ES2260416T3 - Polipeptido que induce anticuerpos que neutralizan el vih. - Google Patents
Polipeptido que induce anticuerpos que neutralizan el vih.Info
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Abstract
Polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 que comprende al menos una mutación seleccionada entre el grupo consistente en: I101D o S.
Description
Polipéptido que induce anticuerpos que
neutralizan el VIH.
La presente invención se refiere a un
polipéptido mutado derivado de la proteína gp41, así como a una
vacuna que lo contiene.
La puesta a punto de un método de inmunización
contra el VIH es actualmente una de las prioridades de la
investigación científica.
Los mayores obstáculos que son la elevada
variabilidad genética del virus y la baja exposición al sistema
inmunitario de epítopes virales neutralizantes frenan
considerablemente la elaboración de una inmunidad neutralizante.
La glicoproteína de envoltura del VIH que se
requiere para conferir al virus su carácter infeccioso representa el
objetivo de anticuerpos neutralizantes. Estas características han
hecho de este último un tema de intensas investigaciones.
La envoltura glicoprotéica (env) del virus de
inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1)
se sintetiza a partir del precursor gp160 que da bajo la acción de
una proteasa las sub-unidades gp120 y gp41.
La fijación de gp120/gp41 a los receptores
celulares (CD4 y un receptor de las quimioquinas tal como el CCR5 o
el CXCR-4) induce un cambio de conformación de la
gp41 de un estado latente (no-fusógeno) a un estado
de fusión activo (fusógeno). Entre estos dos estados, existe un
estado transitorio llamado "intermedio" durante el que la gp41
se presenta como una proteína de membrana a la vez en las membranas
viral y celular (Weissenhorn et al, Nature (1997), 387
(6631), 426-30).
Experimentos de unión han permitido establecer
que el estado latente no fusógeno se caracteriza por la
inaccesibilidad de grandes partes del ectodominio de la gp41. La
gp120 interacciona en efecto de forma que enmascara los epítopes.
Por otra parte, se ha demostrado que la inhibición del cambio de
estructura del estado intermedio hacia el estado fusógeno por
péptidos utilizados como competidores podía afectar a la infección
viral (Weissenhom W. et al, Molecular Membrane
Biology, 1999, 16, 3-9).
La utilización del estado fusógeno de la gp41
con fines de vacunación se describe en el documento WO00/40.616.
Según esta solicitud, las hélices N se pueden utilizar solas o en
asociación con las hélices C para reproducir en este último caso la
conformación fusógena de la gp41.
Por otra parte, el efecto de la introducción de
ciertas mutaciones en el dominio próximo al péptido de fusión de la
gp41 (aa. 553-595) ha sido descrito por Weng, Y.
et al. (J. of Virology, vol. 72, No. 12, páginas
9676-9682, Dic.
1998).
1998).
La solicitante propone un nuevo antígeno vacunal
utilizable en la vacunación contra el VIH. La solicitante ha probado
en efecto por primera vez que el estado intermedio de la gp41 es
capaz de inducir anticuerpos que neutralizan los aislados primarios
del VIH.
La presente invención se refiere por lo tanto a
un polipéptido capaz de formar una estructura que corresponde o
imita el estado intermedio de la gp41.
Según un modo de realización, dicho polipéptido
comprende al menos una mutación seleccionada entre el grupo que
consiste en: I101D o S.
Según un modo de realización particular, el
polipéptido comprende al menos otra mutación seleccionada entre el
grupo que comprende las siguientes mutaciones: G13A, L, M, I, W o
K; Q17A o E; Q18A o E; A24Q, E, S o R; Q28A; T35I o L; V36Q o E;
W37S o D; G38A, V, L, I, M o E; Q39A, V, L, I, M o E; K40E, A, V, L,
I, o M; Q41 A, V, L, I, M o E; Q43A, V, L, I, M o E; L47A o D; V49I
o L; R51A, N o E; Q56I; C64S; C70S; o L; W94D; D98A, V, L, I, M o K;
R99A, N o E; Y104M o E; I108D; Q119A, V, L, I, M, S, N o R; E120A;
K121A; E123A; E125A; R153N o A y R173N o A.
Según un modo de realización preferido, el
polipéptido según la presente invención comprende las siguientes
mutaciones: T35I + Q28I +I101D; T35I + Q28I + I101D + Q119N; I101D
+ I108D + Q131N + W37A o I101D + I108D + Q142N + L126D; W37A + I101D
+ I108D + Q119N; o I101D + I108D + Q119N + L126D.
Según otro aspecto la presente invención se
refiere a un conjugado que comprende un polipéptido según la
invención conjugado con una proteína o un péptido portador.
Según otro aspecto, la presente invención se
refiere a una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido
según la invención, o para un conjugado según la invención.
\newpage
La presente invención se refiere también a un
vector de expresión que comprende dicha secuencia de ADN así como
una célula huésped que contiene dicho vector.
La presente invención tiene también como
objetivo una vacuna contra el VIH, que comprende al menos un
polipéptido tal como se ha definido anteriormente, o al menos un
conjugado tal como se ha definido anteriormente, o al menos un
vector de expresión tal como se ha definido anteriormente, un
soporte farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un
adyuvante.
Otro objetivo de la presente invención se
refiere al procedimiento de preparación de un polipéptido tal como
se ha definido anteriormente que comprende la expresión de dicho
polipéptido a partir de una célula huésped tal como se ha definido
anteriormente.
La invención se describe más detalladamente en
la descripción que sigue.
El fenómeno de cambio de conformación de la gp41
que precede a la fusión de las membranas celulares y virales se
ilustra en la figura 1.
La solicitante ha probado de forma sorprendente
que el estado intermedio de la gp41 inducía en el humano anticuerpos
que neutralizan los aislados primarios del VIH. La inducción de
anticuerpos que neutralizan los aislados primarios se puede
determinar fácilmente mediante el ensayo de neutralización tal como
se describe en el artículo de C. Moog et al (AIDS
Research and human retroviruses, vol. 13 (1),
13-27, 1997). Se estima en el marco de la presente
invención que han sido inducidos anticuerpos neutralizantes por el
antígeno ensayado cuando el suero diluido a la 1/5^{a} produce
una reducción en un factor de 10 de la cantidad de p24 presente en
el sobrenadante de
cultivo.
cultivo.
Se entiende en el marco de la presente invención
por "polipéptido correspondiente o que imita el estado intermedio
de la gp41" un polipéptido, preferentemente trimérico, que
presenta en condiciones fisiológicas una conformación abierta.
Esta conformación abierta se caracteriza por el hecho de que al
menos una de las hélices C no está apareada alrededor de las
hélices N según la orientación antiparalela tal como la que se
presenta en la forma fusógena. Preferentemente, las tres hélices C
no están apareadas con las hélices N según la orientación
antiparalela tal como se presenta en la forma fusógena. En dicha
conformación, es probable que la hélice C no apareada al trímero
central constituido por hélices N adopte una conformación libre
("coil"). En la conformación abierta según la
invención, las hélices N se aparean entre sí según una orientación
paralela formando preferentemente un trímero. En el caso del
monómero, la conformación abierta según la invención se caracteriza
por el hecho de que la hélice C no está apareada a la
hélice N.
hélice N.
La obtención de una conformación abierta se
puede probar mediante la técnica de medida de la fluorescencia
intrínseca del polipéptido tal como lo describe Schmid, F.X. (1989)
"Spectral methods of characterising protein conformation and
conformational changes" Creighton, T.E. Protein structure- a
practical approach. pp251-284, IRL, Oxford
University Press. En resumen, el polipéptido se excita a 295 nm y el
especto de emisión de fluorescencia se registra a
310-380 nm. Existe una correlación entre el máximo
de emisión a estas longitudes de onda y el entorno de los
triptófanos en la estructura. Un resto triptófano que está
completamente expuesto al disolvente (es decir, entorno hidrófilo)
tiene un máximo de emisión de aproximadamente 355 nm, mientras que
un resto triptófano que está protegido del disolvente (es decir,
presente en el interior del polipéptido) tiene un máximo de emisión
de aproximadamente 325 nm. El polipéptido según la invención
presenta en su forma trimérica 9 restos triptófano en el nivel de
la interfases N/C. La obtención de una conformación abierta se va a
traducir por lo tanto en un aumento del máximo de emisión registrado
a 310-380 nm.
El polipéptido según la invención tiene la
particularidad de ser estable es decir que conserva su conformación
intermedia en condiciones fisiológicas. La estabilidad del péptido
según la invención se puede controlar fácilmente mediante la técnica
de microcalorimetría diferencial (DSC) bien conocida por el
experto. Se puede referir por ejemplo a los artículos de Cooper
et al, Phil Trans. R. Soc. Lon. A (1993)
345, 23-35, y de V.V.Plotnikov et al, Analytical
Biochemistry 250, 237-244, (1997).
La solicitante también ha probado de forma
sorprendente que el polipéptido según la invención conservaba su
conformación "abierta" en medio fuertemente ácido. Esta
propiedad hace del polipéptido según la invención un antígeno
vacunal administrable por vía oral. La solicitante ha probado en
efecto que el ectodominio de la proteína gp41 es extremadamente
termoestable a pH 2,5. La medida de la Tm (temperatura a la que el
50% de las proteínas presentes están desnaturalizadas) de la gp41
en 50 mM de formato de sodio por DSC (calorimetría diferencial de
barrido) da un valor de 110ºC, apareciendo el principio del fenómeno
de desnaturalización a aproximadamente 100ºC a pH = 2,5. La
termoestabilidad de la proteína gp41 a pH neutro ha sido evaluada
por Weissenhorn et al (EMBO, 1996, 7,
1507-1514). La Tm medida a pH neutro por estos
autores es de 78ºC, lo que significa que de forma sorprendente esta
proteína es más estable a pH ácido que a pH neutro. Estos
resultados han sido confirmados mediante un análisis por dicroísmo
circular con el fin de calcular el porcentaje de hélice alfa en la
proteína.
La solicitante también ha probado que el
polipéptido según la invención presentaba la misma particularidad.
Esta propiedad específica hace del polipéptido según la invención un
antígeno vacunal de elección para una administración por vía
oral.
El polipéptido según la invención está
constituido por la secuencia correspondiente a la proteína gp41
desprovista de toda o parte, preferentemente de la totalidad, de la
secuencia correspondiente al dominio transmembranal. El polipéptido
según la presente invención además está desprovisto de toda o parte,
preferentemente de la totalidad, de la secuencia correspondiente al
péptido de fusión. Según un modo de realización preferente, toda o
parte de la secuencia correspondiente al dominio intracitoplasmático
está también eliminado.
Se entiende por "gp41" en el marco de la
presente invención, una proteína gp41 resultante de cualquier cepa
del VIH1 o del VIH2, preferentemente del VIH1, incluidas las cepas
de laboratorio y los aislados primarios. Se pueden citar a modo
ilustrativo las cepas MN y BX08.
La secuencia nucleótica y peptídica de un gran
número de proteínas gp41 es conocida y está disponible por ejemplo
por internet (http://hiv web.lanl.gov/) y en los
correspondientes compendios de Los Alamos. Está claro que cualquier
secuencia en la que se hayan introducido una o varias mutaciones
conservativas está también incluida en el marco de la presente
invención.
Los diferentes dominios constitutivos de la gp41
identificados anteriormente se definen aquí por referencia a la
secuencia de la gp41 LAI tal como se representa en la figura 2 en la
que el 1^{er} aminoácido A está numerado como 1. No todos los
autores se ponen de acuerdo sobre la definición de las secuencias
correspondiente al péptido de fusión y al dominio transmembranal.
Según algunos autores, el péptido de fusión corresponde a la
secuencia
1-32.
1-32.
Aunque se prefiera la supresión de la secuencia
1-23, en particular debido a la presencia de una
metionina en posición 24, la supresión de la secuencia
1-32 es igualmente apropiada en el marco de la
presente invención. En relación con el dominio transmembranal,
algunos autores estiman que este último comienza en el resto 154.
Aunque se prefiera la supresión de la secuencia
173-194, la supresión de la secuencia
154-194 también se considera en el marco de la
presente invención.
El polipéptido según la invención se puede
obtener por mutación de la secuencia natural de la gp41.
Según un modo de realización preferido, el
polipéptido según la invención se prepara a partir de secuencia de
la gp41 LAI en la que se han suprimido el dominio transmembranal y
el péptido de fusión así como una parte del dominio
intracitoplasmático. Esta secuencia está representada en la figura
3.
Las mutaciones identificadas en el texto que
sigue se numeran por referencia a la secuencia de la figura 3 en la
que el 1^{er} aminoácido M está numerado como 1.
La solicitante ha determinado un cierto un
número de mutaciones que desestabilizan la estructura del estado
latente y/o del estado fusógeno de la gp41 (en el estado monomérico
y/o trimérico) y/o estabilizan el estado intermedio de la gp41 (en
el estado monomérico y/o trimérico), y/o favorecen la
transconformación del estado latente en el estado intermedio y/o
desfavorecen la transconformación del estado intermedio en el estado
fusógeno. Estas mutaciones permiten estabilizar el polipéptido
según la invención en una conformación abierta.
La solicitante ha probado que el polipéptido
según la presente invención y más particularmente las hélices N y C
identificadas en la estructura del estado fusógeno se podían dividir
en cuatro regiones (numeradas por referencia a la secuencia de la
secuencia de la figura 3) que corresponden respectivamente a las
secuencias Ala7-Ile25 (región 1),
Glu26-Ala44 (región 2), Arg45-Leu58
(región 3) y Trp94-Lys131 (región 4) y que las
mutaciones que modifican las propiedades electrostáticas y/o la
anfifilicidad y/o las propiedades estructurales de estas regiones
conducen a la obtención de un polipéptido de conformación abierta
según la invención. La solicitante ha probado en particular que la
modificación de la estructura de la región 2, pasando de una
estructura expandida a una estructura en hélice alfa, lleva a la
formación de la hélice N y la obtención de una conformación
abierta.
Las modificaciones introducidas se pueden
evaluar por métodos clásicos bien conocidos por el experto. Se puede
citar por ejemplo como método utilizable el método de Eisenberg que
permite la medida de la hidrofobicidad media y del momento
hidrófobo medio a lo largo de una secuencia, el análisis de grupos
hidrófobos, de potenciales hidrófobos o de potenciales
electrostáticos moleculares. Las modificaciones de estructura se
pueden evaluar por ejemplo mediante estudios de dinámica molecular
así como mediante programas de predicciones de estructuras
secundarias tales como PHD, NPSA, etc. Estos métodos se describen en
los siguientes artículos: Método de Eisenberg: Eisenberg,
D., Schwarz, E., Komaromy, M y Wall, R 1984 Journal of Molecular
Biology. 179: 123-142; Análisis de los grupos
hidrófobos: Gaboriaud, C., Bissery, V., Benchetrit, T. y
Mornon, JP. 1987. FEBS Letters. 224 (1):
149-55; Potencial de hidrofobicidad
molecular: Brasseur, R 1991. Journal of biological
chemistry. 266: 16120-16127; Potencial
electrostático molecular: Delleers, M. y Brasseur, R 1989
Biochemical Pharmacology. 38 (15): 2441-2447;
Dinámica molecular (estudio de la estabilidad): Berendsen,
H.J.C., van der Spoel, D. y van Drunen, R. 1995 GROMACS. Computer
Physics Communications. 95: 43-56; Dinámica
molecular (transconformación): Guilbert, C., Perahia, D. y
Mouawad, L. 1995. Computer Physics Communications. 91:
263-273; PHD: Rost, B. y Sander, C. 1994
Proteins. 19: 55-72; NPSA: Combet, C.,
Blanchet, C., Geourjon, C. y Deléage, G. 2000 Trends in
biochemical sciences. 25 (3):
147-150,
147-150,
\newpage
La solicitante ha probado que las mutaciones
tales como se han definido anteriormente y relativas a aminoácidos
de la región 1 desfavorecen las interacciones de esta región con las
regiones 3 y 4 en el estado latente y/o con la región 4 en el
estado fusógeno y/o favorecen la multimerización de esta región en
el estado fusógeno. Las mutaciones tales como se han definido
anteriormente y relativas a aminoácidos de la región 2 favorecen
una estructura de esta región en hélice \alpha y/o la
transconformación en dicha estructura, y/o desfavorecen las
interacciones de esta región con las regiones 3 y 4 en el estado
latente y/o con la región 4 en el estado fusógeno y/o favorecen la
multimerización de esta región en el estado fusógeno. Las
mutaciones tales como se han definido anteriormente y relativas a
aminoácidos de la región 3 favorecen la multimerización en el
estado latente y/o en el estado fusógeno, y/o desfavorecen las
interacciones de esta región con las regiones 1 y 2 en el estado
latente y/o con la región 4 en el estado fusógeno. Las mutaciones
tales como se han definido anteriormente y relativas a aminoácidos
de la región 4 favorecen la multimerización de esta región en el
estado latente y/o desfavorecen las interacciones de esta región
con las regiones 1 y 2 en el estado latente y/o con las regiones 1,
2 y 3 en el estado fusó-
geno.
geno.
Las regiones 1 a 4 del polipéptido según la
invención así como la función de las mutaciones se resumen en las
figuras 4 y 5. En la figura 4, las regiones 1 a 4 se localizan en la
proteína gp41 completa incluyendo por lo tanto el péptido de fusión
(AA 1-23) con el 1^{er} aminoácido A numerado
1).
En el texto que sigue, los aminoácidos se
representan mediante su código internacional, y el código
L_{1}NNL_{2} indica que el aminoácido representado por L_{1}
encontrándose en posición NN está mutado en el aminoácido
representado por L_{2}.
La presente invención tiene por lo tanto como
objetivo un polipéptido que comprende al menos una mutación,
seleccionada entre el grupo que consiste en: I101D o S,
preferentemente dos mutaciones seleccionada(s) entre el grupo
que consiste en: T35I y I101D o S. Esta primera mutación está
asociada preferentemente al menos con otra mutación,
preferentemente con 1 a 3 mutaciones, localizada(s)
preferentemente en una o varias de las regiones 1 a 4. En el caso
de que se seleccionen dos mutaciones en el grupo anterior, estas
mutaciones se combinan al menos en otra mutación, preferentemente
con 1 a 2 mutaciones, localizada(s) preferentemente en una o
varias de las regiones
1 a 4.
1 a 4.
El polipéptido según la presente invención
comprende preferentemente al menos dos mutaciones que desfavorecen
las interacciones entre las hélices N/C. Según un aspecto
particularmente preferido estas dos mutaciones están combinadas con
al menos una mutación, preferentemente dos mutaciones, que favorecen
las interacciones entre las hélices N según una orientación
paralela. Dicho polipéptido así obtenido puede además comprender
ventajosamente una o varias otras mutaciones que presenten los
efectos identificados en la figura 4, y en particular al menos una
de las mutaciones identificadas en la tabla 1 en las columnas 3 a
6.
Estas mutaciones suplementarias se seleccionan
preferentemente entre el grupo que comprende las siguientes
mutaciones: G13A, L, M, I, W o K; Q17A o E; Q18A o E; A24Q, E, S o
R; Q28A; T35I o L; V36Q o E; W37S o D; G38A, V, L, I, M o E; Q39A,
V, L, I, M o E; K40E, A, V, L, I, o M; Q41A, V, L, I, M o E; Q43A,
V, L, I, M o E; L47A o D; V49I o L; R51A, N o E; Q56I; C64S; C70S; o
L; W94D; D98A, V, L, I, M o K; R99A, N o E; Y104M o E; I108D;
Q119A, V, L, I, M, S, N o R; E120A; K121A; E123A; E125A; R153N o A y
R173N
o A.
o A.
Preferentemente las posiciones K40 y D98 no
mutan simultáneamente.
Como ejemplo de combinaciones de mutaciones
suplementarias utilizables en el marco de la presente invención, se
pueden citar: Q17A + Q18A; Q17A + Q18A + Q28A; Q41E + Q43E; C64S +
C70S; E120A, + K121A; E120A + E123A y K121A + E125A.
Ejemplos de polipéptidos según la presente
invención son los polipéptidos que comprenden las siguientes
mutaciones: T35I + Q28I + I101D; T35I + Q28I + I101D + Q119N; V49I +
Q28I +I101D; V49I + Q28I + I101D + Q119N; Q56I + Q28I + I101D; Q56I
+ Q28I + I101D + Q119N; I101D; I101S; I108D; W94D; I101D + Q28I +
V49I; I101D + Q28I + Q56I; I101S + Q28I + T35I; I101S + Q28I + V49I;
I101S + Q28I + Q56I; I101D + I108D + Q131N + W37A; I101S + I108D +
Q131N + W37A; I101D + W94D + Q131N + W37A; I101S + W94D + Q131N +
W37A; I101D + I108D + Q142N + L126D. I101S + I108D + Q142N + L126D;
I101D + W94D + Q142N + L126D; I101S + W94D + Q142N + L126D; T35I +
Q28I + I101S + Q119N; V49I + Q28I + I101S + Q119N; Q56I + Q28I +
I101S + Q119N; T35L + Q28I +I101D; T35L + Q28I + I101D + Q119N; V49L
+ Q28I +I101D; V49L + Q28I + I101D + Q119N; Q56L + Q28I +I101D; Q56L
+ Q28I + I101D + Q119N; I101D + Q28I + V49L; I101D + Q28I + Q56L;
I101S + Q28I + T35L; I101S + Q28I + V49L; I101S + Q28I + Q56L; T35L
+ Q28I + I101S + Q119N; V49L + Q28I + I101S + Q119N; Q56L + Q28I +
I101S + Q119N; W37A + I101D + I108D + Q119N; o I101D + I108D + Q119N
+
L126D.
L126D.
Estos polipéptidos corresponden preferentemente
a un polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 en el que se han
introducido las mutaciones anteriores.
Ejemplos de polipéptidos particularmente
preferidos en el marco de la presente invención son los polipéptidos
de secuencia SEQ ID Nº 2 en los que las mutaciones: I101D; T35I +
Q28I + I101D; T35I + Q28I + I101D + Q119N; I101D + I108D + Q131N +
W37A o I101D + I108D + Q142N + L126D; W37A + I101D + I108D + Q119N;
o I101D + I108D + Q119N + L126D han sido introducidas.
Se pueden aportar otras modificaciones a los
polipéptidos de la invención, por ejemplo para facilitar la
expresión y favorecer una mejor solubilidad. Ventajosamente se
pueden reemplazar una o dos cisteínas en posición 64 y 69 por
ejemplo por serina.
Aunque el polipéptido según la presente
invención presenta una conformación abierta que es estable en
condiciones fisiólogicas, esta conformación se puede reforzar por
adición de restos cisteína a los extremos del polipéptido. Con esta
finalidad, dos restos cisteína suplementarios se pueden añadir en el
extremo N-terminal o C-terminal,
preferentemente en el N-terminal del polipéptido
según la invención, para fijar por covalencia el trímero en una
conformación abierta. En este caso, los aminoácidos Q17 y Q18
preferentemente están mutados en cisteína.
Las mutaciones propuestas se pueden combinar
para obtener un efecto de sinergia o al menos un efecto aditivo. El
polipéptido según la presente invención comprende preferentemente al
menos dos mutaciones que desfavorecen las interacciones entre las
hélices N/C. Según un aspecto particularmente preferido estas
mutaciones se combinan con al menos una mutación, preferentemente
dos mutaciones, que favorecen las interacciones entre las hélices N
según una orientación paralela. Dicho polipéptido así obtenido puede
además implicar ventajosamente una o varias otras mutaciones que
presenten los efectos identificados en la figura 4, y en particular
al menos una de las mutaciones identificadas en la tabla 1 en las
columnas 3 a 6. Preferentemente las posiciones K40 y D98 no mutan
simultánea-
mente.
mente.
Las mutaciones propuestas en el marco de la
presente invención se resumen en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
El polipéptido según la invención se puede
obtener por cualquier técnica clásica de síntesis química o de
ingeniería genética.
Cuando el polipéptido se produce por síntesis
química, el polipéptido según la invención puede ser sintetizado
bien en forma de una secuencia única, o bien en forma de varias
secuencias que se unen a continuación las unas a las otras. La
síntesis química se puede realizar en fase sólida o en disolución,
siendo ambas técnicas conocidas por el experto. Estas técnicas
están descritas principalmente por Atherton y Shepard en
"solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989)
y por Houbenweyl en "method der organischen chemie"
editado por E.Wunsch vol, 15-I y II thieme,
Stuttgart, 1974, así como en los siguientes artículos: Dawson PE
et al (Synthesis of proteins by native chemical ligation
Science 1994; 266(5186):776-9);
Kochendoerfer GG et al (Chemical protein synthesis.
Curr Opin Chem Biol 1999;
3(6):665-71); y Dawson PE et al
Synthesis of native proteins by chemical ligation, Annu
Rev Biochem 2000; 69: 923-60.
El polipéptido según la invención también se
puede producir por técnicas de ingeniería genética bien conocidas
por el experto. Estas técnicas están descritas en detalle en
Molecular Cloning: a molecular manual de Maniatis
et al, Cold Spring Harbor, 1989). Clásicamente, la secuencia
de ADN que codifica para el polipéptido según la invención se
inserta en un vector de expresión, mutado por mutagénesis dirigida.
Cuando se deben introducir varias mutaciones, se realiza una
primera reacción de mutagénesis, y luego el plásmido mutado
resultante se utiliza como matriz para la realización de la segunda
reacción de mutagénesis para obtener el plásmido que comprende la
doble mutación. Cuando dos mutaciones están separadas por menos de 5
aminoácidos, estas dos mutaciones se realizan simultáneamente con un
solo oligonucleótido que comprende las dos mutaciones.
El vector de expresión que comprende la
secuencia mutada se utiliza a continuación para transformar una
célula huésped que permita la expresión de la secuencia de interés.
El polipéptido producido se aísla a continuación del medio de
cultivo mediante técnicas bien conocidas por el experto, tales como
precipitación con etanol o con sulfato de amonio, extracción con
ácido, cromatografía de intercambio anión/catión, cromatografía
sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba,
cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxiapatita y
cromatografía sobre lectina. Preferentemente, se utiliza la
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en la
purificación.
Según el sistema de expresión utilizado
(proteína secretada o no) y según el procedimiento de purificación,
el polipéptido purificado se puede presentar con diferentes formas.
Puede estar en forma desnaturalizada, monomérica o multimérica.
Cuando se encuentra en forma desnaturalizada es posible restituirle
su conformación abierta según la invención utilizando el
procedimiento descrito en el ejemplo 1. Para obtener formas
multiméricas y en particular trímeros, las moléculas de polipéptido
purificadas se deben colocar en un medio que permita a las moléculas
que sean perfectamente solubles y esencialmente sin interacción
entre ellas y preferentemente sin estructura secundaria. Para ello
se pueden utilizar detergentes tales como el dodecil sulfato de
sodio, N-lauril sarcosina, cloruro de guanidinio,
urea, tiocianato de sodio o agentes caotrópicos. Se podrán favorecer
las condiciones deseadas mediante la utilización de disolventes o
la utilización de ácidos. Cumplida esta primera condición, se
coloca la muestra en una casete de diálisis para eliminar una parte
de los agentes caotrópicos, de forma que se favorezcan las
interacciones entre los monómeros de polipéptido conservando en las
moléculas suficiente solubilidad. En una segunda etapa, favorecida
la formación de trímeros, se dializa la muestra completamente en un
medio fisiológico que mantiene al polipéptido en disolución o en
suspensión. Se obtienen entonces trímeros del polipéptido según la
invención en una conformación abierta. Dicha técnica se describe
con detalle en el documento WO00/08.167.
Cualquier vector de expresión clásicamente
utilizado para la expresión de una proteína recombinante se puede
utilizar en el marco de la presente invención. Este término engloba
pues tanto los vectores de expresión llamados "vivos" tales
como los virus y las bacterias como los vectores de expresión de
tipo plasmídicos.
Preferentemente se utilizan vectores en los que
la secuencia de ADN del polipéptido según la invención depende de un
promotor fuerte, inducible o no inducible. Se puede citar como
ejemplo de promotor utilizable, el promotor de la ARN polimerasa
T7.
Los vectores de expresión incluyen
preferentemente al menos un marcador de selección. Dichos
marcadores incluyen, por ejemplo, la dihidrofolato reductasa o la
resistencia a la neomicina para el cultivo de células de eucariota
y los genes de resistencia a la canamicina, tetraciclina o
ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias.
Se pueden citar como vectores de expresión
utilizables en el marco de la presente invención por ejemplo los
plásmidos pET28 (Novagen) o pBAD (Invitrogen); los vectores virales
tales como: baculovirus, poxvirus en particular los poxvirus
descritos en las patentes US 5.942.235, US 5.756.103 y US 5.990.091,
los virus de la vacuna recombinantes, en particular los virus
recombinantes descritos en las patentes EP0083286, US 5.494.807 y US
5.762.938.
La mutagénesis dirigida se realiza según las
técnicas usuales corrientemente utilizadas por el experto, por
ejemplo, utilizando la polimerasa Pfu (Quich Change
Mutagenesis Kit, Stratégène) o el kit de mutagénesis de
Bio-Rad. Las mutaciones se confirman por
secuenciación de la forma habitual. Este tipo de método se describe
con detalle en el Maniatis et al (Molecular cloning,
a laboratory manual cf supra).
Para favorecer la expresión y la purificación
del polipéptido, este último se puede expresar en una forma
modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no
solamente señales de secreción, sino también regiones funcionales
heterólogas suplementarias. Por ejemplo, se puede añadir una región
de aminoácidos suplementarios, particularmente aminoácidos
cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para
mejorar la estabilidad y el mantenimiento en la célula huésped.
Para la expresión del polipéptido, se puede
utilizar cualquier célula huésped clásicamente utilizada en
asociación con los vectores de expresión descritos
anteriormente.
Se pueden citar como ejemplos no limitativos las
células de E. coli, BL21 (\lambdaDE3), HB101, Topp 10, CAG
1139, Bacillus, las células eucariotas tales como CHO o Vero.
Preferentemente se utilizará en el marco de la
presente invención el siguiente sistema vector de expresión/célula:
pET(Cer)/BL21LamdaDE3, o BL21LamdaDE3(RIL).
En función del huésped empleado en el proceso de
producción por vía recombinante, los polipéptidos de la presente
invención pueden ser glicosilados o no glicosilados. Además, los
polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto de
metionina suplementaria en el extremo
N-terminal.
La presente invención tiene también como
objetivo los conjugados que comprenden un polipéptido según la
invención y una proteína portadora o un péptido portador.
La proteína (o péptido) portador refuerza la
inmunogenicidad del polipéptido según la invención principalmente
aumentando la producción de anticuerpos específicos. Dicha proteína
(o péptido) portador comprende preferentemente uno o varios
epítope(s) T de ayuda. Por "epítope T de ayuda", se
entiende una cadena de aminoácidos que, en el contexto de una o
varias moléculas del MHC clase II, activa los linfocitos T de ayuda.
Según un modo de realización ventajoso, la proteína (o péptido)
portadora utilizada mejora la solubilidad en agua del polipéptido
según la invención.
Como proteína portadora se pueden utilizar por
ejemplo las proteínas de superficie de fagos como la proteína pIII o
pVIII del fago M13, las proteínas de superficie bacterianas como las
proteínas LamB, OmpC, ompA, ompF y PhoE de E. coli, la
proteína CotC o CotD de B. Subtilis, las porinas bacterianas
como la porina P1 de Neisseria gonorrheae, la porina P1 o P2
de H. influenzae B, la porina de clase I de N. meningitidis B, la
porina P40 de K. pneumoniae, lipoproteínas tales com OspA de
B. bugdorfi, PspA de S. pneumoniae, TBP2 de N. meningitidis
B, TraT de E. coli así como la adesina A de S.
pneumoniae; las proteínas "heat shock" tales como Hsp65 o
Hsp71 de M. tuberculosis o bovis o Hin 47 de H. infuenzae tipo B.
También son particularmente apropiadas en el marco de la presente
invención, las toxinas bacterianas destoxificadas como la anatoxina
tetánica o diftérica, la sub-unidad B de la toxina
colérica, la sub-unidad B de la toxina colérica, la
sub-unidad B de la endotoxina A de P.
aeruginosa o la exotoxina A de S. aureus.
Como péptido portador se pueden utilizar por
ejemplo en el marco de la presente invención los péptidos p24E,
p24N, p24H y p24M descritos en el documento WO94/29.339 así como los
péptidos PADRE tal como se describen por Del guercio et al
(Vaccine (1997); vol 15/4, p441-448).
La proteína (o péptido) portador está unido al
extremo N o C terminal del polipéptido según la invención por
cualquier procedimiento de conjugación bien conocido por el experto.
Además, la secuencia que codifica para la proteína (o péptido)
portador se puede fusionar ventajosamente a la secuencia que
codifica para el polipéptido según la invención y la secuencia
resultante se puede expresar en forma de una proteína de fusión por
cualquier procedimiento clásico. Todas las técnicas de ingeniería
genética útiles para hacer esto se describen en el Maniatis et
al. Dichos conjugados se pueden aislar por cualquier
procedimiento clásico de purificación bien conocidos por el
experto.
La presente invención también tiene como
objetivo las secuencias de ADN que codifican para los polipéptidos y
los conjugados según la invención así como los vectores de expresión
que comprenden dichas secuencias y las células huésped transformadas
por dichos vectores.
Mejor que extraer y purificar el polipéptido o
el conjugado expresado por el vector de expresión a menudo es más
fácil y a veces más ventajoso utilizar el mismo vector de expresión
en la vacuna según la invención. La presente invención tiene por lo
tanto también como objetivo cualquier vector de expresión tal como
se ha definido anteriormente.
Cualquier célula huésped tal como se ha definido
anteriormente transformada por dicho vector de expresión está
incluida en el marco de la presente invención.
La presente invención tiene también como
objetivo los anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos y
conjugados tales como se han descrito anteriormente. La preparación
de dichos anticuerpos se realiza mediante técnicas clásicas de
obtención de anticuerpos policlonales y monoclonales bien conocidos
por el experto.
Estos anticuerpos son particularmente apropiados
para ser utilizados en un esquema de inmunización pasiva.
La presente invención también tiene como
objetivo vacunas útiles para fines terapéuticos y profilácticos. Las
vacunas según la presente invención comprenden al menos un
polipéptido, al menos un conjugado o al menos un vector de expresión
tal como se ha definido anteriormente, un soporte o diluyente
farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante.
La cantidad de polipéptido, de conjugado o de
vector en la vacuna según la presente invención depende de numerosos
parámetros como lo comprenderá el experto, tales como la naturaleza
de la proteína portadora, el vector utilizado o la vía de
administración. Una cantidad apropiada es una cantidad tal que
induce una respuesta inmunitaria humoral capaz de neutralizar
aislados primarios del VIH después de la administración de esta
última. La cantidad de polipéptido que se administra es del orden
de 10 a 100 microgramos. La cantidad de conjugado que se administra
se deducirá de las cantidades indicadas anteriormente teniendo en
cuenta el PM de la proteína portadora. La cantidad de vector de
expresión que se administra es del orden de 10 a 5.000 microgramos
en el caso de un vector no viral y del orden de 10^{4} a 10^{8}
TCID50 en el caso de un vector viral.
Las vacunas según la presente invención también
pueden contener un adyuvante. Cualquier adyuvante o mezcla de
adyuvantes farmacéuticamente aceptable se puede utilizar para esta
finalidad. Se pueden citar como ejemplo las sales de aluminio tales
como el hidróxido de aluminio o el fosfato de aluminio. También se
pueden añadir a la vacuna según la invención agentes auxiliares
clásicos tales como agentes humectantes, cargas, emulsificantes,
tampones etc.
Las vacunas según la presente invención se
pueden preparar por cualquier procedimiento clásico conocido por el
experto. Clásicamente los antígenos según la invención están
mezclados con un soporte o diluyente farmacéuticamente aceptable,
tal como el agua o una disolución salina tamponada con fosfato. El
soporte o diluyente se seleccionará en función de la forma galénica
elegida, del modo y de la vía de administración así como de la
práctica farmacéutica. Los soportes o diluyentes apropiados así
como las exigencias en materia de formulación farmacéutica se
describen con detalle en Remington's Pharmaceutical Sciences, que
representa una obra de referencia en este campo.
Las vacunas mencionadas anteriormente se pueden
administrar por cualquier vía clásica, habitualmente utilizada en
el campo de las vacunas, tal como la vía parenteral (intravenosa,
intramuscular, subcutánea, etc..). Se utilizará preferentemente en
el marco de la presente invención una administración intramuscular.
Dicha administración se puede realizar ventajosamente a nivel de
los músculos del muslo o del brazo. Una administración por vía
mucosa nasal, oral, vaginal o rectal también puede ser recomendada
en el marco de la presente invención. La administración se puede
realizar por administración de una dosis única o dosis repetidas,
por ejemplo a día 0, a 1 mes, a 3 meses, a 6 meses y a 12 meses.
Preferentemente se utilizarán las inyecciones a día 0, a 1 mes y a 3
meses con una dosis de recuerdo cuya periodicidad podrá ser
determinada fácilmente por el médico que lo trata.
La vacuna según la presente invención se puede
administrar ventajosamente según un esquema posológico que comprende
la co-administración de un vector de expresión según
la invención y de un polipéptido según la invención o según un
esquema de "prime-boost" en el que se
administra en primer lugar el vector según la invención y el
polipéptido como inyección de recuerdo. En estos dos esquemas
posológicos, el vector de expresión según la invención se puede
reemplazar por cualquier vector de expresión que exprese uno o
varios antígenos o epítopes del VIH diferentes del polipéptido
según la invención, y en particular por un vector ALVAC o NYVAC.
La presente invención también comprende cubrir
un polipéptido, un conjugado o un vector tal como se ha definido
anteriormente y la vacuna que contiene estos compuestos para su
utilización para inducir anticuerpos neutralizantes de los aislados
primarios del VIH.
La solicitante ha probado de forma sorprendente
que los polipéptidos según la invención eran capaces, después de
administración, de inducir anticuerpos susceptibles de neutralizar
aislados primarios del VIH. Estos antígenos representan por lo
tanto candidatos de valor para la elaboración de una vacuna
utilizable para la protección y/o el tratamiento de un gran número,
incluso la totalidad de los sujetos de riesgo o infectados por el
VIH.
La presente invención se refiere por lo tanto
también a un método de inducción de una respuesta inmunitaria en el
sujeto huésped incluido el hombre que comprende la administración de
una vacuna según la invención. Se entiende por "una respuesta
inmunitaria" una respuesta que comprende la producción de
anticuerpos dirigidos específicamente contra el polipéptido según
la invención. La producción de anticuerpos específicos se puede
determinar fácilmente mediante técnicas clásicas bien conocidas por
el experto tales como ELISA, RIA, transferencia de western.
La invención tiene también como objetivo un
método de diagnóstico que comprende la puesta en contacto de un
polipéptido según la invención con una muestra biológica y la
detección de los complejos anticuerpo/polipéptido formados.
El polipéptido según la presente invención se
puede utilizar en efecto en un ensayo ELISA para detectar los
anticuerpos anti-gp41 que están presentes en el
suero de los individuos. El polipéptido según la presente invención
es por lo tanto una herramienta de diagnóstico ya que la presencia
de anticuerpos anti-gp41 es un marcador fiable de
una infección por el VIH.
En este caso, el polipéptido según la invención
se deposita sobre una placa ELISA, y luego se pone en contacto con
diluciones en serie del suero del paciente que se va a ensayar y
finalmente se pone en contacto con un anticuerpo
anti-humano unido a una enzima. El complejo
anticuerpo anti-humano/anticuerpo
anti-gp41/polipéptido así formado se detecta a
continuación por colorimetría.
La presente invención se va a describir de forma
más detallada en los ejemplos que siguen por referencia a las
figuras anexas en las que:
La figura 1 es una representación esquemática
del fenómeno de cambio de conformación de la gp41 que precede a la
fusión de las membranas celular y viral.
La figura 2 da la secuencia completa de la gp41
LAI en la que (_____) representa el péptido de fusión y
(- - - - - -) representa el dominio
transmembranal.
La figura 3 da la secuencia del polipéptido que
deriva de la proteína gp41 LAI que se utiliza como producto inicial
en los ejemplos proporcionados.
Las figuras 4 y 5 dan una representación
esquemática de las regiones 1 a 4, la figura 4 resume las funciones
de las mutaciones consideradas. Las cifras dadas entre paréntesis se
refieren a las regiones identificadas, "favorecer las
interacciones (3-12)" significa que las
interacciones entre la región 3 y las regiones 1 y 2 están
favorecidas.
Los ejemplos descritos a continuación se dan a
modo puramente ilustrativo de la invención y no pueden en ningún
caso considerarse como limitativos del alcance de esta última.
La secuencia de ADN que codifica para el
polipéptido identificado en la figura 3 ha sido clonada en un
sistema de expresión inducible.
El vector utilizado es el
Pet-cer que se construye a partir del vector pET28
de Novagen. El vector comercial pET28c ha sido amplificado por PCR
mediante 2 cebos situados a una y otra parte de la región
correspondiente al origen F1, de forma que el producto amplificado
corresponde a la casi totalidad del vector de origen menos la
región que comprende el origen F1. Los sitios de restricción únicos
AscI y PacI son aportados respectivamente por los 2 cebos que han
servido para la amplificación. Paralelamente el fragmento cer se
amplifica mediante 2 cebos que permiten obtener este fragmento
rodeado por los sitios AscI y PacI.
El vector y el fragmento Cer son digeridos por
las enzimas AscI y PacI y luego unidos entre sí. Este vector
comprende en particular un casete de expresión bajo el control del
promotor T7, un poli-ligador posterior al promotor
T7 para la clonación del gen de interés, el fragmento CER situado
posterior al poli-ligador, que permite reducir la
multimerización de los plásmidos, un terminador de transcripción T7
term y el gen de resistencia a la canamicina. La regulación
positiva del promotor se obtiene en presencia de la T7 ARN
polimerasa.
La mutagénesis dirigida para la obtención de los
polipéptidos mutados según la invención se realiza mediante la
utilización del KIT QuickChange site-directed
mutagenesis de Stratagène.
Para cada mutación se definen 2 oligonucleótidos
de mutagénesis que rodea el aminoácido que va a mutar. Por ejemplo
para la mutación R51A, se utilizan los siguientes
oligonucleótidos:
Los 2 oligonucleótidos se hibridaran a la misma
secuencia en las hebras complementarias del plásmido que contienen
la secuencia que va a mutar. La mutación se sitúa en el centro de
los oligonucleótidos y está rodeada por 12 nucleótidos a cada
lado.
La reacción de mutagénesis se realiza sobre el
plásmido del ejemplo 1 en las siguientes condiciones: se somete una
mezcla que contiene: tampón de reacción 10X 5 \mul; plásmido que
va a mutar 100 ng/\mul 1 \mul; Oligo 5' (125 ng/\mul), 1
\mul; Oligo 3' (125 ng/\mul), 1 \mul, Mix dNTPs 10 mM, 1
\mul, H20 UF, 40 \mul y polimerasa termoestable de Pyrococcus
furiosus 2,5 U/\mul, 1 \mul a una PCR según los ciclos
definidos a continuación: 95ºC, 30''; 95ºC, 30''; 55ºC, 1'; 68ºC,
2'/kpb de plásmido; 12 ciclos; temperatura de fin de reacción:
20ºC.
Utilizando el protocolo anterior, se han
preparado los diferentes mutantes identificados en la tabla 1.
La expresión de los plásmidos resultantes de la
etapa 2 anterior se realiza en E. coli. Para hacerlo se
utiliza una cepa modificada de E. coli: BL21
RIL\lambdaDE3.
Esta cepa está enriquecida en
ARN-t poco abundantes (ARG, ILE, LEU), y contiene el
gen que codifica para la T7 ARN polimerasa que está bajo el control
del promotor lac UV5 inducible por adición de IPTG a una
concentración de 1 mM.
En un primer momento la cepa se transforma por
el plásmido mutado según el protocolo que comprende las siguientes
etapas: repicado de 3 colonias en 10 ml de LB+ANTIBIOTICO;
Incubación una noche a 37ºC; volver a sembrar el precultivo al
1:100 en 15 ml de LB+ANTIBIOTICO al 1:100; dejar crecer hasta DO600
de 0,5; tomar una muestra de 1 ml para verificar la DO600; tomar una
muestra de 7 ml para la muestra no inducida; inducir los otros 7 ml
con 1 mM de IPTGet Inducción 3H a 37ºC.
El mismo protocolo se ha llevado a cabo sobre
varios litros de cultivo para producir una gran cantidad de
bacterias para purificar el polipéptido mutado.
El residuo celular formado por bacterias
recogidas en un litro de medio de cultivo se descongela y recoge en
2 x 100 ml de tampón Tris 30 mM a pH 8 en presencia de un inhibidor
de proteasa (Péfabloc, Interchim) a una concentración de 100 \muM.
Se añade lisozima con una concentración de 100 \mug/ml y la mezcla
se incuba 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se rompen
a continuación por ultrasonidos.
(4 ciclos de dos minutos) con una potencia
aproximada de 150 Watios. La gp41 se encuentra en forma de cuerpos
de inclusión. Éstos se lavan en un tampón
PBS-tween20 al 0,05% a 4ºC y se centrifugan durante
15 minutos a 10.000 g. Después de la eliminación del sobrenadante,
la disolución del residuo de centrifugación compuesto esencialmente
por cuerpos de inclusión se efectúa en un hora a temperatura
ambiente con agitación suave en presencia de 50 ml de tampón CAPS a
pH 10,4 que contiene 3% de N-lauril sarcosina.
La fracción disuelta se dializa a continuación a
4ºC frente a tampón Tris 30 mM a pH 8 que contiene urea 8 M (5
baños) y se filtra sobre un filtro de porosidad 0,45 \mum y luego
se carga sobre una columna Hi-Trap 1 ml
(Pharmacia). Estos soportes de cromatografía de afinidad quelatan
los átomos de níquel sobre los que se fijan los restos histidina del
extremo C terminal de la proteína.
Después de lavado, la elución de la proteína se
obtiene en un tampón Tris 30 mM a pH 8 que contiene urea 8 M y 500
mM de imidazol. Las fracciones eluidas se dializan en un tampón Tris
30 mM a pH 8 y 8 M urea sin imidazol y con cantidades decrecientes
de urea, llegando hasta 2 M. Esta técnica permite purificar todas
las moléculas de gp41 mutantes o nativas en presencia o en ausencia
del péptido de fusión.
La inmunogénesis ensayada en este ejemplo
corresponde a un polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 en la que se
ha introducido la mutación I101D por mutagénesis dirigida y que
comprende en el extremo C-terminal una secuencia de
histidinas para facilitar su purificación. La preparación de la
inmunogénesis se ha realizado según los procedimientos descritos en
los ejemplo anteriores.
Grupos de 5 cobayas han sido inmunizados 3 veces
por vía intramuscular (en el muslo, a nivel del músculo biceps
femoris) con 3 semanas de intervalo (días 1, 22 y 43) con 20
\mug por dosis de gp41 nativo o polipéptido I101D en presencia de
6 mg de fosfato de aluminio. La inmunogénesis ha sido administrada
en un volumen de 0,5 ml, es decir 0,25 ml por muslo. Los sueros se
han recogido los días 1, 43 y 57.
En los sueros inmunes (día 43) individuales y
las mezclas de sueros preinmunes (día 1) de cada grupo se han
analizado por ELISA sus títulos de anticuerpos IgG inducidos contra
la gp41 nativa y contra la gp160 MN/LAI-2.
Los sueros inmunes (día 57) individuales y las
mezclas de sueros preinmunes (día 1) de dos grupos se han ensayado
por su actividad seroneutralizante frente al aislado
VIH-1 primario Bx08.
Los resultados obtenidos muestran que el
polipéptido según la presente invención es tan inmunógeno como la
gp41 nativa.
Además, el ensayo de neutralización de C. Moog
et al ha demostrado que el polipéptido según la invención
inducía anticuerpos neutralizantes. (% de reducción > que un
factor 10).
<110> AVENTIS PASTEUR
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDO QUE INDUCE ANTICUERPOS
QUE NEUTRALIZAN EL VIH
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PM0101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia humana
tipo 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(344)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> proteína gp41 LAI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia humana
tipo 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (177)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> polipéptido derivado de gp 41
LAI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Polipéptido de secuencia SEQ ID Nº 2 que
comprende al menos una mutación seleccionada entre el grupo
consistente en: I101D o S.
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que
comprende al menos otra mutación seleccionada entre el grupo que
comprende: G13A, L, M, I, W o K; Q17A o E; Q 18A o E; A24Q, E, S o
R; Q28A; T35I o L; V36Q o E; W37S o D; G38A, V, L, I, M o E; Q39A,
V, L, I, M o E; K40E, A, V, L, I, o M; Q41A, V, L, I, M o E; Q43A,
V, L, I, M o E; L47A o D; V49I o L; R51A, N o E; Q56I; C64S; C70S; o
L; W94D; D98A, V, L, I, M o K; R99A, N o E; Y104M o E; I108D;
Q119A, V, L, I, M, S, N o R; E120A; K121A; E123A; E125A; R153N o A y
R173N o A.
3. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, que comprende las siguientes mutaciones:
T35I + Q28I + I101D; T35I + Q28I + I101D + Q119N; I101D + I108D +
Q131N + W37A; I101D + I108D + Q142N + L126D; W37A + I101D + I108D +
Q119N; o I101D + I108D + Q119N + L126D.
4. Conjugado que comprende un polipéptido según
una de las reivindicaciones 1 a 3, conjugado con una proteína o un
péptido portador.
5. Secuencia de ADN que codifica para un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o
para un conjugado según la reivindicación 4.
6. Vector de expresión que comprende la
secuencia de ADN según la reivindicación 5.
7. Célula huésped que contiene el vector según
la reivindicación 6.
8. Procedimiento de preparación de un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un
conjugado según la reivindicación 4 que comprende la expresión de
dicho polipéptido a partir de una célula huésped tal como se ha
definido en la reivindicación 7.
9. Vacuna contra el VIH, que comprende al menos
un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, o al menos
un conjugado según la reivindicación 4 o al menos un vector de
expresión según la reivindicación 6, un soporte farmacéuticamente
aceptable y opcionalmente un adyuvante.
10. Utilización de un polipéptido según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la preparación de un
medicamento para la inducción de anticuerpos que neutralizan
aislados primarios del VIH.
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