénios de superfície de células tumorais, poderão facilmente ser associados à esfera de VP6 para a libertação de agentes citotóxicos directamente para as células tumorais. Adicionalmente, sabe-se que certas partículas virais e outras proteinas têm a capacidade de se dirigir para tipos particulares de células e tecidos, e estes agentes direccionadores poderão igualraente ser acoplados à esfera de VP6.

Os agentes direccionadores poderão ser ligados às esferas de VP6 tanto antes como depois de o agente terapêutico ter sido encapsulado, usando técnicas convencionais de ligação quimica. Uma vantaqem particular da proteina VP6, no entanto, é a de que este sistema permite a ligação de moléculas com uma manipulação minima, através de interacções proteina-proteina. Por exemplo, um péptido sintético correspondendo ao agente direccionador de interesse pode ser sintetizado por via quimica de uma tal forma que este contenha igualmente uma sequência de aminoácidos (péptido de ligação) necessário para ligar o agente direccionador à VP6. 0 agente direccionador pode igualmente ser produzido através da tecnologia do DNA recombinante, como acima descrito, caso em que a sequência nucleotidica que corresponde ao péptido de ligação pode ser adicionada de forma a que o produto resultante é uma combinação (proteina de fusão) do agente direccionador e do péptido de ligação. A ligação da molécula ao veiculo VP6 é então conseguida simplesmente pela mistura das duas substâncias, sem qualquer manipulação adicional.

Foram já encontrados ou projectados diversos péptidos com a capacidade de se ligarem à VP6. As sequências de 22

aminoácidos de dois deles são: (1) Péptido A (22 aminoácidos): Cys-Asp-Gly-Lys-Tyr-Phe-Ala-Tyr-Lys-Val-Glu-Thr-Ile-Leu-Lys-Arg-Phe-His-Ser-Met-Tyr-Gly, e (2) Péptido B (25 aminoácidos): Cys-Asn-Ile-Ala-Por-Ala-Ser-Ile-Val-Ser-Arg-Asn-Ile-Val-Tyr-Thr-Arg-Ala-Gln-Pro-Asn-Gln-Asp-Ile-Ala.

Ambos os péptidos A e B ocorrem naturalmente como porções da proteina virai 4 (VP4) dos rotavirus, e são sensíveis à tripsina. A clivagem dos péptidos pela tripsina evita que estes se liguem à VP6. E evidente que ambas as sequências expostas são aqui apresentadas apenas como exemplo, e que outras composições semelhantes a sequências de ligação, ou sequências em que são introduzidas modificações conservativas, limitadas, de aminoácidos, poderão igualmente ser usadas. De facto, poderão ser projectados péptidos de ligação adicionais pelos peritos na técnica, à luz da presente exposição. Por exemplo, podem também ser usadas variantes de péptidos derivados do péptido B, desde que o péptido inclua uma cisteina e aminoácidos carregados positivamente, e que a conformação tridimensional do péptido seja tal que este se ligue à VP6. Tais péptidos são discutidos mais pormenorizadamente no Pedido de Patente Norte-americana co-pendente No. 07/489.790, de 2 de Março de 1990.

As esferas de VP6 assim formadas, contendo agentes biologicamente activos, encontrarão uma variedade de aplicações. Especificamente, o efeito e o destino do agente encapsulado na esfera de VP6 pode ser estudado in vitro, servindo as descobertas feitas como base para o desenvolvimento de sistemas de utilização 23

terapêutica.

Outros usos incluem o tratamento de diversos distúrbios e doenças. Como acima foi exposto, se uma citoquina fôr encapsulada na esfera de VP6, poderão ser activados os monócitos e os macrófagos, o sistema imunológico poderá ser estimulado, e serão combatidas infecções bacterianas, virais, parasiticas e fúngicas. Ainda, os macrófagos activados poderão igualmente permitir o retardamento do crescimento de células tumorais. Adicionalmente, se um agente citotóxico fôr encapsulado nas esferas de VP6 e um anticorpo direccionador, dirigido contra um antigénio de superfície de uma célula tumoral, estiver presente na esfera de VP6, o agente citotóxico poderá dirigir-se para, e actuar sobre, células tumorais especificas. Ainda, como acima exposto, outros agentes poderão ser acoplados à esfera de VP6 para efectuar a libertação de fármacos particulares para tipos específicos de células ou tecidos, com o fim de proporcionar uma resposta local.

As esferas de VP6 contendo agentes biologicamente activos, tanto isolados como em combinação, poderão ser formuladas em composições farmacêuticas para libertação para um hospedeiro pretendido. Os seguintes modos de administração servirão para libertar e combinar o agente terapêutico para o grupo seleccionado de células, numa mistura de células. A preparação de tais composições é bem conhecida da técnica. Tipicamente, as composições farmacêuticas para utilização no âmbito do presente invento são preparadas como injectáveis, tanto na forma de soluções como de suspensões liquidas. A preparação poderá igualmente ser emulsifiçada. 0 agente encapsulado em VP6 24

pode ser misturado com excipientes que sejam farmaceuticamente aceitáveis e compativeis com o ingrediente activo. Exemplos de excipientes adequados incluem a água, soro fisiológico, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes, e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, as composições farmacêuticas poderão conter quantidades minimas de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes tamponantes do pH. As composições farmacêuticas são administradas convencionalmente por via parentérica, por injecção, por exemplo, que poderá ser tanto intravenosa, como subcutânea ou intramuscular. As formulações injectáveis conterão uma quantidade eficaz do ingrediente activo, sendo a quantidade exacta prontamente determinada por um perito na técnica. 0 ingrediente activo poderá encontrar-se presente numa concentração de cerca de 0,01% a cerca de 95% (p/p) da composição injectável, ou ainda a concentrações mais elevadas ou mais baixas, se apropriado.

As formulações de libertação controlada ou retardada, já conhecidas da técnica, encontrarão igualmente utilidade no contexto do presente invento. Tais formulações estão descritas em, e.g., Reminqtonfs Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985). A VP6, com o agente terapêutico nela encapsulado, pode ser combinada com a formulação de libertação retardada particular. Alternativamente, o agente terapêutico a ser libertado poderá ser combinado com a formulação de libertação controlada e, então, encapsulado na esfera de VP6.

Formulações adicionais, que são adequadas a outros modos de administração, incluem supositórios, formulações orais e aerossóis nasais. Para os supositórios, a composição farmacêutica 25 incluirá agentes de ligação e veiculos tradicionais, tais como os polialcalinoglicóis ou os triglicéridos. Tais supositórios poderão ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo numa concentração da gama de cerca de 0,5% a cerca de 10% (p/p), de preferência cerca de 1% a cerca de 2%. As formulaçOes orais incluem os excipientes normalmente utilizados como, por exemplo, gradientes farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, celulose sódica de sacarina, carbonato de magnésio, e semelhantes. Estas composiçOes orais poderão ser tomadas sob a forna de soluções, suspensões, comprimidos, pilulas, cápsulas, formulações de libertação retardada ou pós, e conterão de cerca de 10% a cerca de 95% do ingrediente activo, de preferência de cerca de 25% a cerca de 70%. As formulações intranasais, destinadas a mamíferos, incluirão geralmente veiculos que não causem irritação à mucosa nasal nem perturbem significativamente a função ciliar. Podem ser utilizados, no âmbito do presente invento, diluentes como a água, o soro fisiológico, ou outras substâncias conhecidas. As formulações nasais podem igualmente conter conservantes, tais como, mas não limitados a, clorobutanol e cloreto de benzalcónio. Poderá estar presente um surfactante para aumentar a absorção das proteinas de interesse pela mucosa nasal.

Adicionalmente, as substâncias encapsuladas em VP6 poderão ser formuladas, para formar composiçOes farmacêuticas, tanto na forma neutra como na de sal. Se forem usados sais, a preparação final conterá tipicamente menos de 0,15M de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida, formados com os grupos amina livres dos polipéptidos 26 activos e com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos cloridrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos como os ácidos acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Os sais formados a partir de grupos carboxilo livres poderão igualmente ser derivados de bases inorgânicas, como, por exemplo os hidróxidos de sódio, potássio, amónio ou o hidróxido férrico, ou de bases orgânicas, tais como a isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaina, e semelhantes.

As formulações do presente invento poderão ser administradas de uma forma compativel com a dosagem, e em quantidades terapeuticamente eficazes. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de toma composição farmacêutica é uma dose suficiente para conseguir o efeito desejado sobre o tipo celular particular num indivíduo ao qual a composição é administrada. As dosagens necessárias para atingir estes efeitos podem ser determinadas por um técnico de pericia média, baseado na presente exposição, através da execução de ensaios de rotina usando controlos apropriados. A comparação entre os grupos apropriados de tratamento e os controlos indicarão se uma determinada dosagem é eficaz. Geralmente, a dosagem eficaz variará segundo o modo de administração. Por exemplo, no caso de uma injecção intramuscular, geralmente uma dose de 0,001 μg/kg a 10 ug/kg encontrará utilidade no âmbito deste invento. São abaixo apresentados exemplos de formas de realização especificas para o presente invento. Os exemplos são oferecidos com fins meramente ilustrativos, e aõ pretendem limitar por qualquer forma o alcance do invento. 27

Depósitos de Estirpes "TJteis na Execução Prática do Invento

Foi efectuado um depósito de culturas biologicamente puras das estirpes que se seguem na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. O número de acesso indicado foi atribuido após um teste de viabilidade bem sucedido, e foram pagas as taxas de depósito. 0 acesso a estas culturas será possibilitado a alguém de direito, durante a pendência do pedido de patente, conforme determinado pelo Delegado, ao abrigo do parágrafo 1.14 da 37 CFR e do parágrafo 122 da 35 USC. Qualquer restrição ao acesso a estas culturas será irrevogavelmente removida pela concessão de uma patente baseada neste pedido. Adicionalmente, os depósitos designados serão mantidos por um periodo de trinta (30) anos a contar da data do depósito, ou por cinco (5) anos a contar do último pedido de acesso ao depósito; ou pela vida máxima da patente norte-americana, sendo a hipótese escolhida aquela que garantir maior duração do depósito. Se uma cultura se tornar não viável ou fôr unadvertidamente destruída, ou, no caso de estirpes contendo plasmideos, estas percam os seus plasmideos, estas culturas serão substituídas por culturas viáveis com a mesma descrição taxonómica.

Estirpe Data de Depósito No ATCC pAC373BRV6 31 de Agosto de 1987 40362 (em E. coli) C. Parte experimental

Materiais e Métodos

Foram adquiridos enzimas através de fontes comerciais, 28

e usados de acordo com as instruções do fabricante. Foram igualmente adquiridos de fontes comerciais radionucleótidos e filtros de nitrocelulose.

Na clonagem de fragmentos de DNA, excepto quando assinalado, todas as manipulações de DNA foram feitas de acordo com procedimentos Standard. Ver Sambrook et al., supra. Os enzimas de restrição, a DNA ligase T4, a E. coli, a DNA polimerase I, o fragmento de Klenow, e outros reagentes biológicos, foram adquiridos a fornecedores comerciais e usados de acordo com as instruções do fabricante. Foram usados geles de agarose para separar fragmentos de DNA de dupla cadeia. Células e Virus:

Foram cultivadas células MA104 (do macaco verde africano) em meio minimo essencial Eagle (MEM), suplementado com 10% de soro de bovino fetal (FBS) (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) . O isolado C486 do rotavirus bovino foi cultivado a partir das fezes de vitelos diarreicos através de um método anteriormente descrito (Babiuk, L.A. et al., J. Clin. Microbiol. (1977) 6 :610-617). O rotavirus C486 está disponivel ao público através da ATCC, Rockville, MD (No de acesso VR-917). 0 virus foi propagado em células MA104 confluentes, na presença de 1 μg de tripsina (Difco Laboratories, Detroit, MI) por ml, na ausência de FBS. As células e o sobrenadante foram recolhidos em conjunto, e as células foram removidas por centrifugação a 500 g durante 20 min. O virus foi concentrado a partir dos fluidos clarificados do sobrenadante ao proceder-se à formação de um pellet num gradiente de 40% de sacarose, a 29

100.000 g e durante 2h ha 15°C. O pellet de virus foi ressuspenso em água redestilada, e a quantidade de proteina virai foi estimada espectrofotometricamente, tal como previamente descrito (Ijaz, M.K. et al., Antiviral Res. (1987) 8^s283—298). 0 virus ressuspenso foi armazenado a -70°C. A proteina VP6 da cápside foi isolada a partir da preparação tal como descrito nos Exemplos que se seguem.

Ensaio de Placas:

Foi efectuado um ensaio em placa para a quantificação do rotavirus infeccioso de acordo com o método previamente descrito (Aha, P.M. e Sabara, M.I., J. Virol. Methods (1990) 28:25-32). Abreviadamente, placas com 12 cúpulas de cultura de tecidos (NUNC) contendo monocamadas confluentes de células MA104, foram lavadas por duas vezes com MEM (isento de FBS). Foram preparadas diluições de 1/10 em série, para cada isolado de rotavirus, em MEM contendo tripsina (Difco Laboratories, Detroit, MI) até uma concentração final de 10 pg/ml. Após a adsorção do virus a 37°C durante 1 hora, o inóculo foi aspirado, as células foram lavadas com MEM e cobertas com Meio Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM) contendo esferas de Sephadex G-75 a 4% (Pharmacia). As placas foram incubadas durante 2 dias a 37°C, o sobrenadante foi aspirado e as placas foram coradas com violeta cristal a 0,5% / metanol a 80% / PBS, lavadas e as placas de lise foram quantificadas. 30

Electroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE1;

As proteínas virais foram separadas por SDS-PAGE sob condiçdes redutoras e não redutoras, de acordo com o procedimento descrito por Laemmli (Laemmli, U.K. Nature (1970) 227:680-685). Foram ressuspensas amostras de virus em tampão de electroforese de amostras (Tris 0,337 M, pH 6,8, SDS a 6%, glicerol a 30%, azul de bromofenol a 0,03%), para a corrida sob condiçdes não redutoras, acrescentando-se mercaptoetanol (BME) a 3,75% para a corrida sob condiçOes redutoras. As amostras foram fervidas durante 5 a 10 minutos, e analisadas após electroforese num gel de resolução de poliacrilamida a 10%, com um gel de empilhamento a 3%.

Análise de Western Blot das Proteínas do Rotavirus:

Os anticorpos específicos das proteínas foram detectados através da técnica de Western Blot descrita por Towbin et al. (Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad, Sei, USA (1979) 7j6:4350-4354) . As proteinas virais, separadas num gel de poliacrilamida a 10%, foram transferidas para um papel de nitrocelulose (0,45 μπι) (BioRad Laboratories) por electrotransferência a 100 volts, durante 1 h, num tampão contendo Tris 20 mM/glicina 190 mM/metanol a 20%. As réplicas obtidas em tira de nitrocelulose foram coradas com negro de amido para determinar a eficiência da transferência de proteinas.

Após a transferência, a reacção da proteina virai com as amostras de soro foi determinada como previamente descrito (Braun, D.K. et al., J. Virol. (1983) £6:103-112). As reacçdes não especificas foram bloqueadas com albumina sérica bovina (BSA) 31

ο a 3% em TBS Ο,ΟΙΜ. Apôs lavagem com TBST, a reacçâo foi desenvolvida com ouro de proteina A (BioRad Laboratories) durante 1 h. Após o desenvolvimento, as bandas de proteina foram acentuadas por intensificação com prata (Janssen Biotech, N.V., Bélgica).

Exemplo 1

Isolamento da VP6 Nativa A proteina virai VP6 foi isolada a partir da suspensão virai purificada (acima descrita) por degradação sucessiva do virus purificado por EDTA e por CaCl2 ou por LiCl, como se segue. As proteínas da cápside externa foram removidas através da incubação do virus (3 mg/ml) em EDTA 50 mM e Tris-HCl 0,01Mr pH 7,4, a 4°C durante 30 min. As partículas subvirais foram recuperadas por ultracentrifugação (lOO.OOOg, 2-3 h, 4°C) e ressuspensas em Tris-HCl 0,01M, pH 7,4, ou borato de sódio 0,01M, pH 9,0. Estas partículas foram então tratadas ou com CaCl2 1,5M e Tris-HCl 0,01M, pH 7,4, a 20°C durante 20-30 min, ou foram congeladas em LiCl 2M e borato de sódio 0,01M, pH 9,0, a -70°C durante 4 dias. Os núcleos e as partículas não degradadas foram separadas das proteínas solubilizadas por ultracentrifugação. O EDTA e os sais foram removidos por diálise extensa a 4°C contra Tris-HCl 0,01M, pH 7,4, a menos que de outra forma indicado. A pureza das amostras foi examinada por electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), como acima descrito. 32

Exemplo 2

Produção de VP6 Recombinante A construção do virus recombinante da poliedrose nuclear da Autographa californica (AcNPV) contendo o gene 6 do rotavirus bovino (BRV) e a recolha de particulas VP6 após infecção de células de Spodoptera frugiperda (SF9) foi já previamente descrita (Redmond, M.J. et al., Mol. Immunol., em impressão). Abreviadamente, foi usado o RNA genómico extraido da estirpe purificada de rotavirus C486 para produzir cDNA. 0 cDNA foi ligado ao local de restrição da Pst I no pBR322, e usado para transformar a estirpe DH1 da E. coli. As colónias resultantes foram sondadas com cDNA radiomarcado, preparado a partir de um molde do segmento 6 de RNA genómico purificado. 0 clone pR6-42, contendo uma cópia completa do RNA do gene 6 foi parcialmente digerido com Aha III, a qual removeu sete nucleótidos 5' não codificantes, assim como as caudas oligo-dC adicionadas durante a clonagem do DNA. Foi então adicionado um linker da Bam Hl. A cauda oligo-dC 3' e a região não codificante foram removidas por digestão com Accl, que remove 56 nucleótidos não codificantes do gene da VP6. Foi então adicionado um linker da Bam Hl. 0 cDNA do gene 6 foi então ligado ao local de restrição da Bam Hl no vector de transferência de baculovirus pAc373. Este vector foi designado por pAC373BRV6 (ATCC No 40362). A integração do gene de rotavirus no genoma da A. californica foi efectuada através de recombinaçâo homóloga em células de S. frugiperda (SF9), como apresentado por Suituners, M.D. e Smith, G.E., Texas Agricultural Station Bulletin 1555;26-27. Os recombinantes foram 33

e identificados por hibridização em placas, como acima descrito, utilizando cDNA radiomarcado, preparado a partir do segmento 6 purificado do rna genómico. Os recombinantes foram purificados através de um ensaio de placas de lise e analisados, para avaliação da expressão de proteínas recombinantes produzidas a partir do gene 6, por análise SDS-PAGE e pela técnica de Western Blot, usando os métodos acima descritos. O virus recombinante contendo o gene 6 foi usado para infectar células SF9. Após uma incubação de 72 h a 27°C, as células foram lisadas em 2 ml de tampão de NaHC03 (pH 7,5) contendo Triton X-100 a 0,05% e 0,2 unidades de inibição de tripsina por ml. Os residuos celulares foram removidos por centrifugação a 1500g. 0 sobrenadante foi dialisado contra um tampão de glicina 0,1M (pH 3,0) durante 24 h. Este passo dissocia os agregados de VP6 em monómeros. A solução de diálise foi substituida por tampão de citrato Ο,ΟΙΜ (pH 4,0), e a diálise prosseguiu por 24 h, periodo durante o qual se formaram as esferas de VP6. Este tampão de diálise foi substituído por um tampão de citrato 0,01M (pH 5,0). A diálise prosseguiu então durante 12 h, a 4°C. 0 material não agregado foi removido por ultracentrifugação, usando filtros de cut-off para pesos moleculares de 300.000 daltons. A qualidade das esferas de VP6 produzidas por este método foi determinada por electromicroscopia, e a sua pureza foi confirmada por SDS-PAGE. 34

Exemplo 3 A. Encapsulação de Proteínas de Pesos Moleculares Variáveis em Esferas de VP6

Foram produzidas partículas de VP6 tal como descrito no

Exemplo 2, introduzindo no entanto as modificações que se seguem. Foram adicionados a uma amostra de 1 ml contendo VP6 (1 mg/ml) 200 μΐ de marcadores de peso molecular de proteínas [^C]- metilados (Tabela 1), numa solução contendo uma concentração final de albumina sérica bovina a 0,5%, sendo a adição à preparação de VP6 feita imediatamente antes de substituir o tampão de glicina pH 3,0 pelo tampão de citrato pH 4,0, prosseguindo então o processamento. A uma outra amostra de 1 ml contendo VP6 (1 mg/ml), foram adicionados à preparação de VP6 200 14

μΐ de proteínas [ C]-metiladas, num tampão de citrato 0,01M, pH 4,0, e o processamento foi retomado. Ambas as amostras foram purificadas por centrifugação (100.000 g, 2 h) através de um gradiente de 40% de sacarose. Os pellets contendo partículas de VP6 foram ressuspensos em dd H2O.

Foi efectuada uma análise de proteínas utilizando a electroforese em gel de poliacrilamida-SDS e a autoradiografia.

Os resultados desta análise indicaram que os marcadores de peso 14 molecular de proteinas [ C]-metilados, que foram encapsulados na partícula de VP6, tinham sido adicionados anteriormente à formação de esferas, i.e., no passo de diálise a pH 4,0. Foi detectada uma pequena ou nula incorporação dos marcadores de 14 peso molecular de proteinas [ C]-metilados para as proteinas que haviam sido adicionadas após a formação de partículas, i.e., a pH 5,0. 35

Tabela 1

Composição e Massas Moleculares dos Padrões de Proteínas

Identificação das Proteínas Massa Molecular Miosina 200.000 Fosforilase 6 97.400 Albumina sérica bovina 69.000 Ovalbumina 46.000 Anidrase carbónica 30.000 Lisozima 14.300 B. Eficiência da Incorporação de Proteínas A eficiência de incorporação foi monitorizada através 14 da adiçao de 1 μΟΐ de proteínas [ C]-metiladas, antes do passo de diálise, com tampão de citrato 0,1M, pH 4,0, prosseguindo a formação de esferas como previamente descrito. Após a centifugação em gradiente de sacarose, o pellet contendo as esferas de VP6 foi ressuspenso em ddH20 e foram tomadas 3 amostras iguais para determinação do conteúdo radioactivo, através de contagem num contador de cintilações de fase liquida. Foram igualmente analisadas desta forma aliquotas do sobrenadante, contendo a amostra original de tampão e a sacarose. Os resultados são apresentados na Tabela 2. 36

Tabela 2

Eficiência do Processo de Encapsulação de Proteínas

Amostra

Radioactividade (MCi) % de incorporação

Partículas de VP6 0,64 64 Sacarose e sobrenadante 0,02 2

Como pode ser observado, as partículas de VP6 foram eficientes na incorporação das proteínas testadas.

Exemplo 4 A. Encapsulação do Interferao Gama Humano Recombinante A produção de esferas de VP6 foi efectuada como descrito no Exemplo 2. Para a encapsulação, foi interrompida a diálise contra o tampão de pH 4,0 após uma hora, e foram r adicionadas à preparação de VP6 10 unidades de interferâo gama recombinante humano (rhu IFN) (Boehringer Manheim Corp.)· A diálise foi então reatada e prosseguiu durante 12 horas, a 4°C, com 3 substituições do tampão de citrato pH 4,0. O tampão de diálise foi substituído por tampão de citrato 0,1M, pH 5,0, e a diálise prosseguiu por mais 24 horas, com 3 substituições do tampão. B. Purificação das Partículas de VP6 Contendo o Interferâo Gama Humano Recombinante

As partículas de VP6 contendo o rhu IFN foram separadas da citoquina livre por centrifugação num gradiente descontinuo de sacarose (passos de 40% e 60%; lOO.OOOg, 2h). 0 pellet contendo as partículas de VP6 foi ressuspenso em tampão citrato 0,1M, pH 37

5,0, e conservado congelado a -70°C até utilização. A análise por SDS-PAGE demonstrou existir rhu IFN nas partículas mas não no gradiente de sacarose.

Exemplo 5

Libertação e Actividade Funcional do rhu IFN Encapsulado A. Isolamento de Leucócitos Mononucleares do Sangue periférico (PBML)

Os PBML humanos foram obtidos a partir de 3 dadores humanos normais: MC, MR, e HH. 0 sangue destes dadores foi recolhido para tubos contendo heparina e centrifugado a 600g durante 30 minutos, até se obter a pelicula amarelo- esbranquiçada. As células desta pelicula foram diluidas a 1:3 com solução salina equilibrada de Hanks (HBSS), e separadas em camadas em Ficoll-Hypaque (Pharmacia), densidade 1,077 g/cm , sendo os tubos centrifugados a 800g durante 45 min. As células recuperadas da interface foram lavadas por duas vezes com HBSS e contadas em azul de tripano. 98-100% das células recuperadas eram mononucleares e 97-99% eram viáveis. B. Cultura e Activação dos PBML com Preparações de rhu IFN e de VP6-rhu IFN Gama 0 meio de cultura usado durante os ensaios foi o RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, 5 μg de gentamicina/ml, e L-glutamina 2 mM. Num dos ensaios, os PBML foram ressuspensos em /Γ meio de cultura, a 3 x 10 células/ml. Dois mililitros desta suspensão de células foram dispensados para cada uma das cúpulas de placas de cultura de tecidos com 12 cúpulas. De forma a avaliar as propriedades de activação do rhu IFN gama encapsulado 38 em VP6, foram adicionados às diferentes cúpulas VP6 purificada, rhu IFN gama, ou VP6 contendo rhu IFN gama, nas concentrações indicadas na Tabela 3. Estas culturas foram incubadas durande 18 h a 37°C, numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2.

Após a incubação, as células não aderentes foram removidas e as células aderentes foram recuperadas por tratamento com lidocaina (lidocaina a 0,7% durante 10 min.). As populações não aderentes e aderentes foram reunidas, coradas para análise de citometria de fluxo, e usadas para ensaios de citotoxicidade. Num outro ensaio, as células foram tratadas com os diferentes protocolos de 5 activação em placas de 96 cúpulas, a uma concentração de 5 x 10 células/cúpula para ensaios de citotoxicidade e à concentração de 1 x 10^ células/cúpula, para a citometria de fluxo. C. Ensaios de Citotoxicidade

Foram realizados ensaios de microcitotoxicidade em triplicado, usando placas de microtitulação com 96 cúpulas de fundo redondo. As células tumorais alvo, não aderentes, K562 (ATCC CCL 243) e P815 (ATCC TIB64) foram marcadas em suspensão (2 x 10^/ml) com 1 ml de RPMI 1640 contendo FBS a 10% e 100 μ(3ί de 51

Na2 Cr04, durante 2 h, a 37°C. Ambas as células alvo foram 5 lavadas por três vezes em HBSS e ressuspensas em 2 x HBSS, a 10 células/ml. Foi adicionada uma aliquota de 50 μΐ de suspensão de células, a cada cúpula contendo células efectoras, e a cúpulas contendo apenas meio e Triton X-100 a 3%. As cúpulas contendo apenas meio serviram como controlos de libertação espontânea, e as cúpulas contendo detergente serviram para calcular a 51 quantidade total libertável de Cr. As placas de microtitulação assim preparadas foram incubadas durante 18 h a 37°C, numa 39 atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO2 · Após a incubação, os fluidos sobrenadantes foram recolhidos através de um sistema de colheita Titertek (Flow Labs Inc.), e a quantidade 51

de Cr libertado foi contada num contador gama (Beckmann). A percentagem de citotoxicidade foi definida como a quantidade de células alvo lisadas em presença das células efectoras (PBML), menos a quantidade de células alvo lisadas na ausência de células efectoras, sendo este cálculo efectuado com base na quantidade de 51

Cr libertado, tal como se segues % de citotoxicidade = (média de CPM do ensaio - média de CPM por libertação espontânea) / (média de CPM por total de libertação - média de CPM por libertação espontânea). A percentagem de citotoxicidade ê, portanto, uma medida da activaçâo das células efectoras pelas linfoquinas testadas. As células efectoras activadas, por seu turno, destroem as células alvo testadas. As células efectoras não activadas não possuem a capacidade de destruir as células alvo testadas. Os resultados dos ensaios são apresentados nas Tabelas 3 e 4.

Tabela 3

Amostra MC: Efeito de Diferentes Protocolos de Activaçâo Sobre a Função Citotóxica

Tratamento % de citotoxicidadea K562 P815

Controlo IL-2, 10 unidades13 12,2 19,5 4,1 8,7 40 7^"

VP6 1:100 11,4 0,8 VP6 1:1000 9,9 2,7 VP6 1:10000 11,3 2,9 VP6-rhuIFN 1:100 17,7 13,8 1:1000 16,2 7,8 1:10000 10,4 8,7 rhulFN, 1000 unidades 17,4 12,8 100 unidades 13,5 7,2 10 unidades 10,4 7,8 A percentagem de citotoxicidade foi determinada como descrito no Exemplo 5C. A razao célula efectora/cêlula alvo, neste ensaio, foi de 10:1.

Foi usada a IL-2 recombinante humana como controlo positivo para a intensificação da citotoxicidade.

Tabela 4

Dadores MR e HH: Efeito dos Tratamentos com VP6 e VP6-IFN sobre a

Função Citotóxica

% de citotoxicidade vs. células P815 Tratamento Dador MR Dador HH

Controlo 1,8 4,2

HuIL-2 47,8 30,4 41 VP6 5,7 3,8 VP6-rhuIFN 28,6 10,7 rhuIFN 23,6 co cri A citotoxicidade foi avaliada como acima descrito. A razão célula efectora/célula alvo, para este ensaio, foi de 50:1. Os dadores MR e HH são humanos.

Como pode ser observado, as linfoquinas encapsuladas foram eficazes na activaçâo de células efectoras, as quais, por seu turno, destruíram as células alvo testadas.

D. Avaliação da Expressão de Antigénios de Classe II do Sistema MHC

Outra forma de avaliar a activaçâo celular e, desta forma, a libertação eficaz das linfoquinas testadas consiste na medição da expressão dos antigénios de superfície da classe II do sistema MHC, uma vez que as células activadas apresentam uma expressão aumentada destes antigénios.

Os PBML foram ensaiados quanto à expressão, à sua superfície, de antigénios MHC da classe II, por citometria de fluxo com fluorescência directa. Um aumento da fluorescência de pico indica a presença de uma expressão aumentada de antigénios MHC da classe II. Após a activaçâo e a recuperação das células aderentes, os PBML foram lavados por duas vezes em HBSS e ressuspensos em PBS com 0,5% de gelatina e NaN3 0,02M. Os PBML foram incubados em gelo durante 1 h, na presença de anticorpos monoclonais, marcados com FITC, dirigidos contra moléculas da 42

Classe II do sistema MHC (Becton Dickinson). Após incubação, os PBML foram lavados por três vezes em PBS/gelatina e fixados em paraformaldeido a 0,4% em PBS 0,1M, pH 7,1. A análise por 3 citometria de fluxo foi efectuada a 5 x 10 células por amostra, utilizando um citómetro de fluxo Epics V da Coulter Electronics Ltd. Os dados foram recolhidos em amplificação logaritmica, numa análise de um só parâmetro. 0 aumento de intensidade da fluorescência foi usado para avaliar a capacidade de diversos protocolos de tratamento para intensificar a expressão de antigénios MHC de classe II, e foi expresso, em histograma, como o canal para o qual foi observado um pico de fluorescência para uma determinada amostra. A proporção de células expressando antigénios MHC de classe II foi expressa como a percentagem de células positivas. Os resultados podem observar-se nas Tabelas 5 e 6.

Tabela 5

Amostra MC: Avaliação da Expressão de Antigénios MHC da Classe II por Citometria de Fluxo >

Fluorescência usando anti-HLA-DR marcado com FITC

Tratamento % de células pico de fluorescência positivas do canal

Controlo 23,9 110 VP6 1:100 21,6 124 VP6 1:1000 19,4 109 VP6 1:10000 20,4 103 43 VP6-rhuIFN 1:100 23,2 157 1:1000 20,9 145 1:10000 18,5 131 rhuIFN, 1000 unidades 24,8 128 100 unidades 19,9 118 10 unidades 23,3 105 Tabela 6 Dadores MR e HH: Avaliação da expressão de antiqénios MHC da classe II por citometria de fluxo Fluorescência usando anti-HLA-DR marcado com FITC Dador Tratamento % de células positivas pico de fluorescência do canal MR Controlo 30,6 93 MR VP6 29,4 104 MR VP6-rhuIFN 32,2 151 MR rhuIFN 31,5 142 HH Controlo 32,6 106 HH VP6 34,6 113 HH VP6-rhuIFN 34,1 159 HH rhuIFN 32,4 141 Como pode ser observado nas tabelas anteriores, o pico de fluorescência foi aumentado no grupo de interferao encapsulado em VP6 , quando em comparação com os controlos ou com a VP6 sem interferão encapsulado, indicando que existiu com o primeiro grupo activação celular, e, portanto, libertação. 44 ο

Exemplo 6

Encapsulação de IL-2 Bovina Recombinante em Esferas de VP6 A produção de esferas de VP6 foi efectuada como descrito no Exemplo 2. Para a encapsulação, a diálise contra o tampão de pH 4f0 foi interrompida após 1 hora, e foi adicionada a cada porção de 1,0 mg de VP6, 0,1 mg de IL- 2 bovina recombinante (rBoIL-2). A diálise foi então reatada, prosseguindo durante 90 minutos a 4°C, com 3 substituições do tampão de citrato. O tampão de diálise foi então substituído por tampão de citrato pH 5,0, e a diálise prosseguiu por mais 24 horas, com 3 substituições do tampão.

As partículas de VP6 foram então separadas da citoquina livre, por centrifugação em sacarose, tal como descrito no Exemplo 4B. A quantidade de rBoIL-2 encapsulada foi quantificada submetendo amostras de rBoIL-2 - VP6, e porções quantificadas de rBoIL-2, a análise de Western Blot, utilizando como sondas antisoros IL-2-especificos, e visualizando depois a ligação do anticorpo por utilização do ouro de proteina A. O "blot" foi então analisado, e a quantidade de rBoIL-2 encapsulada foi estimada por referência aos padrões de rBoIL-2.

Exemplo 7

Libertação e Actividade Funcional da IL-2 Recombinante

Bovina A. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico do bovino

Os PBML de bovino foram obtidos a partir de um dador bovino normal. 0 sangue foi recolhido para tubos contendo 45 heparina e centrifugado a 600g durante 30 minutos, até se obter a película amarelo-esbranquiçada. As células desta película foram diluídas a 1:3 com solução salina equilibrada de Hanks (HBSS), e 3 separadas em camadas em Ficoll-Hypaque, densidade 1,077 g/cm , sendo os tubos centrifugados a 800g durante 45 min. As células recuperadas da interface foram lavadas por duas vezes com HBSS e contadas em azul de tripano. Tipicamente, 98-100% das células recuperadas eram mononucleares e 97-99% eram viáveis. B. Cultura e Activação dos PBML com Preparações de rBoIL-2 e de VP6-rBoIL-2 0 meio de cultura usado durante os ensaios foi o RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, 5 μg de gentamicina/ml, e L-glutamina 2 mM. Os PBML foram ressuspensos em meio a uma concentração inicial de 2 x 10^ células/ml, e distribuídos em aliquotas de 100 μΐ por uma placa de cultura de tecidos com 96 cúpulas. As células foram então incubadas durante 72 horas na presença de porções quantificadas de rBoIL-2, VP6 - rBoIL-2, VP6 ou controlo de meio, tal como mostrado pela Tabela 7. Cada amostra foi representada por três cúpulas. Após 72 horas, foi adicionada timidina tritiada a todas as cúpulas e a incubação continuou por mais 16 horas. Nesta altura, as células foram recolhidas e foi avaliada a incorporação de radiomarcador. Todos os resultados representam a média das três cúpulas por amostra, e estão expressos como um Índice de proliferação, de acordo com a fórmula: (CPM de teste)/(CPM do controlo de meio). 46

Os resultados deste ensaio indicam não só que a rBoIL-2 encapsulada em VP6 é biologicamente activa, mas que ela produz uma curva dose-resposta in vitro que é consistente com a da rBoIL-2 livre.

Tabela 7

Controlo de rBoIL-2 CPM lOOOng 39247 333 37247 111 26901 37 24426 12 21299 4 18696 1,4 15159 0,46 8866 0,15 5281 rBoIL-2 - VP6 CPM 2000ng 25322 200 21965 100 22769 50 17199 25 14664 12,5 9552 6,25 5207 3,1 3330 1,6 2557 0,78 1761 0,39 1268 Controlo de VP6 CPM 10μ1 1035 5 1284 Meio 1494 1476 1043 1038

Assim, é biologicamente activos apresentada encapsulados a produção de agentes em esferas de VP6. Se bem que 47

tenham sido descritas em algum detalhe formas preferenciais de realização do invento, poderão obviamente ser realizadas certas variações sem que se afastem do espirito e do âmbito da invenção, como definida pelas reivindicações anexas. 48

Claims (17)

1. Reivindicações 1. Um método de preparação de uma composição capaz de libertar um agente biologicamente activo para um alvo, compreendendo a dita composição o dito agente biologicamente activo encapsulado em esferas da proteina VP6, sendo o dito método caracterizado pelo facto de compreender: a) a produção, por via recombinante, das ditas esferas da proteina VP6, ou o isolamento das ditas esferas da proteina VP6 a partir de culturas de rotavirus, ou a sintese quimica das ditas esferas da proteina VP6; e b) a encapsulação do dito agente biologicamente activo nas ditas esferas de proteina VP6.
2. 2. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender ainda um agente de direccionamento à superficie das ditas esferas de proteina VP6.
3. 3. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo possuir uma massa molecular de, pelo menos, cerca de 200 daltons.
4. 4. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo possuir uma massa molecular de pelo menos cerca de 10.000 daltons.
5. 5. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo 1 ser o interferão gama.
6. 6. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo ser a interleuquina 2.
7. 7. Um método para a encapsulação de um agente biologicamente activo em esferas da proteina VP6, caracterizado pelo facto de compreender: (a) a mistura da proteina VP6 não estruturada em esferas com o dito agente biologicamente activo; e (b) efectuar a formação de esferas estruturadas da proteina VP6, encapsulando desta forma o dito agente biologicamente activo.
8. 8. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo possuir uma massa molecular de, pelo menos, cerca de 200 daltons.
9. 9. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo possuir uma massa molecular de entre 10.000 e 300.000 daltons.
10. 10. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo ser o interferão gama.
11. 11. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o dito agente biologicamente activo ser a interleuquina 2.
12. 12. Um método para a libertação de um agente biologicamente 2 activo para um grupo seleccionado de células numa mistura de células, sendo o dito método caracterizado pelo facto de compreender a combinação da dita mistura de células com a composição da reivindicação 1.
13. 13. Um método para a libertação de um agente biologicamente activo para um grupo seleccionado de células numa mistura de células, sendo o dito método caracterizado pelo facto de compreender a combinação da dita mistura de células com a composição da reivindicação 2.
14. 14. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o grupo seleccionado de células ser formado por células do sistema imunológico hematopoiético.
15. 15. Um método conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o dito grupo seleccionado de células consistir em monócitos.
16. 16. um método, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o dito grupo seleccionado de células consistir em macrófagos.
17. 17. Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o dito grupo seleccionado de células consistir em células tumorais. Lisboa, 4 de Fevereiro de 1992 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE LIDLjTPJAL

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