ES2284537T3 - Proteinas de fusion bifuncionales recombinantes para la eliminacion de virus variables. - Google Patents

Proteinas de fusion bifuncionales recombinantes para la eliminacion de virus variables. Download PDF

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Abstract

Proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende un primer componente que es una proteína del virus del sarampión modificada de modo que no se une al receptor CD46 ni produce hemadsorción o hemaglutinación, pero conserva su antigenicidad y es reconocido por anticuerpos anti-sarampión; en la que el primer componente es el ectodominio de la proteína hemaglutinina del virus del sarampión (HSar) que se ha modificado mediante la eliminación de entre 58 y 100 aminoácidos N-terminales; mediante mutagénesis de los aminoácidos 243, 451 y 481; y mediante la introducción de deleciones en las regiones de aminoácidos 244-250 y 473-477; y un segundo componente fusionado con el primer componente y que puede unirse a virus genéticamente variables.

Description

Proteínas de fusión bifuncionales recombinantes para la eliminación de virus variables.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a proteínas de fusión recombinantes bifuncionales novedosas, para tratar infecciones con virus genéticamente variables frente a los cuales es difícil desarrollar vacunas.
Antecedentes de la invención
El principio de vacunación se conoce desde el siglo XVIII en la forma de tratamiento empírico contra la viruela. La primera vacuna científica la desarrolló Pasteur (rabia). Ésta fue una vacuna de primera generación, como lo era la vacuna de la viruela, usando animales vivos para su producción. Las vacunas de segunda generación se producen en huevos (gripe, fiebre amarilla) y las vacunas de tercera generación se producen en cultivo celular (polio, sarampión, rubeola, paperas, encefalitis transmitida por garrapatas). Las vacunas de cuarta generación se producen en diversos sistemas de expresión mediante la tecnología del ADN recombinante y están representadas por el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB).
Una vacuna puede consistir en el microorganismo completo (bacteria, virus, parásito, etc.) o parte de él (vacuna de subunidad). En el primer caso, el microorganismo está o bien inactivado (muerto) o atenuado. Además, tal como se mencionó anteriormente, se han usado recientemente antígenos recombinantes o péptidos inmunogénicos sintéticos y se han desarrollado vacunas de ADN que se basan en la célula huésped para producir el/los antígeno(s) deseado(s).
El fin principal de la vacunación es y siempre ha sido la prevención profiláctica de una enfermedad particular.
No obstante, incluso el desarrollo relativamente rápido de vacunas contra algunas enfermedades potencialmente mortales puede ser demasiado tarde para las personas ya infectadas. El número de personas infectadas en todo el mundo por tres de los virus humanos más comunes, virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC) y virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), representa hasta el 10% de la población humana, cuando se combinan las últimas cifras de 300-400 millones para VHB, más de 60 millones para VHC y más de 30 millones para VIH. Por tanto, existe una clara necesidad de agentes terapéuticos y una de las opciones es el desarrollo de vacunas terapéuticas.
El desarrollo de vacunas es caro y el coste de desarrollar una vacuna es de entre 50 millones y 200 millones de US\textdollar. Gran parte de los costes refleja los esfuerzos realizados para garantizar que una variedad de variantes antigénicas del agente infeccioso particular se desactivan por la vacuna. Esto es difícil con microorganismos moderadamente divergentes genéticamente pero es casi imposible con virus que tienen antígenos tan variables como las glucoproteínas de superficie de VIH, VHC o influenza. Por otro lado, hay vacunas sumamente exitosas con un registro probado de eficacia y seguridad, tales como las de la polio y sarampión, paperas y rubeola (SPR). La principal diferencia entre VHC, VIH e influenza por un lado y polio, sarampión, paperas y rubeola por otro lado, es que los miembros de este último grupo contra el que existen vacunas exitosas son genéticamente mucho más estables que los del primer
grupo.
La vacunación contra la gripe se dirige cada temporada a variantes particulares que se pronostica que van a aparecer basándose en estudios epidemiológicos. Las vacunas experimentales contra el VIH se basan en diversos constructos de proteína(s) de la envoltura que se originan a partir de una o varias cepas. Sin embargo, todavía es improbable que este enfoque sea eficaz para el espectro completo o al menos una mayoría de aislados de campo en todo el mundo. No existe aún una vacuna en ensayos para VHC.
Por el contrario, tal como se mencionó previamente, son genéticamente más estables virus tales como el del sarampión. Las cepas de vacuna inducen anticuerpos que dan ampliamente reacción cruzada. La hemaglutinina del sarampión (HSar) es una diana principal para estos anticuerpos. Es una glucoproteína como lo es la segunda proteína de superficie, la proteína de fusión (F). Se requieren ambas para una fusión de membranas celulares, pero la secuencia de acontecimientos comienza con la unión de HSar al receptor celular, que se cree que es CD46. HSar es una proteína anclada a la membrana de la que se propone que los aminoácidos 1 a 34 forman un dominio citoplasmático, mientras que los 35 a 58 comprenden un dominio transmembrana (véase la figura 1). Se cree que los residuos 59 a 181 forman un tallo, parte del cual (135 a 181) forma probablemente una bisagra de una molécula [Sato et al., J. Virol. 69, 513-516 (1995)1. Las espículas de HSar en la superficie del virión consisten en tetrámeros (dímeros de homodímeros unidos mediante puentes disulfuro). Se sugirió que las cisteínas 139 y 154 participaban en los enlaces disulfuro intermoleculares entre las glucoproteínas HSar monoméricas. Todas las formas solubles que resultan de la digestión con endoproteinasa de partículas del virus del sarampión reaccionaron con anticuerpos monoclonales, lo que sugiere la conservación de la antigenicidad/reactividad [Sato et al., J. Virol. 69, 513-516 (1995)]. Se mapeó el dominio de HSar requerido para las actividades de hemadsorción y hemaglutinación entre los residuos 451 y 505 [Hummel & Bellini, J. Virol. 69, 1913-1916 (1995)]. Además de la hemadsorción, las mutagénesis de Val451Glu y Tyr481Asn también suprimieron la regulación por disminución de CD46 y la fusión de células HeLa [Lecouturier et al., J. Virol. 70, 4200-4204 (1996)]. Se mapeó un nuevo sitio novedoso requerido para la interacción de CD46 entre 473 y 477 [Patterson et al., Virology 256, 142-151 (1999)]. Un epítopo neutralizante adicional NE244-250, ubicado próximo al aminoácido Arg 243 de regulación por disminución de CD46, puede estar implicado en la unión de CD46 [Fournier et al., J.Gen. virol. 78, 1295-1302 (1997)].
Es un objeto de la presente invención proporcionar un constructo adecuado para el tratamiento de las personas infectadas por virus genéticamente variables.
Sumario de la invención
Las formulaciones de vacuna exitosas se dirigen generalmente contra proteínas de la superficie, y dan como resultado la producción de anticuerpos neutralizantes. Cuando las proteínas de superficie son variables, como es el caso en virus genéticamente variables como VIH-1, éste es un proceso arduo. La presente invención salva el problema empleando una entidad que, aunque sin neutralizar el virus, puede unirse a proteínas de superficie que están conservadas entre las cepas virales y al hacerlo así puede mediar la eliminación del virus.
Por tanto, la presente invención proporciona una proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende:
- un primer componente que es una proteína del virus del sarampión modificada de modo que no se une al receptor CD46 ni produce hemadsorción o hemaglutinación, pero conserva su antigenicidad y es reconocido por anticuerpos anti-sarampión; en la que el primer componente es el ectodominio de la proteína hemaglutinina del virus del sarampión (HSar) que se ha modificado mediante la eliminación de entre 58 y 100 aminoácidos N-terminales; mediante mutagénesis de los aminoácidos 243, 451 y 481; y mediante la introducción de deleciones en las regiones de aminoácidos 244-250 y 473-477; y
- un segundo componente fusionado con el primer componente y que puede unirse a virus genéticamente variables.
Por un lado, el segundo componente reconoce y se une específicamente a la diana. Es adecuada cualquier entidad de unión de este tipo; no es necesario que tenga un efecto neutralizante. Son particularmente útiles las entidades de este tipo que pueden unirse a secuencias peptídicas en la estructura de la superficie del virus variable, tal como glucoproteínas de la envoltura, que están conservadas entre las cepas virales, incluyendo los virus VIH y VHC notoriamente variables. Por tanto, la proteína de fusión de la invención puede unirse a virus variables.
Por otro lado, se reconoce el primer componente por anticuerpos anti-sarampión, que están presentes en la población general como resultado de programas de vacunación masiva. Específicamente, el primer componente es el ectodominio de la proteína hemaglutinina del virus del sarampión (HSar) que se ha modificado por ingeniería de tal manera que no sea tóxico: no puede unirse al receptor CD46 ni producir hemadsorción o hemaglutinación. Se consigue la falta de toxicidad con la eliminación de entre 58 y 100 aminoácidos N-terminales de HSar, la mutación de los aminoácidos 243, 451 y 481; y la introducción de deleciones en las regiones de aminoácidos 244-250 y 473-477 de HSar. A pesar de la falta de toxicidad, esta HSar variante conserva su antigenicidad y se reconoce y se une a anticuerpos anti-sarampión prevalentes y células de memoria que resultan de vacunaciones o infecciones de sarampión previas. Por tanto, la proteína de fusión de la invención puede unirse a anticuerpos anti-sarampión presentes en la población, incluyendo pacientes infectados por virus variables.
Como resultado, estas proteínas de fusión bifuncionales pueden recordar la inmunidad anti-sarampión existente en un paciente y, al mismo tiempo pueden unirse a una diana viral, tal como VIH o VHC. La reacción inmunitaria anti-sarampión conduce a la eliminación del complejo, que ahora incluye un virus variable. Por tanto, las proteínas bifuncionales son útiles para tratar pacientes infectados por tal virus.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a polinucleótidos (particularmente ADN = que codifica para la proteína de fusión recombinante de la invención. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de fusión, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a un enfoque terapéutico novedoso que usa la inmunidad humoral y/o celular existente contra los virus del sarampión con el fin de eliminar virus genéticamente variables como VIH y VHC. Con este fin, la invención proporciona una proteína de fusión bifuncional que consiste en un antígeno frente al cual el individuo tratado ya ha desarrollado anticuerpos (en el presente documento, HSar) y en un resto de redireccionamiento que media la unión del complejo al virus variable diana.
Con este fin, HSar debe modificarse de varias maneras con el fin de adaptarse de manera óptima al enfoque propuesto.
Para el fin de la presente invención, se eliminaron la mayoría de las funciones de HSar llevadas a cabo en el ciclo de replicación normal. Los requerimientos para HSar como dosis de refuerzo/antígeno portador son los siguientes:
1) inmunogenicidad/reactividad conservada con anticuerpos existentes y reconocimiento conservado por células de memoria
2) Solubilidad/ausencia de anclaje a la membrana
3) Proporcionar un ligador/bisagra entre dos partes no relacionadas de una nueva molécula de fusión
4) Ausencia de unión a CD46
5) Ausencia de aglutinación/unión a eritrocitos.
Con el fin de introducir estos cambios, se amplificaron por PCR constructos del gen de HSAr de la cepa de la vacuna contra el sarampión que carece de entre 58 y 100 aminoácidos N-terminales y se clonaron (figura 1). Se modificaron adicionalmente estos clones mediante mutagénesis dirigida al sitio de los codones para los aminoácidos 451 y 481, así como 243. Además, se introdujeron pequeñas deleciones en las regiones 244-250 y 450-505 (particularmente 473-477). Los criterios de selección fueron: falta de unión a CD46, falta de las actividades de hemadsorción y hemaglutinación. Al mismo tiempo, los constructos exitosos conservan su antigenicidad/capacidad para ser reconocidos por los anticuerpos de individuos vacunados.
Como segundo componente, se presentan varias moléculas candidatas que redireccionan el complejo hasta dianas virales variables, concretamente el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Con el fin de evitar una reacción inmunitaria no deseada a esta parte de la molécula del complejo, sólo se consideran las proteínas de redireccionamiento de origen humano para el tratamiento de seres humanos. Las moléculas candidatas son anticuerpos de cadena sencilla (scFv) que pueden seleccionarse de grandes bibliotecas de presentación en fago. También pueden usarse anticuerpos monoclonales. Para VHC, se sabe que al menos una subpoblación del virus en el torrente sanguíneo está asociada con la fracción de lipoproteínas de baja densidad (LDL), lo más probablemente a través de la unión entre la glucoproteína E1 de VHC y la apolipoproteína B (apoB) de LDL. Por lo tanto, se ha sometido ApoB a fragmentación química y se determinaron los fragmentos relevantes que se unen al virión de VHC y/o glucoproteína E1 de VHC. Éstos estaban fusionados a nivel génico con HSar, modificada según se describió anteriormente.
De manera similar, se estudiaron moléculas candidatas o partes de ellas para la unión a VIH. Con este fin, se investigaron las bibliotecas de expresión preparadas a partir de fuentes que mayoritariamente no entraron en contacto con el virus para descubrir proteínas desconocidas previamente que pueden unirse a las estructuras accesibles del virión de VIH. Se identificaron varias proteínas de unión en una biblioteca de cerebro humano y se secuenciaron algunas de ellas. Dos clones con actividad de unión relativamente elevada fueron:
1) un clon con la secuencia codificante para la creatina cinasa B.
2) un clon para una proteína humana desconocida, cuya secuencia parcial se lee tal como sigue.
100
También serían adecuadas las variantes de estos clones que se diferencian en no más del 5% de las posiciones de aminoácidos y se unen todavía a la proteína de la envoltura del VIH.
Usando los métodos descritos para la apolipoproteína B anteriormente, se fusionaron los fragmentos de estas proteínas que median la unión al virión de VIH y/o proteína env con constructos de HSAr, modificados tal como se describió previamente.
La principal idea de esta invención es usar la memoria inmunológica existente en la mayoría de la población contra un antígeno genéticamente estable como resultado de una infección natural o, preferiblemente, vacunación (que tiene la ventaja añadida de registros disponibles y metodología convencional), y redirigirla hacia agentes infecciosos u otros, contra los cuales es difícil preparar vacunas debido a la variabilidad genética u otros motivos. Se ha elegido la hemaglutinina del sarampión (HSar) por varios motivos:
1) La vacunación contra el sarampión ha demostrado ser satisfactoria durante un largo periodo de tiempo y el sarampión es uno de los futuros candidatos para la erradicación global. Por tanto, hay una alta cobertura de vacunación también en la mayoría de los países en desarrollo.
2) Se ha mostrado que la mayor parte de la actividad protectora frente al virus del sarampión (VS) se dirige contra la hemaglutinina.
3) Existen suficientes datos estructurales y funcionales disponibles sobre la hemaglutinina.
Este tipo de redireccionamiento puede ser aplicable de forma muy amplia dependiendo de la disponibilidad de molécula o motivo de unión/redireccionamiento y puede incluir, aparte de agentes infecciosos, también células cancerígenas. Sin embargo, en la presente invención se hace hincapié en los virus humanos variables, concretamente VIH y VHC. Especialmente, las cifras de prevalencia de VIH en algunas regiones de Asia y África son críticas y se necesitan rápidos enfoques terapéuticos novedosos.
Se sabe bien que los pacientes con SIDA experimentan disfunción de su sistema inmunitario. Por tanto, pueden plantearse cuestiones sobre cuales son los niveles de anticuerpos contra los antígenos de vacunación previa, tales como el sarampión, y cómo está afectada la memoria inmunológica en estos pacientes. De manera sorprendente, no se aceleró mucho la disminución de la inmunidad frente al sarampión en adultos infectados por VIH a pesar de la inmunodeficiencia relacionada con VIH progresiva [Zolopa et al., Clinical Infectious Diseases 18, 636-638 (1994)]. Los niveles de anticuerpos contra el sarampión permanecieron estables en ambos, pacientes infectados por VIH con progresión y sin progresión [Brostrom et al., Clinical y Experimental Immunology 106, 35-39(1996)] y el 95% de 210 pacientes positivos para VIH tenían anticuerpos contra el sarampión independientemente de los recuentos de CD4 [Wallace et al., Vaccine 12, 1222-1224 (1994)].
No hay constancia de que los individuos infectados por VIH tengan afectado su sistema inmunitario de esta manera y no se prevén limitaciones del enfoque terapéutico descrito.
Ejemplos
Se proporcionan los siguientes ejemplos con fines de ilustración únicamente y no deben considerarse como una limitación del alcance de la invención. La figura 1 adjunta a la misma muestra esquemáticamente la modificación por ingeniería genética implicada. La figura 2 muestra la unión de proteínas expresadas por ciertos clones de ADNc (útiles como primer componente) a la glucoproteína de la envoltura de VIH. En lo siguiente, ul significa microlitros, "significa minutos y" significa segundos excepto en las secuencias de nucleótidos.
Ejemplo 1 Amplificación y clonación del gen para hemaglutinina de la cepa de vacuna del virus del sarampión
Se extrajo ARN de la cepa Edmonston del virus del sarampión usado RNasol B (AMS Biotechnology) según las instrucciones del fabricante. Se lavó el ARN con etanol al 80% dos veces, se secó al aire y se disolvió en 100 ul de agua tratada con DEPC.
Síntesis de ADNc: Se mezclaron 30 ul de ARN con 13 ul (25 pMol/ul) de cebador XhoMH/full/A [5'-ggCCTC
gAgTCTgCgATTggTTCCATCTTCCCg-3'; 33 meros], se calentó durante 10 minutos a 70ºC y se enfrió con hielo.
Se añadieron los siguientes componentes de la mezcla de reacción: 34,5 ul de agua/DEPC; 4 ul de mezcla 25 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 5 ul de 10 x tampón Super Reverse Transcriptase (Super RT) (HT Biotechnology); 2,5 ul (100 U) de Rnasin (Promega Corporation) 4 ul de Super RT. Se incubó la mezcla de reacción (volumen final de 100 ul) durante 40 minutos a 42ºC.
Se usó el ADNc resultante para amplificar dos variantes de HSar: de longitud completa (HSarlc) y variante corta, que carece de 59 aminoácidos N-terminales (HSarvc). HSarlc está diseñado para fines comparativos, HSarvc está diseñado para mutagénesis adicional y fusión con la parte de redireccionamiento de las moléculas bifuncio-
nales.
101
Se recubrieron las mezclas de reacción con 50 ul de aceite mineral. Se añadió AmpliTaq durante la primera etapa de desnaturalización (95ºC). Se realizó una PCR usando Trioblock y el siguiente programa:
1 ciclo 95ºC/3' y 65ºC/30'';
30 ciclos 72ºC/60''; 95ºC/30''; 65ºC/30'';
Extensión final 72ºC/7'.
Se analizaron alícuotas de 2,5 ul de las reacciones de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Se limpiaron los productos de la reacción de PCR reacción según las instrucciones del fabricante usando el kit de columna de centrifugación para purificación QPCR (Qiagen) y se eluyeron con 50 ul de tampón de elución.
Clonación en el vector TOPO 2.1 para subclonación
Se mezcló 1 ul de ADN de TOPO 2.1 proporcionado en el kit de clonación TA (Invitrogen) con 1,5 ul de cada eluato de PCR y 2,5 ul de agua. Durante una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 2 ul de beta-mercaptol-etanol a cada alícuota de células TOP 10 (Invitrogen). Se añadió 1 ul de mezcla de plásmido-inserto a las células TOP 10, se incubó en hielo durante 30 minutos, se sometió a choque térmico a 42ºC durante 30 segundos y se enfrió en hielo durante dos minutos. Se añadieron 250 ul de medio SOC (kit de Invitrogen) a cada transformación y se colocaron horizontalmente los tubos en un agitador a 37ºC durante 30'. Se cultivaron 10 y 100 ul en placas de agar con ampicilina (100 ug/ul) a las que se añadieron 40 ul de X-Gal 40 mg/ml unos 30 minutos antes. Se hicieron crecer 5 colonias blancas de cada constructo durante la noche en medio TYE que contenía ampicilina 100 ug/ml y ADN de plásmido extraído usando minipreparación de plásmido (Quiagen). Se comprobó la presencia de los insertos de tamaño correcto tras la digestión simultánea de los ADN de plásmido con BamHI y XhoI. Las endonucleasas de restricción y componentes de reacción (tampón 2; BSA) procedían de New England Biolabs - NEB. Se incubaron las reacciones 1 hora a 37ºC y se corrieron 25 ul de cada reacción sobre el gel de agarosa y se limpiaron los insertos mediante el kit de purificación en gel Qiaquick (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Clonación en el plásmido cDNA4/HisMax A, B y C para mutagénesis y expresión
Se usan tres variantes de pcDNA4/HisMax (A, B y C; Invitrogen) para garantizar la clonación en el marco de los insertos. Se diseña el plásmido para la sobreproducción de proteínas recombinantes en líneas celulares de mamí-
feros.
Se digirieron los ADN de las variantes A, B y C del plásmido con BamHI y XhoI y se purificaron en gel tal como se describió anteriormente para los insertos. Se ligaron los insertos y plásmidos purificados juntos en una reacción de ligamiento habitual y se transformaron células TOP 10 tal como se describió anteriormente. Se hicieron crecer colonias blancas como se describió anteriormente y se comprobaron los insertos en el marco mediante secuen-
ciación.
Ejemplo 2 Mutagénesis in vitro de HSarlc y HSarvc
Las principales dianas para la mutagénesis fueron:
1. Mutagénesis dirigida al sitio del codón para el aminoácido 243.
2. Mutagénesis dirigida al sitio del codón para el aminoácido 451.
3. Mutagénesis dirigida al sitio del codón para el aminoácido 481
4. Deleciones cortas en las regiones entre los aminoácidos 244-250.
5. Deleciones cortas en las regiones entre los aminoácidos 450-505 (es decir, 473-477).
\vskip1.000000\baselineskip
Se lleva a cabo la mutagénesis usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). La ventaja es que los plásmidos con secuencias clonadas de interés se mutan directamente, sin la necesidad de subclonación adicional. Se necesitan dos cebadores complementarios para cada mutación, en la que el/los nucleótido(s) mutado(s) o inserción/deleción deben situarse en el centro de los cebadores. El procedimiento implica la digestión de las hebras de ADN originales (no mutadas) con DpnI. Se llevan a cabo los procedimientos tal como se describe en el manual de instrucciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos de cebadores usados para la mutagénesis
1 Arginina 243:
Sentido (28 meros): 5'-CTgAgCAgCAAAgCgTCAgAgTTgTCAC-3'
Antisentido (28 meros): 5'-gTgACAACTCTgACgCTTTgCTgCTCAg-3'
Se cambia la arginina 243 por alanina en este caso.
\vskip1.000000\baselineskip
2 Valina 451:
Sentido (32 meros): 5'-CCAACCACAACAATgACTATTggCTgACTATC-3'
Antisentido (32 meros): 5'-gATAgTCAgCCAATAgTCATTgTTgTggTTgg-3'
Se cambió la valina 451 por ácido aspártico en este caso.
\vskip1.000000\baselineskip
3 Tirosina 481:
Sentido (30 meros): 5'-CAAggTTAgTCCCCAgCTCTTCAATgTCCC-3'
Antisentido (30 meros): 5'-gggACATTgAAgAgCTggggACTAACCTTg-3'
Se cambió la tirosina 481 por glutamina en este caso.
\vskip1.000000\baselineskip
4 Región 244-250: deleción de 6 nucleótidos (2 aminoácidos) de los codones para Leu247-Ser248
Sentido (38 meros): 5'-gAgCAgCAAAAggTCAgAgCAACTgAgCATgTACCgAg-3'
Antisentido (38 meros): 5'-CTCggTACATgCTCAgTTgCTCTgACCTTTTgCTgCTC-3' 
\vskip1.000000\baselineskip
5 Región 451-505: deleción de 3 nucleótidos (1 aminoácido) del codón para Arg475
Sentido (32 meros): 5'-CATTggAgTggATACCgTTCAAggTTAgTCCC-3'
Antisentido (32 meros): 5'-gggACTAACCTTgAACggTATCCACTCCAATg-3' 
\newpage
En todos los 5 casos, el ejemplo de la reacción fue tal como sigue (componentes del sistema procedentes del kit):
5 ul de 10 x tampón de reacción
5 - 50 ng de plantilla de ADN dS (partiendo de pcDNA4/HisMax/HSarfl o pcDNA4/HisMax/HSarsv)
125 ng de cebador 1
125 ng de cebador 2 (complementario)
1 ul de mezcla de dNTP
H_{2}Odd hasta 50 ul
1 ul (2,5 U) de de Pfu ADN polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros de ciclación:
1 ciclo a 95ºC durante 30''
12 ciclos (para la mutación puntual)
16 ciclos (para el cambio de un único aminoácido) a 95ºC/30''; 55ºC/1'; 68ºC/14'
18 ciclos (para inserciones o deleciones de múltiples aminoácidos) (2' por kb de plásmido).
Tras la ciclación, se enfriaron las reacciones en hielo durante 2'. Se añadió 1 ul de DpnI (10 U), se mezcló la mezcla de reacción, se centrifugó brevemente en microcentrífuga y se incubó a 37ºC durante 1 hora (eliminación de ADN no mutado).
Se transformó 1 ul de cada ADN de plásmido mutado resultante en células supercompetentes Epicurian Coli XLI-Blue usando un procedimiento convencional, tal como se describe en el ejemplo 1, excepto porque el choque térmico a 42ºC fue durante 45'' cuando se usaron tubos de polipropileno Falcon 2059. Se usó caldo NZY+ (0,5 ml) para incubar la reacción de transformación a 37ºC durante 1 hora con agitación a 225 -250 rpm y se extendió sobre placas de LB-ampicilina a las que se añadieron de antemano 20 ul de X-gal al 10% (p/v) y 20 ul de IPTG 100 mM. Aparecieron colonias tras 16 horas a 37ºC.
Se mutagenizaron pcDNA4/HisMax/HSarfl y pcDNA4/hisMax/HSarsv en paralelo para fines comparativos, de manera escalonada: se usó el producto de la reacción de mutagénesis 1 (cambio de Arg 243) como plantilla para la etapa de mutagénesis 2 (cambio de valina 451) tras confirmación del sitio mutado mediante secuenciación. Por tanto, los productos finales de la mutagénesis dirigida al sitio contenían todos 5 tipos de mutaciones: Arg243; Va1451; Tyr481; deleciones cortas en la región 244-250 y 473-477.
Se investigaron variantes de hemaglutinina del sarampión expresadas por los plásmidos mutagenizados para determinar la pérdida de hemadsorción y unión al receptor celular. De forma importante, deben conservar la capacidad para ser reconocidas por anticuerpos de individuos vacunados previamente o infectados de manera natural. Se usaron aquellas que satisficieron estos criterios para la fusión en el marco con el componente de redireccionamiento de la proteína de fusión final. La fusión está mediada a través de la amplificación del componente de redireccionamiento usando cebadores específicos que contenían el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI. Debe comprobarse la orientación del componente de redireccionamiento de modo que el extremo C-terminal del componente de redireccionamiento esté fusionado con el extremo N-terminal de HSARvc mutagenizada, sustituyendo así 58 aminoácidos N-terminales originales de HSar. En tal construcción, puede usarse la bisagra natural de la molécula de HSar (véase la descripción) para situar las dos partes de la proteína de fusión. Las proteínas de fusión completas experimentan el mismo conjunto de investigaciones que las variantes de HSar mutagenizadas en lo que respecta a las actividades de unión y reactividades de anticuerpos.
Ejemplo 3 Identificación de proteínas que se unen a la proteína de la envoltura de (env) de VIH 1 para fines de direccionamiento
a) Examen de bibliotecas de ADNc de expresión humanas con env recombinante biotinilada
b) Confirmación de la unión en inmunotransferencia de tipo Western
c) Identificación de clones de ADNc seleccionados, mediante secuenciación.
a) Examen de bibliotecas de ADNc de expresión humanas con env recombinante biotinilada
Biotinilación: Se ha disuelto gpl20 de VIH1 recombinante en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 0,5 ug/ul y biotinilada usando el kit de biotinilación (Boehringer, nº de cat. 1418 165) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se fijó la columna y se añadieron 5 ml de disolución de bloqueo, luego se lavó con 6 x 5 ml de PBS.
env: Se disuelve en 500 ul de PBS.
Se toman 475 ul para el marcado.
Se añaden 17,5 ul de PBS y 7,5 ul de biotina-7-NHS 20 mg/ml en DMSO mientras se agita.
Se pone en un tubo.
Se incuba 2 h/ta/rueda giratoria.
Se elimina el tapón y la tapa de la columna preparada.
Se añaden 500 ul de PBS para ajustar el volumen a 1 ml, se permite el flujo a su través.
Se añaden otros 1,5 ml de PBS, se permite el flujo a su través.
Se añaden 3,5 ml de PBS y se recogen 10 gotas (aproximadamente 0,5 ml).
Se espera proteína en los 4 primeros tubos - se corren 7,5 ul sobre el gel.
Tras el ensayo de proteínas, se reúnen fracciones seleccionadas. Examen de una biblioteca de ADNc de expresión humana.
Se preparó la biblioteca de ADNc mediante clonación de ADNc de cerebro humano en el vector de expresión. Se hizo crecer la biblioteca en placas de agar a alta densidad y se transfirió a filtros de nylon y se lisó y fijó usando técnicas convencionales.
Tamizado con filtro
1) incubación de 20 minutos en 200 ml de etanol absoluto.
2) 1 lavado durante 5 minutos en 1 litro de PBS-T-T (PBS-Tween20).
3) 2 aclarados cada uno con 1 litro de PBS y un tercer lavado de 5 minutos con 1 litro de PBS.
4) lavado de 45 minutos con Marvel al 3%-PBS.
5) incubación de 1 hora en env biotinilada/Marvel al 3% -PBS
6) 1 lavado durante 5 minutos en 1 litro de PBS-T-T.
7) 2 aclarados cada uno con 1 litro de PBS y un tercer lavado de 5 minutos en 1 litro de PBS.
8) 20 ml de 1 x PBS con 3% de Marvel
9) incubación de 40 minutos en 1 con dilución 5000 de estreptavidina-peroxidasa del rábano (PR) en Marvel al 3%-PBS. 30 ul de estreptavidina-HRP en 150 ml de Marvel al 3%-PBS.
10) 2 lavados durante 5 minutos cada uno en 1 litro de PBS-T-T.
11) 2 lavados durante 5 minutos cada uno en 1 litro de PBS.
12) Revelado usando reactivos ECL (Amersham).
b) Confirmación de la unión en inmunotransferencia de tipo Western (figura 2)
Se hicieron crecer 11 colonias positivas identificadas procedentes de placas madre en cultivos líquidos durante la noche.
Se preparan extractos a partir de 20 ml de cultivos inducidos de los clones 1-11 usando 4 x tampón de lisis.
\global\parskip0.980000\baselineskip
Tras una reducción de 3 h, se centrifugan las células de inducción a 4000 rpm durante 15'.
Se resuspende el sedimento en 600 ul de agua.
Se añaden 52 ul de DTT 1 M y 220 ul de 4 x tampón de lisis (0,2 x PBS, 8% de SDS).
Incubación a 37ºC, agitación en vórtex ocasional.
Debido al aspecto turbio, se eleva el volumen hasta 24 ml.
Se centrifuga a 4000 rpm/15'. Se desecha el sedimento.
Se centrifugan 2 x 12 ml en Centriprep 10 a 4000 rpm/40'/25ºC.
Se combinan los concentrados, se diluyen con 0,5 x PBS hasta 12 ml y se centrifugan de nuevo en condiciones idénticas.
Se desecha el filtrado y se centrifugan de nuevo los concentrados durante 10'. El volumen final es de aproximadamente 0,5 ml. Se corren 4,5 ul sobre el gel y se confirma la unión en inmunotransferencia de tipo Western con env biotinilada.
Clones 1, 2, 3, 6 y 8:
Minipreparaciones de plásmido preparadas a partir de cultivos durante la noche de 4 ml, 200 - 500 ng por reacción de secuenciación.
Mezcla de reacción Directo (para 6)
24 ul de tampón de sec.
\quad
24 ul de mezcla lista de terminador
\quad
1,92 ul de cebador directo 1:10 (10 pMol/ul)
\quad
8,32 ul de la mezcla a los tubos 1-5
Mezcla de reacción Inverso (para 6)
24 ul de tampón de sec.
\quad
24 ul de mezcla lista de terminador
\quad
1,92 ul de cebador inverso 1:10 (10 pMol/ul)
\quad
8,32 ul de la mezcla a los tubos 6-10.
Se recubre con 40 ul de aceite. Amplificación en placa de 96 pocillos:
25 ciclos:
96ºC/30''
\quad
50ºC/15''
\quad
60ºC/4'
\quad
4ºC/mantenimiento.
Se centrifugan los tubos. Se preparan tubos de 1,5 ml que contienen 2 ul de acetato de sodio 3 M (pH 4,6 - 5,2) y 50 ul de EtOH al 95%. Se transfieren 20 ul a los tubos. Se agita con vórtex y se pone en hielo durante al menos 15 min. Se centrifuga en microcentrífuga durante 15-30 min. Se desecha el sobrenadante. Se aclara con 250 ul de etanol al 70%. Se seca al aire el sedimento. Se resuspende en 4 ul de EDTA 50 mM (7,4-8,0) y 200 ul de formamida desionizada. Se desnaturaliza y se carga.
Resultados:
Clon 1: La secuencia de nucleótidos determinada para esta proteína de unión a env de VIH-1 corresponde a la de la creatina cinasa B de Homo sapiens (registro de GenBank X15334).
\quad
Clon 2: La secuencia de nucleótidos determinada para esta proteína de unión a env de VIH-1 corresponde a la de una proteína humana desconocida. La secuencia se lee tal como se muestra en la descripción de la invención. Hubo dos entradas recientes en GenBank (ambas en 2000) que contienen secuencias casi idénticas: registro AK026796; y AK000685. Ambas se presentaron tras la presentación de la solicitud de patente original.
\quad
Clon 3: La secuencia de nucleótidos determinada para esta proteína de unión a env de VIH-1 corresponde a la de la proteína ribosómica L8 de Homo sapiens (RPL8; registro de GenBank NM000973).
\quad
Clon 6: La secuencia de nucleótidos determinada para esta proteína de unión a env de VIH-1 corresponde a la de una proteína humana desconocida. La secuencia parcial se lee:
\global\parskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
102 
\global\parskip0.980000\baselineskip
\quad
Hubo una presentación reciente en GeneBank (29 de septiembre de 2000) del proyecto japonés NEDO de secuenciación de ADNc humano (registro AK023367) que contenía una secuencia prácticamente idéntica.
\quad
Clon 8: La secuencia de nucleótidos determinada para esta proteína de unión a env de VIH-1 es prácticamente idéntica a la del clon 1, para la subunidad B de creatina cinasa B de cerebro de Homo sapiens.
Ejemplo 4 Fragmentación química de apolipoproteína B purificada a partir de plasma humano (Europa Bioproducts Ltd)
Se ha llevado a cabo la fragmentación química usando un método bien conocido de modificación por ingeniería de proteínas. Se eligieron cuatro tratamientos químicos basándose en la predicción por ordenador del número de cortes en la molécula de apolipoproteína B (ApoB).
Ácido fórmico:
Esperado: 6 cortes. Tratamiento de 100 ug de ApoB con ácido fórmico al 70% en guanidinio-HCl 7 M durante 24 y 48 h a 37ºC.
Hidroxilamina:
Esperado: 17 cortes. Se han escindido 100 ug de ApoB en
\quad
Hidroxilamina 2 M
\quad
Guanidina-HCl 2 M
\quad
K_{2}CO_{3} 0,2 M pH 9,0 durante 4 h a 45ºC.
\quad
Se terminó la reacción mediante la adición de ácido fórmico concentrado hasta pH 2-3 y se desalinizó en Sephadex G-25. aparecieron péptidos mayores a 2500 (PM) en el volumen inicial.
NTCB (2-nitro-5-tiocianobenzoato):
Esperado: 25 cortes. Se disolvieron 100 ug de ApoB en guanidina-HCl 6 M tampón tris-acetato 0,2 M pH 8,0
\quad
Se añade ditiotreitol (DTT) hasta 10 mM para reducir los disulfuros. Incubación durante 1 -2 h a 37ºC. Se añade NCTB en un exceso de 5 veces con respecto al tiol total. Incubación durante 15 minutos a 37ºC. Se acidifica hasta pH 4 o menos, se enfría hasta 4ºC.
Se ha biotinilado la proteína E1 de la envoltura recombinante del virus de la hepatitis C (Europa Bioproducts Ltd) tal como se describió para la proteína env de VIH en el ejemplo 3 y se unió a partículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Promega) y se lavó con PBS. Se diluyeron preparaciones tratadas químicamente de ApoB con PBS y se capturaron los fragmentos en partículas con E1 inmovilizada. Se analizaron los fragmentos capturados mediante SDS-PAGE.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 5 Propiedades antigénicas y unión de HSar mutada
Se subclonaron constructos mutantes de HSar seleccionados en el vector de traducción in vitro pSPUTK (Stratagene) y se expresaron in vitro según las instrucciones del fabricante. Se investigaron los productos para determinar su unión a células que expresan CD46 o el ectodominio CD46 tal como se describe [Devaux et al, Journal of General Virology 77, 1477-1481 (1996)]. Ensayo de hemaglutinación usando VS cepa Edmonston y preincubación de eritrocitos con productos de pSPUTK/HSar tal como se describe por Norrby y Gollmar [Infect. Immunity 11, 231-239 (1975)].
Se determina la presencia de anticuerpos anti-HSar en muestras de suero/plasma anónimas usando un ensayo comercial. Se determina la reactividad de estas muestras hacia el ectodominio de HSar normal y mutada, así como proteínas de fusión con un componente 2 apropiado, tras recubrir los pocillos de placas de 96 pocillos Maxisorb con las proteínas traducidas in vitro investigadas (pSPUTK). Se bloquean las placas con PBS-Marvel, se incuban con muestras de suero/plasma diluidas 1:10, se lavan repetidamente con PBS/Tween 20, se incuban con conjugado de proteína L-PR (peroxidasa del rábano) y se lavan de nuevo. Se revela la reactividad tras incubación con sustrato de PR (TSB). Se detiene el revelado mediante la adición de ácido sulfúrico y se obtiene el resultado usando un lector de ELISA.

Claims (15)

1. Proteína de fusión bifuncional recombinante que comprende un primer componente que es una proteína del virus del sarampión modificada de modo que no se une al receptor CD46 ni produce hemadsorción o hemaglutinación, pero conserva su antigenicidad y es reconocido por anticuerpos anti-sarampión; en la que el primer componente es el ectodominio de la proteína hemaglutinina del virus del sarampión (HSar) que se ha modificado mediante la eliminación de entre 58 y 100 aminoácidos N-terminales; mediante mutagénesis de los aminoácidos 243, 451 y 481; y mediante la introducción de deleciones en las regiones de aminoácidos 244-250 y 473-477; y un segundo componente fusionado con el primer componente y que puede unirse a virus genéticamente variables.
2. Proteína de fusión recombinante según cualquier reivindicación anterior, en la que el segundo componente está fusionado con el extremo N-terminal del primer componente.
3. Proteína de fusión recombinante según cualquier reivindicación anterior, en la que el segundo componente es una proteína de origen humano para evitar la reacción inmunitaria no deseada en seres humanos.
4. Proteína de fusión recombinante según cualquier reivindicación anterior, que puede unirse al virus de la hepatitis C (VHC).
5. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 4, en la que el segundo componente es un fragmento de apolipoproteína B (apoB) que se une a la proteína E1 de la envoltura del VHC.
6. Proteína de fusión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo componente puede unirse al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
7. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 6, en la que el segundo componente es creatina cinasa B humana.
8. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 6, que es una parte de creatina cinasa B humana que puede unirse específicamente a la proteína gp120 de la envoltura de VIH1.
9. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 6, que es una variante de creatina cinasa humana que difiere de la misma en no más del 5% de las posiciones de aminoácidos y puede unirse específicamente a la proteína gp120 de la envoltura de VIH1.
10. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 6, en la que el segundo componente es una proteína codificada por la siguiente secuencia de nucleótidos parcial:
103
11. Proteína de fusión recombinante según la reivindicación 6, en la que el segundo componente es una variante de la proteína según la reivindicación 10 que difiere en no más del 5% de las posiciones de aminoácidos.
12. Proteína de fusión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo componente es un anticuerpo de cadena sencilla humano (scFv).
13. Proteína de fusión recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el segundo componente es un anticuerpo monoclonal humano.
14. Polinucleótido que codifica para una proteína de fusión según cualquier reivindicación anterior.
15. Composición farmacéutica que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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