CN1954217B

CN1954217B - 衍生自gp41的多肽、含有所述多肽的疫苗组合物以及用于治疗个体HIV病毒感染的用途

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Publication number: CN1954217B
Application number: CN2005800108157A
Authority: CN
Inventors: V·维埃拉德; P·德布雷
Original assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2004-02-06
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2025-02-07
Also published as: WO2005076001A3; CA2558733C; WO2005076001A2; CA2558733A1; CN1954217A

Abstract

本发明涉及体外诊断属于人类免疫缺陷病毒(HIV)家族的病毒感染个体的进展状态的领域以及该传染病的治疗疗法。本发明还涉及含有衍生自gp41的多肽的免疫化合物和疫苗组合物。

Description

衍生自gp41的多肽、含有所述多肽的疫苗组合物以及用于治疗个体HIV病毒感染的用途

发明领域

本发明涉及体外诊断属于人类免疫缺陷病毒(HIV)家族的病毒感染个体的进展状态的领域以及该传染病的治疗疗法。

发明背景

迄今为止，感染HIV病毒的个体数目预计为约四千万个个体，因此AIDS病(主要是因个体感染HIV逆转录病毒所致)是目前全球最具破坏性的疾病。

仅在2001年一年中就有五百万个体感染HIV，而同时有三百万个体死亡。自从1983年发现AIDS的主要致病因素(即HIV病毒)以来，已经进行了广泛的努力以了解该病毒的作用机制和开发(i)可重复再现感染的诊断以及(ii)在给定患者中诊断疾病进展的准确方法。

出于监控目的，美国疾病控制中心(CDC)目前将成人或13岁及以上青年人的AIDS定义为存在25种AIDS指征(如KS、PCP或弥散性MAC)之一。对于13岁以下的儿童，AIDS的定义与青年人和成人类似，只是AIDS定义症中包括淋巴样间质性肺炎和复发性细菌感染(CDC，1987b)。在1993年成人和青年人的病例定义扩展为包括CD4⁺T细胞计数小于每立方毫米(mm³)血液200个细胞的个体HIV感染(CDC，1992)。目前的监控定义代替了基于临床症状和HIV感染迹象而非CD4⁺T细胞测定的1987年出版的标准(CDC，1987)。

在临床实践中，使用征候学和免疫功能测定(特别是CD4⁺T淋巴细胞水平)指导治疗感染HIV的人。

尽管科学家已经开发出永生化T细胞系以在实验室中繁殖HIV(Popovic等，1984；Zagury等，1986；Garry，1989；Clark等，1991)，但是HIV在体外感染并杀死CD4⁺T淋巴细胞。已经在体外慢病毒系统中观察到了杀死CD4⁺T细胞的若干机制，这可能解释感染HIV的个体中这些细胞的渐进性的丧失(综述于Garry，1989；Fauci，1993a；Pantaleo等，1993a)。这些机制包括HIV从表面伸出时引起的细胞膜破坏(Leonard等，1988)或非均相分散RNA和未整合DNA的胞内累积(Pauza等，1990；Koga等，1988)。证据还提示CD4和病毒包膜产物的复合可能导致细胞杀伤(Hoxie等，1986)。

除了这些CD4⁺T细胞衰竭的直接机制以外，间接机制可能引起未感染CD4⁺T细胞的死亡(综述于Fauci，1993a；Pantaleo等，1993a)。未感染细胞常与感染细胞融合，产生已与HIV体外细胞致病效应相关联的称之为合胞体的巨细胞(Sodroski等，1986；Lifson等，1986)。当游离的gp120(HIV包膜蛋白)与未感染细胞表面结合并将其标记以通过抗体依赖性细胞毒性应答进行破坏时，也可能杀死未感染细胞(Lyerly等，1987)。由于HIV包膜蛋白与某些第二类主要组织相容性复合体(MHC-II)分子具有一定程度的同源性，因此其它自身免疫现象也可能促成CD4⁺T细胞死亡(Golding等，1989；Koenig等，1988)。

很多研究者提出由HIV编码或衍生自无关试剂的超级抗原可能触发CD4⁺T细胞的大量刺激和膨胀，最终导致这些细胞的衰竭或无反应性(Janeway，1991；Hugin等，1991)。已有人提出称之为凋亡的程序性细胞死亡的不适时的诱导为HIV感染中CD4⁺T细胞丧失的其它机制(Ameisen和Capron，1991；Terai等，1991；Laurent-Crawford等，1991)。最近的报道指出，在外周血和淋巴结中，感染HIV的个体中发生凋亡的程度高于未感染的人(Finkel等，1995；Pantaleo和Fauci，1995b；Muro-Cacho等，1995)。

还观察到HIV在骨髓和胸腺中感染CD4⁺T细胞前体，并破坏这些器官中祖细胞最佳生存和成熟所必需的微环境(Schnittman等，1990b；Stanley等，1992)。这些发现可有助于解释AIDS患者中CD4⁺T细胞池再生的缺乏(Fauci，1993a)。

最近的研究已经证明了甚至在HIV感染的早期，外周血和淋巴组织中均表现出显著的病毒负荷和活跃的病毒复制(Fox等，1989；Coombs等，1989；Ho等，1989；Michael等，1992；Bagnarelli等，1992；Pantaleo等，1993b；Embretson等，1993；Piatak等，1993)。一个研究组报道感染HIV个体的淋巴结中25％的CD4⁺T细胞在病程早期持有HIV DNA(Embretson等，1993)。其它数据提示HIV感染通过涉及持续循环的新病毒感染和每天破坏并置换超过10亿CD4⁺T细胞的动态过程来维持(Wei等，1995；Ho等，1995)。

关于诊断感染HIV患者的疾病进展，目前的一种方法包括评价采自患者的全血样品中所存在HIV病毒数的升高，例如用特异针对HIV蛋白(更具体地针对HIV壳体糖蛋白gp120)的抗体进行常规的免疫测定。

目前另一种诊断患者AIDS进展的方法包括测量采自该患者的全血样品中所发现的HIV基因组拷贝数，例如通过用一种或几种与HIV基因组RNA特异性杂交的核酸引物对所述样品中含有的核酸进行定量PCR扩增。

由于大量研究显示，血流中具有高水平HIV的人比病毒水平较低的个体更有可能发生新的AIDS相关症状或死亡，因此以上这两种方法是有用的。

目前第三种预后患者AIDS进展的方法包括测量来自感染患者(HIV⁺患者)的全血样品中的绝对CD4⁺T细胞水平，例如使用针对CD4抗原的标记抗体对该患者的血样进行流式细胞术。

上述所有预后方法都能够可重复再现地使用，但是也有各自的技术局限性，例如就其对于疾病进展的生物学意义而言。

由于所使用抗体的特异性，使用抗体评价来自患者的生物样品中HIV病毒颗粒的数量存在缺点，因为众所周知，不同的HIV病毒分离群所产生的HIV结构蛋白在其抗原特性上存在显著差异，因而可能产生假阴性结果。

测量来自患者的生物样品中HIV基因组的拷贝数能切实地表明已经整合进感染个体的细胞基因组中的原病毒已经进入活跃的复制循环，疾病正处于活跃进展中。然而，这一技术不能同时反映患者针对病毒进展的免疫应答。

测量患者的CD4⁺T细胞水平也能指示疾病进展，因为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的发病机制很大一部分归因于带有CD4受体(CD4⁺)的T淋巴细胞的降低。CD4⁺T淋巴细胞的渐进性衰竭与临床并发症的增加相关。由于这种关系，CD4⁺T细胞水平的测量被用于建立监控抗AIDS治疗相关性的决策点。CD4⁺T细胞水平还用作人免疫缺陷病毒(HIV)病患者的预后指标。

然而，除了所引起的免疫缺陷之外，测量患者的CD4⁺T细胞水平不能直接反映患者的免疫状态。特别是测量CD4⁺T细胞水平不能说明引起或介导所观察到的CD4⁺衰竭的可能的生物效应物的状态，因而也不能说明引起所观察到的患者免疫缺陷的可能的生物效应物的状态。

实际上，还应该提到的是，也可以通过检测患者细胞(特别是CD4⁺细胞)所表达的已知HIV共受体如CCR5共受体的氨基酸序列中所发生的突变来预测给定感染HIV患者中AIDS的进展，因为已经观察到，在其编码CCR5共受体的两个拷贝之一带有特定突变的HIV感染者比带有该基因的两个正常拷贝的感染者具有更慢的病程。

然而，本领域仍然需要能使本领域技术人员确定感染HIV病毒的患者中AIDS进展状态的其它方法，以能够更精确地预后疾病的发展(包括多种熟知的AIDS相关疾病的发生或发展)，并在考虑AIDS病的进展状态后能够更精确地监测可能对HIV感染患者更有利的治疗疗法。例如，本领域需要指示AIDS进展的新生物标记物，所述标记物应优选与HIV感染的生物学具有生物学相关性，如与受测患者免疫状态相关的新生物标记物。

事实上这些新的生物标记物可以与一种或几种已知的标记物(例如上文所述的标记物)组合使用。

另外，本领域仍然需要新的治疗用化合物，以预防个体在感染HIV病毒后出现AIDS，或者更一般地，治疗感染HIV病毒的患者。特别地，新抗HIV多重疗法或HAART(“高活性抗逆转录病毒疗法”)的定义需要包括针对HIV蛋白酶和HIV逆转录酶以外的其它靶分子和作用于与疾病的不同阶段相关的靶标的药物活性化合物。值得注意的是，本领域需要具有药用意义的新化合物，所述化合物在HIV已经开始活跃复制的HIV感染患者(特别是接近发生CD4⁺T细胞数目降低的HIV感染患者和因此为免疫缺陷易患者的HIV感染患者)以及CD4⁺T细胞衰竭已经开始的HIV感染患者中具有生物学活性。

发明概述

本发明首先涉及含有以下氨基酸序列的多肽：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆SWSNKSX₇X₈X₉X₁₀X₁₁(I)，

其中彼此独立地，X₁、X₂、X₃、X₅、X₆、X₇、X₉、X₁₀和X₁₁指任意氨基酸残基，X₄指除A和W以外的任意氨基酸残基，且其中X₈指除E和S以外的任意氨基酸残基。

还涉及预防或治疗个体感染HIV家族病毒的相关疾病的药物组合物，所述组合物含有与至少一种可生理使用的赋形剂组合的有效量的与式(I)的多肽特异性结合的配体化合物。

本发明还涉及筛选用于预防或治疗个体感染HIV家族病毒相关疾病的化合物的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：

(i)将待测的候选化合物与上文所述的多肽孵育，

(ii)测定待测的候选化合物与上文所述多肽的结合。

本发明还涉及含有多肽(I)和免疫佐剂化合物的疫苗组合物。

还涉及使用所述治疗活性化合物和本说明书中另外描述的药物组合物治疗HIV感染患者的方法。

附图简述

图1.用表达若干HIV蛋白的痘苗病毒处理纯化的CD4 ⁺ T细胞后NKp44L 的过表达。

以20pfu/细胞用表达HIV蛋白的若干痘苗病毒感染纯化的CD4⁺T细胞。两天后，洗涤细胞两次并用抗NKp44L单抗(灰粗线)或IgM同种型对照(黑细线)染色。用流式细胞术分析细胞。UI：未感染的细胞。WT：用野生型痘苗病毒感染的细胞。Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat、Nef：分别用表达Gag、Pol、gp160、gp120、gp41、Tat或Nef的痘苗病毒感染的细胞。每个图中均标出了NKp44L表达的百分比。

横坐标：NKp44L表达，纵坐标：细胞数。

图2.用重组gp160HIV蛋白处理纯化CD4+T细胞后NKp44L的过表达。

在10U/ml IL2存在下在2天期间将一百万个细胞与5μg/ml对照蛋白(Ctl；实心圆)或重组gp160蛋白(gp160-A：实心三角)(gp160-B：实心方块)或不与蛋白(UT：未处理的细胞)孵育。

2A)洗涤细胞，用抗NKp44L单抗和CD4单抗或同种型对照进行染色，并用流式细胞术进行分析。每个图中均标出了CD4⁺T细胞中NKp44L的表达。横坐标：CD4表达，纵坐标：NKp44L表达。

2B)用活化的自体纯化NK细胞的细胞毒活性分析与重组gp160HIV蛋白孵育的CD4⁺T细胞的NK溶胞敏感性。以不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比(横坐标)表示NK溶胞活性。虚线的空心菱形：未处理的细胞；实心圆：用对照蛋白处理的细胞；实心三角：用gp160-A处理的细胞；实心方块：用gp160-B处理的细胞。纵坐标：特异性NK溶胞(％)。

图3.衍生自HIV gp41蛋白的肽库既诱导对NK溶胞更高的敏感性又诱导 NKp44L的过表达。

用5μg/ml衍生自HIV gp41蛋白(标为A到J)或来自作为对照的gp120蛋白(gp120)的肽库处理一百万个纯化的CD4⁺T细胞。每个肽库包括如材料和方法一节所述的10种肽。细胞在10u/mlIL2存在下孵育两天，之后洗涤两次。

3A)用活化的自体纯化NK细胞的细胞毒活性分析用不同肽库处理的CD4⁺T细胞的NK溶胞敏感性。以不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比(横坐标)进行NK溶胞活性分析。纵坐标：特异性NK溶胞(％)。

3B)细胞用抗NKp44L单抗和CD4单抗或同种型对照染色并用流式细胞术分析。在该图中仅有未处理的细胞(无)或用衍生自gp120或衍生自gp41(C和J)的肽库处理的细胞的结果。每个图中均标出了CD4⁺T细胞中NKp44L表达的百分比。在其它库中观察到了NKp44L的低表达(范围从0.2％到1.3％)。横坐标：NKp44L表达，纵坐标：CD4表达。

图4.分析衍生自HIV gp41蛋白的C库中的每种肽。

用5μg/ml来自C库的肽(见图6)(标为C141到C150)或作为对照的gp41-E162肽或gp120-87肽处理一百万个纯化的CD4⁺T细胞。细胞在10u/ml IL2存在下孵育两天，之后洗涤两次。

4A)测试了与不同肽孵育的CD4⁺T细胞的杀伤模式对NK的敏感性。显示了E/T比为40/1的活化的自体纯化NK效应细胞的数据。纵坐标：特异性NK溶胞(％)。

4B)细胞用抗NKp44L单抗和CD4单抗或同种型对照染色并用流式细胞术分析。纵坐标：NKp44L表达。

图5.gp41HIV蛋白表达的NH ₂ -SWSNKS-COOH基序的显著作用。

5A)gp41-C147肽(野生型：WT)和仅在“SWSNKS”基序(对照1：Ctl1)中或在全部的15肽序列(对照2：Ctl2)中含有一些修饰的两种不同对照肽的序列。

用1μg/ml高度纯化的WT肽或用两种对照肽(Ctl1和Ctl2)处理一百万个纯化的CD4⁺T细胞。细胞在10u/ml IL2存在下孵育两天，之后洗涤两次。

5B)用活化的自体纯化NK细胞的细胞毒活性分析与不同肽孵育的CD4⁺T细胞的NK溶胞敏感性。以不同的效应细胞/靶细胞(E/T)比(横坐标)进行NK溶胞活性分析。虚线的空心菱形：未处理的细胞；实心圆：用WT肽处理的细胞；实心方块：用Ctl1肽处理的细胞。实心三角：用Ctl2肽处理的细胞；纵坐标：特异性NK溶胞(％)。

5C)细胞用抗NKp44L单抗和CD4单抗或用同种型对照染色并用流式细胞术分析。在每个图中均标出了CD4⁺T细胞中NKp44L表达的百分比。横坐标：NKp44L表达，纵坐标：CD4表达。

图6.加入“活性SWSNKS”肽后NK溶胞活性和NKp44L表达的动力学研究

在范围从0到2880min的若干时间用1ug/ml高度纯化的野生型(WT)肽或两种对照肽(Ctl1和Ctl2)处理一百万个纯化的CD4⁺T细胞。孵育后，洗涤细胞两次，之后用活化的自体纯化NK细胞分析细胞毒活性。以不同的效应子/靶(E/T)比例实现NK溶胞活性9A)。用10ug/ml抗NK44L单抗(B)预处理细胞后实现NK细胞毒活性。流式细胞术分析显示了NKp44L(A)的细胞表面表达和NKp44L(B)的胞内表达。虚线的空心菱形：未处理细胞；实心圆：用WT肽处理的细胞；实心方块：用Ctl1肽处理的细胞；实心三角：用Ctl2肽处理的细胞；虚线的空心圆：用抗NKp44L单抗预处理后用WT肽处理的细胞；虚线的空心方块：用抗NKp44L单抗预处理后用Ctl1肽处理的细胞。

图7.不同人细胞中NKp44L的细胞表面表达。

K562、Jurkat和静息PBMC中NKp44L的细胞表面表达。细胞与1μg/ml抗NKp44L单抗(灰粗线)或IgM同种型对照(黑细线)一起孵育并用流式细胞术进行分析。横坐标：NKp44L表达，纵坐标：细胞数。

图8.#7.1—特异性抑制NKp44介导的NK溶胞的抗NKp44L单抗—的鉴定。

(A)NCR-Ig融合蛋白的细胞表面表达。将未感染的(UI)和HIV-1感染的(Sf2)U2细胞与10μg/ml NKp30-Ig(30-lg)、NKp46-Ig(46-lg)或NKp44-Ig(44-Ig)融合蛋白(黑线)或Ig对照(虚线)一起孵育并用流式细胞术进行分析。标出了NKp44-Ig表达的频率。(B)用#7.1单抗检测的NKp44L细胞表面表达。将未感染(UI)和HIV-1感染的(Sf2)U2细胞与1μg/ml#7.1单抗(黑线)或IgM同种型对照(虚线)孵育并用流式细胞术进行分析。(C)#7.1单抗抑制NKp44-Ig结合。将已预先用10！mgNKp44-Ig融合蛋白(下图；黑线)或对照NKp46-Ig融合蛋白(上图；黑线)染色的HIV-1感染的U2细胞与#7.1单抗(灰线)或IgM同种型对照(虚线)在4℃孵育1！h，并用1％PBS-BSA洗涤两次。然后用流式细胞术分析细胞。标出了NCR-Ig孵育后表达NKp44L的细胞百分比。(D)#7.1单抗抑制天然细胞毒性。以不同的效/靶细胞比用10！mg/ml#7.1单抗进行处理后，分析在100U/ml IL2存在下培养的纯化NK细胞针对未感染的U2细胞和HIV-1感染的U2细胞系的细胞毒活性。空心圆：用IgM同种型对照处理的未感染U2细胞；实心圆：用#7.1单抗处理的未感染U2细胞。空心方块：用IgM同种型对照处理的HIV-1感染的U2细胞。实心方块：用#7.1单抗处理的HIV-1感染的U2细胞。(E)#44/8抗NKp44单抗抑制天然细胞毒性。以不同的效/靶细胞比用10μg/ml#44/8单抗进行处理后，分析在100U/ml IL2存在下培养的纯化NK细胞针对未感染的U2细胞和HIV-1感染的U2细胞系的细胞毒活性。空心圆：用IgG1同种型对照处理的未感染U2细胞；实心圆：用#44/8抗NKp44单抗处理的未感染U2细胞。空心方块：用IgG1同种型对照处理的HIV-1感染的U2细胞。实心方块：用#44/8抗NKp44单抗处理的HIV-1感染的U2细胞。

图9.衍生自gp41HIV蛋白的NH ₂ -SWSNKS-COOH基序的关键作用。

(E)抗gp41-C146多克隆抗体抑制NKp44L效应。用数种浓度的gp41-C146抗体对来自两个感染患者(#CG：322个CD4⁺细胞/mm³和#BT：208个CD4⁺细胞/mm³)的一百万个纯化的CD4⁺T细胞处理过夜。用抗NKp44L单抗将细胞染色并用流式细胞术分析。(F)在抗gp41-C146抗体存在下抑制NK溶胞活性。将来自#CG和#BT样品的CD4⁺T细胞与数种浓度的抗gp41-C146抗体孵育，然后用IL-2活化的自体纯化NK细胞分析细胞毒活性。空心圆：未感染的细胞；实心方块、三角形和菱形：分别为用1、10和20mg/ml抗gp41-C146抗体处理的CD4⁺T细胞。C146肽是由式(II)的氨基酸序列组成的多肽。

发明详述

a)本发明人的前期发现

本发明人先前已经发现，称之为NKp44L的特定蛋白质在来自HIV感染个体的CD4+T细胞中表达，而该蛋白在来自未感染HIV个体的CD4+T细胞中不表达。NKp44L在如下细胞中不表达：(i)来自HIV感染患者、不表达CD3抗原的外周血单核细胞(PBMC)、(ii)来自HIV感染患者、表达CD3抗原但不表达CD4抗原的PBMC，和(iii)来自HIV感染患者、表达CD8抗原的PBMC。特别地，NKp44L蛋白的表达水平在来自HIV感染个体的活化CD4⁺T细胞如PHA活化的CD4⁺T细胞中进一步增强。

另外，本发明人先前已经发现，NKp44L蛋白表达水平的提高与感染HIV的患者中(从而在AIDS进展的患者中)观察到的CD4⁺T细胞数目的下降相关。因此，NKp44L蛋白的表达水平可指示HIV感染患者的免疫状态。

还发现来自HIV感染患者的CD4⁺T细胞特别是表达NKp44L蛋白的CD4⁺T细胞，含有其被自然杀伤(NK)细胞特别是活化的NK细胞(特别是来自同一患者的自体NK细胞)溶胞的特异性靶标。

重要的是，本发明人已经表明，HIV感染个体的NK细胞由表达NKp44L蛋白的自体CD4⁺T细胞通过非MHC依赖性触发机制特异性活化。

另外，由于本发明人已经表明，CD4⁺T细胞表达的NKp44L触发自体NK细胞并[通过活化的NK细胞对CD4⁺T细胞的非MHC依赖性识别]激活这些NK细胞对CD4⁺T细胞的特异性细胞溶解，因此NKp44L蛋白的表达水平构成了HIV感染发展状态的新的具有极高生物学意义的生物标记物。在这一具体环境中，HIV感染患者的CD4⁺T细胞所表达的NKp44L蛋白通过NKp44L蛋白与NK细胞表面表达的其特异性受体对应物[即已由Cantoni等(1999)和Vitale等(1998)所描述的NKp44L受体蛋白]的特异性结合来激活NK细胞。

另外，另一发明实体以前已经分离了NKp44L蛋白，且该蛋白已显示表达于多种肿瘤细胞系之中。另外，已经显示某些肿瘤细胞表达的NKp44L是与上文引述的NKp44受体蛋白特异性结合的配体，所述受体蛋白由NK细胞(包括活化的NK细胞)表达。该发明实体以前还显示，由活化的NK细胞所表达的NKp44受体蛋白可能至少部分地参与活化的NK细胞所实现的肿瘤细胞溶解(未出版的信息)。

总而言之，本发明人得到的结果使人们能够实施多种将NKp44L蛋白用作已被诊断为感染HIV的个体疾病进展的新生物相关标记物的方法。

b)本发明的发现

本发明人现在令人惊讶地发现，衍生自HIV gp41蛋白的特定多肽显著增强SEQ ID NO：1序列的NKp44L蛋白在CD4⁺T细胞膜表面的表达。

NKp44L蛋白由SEQ ID NO：3序列的核酸编码。

根据本发明还已经确定，NK细胞对HIV感染患者中CD4⁺T细胞的溶胞作用依赖于该特异性HIV多肽。

HIV-1gp41由三个结构域组成，胞外结构域(外功能区)、跨膜结构域和胞内结构域(内功能区)。gp41外功能区含有三个主要功能区，即位于gp41N端的融合肽、接下来是毗邻gp41外功能区N和C端部分的两个4-3七肽重复序列，分别命名为NHR(N端七肽重复序列)和CHR(C端七肽重复序列)。N和C端重复也称之为“HR1”和“HR2”。

NHR和CHR区都发挥着HIV-1和CD4⁺T细胞膜融合过程中构象变化所需必要结构的功能。

令人吃惊地，本发明人发现衍生自gp41的位于众所周知的HR1和HR2区之间的短肽诱导CD4⁺T细胞的NKp44L表面表达。

换言之，本发明人鉴定了衍生自HIV gp41蛋白的短肽，其与NKp44L表面表达相关，因而与内源NK细胞对CD4⁺T细胞的溶胞相关。

与众所周知的HR1和HR2区截然不同，本发明人得到的这些结果使人们能够实施多种利用衍生自gp41的特定肽作为治疗剂的新靶标的筛选方法。

重要的是，本发明人还显示，NKp44L蛋白表达于肿瘤细胞表面，且所述衍生自gp41的短肽诱导或增强该NKp44L表达。

因此，根据本发明，所述衍生自gp41的短肽可用于在肿瘤细胞表面表达NKp44L，随之诱导其被NK细胞特异性溶胞。

因此，本发明涉及治疗方法和药物组合物，包含如上文所简述的多肽，可用于生产抗癌药物组合物。

另一方面，本发明人已经发现在个体的HIV感染中产生了针对衍生自gp41蛋白的多肽的抗体。

更准确地，根据本发明已经发现了采自HIV感染个体的针对衍生自gp41多肽的抗体的表达水平和CD4⁺T细胞水平之间具有统计学意义的相关性。

还发现在被HIV感染的患者中，这些抗体抑制NK细胞对CD4⁺T细胞的毒性。

因此，本发明涉及治疗方法和包含如上文所简述的多肽的疫苗组合物。

根据本发明还发现上述抗体的水平在HIV感染的进展期间下降，特别是对于由其CD4⁺T细胞衰竭导致患者发生免疫缺陷而言。

本发明人得到的结果使得人们能够实施多种方法，所述方法将针对衍生自gp41的多肽的抗体水平用作已诊断为感染HIV的个体疾病进展的新生物相关标记物。

本发明的多肽

因此，本发明的一个客体是含有以下氨基酸序列的多肽：

X₁X₂X₃X₄X₅X₆SWSNKSX₇X₈X₉X₁₀X₁₁(I)，

术语“任意氨基酸残基”代表选自以下氨基酸的任一氨基酸残基：A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y和V。

所述多肽也称为式(I)的多肽。

本发明还涵盖含有以下氨基酸序列的其它多肽：

PWASNASWSNKSLDDIW(II)。

在某些实施方案中，所述多肽长度至少为17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或200个氨基酸残基。

如上文所定义的多肽优选衍生自gp41蛋白并具有来自HIV-1gp41蛋白的至少39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个连续氨基酸，并含有上文式(I)的氨基酸序列。

可以使用本领域普通技术人员所公知的多种表达载体中任何一种通过重组DNA技术(例如基于HIV1gp41蛋白的DNA序列)产生式(I)的多肽。可在已由含有编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染的任何合适的宿主细胞中实现表达。合适的宿主细胞包括原核生物细胞、酵母和高等真核细胞如哺乳动物细胞和植物细胞。优选地，使用的宿主细胞为大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系如COS和CHO。首先可以使用市售的过滤器浓缩来自适当宿主/载体系统的上清液，所述宿主/载体系统将重组蛋白质或多肽分泌到培养基中。浓缩后，可以将浓缩液施加到适当的纯化基质如亲和基质或离子交换树脂上。最后，可以采用一个或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。

当式(I)的多肽含有少于约100个氨基酸(通常少于约50个氨基酸)时，可以使用本领域普通技术人员所熟知的技术通过合成方法进行产生。例如，可以使用任何市售的固相技术合成这些多肽，如Merrifield固相合成方法，其中将氨基酸顺次加入到正在生长的氨基酸链中。参阅Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。自动化合成多肽的设备可从供应商(如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division(Foster City，Calif.))购得，并可根据生产商的说明书进行操作。

优选地，式(I)的多肽由以下氨基酸序列组成：PWASNASWSNKSLDDIW(II)。

下文的实施例1-3举例说明了氨基酸序列(II)的多肽诱导NKp44L在CD4⁺T细胞表面的表达。

诱导NKp44L在细胞表面表达的高动力学与诱导预合成的NKp44L胞内蛋白质从胞质到细胞表面的移位一致。

本发明的药物组合物

本发明的另一客体是预防或治疗个体感染HIV家族病毒相关疾病的药物组合物，所述组合物含有与至少一种可生理使用的赋形剂组合的有效量的与式(I)多肽特异性结合的配体化合物

“可生理使用的赋形剂或载体”指可安全地用于全身或局部给药的固体或液体填充剂、稀释剂或物质。取决于具体的给药途径，本领域熟知的多种可药用载体包括固体或液体填充剂、稀释剂、助水溶物、表面活性剂和包胶物质。使用的载体量与F(ab).sub.2片段相关，以提供每单位剂量组合物的实际物质量。

可以包括在本发明组合物中用于全身给药的可药用载体包括糖、淀粉、纤维素、植物油、缓冲液、多元醇和海藻酸。具体的可药用载体描述于全部引入本文为参考的以下文献：于1983年8月30日授权的美国专利No.4,401,663，Buckwalter等；于1983年12月28日公开的欧洲专利申请No.089710，LaHann等和于1983年1月5日公开的欧洲专利申请No.0068592，Buckwalter等。肠胃外给药的优选载体包括丙二醇、吡咯烷酮、油酸乙酯、水性乙醇及其组合。

代表性的载体包括阿拉伯胶、琼脂、海藻酸盐、羟烷基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、角叉菜胶、粉状纤维素、瓜尔胶、胆固醇、明胶、琼脂胶、阿拉伯胶、梧桐胶、印度胶、豆角胶、辛苯聚醇9、油醇、果胶、聚丙烯酸及其同系物、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、月桂硫酸钠、聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇单硬脂酸酯、丙二醇单硬脂酸酯、黄胞胶、黄芪胶、山梨坦酯、硬脂醇、淀粉及其修饰物。合适的范围在约0.5％到约1％内变化。

为配制本发明的药物组合物，本领域技术人员最好参考最新版本的欧洲药典或美国药典。

优选地，本领域技术人员可参考第四版的“2002”欧洲药典或USP25-NF20版美国药典。

每一剂本发明的药物组合物中含有的治疗活性化合物的重量取决于所述治疗活性化合物的分子量以及有效阻断感染HIV患者中NK细胞对CD4⁺T细胞的细胞溶解的重量。

例如，为确定一剂本发明药物组合物中治疗活性化合物的正确量，本领域技术人员首先通过实施下文所述的本发明的筛选方法测定多种重量或浓度的所述治疗活性化合物体外抑制CD4⁺T细胞的细胞溶解的能力，然后保留或选择阻断细胞溶解的所述治疗活性化合物的给定量或浓度。

其后，本领域技术人员将所述保留或选择的量或浓度换算到人体内环境，从而使施用该药物组合物的患者血液中所述治疗活性化合物的浓度与体外阻断细胞溶解的浓度相同。

优选地，配体化合物包括针对本发明多肽的抗体。

优选地，配体化合物或包含它的药物组合物可以与抑制HIV和CD4⁺T细胞之间膜融合的化合物组合。这些化合物为例如衍生自gp41蛋白HR1或HR2区的肽以及更准确地称为T20、T21的肽或美国专利申请6,623,741中所述的肽。

本发明还涉及针对式(I)多肽的抗体。

本发明还涉及与式(I)多肽特异性结合的配体化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗个体感染HIV家族病毒的相关疾病。

此外，本发明人还证明，NKp44L蛋白在肿瘤细胞(如Jurkat细胞和K562细胞)表面表达。

他们还显示，式(I)多肽诱导肿瘤细胞在细胞表面表达NKp44L，从而使得这些用多肽处理过的肿瘤细胞易感于NK细胞的特异性溶胞。

因此，本发明涉及包含式(I)多肽的用于治疗癌症的方法和药物组合物。

本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物，其含有与至少一种可生理使用的赋形剂组合的有效量的含有式(I)多肽或由其组成的抗原化合物。

优选地，用于携带本文所述药物组合物的可生理使用的赋形剂与本说明书中关于NKp44L配体的第一部分中所述的赋形剂相同。

本发明还涉及用于治疗癌症的药物组合物，其含有与至少一种可生理使用的赋形剂组合的有效量的抗原化合物，所述抗原化合物含有进行了融合以靶向癌细胞的式(I)的多肽或由其组成。

优选地，所述靶向癌细胞的化合物包括针对癌症特异性抗原的抗体，如美国专利6,338,947中所述的乳腺癌特异性的SCP-1、NY-ESO-1或SSX-2，黑色素瘤特异性的SSX-2、NY-ESO-1或MAGE-3，或如美国专利6,440,663中所述的肾脏癌症特异性抗原；美国专利6,238,668中所述的结肠癌特异性的KH-1和N3。

本发明的免疫原性组合物和疫苗组合物

本发明人已经发现，在个体的HIV感染过程中产生针对衍生自gp41蛋白的多肽(即式(I)多肽)的抗体。

更准确地，根据本发明已经发现了在取自感染HIV个体的针对式(I)多肽的抗体的表达水平与其CD4⁺T细胞水平之间具有统计学意义的相关性。

还发现了在HIV感染的患者中这些抗体抑制NK细胞对CD4⁺T细胞的细胞毒性。

另外，本发明人惊讶地发现因其抑制CD4⁺T细胞的NK溶胞能力而筛选到的抗体预HIV-1感染的细胞上的NKp44L特异性反应(实施例5)。

更准确地，当用上文所述的抗体预处理被HIV-1慢性感染的细胞时，其NK介导的溶胞急剧下降(图9E)，用抗NKp44单抗处理NK细胞产生相同的效果(图9F)。

NKp44是具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的蛋白质，由SEQ ID NO：4序列的核酸编码。

还已经发现，针对上述式(I)多肽的抗体抑制NKp44L表达到CD4+T细胞表面，附带地还降低对NK溶胞的敏感性。

相反，用针对衍生自gp41蛋白的其它多肽(如衍生自gp41HR1或HR2结构域的T20或T21多肽)的抗体没有得到这样的结果。

更准确地，已经发现在与针对多肽(I)的抗体孵育的来自两个感染HIV-1的患者的纯化CD4⁺T细胞中，NKp44L的表达显著低于纯化后未经处理的细胞或用对照抗体处理的细胞(实施例6，图9)。

还已发现，在缺乏针对多肽(I)的抗体时，感染HIV的患者的血清不能降低CD4⁺T细胞的NK溶胞。

这些结果强烈提示，式(I)的多肽在HIV感染中对诱导NKp44L表达发挥关键作用，且gp41蛋白参与活化的NK细胞对CD4⁺T细胞的选择性破坏。

不希望束缚于任何具体的理论，本发明人相信HIV-1获得了通过选择性触发CD4⁺T细胞而使用NK细胞接触宿主免疫系统的能力。

因此，可以使用针对多肽(I)的抗体阻断NKp44L表达，以对抗这些有害作用。

为了阐明这一假说，本发明人已经发现在CD4⁺T细胞表面的NKp44L表达和针对衍生自gp41的式(I)多肽的抗体水平之间存在反相关。

因此，本发明的另一客体是含有式(I)多肽和免疫佐剂化合物的疫苗组合物。

本发明的另一客体是含有与至少一种可生理使用赋形剂组合的式(I)多肽的免疫原性组合物。

“免疫原性组合物”在文中指能够在个体中诱导免疫应答(例如诱导产生针对式(I)多肽的抗体)的物质。

优选地，所述免疫佐剂化合物选择弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、霍乱毒素(CT)及其B亚单位(CTB)、来自百日咳杆菌(Bordetellapertusssis)的毒素(PT)、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)、单磷酰脂质A、CpG寡核苷酸、咪唑并喹诺酮、含有鲨烯和合成共聚物的水包油乳剂、胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷和免疫刺激复合物(ISCOM)以及双十八烷基二甲基溴化铵或双十八烷基二甲基氯化铵(DDA)。

例如，为促进Th2型免疫应答，所述免疫佐剂可选自：氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钾、磷酸钙或细菌毒素如霍乱毒素(CT)及其B亚单位(CTB)、来自百日咳杆菌的毒素(PT)或来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(LT)。在寻求Th1型应答时，所述免疫佐剂可选自：单磷酰脂质A、CpG寡核苷酸、咪唑并喹诺酮。为优先刺激抗体应答，可以使用油基佐剂如含有鲨烯和合成多聚体的水包油乳剂或胞壁酰二肽及其衍生物作为免疫佐剂。为促进粘膜免疫应答，可以使用多糖如右旋糖苷、甘露聚糖、葡聚糖或壳聚糖作为免疫佐剂。为增强抗体产生并刺激T细胞毒淋巴细胞，可以使用皂苷或免疫刺激复合物(ISCOM)作为免疫佐剂。为诱导体液和细胞应答，可以使用弗氏完全佐剂作为免疫佐剂。为诱导炎性应答和高水平的抗体，可以使用弗氏不完全佐剂作为免疫佐剂。为获得迟发型超敏反应，可以使用亲脂胺如双十八烷基二甲基溴化铵或双十八烷基二甲基氯化铵(DDA)作为免疫佐剂。

为增强本发明疫苗组合物的免疫原性，式(I)多肽可以含有2到12个式“SWSNKS”的肽。

具体地，所述抗原多肽抗原可具有下式(III)的结构：

NH₂-PepNt-[(I)_n-PepX_n]_n-PepCt-COOH (III)，

其中：

-“PepNt”由氨基酸长度在0到100个氨基酸残基内变化并位于式(III)多肽N端的多肽组成；

-“[(I)_n-PepX_n]”由多肽单位组成，其中：

-“(I)₁到(I)_n”彼此独立地由式“SWSNKS”的多肽组成，n为从1到12的整数；且

-“PepX₁”到“PepX_n”彼此独立地由氨基酸长度在1到30个氨基酸残基内变化的间隔肽组成，n为从1到12的整数；

-“n”为所述多肽中[(I)_n-PepX_n]多肽单位的数目，n为从1到12的整数；且

-“PepCt”由氨基酸长度在0到100个氨基酸残基内变化并位于式(III)多肽C端的多肽组成。

所述抗原多肽可以通过氨基酸残基与载体蛋白或合成多聚体共价连接。

为增强肽的免疫原性，式(I)的肽可以与作为载体的较大分子共价连接(“缀合”)。

可以使用若干方法之一将肽附着到载体上，包括使用戊二醛(Reichlin，Methods Enzymol.70：159-165，1980)或DDC操作(如Atassi等，Biochem.Biophys.Acta670：300-302，1981)通过肽赖氨酸连接、使用DDC通过肽天冬氨酸或谷氨酸连接(Bauminger等，Methods Enzymol 70：151-159，1980)、使用双偶氮联苯胺通过肽酪氨酸连接(Walter等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA77：5197-5200，1980)、通过光化学附着位点连接(Parker等，ColdSpring Harbor Symposium-Modern Aoproaches to Vaccines，Chanock&Lerner编辑，Cold Spring Harbor Press，New York，1984)或通过肽半胱氨酸连接(Liu等，Biochem.18：690-697，1979)。

可以通过透析或凝胶过滤从过量的游离肽中将肽载体缀合物分离开。可以通过使用放射性示踪物以特殊的操作建立载荷水平来测定载体的肽载荷水平，或通过缀合物的定量氨基酸分析与未载荷载体进行比较来测定肽载荷水平。使用后一技术时，可以便利地将独特的非天然氨基酸(如正亮氨酸Nle)在N端或C端侧掺入肽中，在通过缀合物的氨基酸分析进行测量时可将其作为肽掺入的定量标记物。该正亮氨酸还可发挥在抗原位点和如上文所述掺入以便于附着的任何氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸或酪氨酸)之间间隔区的功能。

优选地，所述载体蛋白选自匙孔槭血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白或白喉类毒素。

在本发明的疫苗组合物中，所述合成多聚体可以是含有由赖氨酸残基组成的核心基质的多分支肽构建体。

J.P.Tam[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85，5409-5413(1988)]已经使用多聚体中赖氨酸骨架的放射状分支系统开发了不使用载体的抗原。这些抗原设计用于产生针对多种疾病的疫苗。具体地，Tam在PCT专利申请流水号W093/03766和美国专利申请US5,229,490中描述了用于产生针对HIV感染的疫苗的抗原。

核心基质优选为天然分支的树状多聚体，优选其每一分支是相同的。核心基质基于具有至少两个官能团的核心分子，具有末端官能团的分子分支共价键合在所述核心分子上。用于形成核心基质的示例为赖氨酸。中心赖氨酸残基与两个赖氨酸残基键合，每个赖氨酸残基通过羧基基团与中心赖氨酸残基的氨基基团之一键合。这提供了具有四个氨基基团的分子，它可以是含有四个式(I)多肽的结构的核心基质。上述结构的产生为本领域已知。参阅如Tam等，J.Immun.148，914-920(1992)和Wang等，Science，254，285-288(1991)。

此外，可以在所述多肽和所述载体蛋白或合成多聚体之间添加间隔区。可以采用肽接头序列通过足以保证每一多肽折叠成其二级和三级结构的距离将第一和第二多肽组件分隔开。使用本领域熟知的标准技术将这些肽接头序列掺入融合蛋白。可以基于以下因素选取合适的肽接头序列：(1)其有能力采取柔性伸展构象；(2)其无能力形成与第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)没有可能与多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。优选的肽接头序列含有甘氨酸、天冬酰胺和丝氨酸残基。其它接近中性的氨基酸如苏氨酸和丙氨酸也可以用于接头序列中。可以有用地用作接头的氨基酸序列包括在Maratea等，Gene40：39-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8258-8262，1986；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180中所公开的序列。接头序列的长度一般可以从1到约50个氨基酸。当第一和第二多肽具有可用于分隔功能结构域和防止空间位阻的非必需N端氨基酸区时不需要接头序列。

本发明还涉及包含含有氨基酸序列SWSNKS的多肽的疫苗组合物，所述多肽通过氨基酸残基与载体蛋白或合成多聚体共价连接。

合成多聚体可以是含有由赖氨酸残基组成的核心基质的多分支肽构建体。可以在所述多肽和所述载体蛋白或合成多聚体之间引入间隔区。

优选地，在上文刚刚述及的疫苗组合物中，在所述多肽和所述载体蛋白或合成多聚体之间存在间隔区。

本发明还涉及针对式(I)多肽的抗体在制备治疗个体感染HIV家族病毒的相关疾病的药物组合物中的用途。

附加化合物

在优选的实施方案中，本发明的疫苗组合物还含有一种或多种选自以下的组分：表面活性剂、吸收促进剂、吸水多聚体、抑制酶降解的物质、醇、有机溶剂、油、pH控制剂、防腐剂、渗透压控制剂、推进剂、水及其混合物。

合适的补充载体的实例包括但不仅限于：无菌水、盐水、缓冲液、磷酸缓冲盐溶液、缓冲氯化钠、植物油、最低基本培养基(MEM)、含有HEPES缓冲液的MEM等等。

任选地，本发明的疫苗组合物可以含有常规的第二佐剂，其不同的量取决于佐剂和所期望的结果。取决于其它成分和所期望的效果，惯用量范围以重量计约0.02％到约20％。

合适的第二佐剂的实例包括但不仅限于：稳定剂、乳化剂、氢氧化铝、磷酸铝、pH调整剂如氢氧化钠、盐酸等，表面活性剂如Tween.RTM.80(聚山梨酯80，可从Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.购得)、脂质体、免疫刺激复合物佐剂、合成糖肽如胞壁酰二肽、膨胀剂如右旋糖苷或右旋糖苷与例如磷酸铝的混合物、聚羧乙烯(carboxypolymethylene)、细菌细胞壁如分枝杆菌细胞壁提取物、其衍生物如小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)、牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，如牛卡介苗(BCG)、牛痘或动物痘病毒蛋白质、亚病毒颗粒佐剂如环状病毒、霍乱毒素、N，N-双十八烷基-N′，N′-二(2-羟乙基)-丙二胺(阿夫立定)、单磷酰脂质A、双十八烷基二甲基溴化铵(DDT，可从Kodak，Rochester，N.Y.购得)、人工合成材料或其混合物。氢氧化铝期望与其它第二佐剂和免疫佐剂如Quil A混合。

合适的稳定剂的实例包括但不仅限于：蔗糖、明胶、蛋白胨、消化蛋白提取物如NZ胺或NZ胺AS。乳化剂的实例包括但不仅限于：矿物油、植物油、花生油和可用于注射或鼻内疫苗组合物的其它标准可代谢无毒油。

这些佐剂在文中标识为“第二”仅用于与上述免疫佐剂化合物相区别。

可以向疫苗组合物中以范围从约0.0001％到约0.1％(以重量计)的有效量加入常规防腐剂。取决于制剂所使用的防腐剂，也可以使用低于或高于这一范围的量。典型的防腐剂包括如山梨酸钾、焦亚硫酸钠、酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、柳硫汞等。

灭活的、修饰的或其它类型的疫苗组合物的选择和制备改进的本发明疫苗组合物制剂的方法是本领域普通技术人员已知或易于确定的。

例如，当本发明的疫苗组合物中多肽(I)不与免疫佐剂共价键合时，可以在施用式(I)多肽的同时、贯序或其后不久以口腹、肠胃外或其它方式给予药理有效量的本文所述的免疫佐剂化合物。

作为一般性原则，本发明的疫苗组合物可以便利地口服、肠胃外(皮下、肌内、静脉内、皮内或腹膜内)、口内、鼻内或透皮给药。

本发明的体外筛选和诊断方法

a)筛选方法

本发明人惊讶地发现衍生自HIV gp41蛋白的特定多肽显著增强Nkp44L蛋白在CD4⁺T细胞表面的表达。

本发明还涉及第一种体外筛选用于预防或治疗个体感染HIV病毒相关疾病的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将待测的候选化合物与式(I)的多肽孵育，

(ii)测定待测的候选化合物与式(I)多肽的结合。

例如，候选化合物与式(I)多肽的结合可以由本领域技术人员通过使用双杂交系统实现。可将本领域技术人员已知的其它方法如生物传感器技术(Edwards和Leatherbarrow(1997)或Szabo等(1995))、亲和层析或高通量筛选(HTS)(Leblanc等2002)用于结合测定。

可以根据以上筛选方法筛选的候选化合物可以是任何种类，包括但不仅限于天然或合成化合物或生物来源的分子如多肽。

优选地，步骤(ii)包括将步骤(i)结束时得到的化合物进行凝胶迁移测定并检测候选化合物和式(I)多肽之间形成的复合物。

可以如本领域技术人员所知进行凝胶迁移测定。

如果蛋白质是与另一蛋白质形成的复合物的一部分，其表观分子量会发生改变，因此可以通过测定所分析蛋白质相应的染色位置(蛋白质条带)方便地观察对候选化合物和本发明多肽之间形成的复合物的检测。

一方面，可以通过特异性抗体(如特异性针对式(I)多肽的抗体)检测进行凝胶迁移测定的蛋白质相应的染色(蛋白质条带)。另一方面，可以标记式(I)的多肽，以更易于检测凝胶上的蛋白质/候选化合物。例如，本发明的多肽可以与GST、HA、多聚组氨酸链或其它可检测分子融合，以便于鉴定凝胶上的不同蛋白质。

本发明还涉及体外筛选用于预防或治疗个体感染HIV病毒相关疾病的化合物的另一种方法，所述方法包括以下步骤：

a)(i)使第一种CD4⁺T细胞培养物与候选化合物和HIV病毒接触；

(ii)在不存在所述候选化合物时使第二种CD4⁺T细胞培养物与HIV病毒接触；和

b)检测从培养物(i)和(ii)得到的CD4⁺T细胞表面上NKp44L的存在。

可以通过本领域技术人员已知的方法(如对应于实施例6材料和方法部分的细胞荧光测定术分析)检测CD4⁺T细胞表面上NKp44L的存在。

优选地，上述方法包括额外的步骤(c)，包括，当从培养物(ii)得到的CD4⁺T细胞表面NKp44L的表达水平高于从培养物(i)得到的CD4⁺T细胞表面NKp44L的表达水平时，阳性选择候选化合物作为治疗剂。

可以如相应的材料与方法章节所述，使用荧光激活细胞分选仪(FACS)通过计数表面表达NKp44L的CD4⁺T细胞的数目来评估NKp44L在CD4⁺T细胞表面表达水平的比较。

或者，可以如相应的材料与方法章节所述，通过测定CD4⁺T细胞的NK溶胞活性间接地检测CD4⁺T细胞表面上NKp44L的存在。

尽管由体外方法组成，但就防止CD4⁺T细胞被活化的NK细胞溶胞而言，以上筛选方法步骤(b)的具体实施方案具有通过直接证明候选化合物的生物活性直接反映所述候选化合物的治疗潜力的技术优势。

活化的NK细胞可包括来自NK细胞系(如Gong等(1994)所述的NK92细胞系)的细胞，或者可包括正常人的纯化NK细胞原代培养物。

表达NKp44L蛋白的CD4⁺T细胞可包括已经由能够使细胞表达NKp44L蛋白的载体转染的最终为细胞系形式的CD4⁺T细胞，或者可包括最初从HIV感染患者的血液样品纯化的CD4⁺T细胞。

在上述筛选方法的具体实施方案中，由于均来自同一HIV感染患者，活化的NK细胞和CD4+T细胞是自体的。

优选地，细胞溶解测定由常规技术组成，其中首先用⁵¹Cr使作为靶细胞的CD4⁺T细胞具有放射性，且其中细胞溶解值由细胞溶解百分比组成，通过细胞培养基中由溶解的CD4⁺T细胞所释放的⁵¹Cr的量来衡量。

最优选通过在渐增的效应细胞(NK细胞)与靶细胞(CD4⁺T细胞)比(如从1∶1到50∶1的效应细胞∶靶细胞比)下测定NK细胞的溶胞活性获得细胞溶解值。

用于上文刚才所述筛选方法的候选化合物可以选自与一种或多种式(I)多肽结合的候选化合物。

因此，本发明还涉及体外筛选用于预防或治疗个体感染HIV病毒的相关疾病的化合物的方法，所述方法包含以下步骤：

(i)用上述第一种筛选方法筛选候选化合物，和

(ii)用上文刚才所述的第二种筛选方法筛选步骤(i)中阳性选择的候选化合物。

b)本发明的诊断方法

本发明人已经发现在HIV感染中产生针对多肽(I)的抗体。

根据本发明还发现了在采自HIV感染个体的针对多肽(I)的抗体的表达水平和CD4⁺T细胞水平之间具有统计学意义的相关性。

根据本发明已经发现这些抗体的水平在HIV感染的进展(特别是就由CD4⁺T细胞渐进性衰竭引起的患者免疫缺陷的发生而言)期间下降。

此外，本发明人发现这种动力学是针对式(I)多肽的抗体所特有的，在针对衍生自gp41HR1和HR2结构域的肽T20或T21的抗体中并未观察到。

从上文简述的本发明人得到的实验结果可以得出，个体血清中含有的针对多肽(I)的抗体水平揭示其本身构成了个体HIV病毒感染进展状态的精确生物标记物。另外，由于本发明人已经表明针对多肽(I)的抗体水平在HIV感染患者之初更为重要，因此所述抗体的表达水平构成了HIV感染进展状态的新生物学标记物，具有极高的生物学意义。

因此，本发明还涉及体外评估个体感染HIV病毒进展状态的方法，其中所述方法包括检测取自所述个体的样品中针对式(I)多肽的抗体的步骤。

本发明所使用的“HIV”病毒包括HIV-1或HIV-2病毒，更具体地包括HIV-1或HIV-2病毒的任何病毒株或分离群。

本文所用的感染“进展状态的评估”包括指示受测的HIV感染患者免疫状态的原始实验数据。因此，如上文已经提到的，在针对式(I)多肽的抗体量和CD4⁺T细胞计数之间存在统计学相关性。

仅仅检测针对式(I)多肽的抗体对于受测患者中疾病进展状态的整体准确临床诊断或预后可能是不够的。因此，可以通过疾病的其它诊断或预后标记物(如本说明书先前引用的本技术领域标记物之一)实现针对式(I)多肽的抗体的检测或与其组合。

可以使用已知的技术如ELISA或RIA测试实现针对式(I)多肽的抗体的检测。

本发明的治疗方法

本发明还涉及预防或治疗个体感染HIV家族病毒的相关疾病的方法，其中所述方法包括对需要这些治疗的患者施用有效量的免疫原性组合物或疫苗组合物的步骤，所述组合物含有与免疫佐剂化合物组合的式(I)多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

-制备与白喉类毒素连接的含有氨基酸序列(II)的一批纯化(HPLC，>95％)多肽，

-对第一个“对照”组的哺乳动物仅注射白喉类毒素，

-对第二个“测试”组的哺乳动物注射与白喉类毒素连接的含有氨基酸序列(II)的多肽。

优选地，当所使用哺乳动物为猕猴(Macaca mulatta)物种时，每只动物每次注射接受0.5mg与或不与上述多肽连接的白喉毒素，接着在3、6或9周后与弗氏不完全佐剂组合重新注射三次。

-在末次注射两周后，以50TCID50/ml的1ml稀释液用SHIV33感染两组哺乳动物。

-(感染前)在每次注射后第0天和第1周采样，包括血清和PBMC(外周血单核细胞)，用SHIV感染后每周采样一次。

-分析采集的样品。

并非限制地，这些分析可以包含样品常规方面的对照、使用FACS测量CD4⁺T细胞数、通过RT-PCR测量病毒载量、用EIA技术通过检测针对Env蛋白的抗体来测定血清转化、通过ELISA检测针对式(II)多肽的抗体。

这些分析还可以包括研究由所述哺乳动物产生的抗体对感染HIV的细胞(例如慢性感染细胞)的作用。例如，这些细胞为HIV-sf2感染的U2细胞、HIV-BRU感染的Jurkat细胞或BRU感染的或采自HIV感染患者的CD4⁺T细胞。

另外，这些分析还可以包括通过FACS测量NKp44L表达水平、通过EIA分析P24的量或使用下文所述的⁵¹Cr测试分析NK细胞的若干菌株(如自体或同种异体的NK92、NK3.3或NKL细胞)的NK细胞毒活性。

本发明的另一客体包括预防或治疗与个体感染HIV家族病毒的相关疾病的方法，其中所述方法包括对需要这种治疗的患者施用有效剂量的针对式(I)多肽的抗体。

本发明还涉及与式(I)多肽特异性结合的配体化合物在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防或治疗与个体感染HIV家族病毒相关的疾病。

本发明还涉及式(I)多肽在制备疫苗组合物中的用途，所述疫苗组合物用于预防或治疗与个体感染HIV家族病毒相关的疾病。

以下实施例对本发明进行进一步阐释，但并无任何限制。

实施例

A.一般材料和方法

A.1HIV-1感染的供体

从Pitie-Salpetriere的自愿供体得到25个HIV-1感染患者的血样。生物临床检查包括常规测定病毒载荷量、全血和CD4⁺T淋巴细胞计数。

通过白细胞分离法从血库( Pitie-Salpetriere)得到20个未感染供体的血样作为对照组。

A.2细胞荧光测定术分析

对新获得的PBMC进行三色FACS分析。同种型匹配的免疫球蛋白作为阴性对照(BD)。使细胞与适当的抗体混合物在4℃孵育1小时。抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD56、抗NKp44、抗NKp46或抗NKp44L单抗。使用FACS裂解液(BD)溶解红细胞。如前述在FACScan上分析至少20,000个白细胞。

为衡量细胞表面激活标记物的表达，PBMC用PE或FITC缀合的抗HLA-DR、抗CD69、抗CD25或抗CD71(全部来自BD)染色并用FACS进行分析。

A.3纯化表达NKp44L的T CD4 ⁺ 细胞

使用RosetteSepCD4⁺富集试剂盒(StemCell)进行CD4⁺T细胞的亚群分选。通过两步磁性分离阳性选择表达NKp44L的CD4⁺T细胞，将CD4⁺T细胞与10μg/ml抗NKp44L于室温孵育1小时，接着以珠比细胞10∶1的比例用包被了山羊抗IgM小鼠的Dynabeads(Dynal)珠于室温处理30分钟。通过FACS分析测定细胞级分的纯度。

A.4原代NK细胞的分离和NK细胞毒性测定

从PBMC产生NK株系，然后用StemSep细胞分离系统和NK细胞富集抗体混合物(StemCell technologies)进行纯化。在补充了100单位rhlL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培养基(StemCell technologies)中培养NK纯化细胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44和抗NKp46单抗染色后通过流式细胞术评价这些制品的纯度。

如前述在4小时的⁵¹Cr释放测定中测定细胞毒活性。简言之，靶细胞用每10⁶个细胞100μCi的Na⁵¹Cr(Amersham)在37℃标记2小时，用培养基洗涤两次。然后将靶细胞铺到圆底96孔微孔板中(每孔4×10³细胞)，并以若干E/T比加入效应细胞。平板在37℃孵育4小时。接着收集上清液并以γ计数测量⁵¹Cr释放。在纳入Ab的实验中，以20μg/ml的终浓度将其加入。按常规方法计算相对的特异性⁵¹Cr释放。计算中扣除的自发⁵¹Cr释放值在总掺入放射性的10％到20％之间。在减去从对照靶标得到的非特异性溶胞后得到结果。每个点代表三份重复的平均值。三份重复的范围总是在其平均值的5％以内。

A.5统计学分析

使用Sperman非参数排序相关性分析进行相关性分析。全部计算使用GraphPad Prism进行。

B.材料和方法

B.1纯化CD4 ⁺ T细胞

使用RosetteSepCD4⁺富集试剂盒(StemCell)进行CD4⁺T细胞亚群分选。通过FACS分析测定细胞级分的纯度。

B.2细胞荧光测定术

对纯化CD4⁺T细胞进行双色FACS分析。同种型匹配的免疫球蛋白作为阴性对照(BD)。将细胞与适当的抗体混合物在4℃孵育1小时。抗CD4或抗NKp44L单抗。如前述在FACSan上分析至少20,000个CD4⁺T细胞。如前述实现NKp44L的胞内表达，简言之，将细胞在4％PFA缓冲液中孵育20分钟，接着在4℃在0.1％皂苷/PBS/1％BSA缓冲液存在下洗涤染色。之后用FACS分析细胞。

B.3原代NK细胞的分离和NK细胞毒性测定

从PBMC产生NK株系，然后用StemSep细胞分离系统和NK细胞富集抗体混合物(StemCell technologies)纯化。在补充了100单位rhlL-2(Boheringer)的MyeloCult H5100培养基(StemCell technologies)中培养NK纯化细胞。用抗CD3(BD)、抗CD56(BD)、抗NKp44和抗NKp46单抗染色后通过流式细胞术评价这些制品的纯度。

如前述在4小时的⁵¹Cr释放测定中测定细胞毒活性。简言之，靶细胞用每10⁶个细胞100μCi的Na⁵¹Cr(Amersham)在37℃标记2小时，用培养基洗涤两次。然后将靶细胞铺到圆底96孔微孔板中(每孔4×10³细胞)，并以若干E/T比例加入效应细胞。平板在37℃孵育4小时。接着收集上清液并以γ计数衡量⁵¹Cr释放。在纳入Ab的实验中，以20μg/ml的终浓度将其加入。按常规方法计算相对特异性⁵¹Cr释放。计算中扣除的自发⁵¹Cr释放值在总掺入放射性的10％到20％之间。在减去从对照靶标得到的非特异性溶胞后得到结果。每个点代表三份重复的平均值。三份重复的范围总是在其平均值的5％以内。

B.4表达HIV-1蛋白的重组痘苗病毒

将以20PFU/细胞的多重感染用野生型痘苗病毒(WT)或多种重组痘苗病毒感染的纯化CD4⁺T细胞作为靶细胞。HIV-1-LAI Gag、Pol、Env、Nef、Tat和Vif蛋白的重组痘苗病毒由Transgène(Strasbourg，France)提供。

B.5肽和肽库

合成的15肽购自Epytop(Nimes，France)或由Agence Nationale de laRecherche sur le SIDA馈赠。HPLC图谱显示纯度均高于80％。肽库包括10种左右不同的肽，每种肽与连续的前一种肽有11个残基的重叠。

B6.筛选单抗抑制NK溶胞的能力

11.抗NKp44(44/8；IgG1)和抗NKp44L单抗(#7.1；IgM)得自按照生产商的说明书用ClonaCell-HY杂交瘤克隆试剂盒(StemCellTechnologies Inc.)免疫的5周龄BaIB/c小鼠。利用抗小鼠过氧化物酶杂交瘤筛选试剂(Roche)和ELISA选择抗体。在特异性缺失IgG1人Fc片段后，通过用NKp44-Ig蛋白免疫小鼠制备抗NKp44(44/8)单抗。为得到#7.1单抗(IgM)，用酸处理的U2-sf2细胞免疫小鼠。如前述制备这些细胞(S.Sumitran-Karuppan，E.Moller，Transi.Immunol.4，163，1996.)。简言之，将一百万个U2-Sf2细胞在PBS中洗涤3次，并用酸性缓冲液在冰上处理5分钟，所述缓冲液通过混合等体积的0.263M柠檬酸和含有1％(w/v)BSA的0.123M Na₂HPO₄制备。再洗涤三次后，将细胞重悬于PBS之中，接着辐照并注射到小鼠中。以未处理或酸处理的721.221细胞作为靶标用⁵¹Cr细胞毒测定分析全部杂交瘤，并用不同的融合蛋白通过ELISA分析抗NKp44杂交瘤的特异性。在硫酸铵沉淀(50％饱和溶液)后，在甘露聚糖结合蛋白(MBP)柱(Pierce)上纯化#7.1单抗(IgM)，在蛋白A/G柱(Pierce)上纯化抗NKp44单抗。在SDS-PAGE上确认每种纯化单抗的纯度。

C.结果

实施例1几种HIV病毒蛋白对NKp44L表达的影响

用表达HIV病毒蛋白的重组痘苗病毒进行感染来检测HIV病毒蛋白对NKp44L表达的影响。如图1所示，在表达gp160(33.9％)或gp41HIV包膜蛋白(35.6％)的痘苗病毒感染的CD4⁺T细胞中NKp44L的表达明显增强。相反，测试的其它HIV蛋白如Gag、Pol、Tat、nef、vif或gp120均不影响NKp44L蛋白的细胞表面表达。此外，在非病毒系统中证实了Env蛋白增强NKp44L表达的作用。用两种不同来源供应的重组gp160蛋白处理纯化的CD4⁺T细胞，如图2A所示，这些gp160重组蛋白影响NKp44L的表达。事实上，分别用gp160-A和gp160-B处理后，10.7％和9.6％的CD4⁺T细胞表达NKp44L。另一方面，未处理细胞或与对照蛋白孵育的细胞中未观察到效果。总而言之，这些结果显示重组gp160蛋白明显增强NKp44L在CD4⁺T细胞表面的细胞表面表达。

实施例2gp160诱导CD4 ⁺ T细胞的NK溶胞

对未处理细胞、用对照蛋白处理的细胞或用两种重组gp160蛋白处理的细胞的NK溶胞比较(图2B)显示，在用重组gp160蛋白培养的CD4⁺T细胞存在下，靶细胞溶胞提高了。使用两种不同类型的重组gp160蛋白说明用于诱导过表达NKp44L的操作和NK溶胞活性的提高对实验结果无影响。总之，这些结果说明，与NK溶胞活性强烈提高相关的NKp44L过表达需要gp41HIV Env蛋白。

实施例3 鉴定gp41Env蛋白与NK溶胞活性提高相关的肽基序

测试了如材料&方法一节所述制备的重叠肽库的效应以包括全部gp41蛋白。将CD4⁺T细胞与5μg每种肽库孵育并针对活化NK细胞进行测试。如图3所示，在与名为gp41C的肽库孵育的细胞中NK溶胞提高，而任何其它肽库则没有。测试了用每种肽库处理的纯化CD4⁺T细胞的NKp44L表达。这一受体仅在用gp41C库处理的细胞中可检测到，阳性细胞百分比为13.3％。在所有与其它受测肽库孵育的细胞中均未检测到NKp44L。这提示gp41C库中的一个或几个肽基序通过过表达NKp44L与NK溶胞直接相关。之后测试了gp41C库中包含的所有肽的重复实验。如图4A所示，在肽gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147存在下NK细胞毒活性强烈升高。相反，对于其它受测肽，NK溶胞活性维持在接近背景的低水平。平行地，用gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147预处理CD4⁺T细胞后，NKp44L的表达提高了，阳性细胞百分比在22％和16％之间变化，而其它肽则不然(阳性细胞少于7％)(图4B)。这些结果说明gp41EnvHIV蛋白特有的肽可以提高NK溶胞活性。对该结论的其它支持来自名为gp41-C145、gp41-C146和gp41-C147的连续肽包含共同的肽基序NH₂-SWSNKS-COOH。该gp41HIV-1蛋白特有的基序高度保守。证明gp41的一些连续肽是NK溶胞的主要介质之后，评估肽基序NH₂-SWSNKS-COOH是否与CD4⁺T的NK溶胞直接相关是很重要的。用该6肽进行的初步实验未显示出NKp44L的细胞表面表达或NK细胞毒活性的提高，提示该序列太小或太快地被一些肽酶攻击。然而，为证实这一假说，构建了衍生自gp41-C146(WT)的两个15肽，所述15肽在NH2-SWSNKS-COOH基序(Ctl1)或全部15肽序列(Ctl2)中包含一些突变(图5A)。如图5B所示，在肽WT存在下NK细胞毒活性强烈提高。未处理(无)或用两种对照肽处理的细胞则相反。对于NKp44L的细胞表面表达也观察到相似的模式，事实上，用WT肽处理的细胞中，约17.4％的CD4⁺T细胞表达该标记物。相反，未处理细胞或用对照肽处理的细胞中NKp44L细胞的百分比小于4％。这些结果显示gp41蛋白中包含的NH₂-SWSNKS-COOH基序与CD4⁺T细胞的NK溶胞强相关。

gp41肽的效应是时间依赖性的(图6)。NK溶胞活性在与WT肽孵育30分钟后出现，并在接近第4天时达到最大值。另一方面，用未处理细胞或用对照肽处理的细胞进行处理之后未观察到明显效果。此外，在用WT肽处理的细胞中，用带有抗NKp44L单抗的细胞预处理之后，NK溶胞活性的提高受到强烈抑制，证实了NK活性与NKp44L细胞表面表达的提高直接相关(图6C)。然而，NKp44L细胞表面表达的动力学研究揭示该受体在细胞表面迅速表达，事实上在用WT肽处理10分钟之后，约10％的CD4⁺T细胞表达该蛋白，在处理4天后得到表达的最大值(约30％)。NKp44L非常迅速的细胞表面表达提示没有新合成NKp44L，并提示该蛋白存在于用IL2培养的CD4⁺T细胞内。NKp44L的胞内染色证实了这一假说。如图6D所示，在细胞内检测到NKp44L的高表达，且其不依赖于肽的存在。

实施例4不同人细胞的NKp44L的细胞表面表达

如图7所示，测试了NKp44L在K562、Jurkat和静息PBMC上的细胞表面表达。将细胞与1μg/ml抗NKp44L单抗(灰粗线)或IgM同种型对照(黑细线)孵育并用流式细胞术分析。可以明显看出，与PBMC相反，肿瘤细胞如jurkat和K562细胞在其表面表达NKp44L。

实施例5#7.1-特异性抑制NKp44介导的NK溶胞的抗NKp44单抗-的鉴定。

为了研究该配体在HIV-1感染中的相关功能和表达，测试了单抗文库抑制NK溶胞的能力。其中之一即#7.1单抗揭示了在NKp44L上表达的表位。仅在HIV感染的U2细胞中发现该单抗的特异性染色，在未感染U2细胞中则没有(图8B)，且其染色水平与NKp44-Ig融合蛋白相似(比较图8A和8B)。该融合蛋白对#7.1单抗染色的抑制证实#7.1单抗与NKp44配体(NKp44L)特异性相互作用(图8C)。对照实验表明NKp46-Ig融合蛋白没有效果(图8C)。此外，当用#7.1单抗预处理HIV-1Sf2慢性感染的U2细胞时，其NK介导的溶胞急剧下降(多达40％)(图8D)。用抗NKp44单抗处理NK细胞产生相同的效果(图8E)。注意在两个系列的实验中，在抗NKp44或7.1单抗存在下得到的溶胞数量级与未感染细胞中所观察到的相似。我们在用HIV-1BRU毒株慢性感染的Jurkat细胞中得到了相似的结果(数据未显示)。总之，这些数据强烈提示NKp44L在HIV-1感染期间表达，且#7.1单抗与HIV-1感染细胞上的NKp44L特异性反应。

实施例6衍生自gp41HIV蛋白的NH ₂ -SWSNKS-COOH基序的关键作用

测试了兔抗gp41-C146肽的多克隆抗体抑制NKp44L表达的能力和对NK溶胞的敏感性。简言之，将高度纯化的肽(gp41-C146肽)(>95％)与KLH连接并注射到数只兔子中。通过在PeptiPlaks上的ELISA测定血清效价。通过层析纯化抗体。在与纯化抗gp41-C146多克隆抗体孵育的来自两个感染HIV-1患者的纯化CD4⁺T细胞中，NKp44L表达(7.8％)显著低于纯化而未处理的细胞(27.2％)或用对照抗体处理的细胞(27.9％)(图9E)。在抗gp41-C146多克隆抗体存在下NK活性的显著抑制证实了这一效应(图9F)。这些结果强烈提示在HIV感染期间，gp41NH₂-SWSNKS-COOH基序在诱导NKp44L表达方面发挥关键作用，且gp41蛋白参与活化的NK细胞对CD4⁺T细胞的选择性破坏。

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Claims

1.具有下式(III)的抗原化合物的用途，其中

NH₂-PepNt-[(1)_n-PepX_n]_n-PepCt-COOH(III)，

-“PepNt”由氨基酸长度在0到6个氨基酸残基内变化并位于式(III)多肽N端的多肽组成；

-“[(I)_n-PepX_n]”由多肽单位组成，其中：

-“(I)₁到-(I)_n”彼此独立地由式“SWSNKS”的多肽组成，n为1；且

-“PepX₁”到“PepX_n”彼此独立地由氨基酸长度为0个氨基酸残基的间隔多肽组成，n为从1到12的整数；

-“n”为所述多肽中[(I)_n-PepX_n]多肽单位的数目，n为整数1；且

-“PepCt”由氨基酸长度在0到5个氨基酸残基内变化并位于式(III)多肽C端的多肽组成，

其用于制备疫苗组合物，所述疫苗组合物用于治疗个体感染HIV家族病毒的相关疾病，其中所述疫苗组合物引起使得CD4⁺细胞NK溶胞降低的抗体应答。

2.根据权利要求1的用途，其中所述抗原化合物由氨基酸序列PWASNASWSNKSLDDIW(II)的多肽组成。

3.根据权利要求1和2中任一项的用途，其中所述抗原化合物与载体蛋白或合成多聚体缀合。

4.根据权利要求3的用途，其中所述载体蛋白选自匙孔槭血蓝蛋白、牛血清白蛋白或白喉类毒素。

5.根据权利要求3的用途，其中所述合成多聚体为含有由赖氨酸残基组成的核心基质的多分支肽构建体。

6.根据权利要求3的用途，其中在所述多肽和所述载体蛋白或合成多聚体之间存在间隔区。

7.根据权利要求1至6中任一项的用途，其中所述疫苗组合物包含免疫佐剂化合物。

8.根据权利要求7的用途，其中免疫佐剂化合物选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝、磷酸钙、磷酸铝、磷酸钾、霍乱毒素及其B亚单位、来自百日咳杆菌的毒素、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素、单磷酰脂质A、CpG寡核苷酸、咪唑并喹诺酮、含有鲨烯和合成共聚物的水包油乳剂、胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷和免疫刺激复合物以及双十八烷基二甲基溴化铵或双十八烷基二甲基氯化铵。

9.针对具有下式(III)的抗原多肽的抗体，其中：

NH₂-PepNt-[(1)_n-PepX_n]_n-PepCt-COOH (III)，

-“[(I)_n-PepX_n]”由多肽单位组成，其中：

-PepCt”由氨基酸长度在0到5个氨基酸残基内变化并位于式(III)多肽C端的多肽组成。

10.针对抗原多肽的抗体，其中所述抗原多肽由氨基酸序列PWASNASWSNKSLDDIW(II)的多肽组成。