JP2005527513A - ワクチン製造のためのリポペプチド混合物の使用 - Google Patents

ワクチン製造のためのリポペプチド混合物の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、ワクチンを製造するための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用に関する。該リポペプチドは、少なくとも1つの非ペプチド親油性ベクターへヒドラゾン結合によって溶液中において連結されているペプチド化合物を含む。本発明はまた、HCVの天然配列NS3に関する。

Description

本発明は、ワクチンを製造するための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用に関し、前記リポペプチドは、非ペプチドタイプの少なくとも1つの親油性ベクターへ、ヒドラゾン結合によって、溶液中で連結されたペプチド化合物によって構成されている。
ワクチンを製造するためのリポペプチドの使用は、既に記載されている:例えば、特許出願PCT/FR98/02605は、免疫応答を誘発するためのリポペプチドの複合ミセル(composite micelles)を記載している。このような使用は、所定の化学組成から出発して、クラスIおよびクラスIIの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)の分子と共同して抗原提示細胞(APC)によって同時に提示される多様なコレクションのペプチド抗原を免疫系へ与えることを可能にする。従って、提示される抗原の特定の細胞[:ヘルパーT細胞(“ヘルパー”Tリンパ球、HTL)、抗体産生B細胞、または細胞傷害性T細胞(細胞傷害性Tリンパ球、CTL)]を活性化することが可能である。
各個体における防御的ポリクローナル免疫応答を誘発するために、ワクチン組成のエピトープ多様性の増加は、最も有望なストラテジーの1つである。
いくつかの実験は、N−ε−パルミトイルリシンによりC末端位で修飾されている複数のエピトープを有するいくつかのペプチドでの免疫化に続いて、複数の細胞性応答が極めて効率的に誘発され得ることを示した。
従って、例えば、7〜8の異なる成分を含むリポペプチドのいくつかの混合物は、霊長類(Bourgault-Villada et al., 1997, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 19, 81-87; Mortara et al., 1999, J. Virol, 73, 4447-4451; Mortara et al., 2000, Virology, 278, 551-561)およびヒト(Gahery-Segard et al., 2000, J. Virol., 74, 1694-1703; Pialoux et al., 2001, AIDS, 15 1239 − 1249)中のウイルスに対する特異的T細胞応答を誘発するために使用された。
Pialouxらによる研究は、ヒト免疫不全ウイルス(1型ウイルス、HIV−1)による感染についてのモデルにおける、24から33残基の長さを有する6リポペプチドの混合物600μg〜3mgの用量(1ペプチド当たり100μg〜500μg)を受容した健康なボランティアの大部分においてHTLおよびCTL応答を誘発することが可能であったことを示した。第I相臨床試験において使用された6リポペプチドのカクテルの耐性および免疫原性は、このような合成製剤が従来の組換えワクチンの有望な代替アプローチであることを確認した。
当該分野において公知のリポペプチドは、ペプチドのC末端またはN末端位での固相におけるペプチド合成によって構築される。これらのリポペプチドは、親油性のものであり、そして従って、水溶液中で凝集する傾向にある。従って、工業規模でのそれらの製造時に遭遇する主な障害は、非常に制限された分離能力(resolving power)を有する分取RP−HPLCを使用する精製工程を伴う。所望の生成物は、カラム上における制限された負荷でのみ、副産物から分離され得る。従って、工業規模でワクチンを調製するために、そしてC末端位における分枝リポペプチドを考慮した場合、作業コストの大部分は、クロマトグラフィー工程の反復に充てられる。従って、精製収率は、比較的低く、典型的には実験室規模で10、そして恐らく工業規模ではより低く(10〜100mg)、1〜2%、またはワクチンのバッチのサイズが10倍増加されるとなおより低い。
リポペプチドの複合ミセルを調製する目的は、抗原を提示する各細胞の近位における、ワクチンの全成分の等しい分散を確実にすることであり、主題は、抗原提示細胞との物理的連絡を介して、ヘルパーTリンパ球と細胞傷害性Tリンパ球との間の細胞協働(cell cooperation)を可能にすることである。効率的な細胞協働を達成するために、リンパ球は、タイプIおよびタイプII主要組織適合遺伝子複合体によって提供される同一の抗原提示細胞エピトープを、表面上で、同時に認識しなければならない。臨床試験において実験的に得られる結果は、ヘルパーTエピトープがリポプチド抗原において同定されかつ細胞傷害性Tエピトープが同一組成を有する別のリポペプチドに存在すると同定される、効率的な免疫応答を得ることが可能であることを確認する(Gahery-Segard et al., 2000, J. Virol., 74, 1694-1703; Pialoux et al., 2001, AIDS, 15 1239 − 1249)。
先行技術に従うリポペプチドの複合ミセルを得るために、各リポペプチドは、精製されて、そしてそれらが混合される前に個々にキャラクタライズされなければならない。先行技術に従って混合を行うために、各リポペプチドは、ワクチンの成分である各リポペプチドの完全な溶媒和を可能にする条件下で個々に溶解されなければならない(PCT/FR98/02605)。核磁気共鳴を使用しての溶液の研究は、この状態の溶解は、高濃度(80%)の酢酸水溶液においてのみ得られることを示した。従って、先行技術に従う方法は、個々に各成分を溶解し、それらの混合物を調製し、それをホモジナイズし、そして次いで稀釈および続いての凍結乾燥前に、0.22μmの多孔性を有するフィルターを備える滅菌濾過を行うために、酢酸水溶液(80%)中におけるリポペプチドの比較的長い滞在時間(residence time)を包含する。このような溶媒中での滞在時間は、酸に対して感受性である特定の親油性ベクターまたは特定のペプチド鎖と非適合性である。
従って、本願出願人は、その製造が先行技術に従うワクチンのそれにおける欠点を有しない、ワクチンを工業規模で製造するという目標を設定した。
従って、本発明の主題は、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用によるワクチン製造であり、該リポペプチドは、好ましくは、ペプチド化合物の均質混合物の同時脂質化(simultaneous lipidation)によって得られ、そして非ペプチド性質の少なくとも1つの親油性ベクターへヒドラゾン結合により連結されたペプチド化合物によって構成されており、そして以下の一般式(I)を有する:
[((R1)(R2i)D−H]j−P (I)
式中、
(R1)(R2iDは該親油性ベクターを示し、式中:
− iは0または1を示し、
− iが0に等しい場合、Dは結合を示し、
− iが1に等しい場合、Dは、飽和、不飽和または芳香族の、単または多環式ヘテロ環を示し、
− R1およびR2は、同一であるかまたは異なり得、各々、式L−f−E−f’(式中、Lは脂質の残基を示し、Eはスペーサーを示し、そしてfおよびf’は、各々、LとEへ並びにEとDへ連結する官能基を示す)を有する基を示し、そして
− Pは、該ペプチド化合物を示し、
− Hは、該親油性ベクターによって保有されるアルデヒド官能基と該ペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体官能基との溶液中における連結によって形成される該ヒドラゾン結合を示し、
− jは、1〜3を示す。
jが2または3を示す場合、リポペプチドの混合物は、水性媒体中の均質な溶液または懸濁液を形成しなければならず、そして所望の免疫原性のものでなければならない。
1つの好ましい実施形態において、式(I)に従うリポペプチドの少なくとも1つの混合物の使用は、有利には、iが0に等しく、jが1に等しく、そして基L(R1およびR2に関連して定義される式L−f−E−f’における)が、例えば、ステロール、ステロール誘導体(例えば、コレステロール誘導体)、あるいは4〜30炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝の炭素鎖を示すようなものである。このような炭素鎖は、パルミチン酸(Lが式CH3−(CH214−に対応する)またはオレイン酸(Lが式CH3−(CH27−CH=CH−(CH27−に対応する)のような脂肪酸の親油性部分を形成する。
本発明の1つのより好ましい実施形態において、ステロール誘導体はコレステロール誘導体であり、そして炭素鎖は式CH3−(CH214−に対応する。
更に、Eは、有利には、1〜18の炭素原子ならびに必要に応じて1〜16のヘテロ原子(例えば、窒素または酸素)および/またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される1〜7の基を含む、直鎖、分枝鎖または環式の、飽和または不飽和の炭素鎖を示す。Eは、場合によっては、1〜8のヒドロキシルまたはアミノ基および/または1〜16のハロゲン原子(例えば、塩素またはフッ素)によって置換されていてもよい。
同様に、fは、有利には、−CO−NH−または−CO−O−結合を示し、そしてf’は、−NH−CO−または−O−CO−結合を示す。
本発明の意味において、
−“炭素環”(“シクロアルキル”とも呼ばれる)は、3〜8の炭素原子を含む単または多環式炭素環(例えば、シクロペンチルまたはシクロヘキシル)を意味すると理解され;
−“アリール”は、5〜14の炭素原子を含む芳香族、単または多環式炭素環(例えば、フェニル、ナフチルまたはクレシル)を意味すると理解され;
−“ヘテロ環”は、窒素、酸素および硫黄から選択される1またはそれ以上のヘテロ原子を含む炭素環(例えば、ピペラジン)を意味すると理解され;
−“ヘテロアリール”は、窒素、酸素および硫黄から選択される1またはそれ以上のヘテロ原子を含むアリール(例えば、ピリジン、ピリミジンまたはピラジン)を意味すると理解される。
本発明に従う好ましい親油性ベクターの例は、以下の式(II)および(III)に対応する:
Figure 2005527513
式中、Lは上記に定義される通りであり、そして例えば、式CH3−(CH214−の炭素鎖(即ち、パルミチン酸の親油性部分)を示す。
式(I)におけるペプチド化合物Pは、1またはそれ以上のペプチド抗原および1またはそれ以上のペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティック(dendrimeric glycomimetics)によって形成される群から選択され得る。
本発明の意味において、“1またはそれ以上の”ペプチド抗原またはデンドリマー性のグリコミメティックは、ペプチド化合物Pが、それによってリポペプチドの混合物の活性を改変させること無しに共に連結された、単一または数個のペプチド抗原またはデンドリマー性のグリコミメティックによって構成され得るという事実を意味すると理解される。
ペプチド抗原は、有利には、ペプチドならびにグリコペプチド(glycopeptides)およびシュードペプチド(pseudopeptides)を含むペプチド誘導体によって構成される群から選択される。
本発明の意味において、用語“ペプチド”は、それらの性質および数に関わらず、数個のアミノ酸の任意の鎖を意味すると理解され;従って、用語“ペプチド”は、オリゴペプチド(ジペプチドまたはトリペプチド)およびポリペプチドもしくは蛋白質の両方を意味する。“グリコペプチド”は、糖質(それらが、単糖類(例えば、中性糖)または多糖類である)と共有結合によって結合されたペプチドを意味すると理解される。“シュードペプチド”は、その1またはそれ以上のペプチド結合(−CO−NH−)が非ペプチド結合(例えば、−CO−NH−NH−、−CH2−NH−または−CO−NH−O−結合)で置換されているペプチドを意味すると理解される。
本発明の意味において、“ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティック”は、その構造がアミノ酸またはそれらの誘導体に基づいておりそして非常に枝分かれした形態、樹状(arborescent)タイプのものである、グリコミメティックを意味すると理解される。
前記ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックは、以下の一般式(IV)に対応する:
(B2M)m(XN)nA (IV)
式中:
− B2は、以下の1またはそれ以上の一般式(a)または(b):
Figure 2005527513
[式中、R1、R2、R3およびR4は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてWは、結合、あるいは1〜18の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄および窒素から選択される1〜12の原子を含む、直鎖、分枝鎖または環状の、飽和または不飽和の炭素鎖(該炭素鎖は、場合によっては1〜16のハロゲン原子によって置換されている)を示す]に対応し、
− Xは、1〜6のアミノ酸を含む、X’オリゴペプチドの残部を示し、
− Aは、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、スレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される、同じかまたは異なるアミノ酸の鎖を含む、少なくも三官能性のA’化合物の残部を示し、
− mは、1〜32の整数であり、
− nは、0〜32の整数であり、そして、
− MおよびNは、各々、それぞれ、B2とAとの間(n=0の場合)またはB2とXとの間(nが0とは異なる場合)、そしてXとAとの間(nが0とは異なる場合)の連結基を示し、そして、互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基の中から選択される官能基を含む。
式(IV)を有する化合物は、国際特許出願PCT/FR00/02194に記載されている。
本発明の意味において、“保護”基は、Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE and P.G.M. WUTS, Second Edition 1991, J. WILEY and Sonsという題名の仕事において規定されるように、ヒドロキシル官能基またはジオール(この場合、R1、R2、R3およびR4から選択される2つの基が、互いに共有結合的に連結されて一緒に環を形成し得る)を保護する保護基を意味すると理解される。例として、そして非限定的には、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、tertブチルジメチルシリル、tertブチルジフェニルシリル、トリメチルシリルエチルエーテル、tert−ブトキシメチル、メトキシ−メチル、ベンジルオキシメチル、2−メトキシエトキシメチル、メチルチオメチル、アセチル、または2’,3’−ジメトキシブタン−2’,3’−ジイル基が挙げられ得る。
例として、そして非限定的には、以下の一般式(a)および(b)において:
− 好適なハロゲン原子は、臭素、塩素およびフッ素であり;そして
− 好適な炭素鎖は、アルキル基(メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、tertブチル、ペンチル、...)、アルケニル基(ビニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、...)、アルキニル基(エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、...)、シクロアルキル基(シクロペンチル、シクロヘキシル、...)、ヘテロ環(ピペラジン、...)、アリール基(フェニル、クレシル、...)、ヘテロアリール基(ピリジン、ピリミジン、ピラジン、...)、ポリエチレングリコール基あるいは、また、ポリアミンである。
式(a)および(b)は、キナ酸およびシキミ酸ならびに環の1、3、4および/または5位に保有されるヒドロキシルを保護することによって得られるそれらの誘導体のいくつかの残部(rests)を示す。
本発明に従う1つの好ましい実施形態において、一般式(IV)に従う化合物は、mが4〜16の整数であり、nが2〜8の整数であり、Xが2〜4のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドの残部であり、そしてAが2〜8のリシン残基を含みかつデンドリマーの形態をとるオリゴペプチドの残部であり、そしてB2が(−)−シキミ酸および(−)キナ酸から選択される1またはそれ以上の化合物の残部を示すようなものである。
式(I)に従うリポペプチドの混合物において、式(IV)に従うペプチド化合物の存在は、マンノースレセプターまたはマンノースレセプターに関連するC−レクチンファミリーレセプターを有する細胞へリポペプチドを選択的に運搬する(vectorize)ことを可能にする。従って、式(IV)に従う、ペプチド抗原およびデンドリマー性のグリコミメティックによって構成されるPペプチド化合物を含む、リポペプチドの混合物は、マンノースレセプターに関連するC−レクチンファミリーレセプターを発現する細胞へ、上記リポペプチドの混合物を標的化させることを可能にする。
本発明に従うリポペプチドの混合物の使用は、有利には、1〜20の異なるリポペプチド、好ましくは1〜10の異なるリポペプチドを含む。
ワクチンを製造するためのリポペプチドの混合物の本発明に従う使用は、全タイプのワクチン(即ち、慣用的には予防ワクチン、それだけではなく“治療用途のワクチン”も)の製造における使用に及ぶ。このようなワクチンは、細菌、ウイルスまたは寄生生物起源の感染性疾患あるいは種々のタイプの癌に対して向けられ得る。本発明に従う使用はまた、種々の感染性疾患に対応するペプチド抗原の混合物を含む多価ワクチンの製造を可能にする。
従って、本発明に従うワクチンは、予防的ワクチン接種の観点からだけでなく、治療的観点からもまた有効であり;特に、本発明に従う親油性ワクチンは、新規のエピトープに対する応答を惹起するため、ならびに確立された免疫応答の分極(polarisation)を分極化または強化するために使用され得る。観察された結果は、実際に、リポペプチドが感染した患者において新規の抗−HIV、CD4、CD8免疫応答を誘発し得るということを示している。
ペプチド化合物は、有利には、ウイルスタイプ(例えば、HIVまたはHCV)の感染因子(infectious agent)から誘導されるペプチド抗原によって構成されている。
本発明に従う少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用は、好ましくは、経粘膜または経皮投与、また非経口投与(筋肉内、皮下、皮内、静脈内)用に処方される。
現在入手可能な大抵のワクチンは、非経口投与され、これは、訓練された医療従事者を必要とし、高い費用を伴い、注射の部位での反応を誘発し得、そして特定の状況下で、汚染された注射器の使用に続く感染を生じさせる(例えば、HIVおよび肝炎ウイルスの伝染)。WHO評価によれば、発展途上国において、無滅菌注射器の広範な再使用のために、ワクチン接種目的のために行われる注射の50%において、安全な予防措置が採られていない(Jodar L. et al., Vaccine, 19 (2001), 1594-1605; Kane A. et al., Bull WHO 77 (1999) 801-807)。更に、注射針の使用は、一般的に、子供の場合、痛みを伴う。従って、投与し易く、経済的であり、そして実施が容易である免疫化プロトコルを有する、新世代のワクチンを開発する必要があるようである。
粘膜および経皮ワクチンは、非経口的に投与されるワクチンの魅力的な代替物を示す。粘膜投与(例えば、経鼻投与)は、多くの病原体について開放されている部位で免疫応答を誘発することを可能にし、そして経口投与(これは、抗原提示細胞への制限されたアクセス、腸管における蛋白質分解、および小さな幅の免疫応答を伴うままである)の効率的な代替物である。
外部環境との主な接触面である皮膚はまた、多数の病原体の侵入を妨げる免疫バリアである。それは、例えば、ケラチノサイト、そして特に、ランゲルハンス細胞のような特定のイムノコンピテント細胞を有し、リンパ腺とフィットアップ(fit up)され、、ならびにTリンパ球のサブクラスを有しており、全体は“皮膚関連リンパ組織”(Skin-associated lymphoid tissue, SALT)を形成している(Bos J.D., et al., Immunol. Today, 14, (1993), 75-78)。
細胞膜を通過するそれらの能力は、リポペプチドが粘膜表面を通ってエピトープを輸送し、従って、それらは局部免疫系にだけではなく全身系にも送達される(国際出願番号WO 0141797)。本発明に従う、少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用は、更に、疎水性質のリポペプチドとの、ファンデルワールス型の相互作用および極性部分による水中での良好な溶媒和を確実にし得る、賦形剤または両親媒性せいしつの構成成分を含む。
これらの賦形剤または両親媒性成分は、大部分について、極性または荷電アミノ酸により構成され得る。
本発明に従う1つの好ましい実施形態において、リポペプチドの混合物は、更に、1またはそれ以上の臨床的に許容される賦形剤を含む。
特に有利な様式において、臨床的に許容される賦形剤は、マンニトールまたはポリソルベート80、あるいはこれら2つの混合物である。
本発明は、特に、ペプチド抗原として、HIVウイルスのGag、PolおよびNef蛋白質からの少なくとも2つの配列を含むワクチン、特に、Gag17−35、Gag253−284、Pol325−355、Nef66−97、Nef116−147配列の混合物、そして、より詳細には、実施例1に記載のようなリポペプチドに関する。
使用されるリポペプチドにおいて、追加のリシンが各ペプチドのC末端に導入され、C末端カルボン酸がアミド化される。このリシンの側鎖のアミン官能基(e−NH2)は、ヒドラゾン結合を含むスペーサーを介して結合されたパルミトイル部分によって修飾される。
別の好ましい実施形態において、本発明に従う使用は、ペプチド抗原として、以下のペプチド配列を含む:
Figure 2005527513
本発明はまた、以下の天然配列に関連する:
Figure 2005527513
従って、これらは免疫原性のものである。
上記実施形態に加えて、本発明は、更に、本発明に従う少なくともリポペプチドを含む混合物のワクチン製造のための使用の実施例、ならびに実施例5に従うワクチン用量(SIV)の注射後のマカクにおける免疫原性の分析結果を示す図1を参照する、以下の説明から明らかとなる他の実施形態を包含する。
以下の実施例において、以下の略語を使用した:eq.:当量; Boc:tert−ブチルオキシカルボニル; Fmoc:9−フルオレニル−メトキシカルボニル; Mtt:4−メチル−トリチル; DMF:ジメチルホルムアミド; TFA:トリフルオロ酢酸; CH2Cl2:ジクロロメタン; MeOH:メタノール; EtOH:エタノール; THF:テトラヒドロフラン; AcOH:酢酸; AcOEt:酢酸エチル; H2O:水; AcO-NH4 +:酢酸アンモニウム; CDCl3:重水素化クロロホルム; EDT:エタンジチオール; TIS:トリイソプロピルシラン; DMSO−d6:ジメチルスルホキシド−d6(完全に重水素化); NaIO4:過ヨウ素酸ナトリウム; NaCl:塩化ナトリウム; Na2SO4:硫酸ナトリウム; MgSO4:硫酸マグネシウム; KH2PO4:リン酸二水素カリウム; PAL:“ペプチド
−アミドリンカー”; BOP:ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス(ジメ
チルアミノ)−ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート; HOBt:N−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール; HBTU::N−[(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)(ジメチルアミノ)メチレン]−N−メチルメタナミニウムヘキサフルオロホスフェートN−オキシド; DIEA:ジイソプロピル−エチルアミン; TEAP:トリエチルアミンホスフェート; HPLC:高速液体クロマトグラフィー; RP−HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー; ES−MS:エレクトロスプレイ質量分析; TOF−PDMS:プラズマ脱離質量分析(plasma desorption mass spectrometry); LC−MS:液体クロマトグラフィーを使用する分析と連結された質量分析(mass spectrometry coupled with analysis using liquid chromatography); 1H NMR:プロトン核磁気共鳴; 13C NMR :炭素核磁気共鳴。
実施例1:ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1)のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量(HIV−HzPAMリポペプチド)の調製
1)ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成:
5つのペプチド、C末端で導入されたリシンの側鎖におけるα−ヒドラジノアセティック基(α−hydrazinoacetic groups)によって官能化された、HIV−1ウイルスのGag、PolおよびNef蛋白質の誘導体を調製した。これらのヒドラジノペプチドを、トリフルオロ酢酸塩の形態で固相合成した。(従来の)Fmoc/tert−ブチル ストラテジー、ならびに最近記載された方法[N,N’,N’−トリ(tert−ブチルオキシカルボニル)−ヒドラジノ酢酸]を、C末端位におけるリシルアミド残基の脱保護されたε−アミノ基へのヒドラジノアセチル基の標的化導入のために使用した(BONNET D. et al., J. Org. Chem, 2001 and 特許出願PCT/FR00/02336)。配列に依存して、合成の収率は、10〜50%である。切断および脱保護後、ペプチドの同定を、ES.MS.を使用して検査した。ヒドラジノペプチドは、24時間110℃での塩酸6N HCl:フェノール、10:1を用いての完全な酸加水分解後に、アミノ酸組成分析を受ける。
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Simatzu 6A HPLCシステムにおけるC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径12.5mmおよび250mm長、プレカラム付き)上でのRP−HPLCにより精製する。RP−HPLC分析を、Simatzu 10A HPLCシステム上でのC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径4.6mmおよび250mm長)を使用して行う。
溶出溶媒(溶媒AおよびB)は以下の通りである:
− 溶媒A:TFA0.05%を含む脱イオン水
− 溶媒B(精製):プロパン−2−オール/H2O混合液(40:60)中TFA0.05%。
− 溶媒B(反応に続く、分析):アセトニトリル/H2O混合液(80:20)中TFA0.05%。
溶出速度は、30分間で10〜100%緩衝液Bの線形勾配、10分間の100%緩衝液B、10分間の10%緩衝液Bを使用して、1ml/minである(215nmで検出、温度:50℃)。
トリフルオロ酢酸塩の形態である得られたペプチドを、以下の表Iに示す。
Figure 2005527513
得られたヒドラジノペプチドについての溶出時間を、以下の表IIに示す。
Figure 2005527513
2)“水和Pamベクター”:[3−(2,2−ジヒドロキシ−アセチルアミノ)−プロピル]−アミドヘキサデカン酸の形態でも存在する、Pam親油性ベクター[3−(2−オキソ−アセチルアミノ)−プロピル]−アミドヘキサデカン酸の合成:
パルミトイル基およびグリオキシリル基から構成される、このベクターの合成は、MELNYKらにより特許出願番号PCT/FR01/02787において(実施例4:親油性ベクター“IIIa”の合成)およびBonnetらにより(BONNET D et coll., Tetrahedron Letters, 2000)記載されている。
500mlフラスコにおいて、10g(66.6ミリモル)の酒石酸を、Amberlyst 15樹脂1質量%の存在下で、100%純粋エタノール200ml中に溶解する。フラスコに、4A活性化モレキュラーシーブを含有するソックスレーシステム(soxhlet system)を備える。エタノールを48時間還流する。次いで、反応媒体を、no4焼結ガラスを使用して濾過し、該樹脂を除去する。濾液を減圧下で濃縮し、そして淡黄色オイルが得られる。残渣を、P25を使用して一晩乾燥させ、そして追加の精製様式を用いずに使用する(m=13.46g、収率=98.0%)。
薄膜クロマトグラフィーを使用しての以下に示す化合物の分析は、CH2Cl2/MeOH/H2O/AcOH溶出液(90/10/0.1/0.05)において、Rf=0.76である。
Figure 2005527513
13.46mg(65.26ミリモル)の化合物を、100%純粋エタノール155ml中に溶解し、そして1,3−ジアミノプロパン56ml(665.26ミリモル)へ滴下する。次いで、反応媒体を室温で3時間撹拌する。次いで、過剰の1,3−ジアミノプロパンを、減圧下での蒸発およびエタノール(3×200ml)の存在下での共沸エントレインメント(azeotropic entrainment)により除去する。得られる黄色オイルを、一晩P25を使用して乾燥させ、エタノール/トルエン混合液(1/1)中におき、そして減圧下で濃縮する(3×200ml)。ペースト形態の黄色化合物を、このようにして得る。この化合物を、エチルエーテル/エタノール(5/1)混合液50ml中に析出させ、次いで濾過し、そして白色析出物を、エチルエーテルの存在下、0℃で1時間30分間撹拌する。次いで、焼結ガラスを使用して濾過し、そして最少量のエチルエーテルで2回コールド洗浄する(cold washed)。残渣固体を、P25を使用して一晩乾燥させる(m=13.92g、収率=81.3%)。
以下に示す化合物の分析は、以下の通りである:THF/AcOH/H2O/AcO-NH4 +(35/20/10/1%質量で(massic))において、Rf=0.34。
Figure 2005527513
996.9mg(3.8ミリモル)の化合物を、水15mlに溶解する。溶液のpH(8.5に等しい)を、1.46gのクエン酸を使用して3.25まで低下させる。次いで、1.06 g(4.9ミリモル)の固体NaIO4を、水浴を使用して室温で維持された反応混合物へ、5分間4段階で添加した。10分後、570mgの酒石酸(3.8ミリモル)を添加して、反応していない過剰なNaIO4を中和する。室温で10分間撹拌した後、24mlのN−メチルモルホリンでpHを8.6へ調節する。反応媒体を70mlの2−メチル−プロパン−2−オールおよび20mlの水で稀釈する。次いで、2.16g(1.6eq.)のスクシンイミジルパルミトエート(succinimidyl palmitoate)を、該溶液へ添加し、これを室温で一晩撹拌する。次いで、pHを、7.11gのクエン酸で3.5へ調節する。該媒体を、40mlの飽和NaCl溶液で稀釈し、そして140mlのジクロロメタンそして次いで100mlのクロロホルムで抽出する。有機相を100mlの飽和KH2PO4溶液で2回、100mlの飽和NaCl溶液で2回洗浄し、次いでNa2SO4で乾燥し、濾過しそして減圧下で濃縮する。残渣の固体化合物を、溶出液としてCH2Cl2/AcOEt/EtOH混合液(70/22/5)を使用してシリカで精製する。951.4mgの親油性ベクター(IIIa)(即ち、42.3%の収率)が、このようにして得られる。
Figure 2005527513
3)リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、2.22マイクロモルの値のペプチドに対応する(対イオンおよび該凍結乾燥物(lyophilisates)のペプチド含有量を考慮に入れる)、5つのHIVペプチド(HIV 1 HzAc;HIV 2 HzAc;HIV 3 HzAc;HIV 4 HzAcおよびHIV 5 HzAc)の各々の当質量混合物(equimassic mixture)9.6mgを使用して行った。この混合物を85μlの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターIIIa(977μg、2.52マイクロモル)を5mm直径のガラスボール(glass balls)を用いて磁気撹拌しながら714mlの2−メチル−プロパン−2−オール中に添加する(即ち、該ペプチドに対して1.14モル当量)。反応媒体の全容量(1.7ml)は、2―メチル−プロパン−2−オールを添加することによって達成される。時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。マイクロ分取実験(micro-preparative experiment)を、生成物の同定を可能にするために行う:サンプルを取り、C3カラム(Zorbax, 4.6 mm x 250 mm)においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF Voyager ABI 4192(ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間300ms、α−シアノケイ皮酸マトリックス)を備えるMALDI-TOF質量分析を使用して、それらを同定する。4時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。得られるリポペプチドについての保持時間(ret.)を、下記の表IIIに示す。
Figure 2005527513
4)リポペプチドの混合物の調製
イオン交換:
TFA塩の形態のリポペプチドを、pH3の酢酸水溶液に溶解し、RP−HPLCカラム(C4 Nucleoprep カラム, 25 mm x 100 mm)上にロードし、次いで同一の溶媒を使用して洗浄し(洗浄操作は、5カラムのそれに対して容積当量で行う)、その後、水/プロパン−2−オール(60:40)中pH3の酢酸溶媒へ移すことなく続けることによって溶出する。
最終調製:
凍結乾燥したリポペプチドの混合物を、酢酸の10%溶液へ溶解し、その後、0.22μメンブラン(SLGV, Millipore)上での滅菌濾過(sterilising filtration)を行う。
5)ワクチン用量の調製:
臨床的に許容される賦形剤(マンニトール/リポペプチド 10/1(w/w)およびポリソルベート80/リポペプチド 2/7(w/w))の導入後、溶液を水中に稀釈し、そして滅菌ガラスアンプル中にアリコートし、その後、最終の凍結乾燥を行う。
ヒトに対して第I相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル2.5mgである。
実施例2:C型肝炎ウイルス(HCV)のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量(CHV HzPAMリポペプチド)の調製
1)ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成:
それらのN末端がα−ヒドラジノアセティック基で官能化された、HCV−1ウイルスのNS3タンパク質から誘導される、3つのペプチドを調製した。これらのヒドラジノペプチドを、トリフルオロ酢酸塩の形態で固相合成した。(従来の)Fmoc/tert−ブチルストラテジー、ならびに最近記載されたプロセス[N,N’,N’−トリ(tert−ブチルオキシカルボニル)−ヒドラジノ酢酸]を、実施例1のように、N−末端位のリシルアミド残基の除去によって脱保護されたε−アミノ基へのヒドラジノアセチル基の標的化導入のために使用した。配列に依存して、合成収率は、10〜50%である。ペプチドの同定は、ES.MSによってチェックした。ヒドラジノペプチドを、24時間110℃での塩酸6N HCl:フェノール(10:1)を用いるトータル酸加水分解後、アミノ酸組成の分析に供する。
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Simatzu 6A HPLCシステムにおけるC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径12.5mmおよび250mm長、プレカラム付き)上のRP−HPLCにより精製する。RP−HPLCを用いる分析を、Simatzu 10A HPLCシステム上でのC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径4.6mmおよび250mm長)上で行った。
溶出溶媒(溶媒AおよびB)は以下の通りである:
− 溶媒A:TFA0.05%を含む脱イオン水
− 溶媒B(精製):プロパン−2−オール/H2O混合液(40:60)中TFA0.05%。
− 溶媒B(反応に続く、分析):Nプロパノール/H2O混合液(80:20)中TFA0.05%。
溶出速度は、30分間で10〜100%緩衝液Bの線形勾配、5分間の100%緩衝液B、10分間の0%緩衝液Bを使用して、1ml/minである(215nmで検出、温度:50℃)。
得られたヒドラジノペプチドを下記の表IVに示す。
Figure 2005527513
ヒドラジノペプチドについての保持時間を下記の表Vに示す。
Figure 2005527513
2)Pamベクターの合成:
パルミトイル基およびグリオキシリル基からなる、このベクターIIIaの合成は、実施例1において記載される。
3)リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、10.77マイクロモルの値のペプチドに対応する(対イオンおよび該凍結乾燥物(lyophilisates)のペプチド含有量を考慮に入れる)、3つのヒドラジノペプチドの各々の当質量混合物(equimassic mixture)41.8mgを使用して行った。この混合物を415μlの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターIIIa(4757μg、12.28マイクロモル、即ち、該ペプチドに対して1.14当量)を5mm直径のガラスボール(glass balls)を用いて磁気撹拌しながら添加し、950μlの2−メチル−プロパン−2−オール中に溶解する。反応媒体の全容量(8.290ml)は、2―メチル−プロパン−2−オールを添加することによって到達する。
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
マイクロ分取実験(micro-preparative experiment)を、生成物の同定を可能にするために行う:サンプルを取り、C3カラム(Zorbax, 4.6 mm x 250 mm)においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF質量分析(MALDI-TOF Voyager ABI 4192、ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間300ms、α−シアノケイ皮酸マトリックス)を使用して、それらを同定する。
4時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
得られるリポペプチドについての保持時間は、下記の表VIに示される保持時間を有する。
Figure 2005527513
3’)分枝グリコミメティックを有するリポペプチドの合成
この合成は、前記で得られたHCVヒドラジノペプチドと、本発明の式(IV)に従う、C−末端リシルアミド残基の除去によって脱保護されたε−アミノ基上へヒドラジノアセチル基が導入されるFmoc/tert−ブチル ストラテジーを使用して合成されたリシンツリー(lysine tree)から作製された4つの原子価(テトラキノイル化ツリー(tetraquinoylated tree))を有する分枝したグリコミメティックとの混合物に基づいて行われる。
[(Qui)4AKHdz]として公知のこのグリコミメティックの合成は、特許出願番号PCT/FR01/02787の実施例2に記載されている。
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。2.14マイクロモルのヒドラジノペプチドに対応する、3つのヒドラジノペプチドの各々の当質量混合物(equimassic mixture)8.9mgを、2.3mg(または1.6μモル)のヒドラジングリコミメティックへ添加する。140μlの水を使用しての湿潤化後に形成されるゲルへ、2−メチル−プロパン−2−オール(410μl)中の溶液中に配置された親油性ベクターIIIa(1640マイクログラム、または1.14ペプチド当量)を、多数の5mm直径のガラスボール(glass balls)を用いて磁気撹拌しながら、添加する;最終容積は2.7mlである。
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
3時間後、混合物を水中に稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
4)および4’)リポペプチドの混合物の調製
実施例1に記載されるようなイオン交換に続いて、3)および3’)で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、10%酢酸溶液へ溶解し、その後、0.22ミクロンメンブラン(SLGV, Millipore)上で滅菌濾過を行う。
5)および5’)ワクチン用量の調製
5)Mannitol−Tween(登録商標)製剤:[3リポペプチド、Pamベクター]
臨床的に許容される賦形剤(マンニトール/リポペプチド 10/1(w/w)およびポリソルベート80/リポペプチド 2/7(w/w))の導入に続いて、溶液を水中に稀釈し、そして滅菌ガラスアンプル中にアリコートし、その後、最終の凍結乾燥を行う。
5’)マンニトール−脂質化(lipidated)グリコミメティック製剤:[3リポペプチド+グリコミメティック、Pamベクター]
リポペプチドと脂質化グリコミメティック[(Qui)4AKHdz]との凍結乾燥化混合物を、酢酸の10%溶液へ溶解し、その後、0.22ミクロン(SLGV, Millipore)メンブラン上で滅菌濾過を行う。臨床的に許容される賦形剤(マンニトール/リポペプチド 10/1(w/w))の導入に続いて、溶液を滅菌フラスコ中で水に稀釈し、その後最終の凍結乾燥を行う。
ヒトに対して第I相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル2.5mgである。
実施例3:C型肝炎ウイルス(HCV)のモデルにおいてヒトで使用可能なワクチン用量(HCV HzCCholリポペプチド)の調製
1)ヒドラジノペプチドの合成
ペプチド合成
合成は、実施例2のものと同一である。
クロマトグラフィー
ヒドラジノペプチドを、Simatzu 6A HPLCシステムにおけるC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径12.5mmおよび250mm長、プレカラム付き)上でのRP−HPLCにより精製する。RP−HPLCを用いる分析を、Simatzu 10A HPLCシステムについてC3分取カラム(Zorbaxカラム:300Å、5μM、直径4.6mmおよび250mm長)上で行った。
溶出溶媒(溶媒AおよびB)は以下の通りである:
− 溶媒A:TFA0.05%を含む脱イオン水
− 溶媒B:プロパン−2−オール/H2O混合液(40:60)中TFA0.05%。
溶出速度は、30分間で0〜100%緩衝液Bの線形勾配、5分間の100%緩衝液B、10分間の0%緩衝液Bを使用して、1ml/minである(215nmで検出、温度:50℃)。
2)"水和Ccholベクター"[3−(2−オキソ−アセチルアミノ)−プロピル]
−カルバミン酸17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イル エステル)の形態でもある、Ccholベクター([3−(2,2−ジヒドロキシ−アセチルアミノ)−プロピル]−カルバミン酸17−(1,5−ジメチル−ヘキシル)−10,13−ジメチル−2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17−テトラデカヒドロ−1H−シクロペンタ[a]フェナントレン−3−イル エステルの合成
このベクターの合成は、MELNYKらにより、特許出願番号PCT/FR01/02787、実施例4:“IIIc”親油性ベクターの合成[本発明において式(II)に対応する]において記載される。
3)リポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。第一合成を、2.96マイクロモルのペプチドに対応する(対イオンおよび該凍結乾燥物(lyophilisates)のペプチド含有量を考慮に入れる)、3つのHCVペプチド(HCV 1 HzAc;HCV 2 HzAcおよびHCV 3 HzAc)の各々の当質量混合物(equimassic mixture)12.2mgを使用して行った。この混合物を115μlの水で含浸し、これはゲルの形成に導く。次いで、親油性ベクターII(1926μg、3.374マイクロモル、即ち、該ペプチドに対して1.14当量)を5mm直径のガラスボール(glass balls)を用いて磁気撹拌しながら添加し、292μlの2−メチル−プロパン−2−オール中に溶解する。反応媒体の全容量(2.3ml)は、2―メチル−プロパン−2−オールを添加することによって到達される。
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行して続く。
マイクロ分取実験(micro-preparative experiment)を、生成物の同定を可能にするために行う:サンプルを取り、C3カラム(Zorbax, 4.6 mm x 250 mm)においてRP-HPLCを使用することにより成分の分離を行い、主要なピークを回収し、MALDI-TOF質量分析(MALDI-TOF Voyager ABI 4192、ポジティブモード, 25 kV リフレクター, 抽出時間300ms、α−シアノケイ皮酸マトリックス)を使用して、それらを同定する。
4時間後、反応が完了し、次いで該混合物を水で稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
得られるリポペプチドについての保持時間は、下記の表VIIに示される。
Figure 2005527513
3’)分枝グリコミメティックを有するCCholリポペプチドの合成
ヒドラジノペプチドの均質混合物は、水または稀釈した酢酸中に各成分を個々に稀釈し、該溶液を混合し、次いで凍結乾燥することによって得られる。この合成は、該ヒドラジノペプチドを、4つの原子価を有する分枝したグリコミメティック[(Qui)4AKHdz]をヒドラジノペプチドと混合することから開始されて行われる。2.9マイクロモルのヒドラジノペプチドに対応する、3つのヒドラジノペプチド(3において記載)の各々の当質量混合物(equimassic mixture)12mgを、3.3mg(または2.2μモル)のヒドラジングリコミメティックへ添加する。200μLの水を使用しての湿潤化後に形成されるゲルへ、2−メチル−プロパン−2−オール(510μl)中の溶液中に配置された親油性ベクター(II)(3360マイクログラム、または1.14ペプチド当量)を、多数の5mm直径のガラスボール(glass balls)を用いて磁気撹拌しながら、添加する。最終容積は3.8mlである。
時間内における該ヒドラジノペプチドの消失が、対応のリポペプチドの出現と並行してモニターされる。
4時間後、混合物を水中に稀釈し、凍結し、そして凍結乾燥する。得られるリポペプチドは白色粉末形態である。
3)および3’)に従う(グリコミメティックを有するまたは有しない)CCholリポペプチドの場合、更なる精製工程が、かなりの量(quite considerable)の反応していないヒドラジン前駆体を排除するために必要とされる。
反応媒体のこの精製は、C4 Deltapak WATERSカラム(15μM、300Å、8mm直径および100mm長)を備えているShimadzu 6Aシステム上でのRP−HPLCを使用して行われる。
溶出溶媒(溶媒AおよびB)は以下の通りである:
− 溶媒A:TFA0.05%を含む脱イオン水、
− 溶媒B(精製):プロパン−2−オール/H2O混合液(40:60)中TFA0.05%。
溶出速度は、12分間で0〜80%緩衝液Bの線形勾配、次いで100%の緩衝液Bを使用して、2ml/minである。溶出されたリポペプチドフラクションを凍結し、そして凍結乾燥する。
4)および4’)リポペプチドの混合物の調製
実施例1に記載されるようなイオン交換に続いて、3)および3’)で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、10%酢酸溶液へ溶解し、その後、0.22ミクロンメンブラン(SLGV, Millipore)上で滅菌濾過を行う。
5)および5’)ワクチン用量の調製
5)マンニトール−Tween製剤:[3リポペプチド、CCholベクター]
臨床的に許容される賦形剤(マンニトール/リポペプチド 10/1(w/w)およびポリソルベート80/リポペプチド 2/7(w/w))の導入に続いて、リポペプチド溶液を滅菌フラスコ中で水で稀釈し、その後、最終の凍結乾燥を行う。
5’)マンニトール−脂質化(lipidated)グリコミメティック製剤:[3リポペプチド+グリコミメティック、CCholベクター]
臨床的に許容される賦形剤(マンニトール/リポペプチド 10/1(w/w))の導入に続いて、リポペプチドと脂質化グリコミメティック溶液を滅菌フラスコ中で水で稀釈し、その後、最終の凍結乾燥を行う。
ヒトに対して第I相臨床試験について奨励されるユニットワクチン用量は、リポペプチドカクテル2.5mgである。
実施例4:C型肝炎ウイルス(HCV)に対する免疫応答を誘発する、ワクチン能を有するリポペプチドの能力の、マウスにおける評価(前臨床試験)
A/特異的リンパ増殖応答
それらのN末端(実施例2を参照のこと)またはそれらのC末端(実施例1の合成プロトコルを参照のこと)がα−ヒドラジノアセティック基によって官能化された、HCV−1ウイルスのNS3タンパク質から誘導された、3つのペプチドを、Pamベクターによって脂質化した(lipidated)。
これらのリポペプチドの免疫原性を、同系Balb/cおよびC57bl/6マウスにおいて、3つのN末端またはC末端リポペプチドPamベクター(1マウス当たり1.2mgの該混合物、100μgのリポペプチドと同等)、または3つの天然ペプチド(1マウス当たり100μg)+モンタニドISA 720、または3つの天然ペプチドのみ(1マウス当たり100μg)の皮下注射後に分析した。
リンパ増殖(Lymphoproliferation)を、以下に記載されるように、マウス脾臓細胞の培養後に測定する:
脾臓を回収し、そしてRPMI 1640培地(GIBCO BRL)中4℃でインキュベートする。次いで、該細胞をナイロンメンブラン上で砕く。該細胞を、4℃で10分間1500rpmで遠心分離する。赤血球を、4℃で10分間、溶解緩衝溶液の存在下で溶解させる。次いで、細胞を、自己マウス血清を4%含有するHL−1培地(Biowhittaker)中で遠心分離する。次いで、細胞をポリスチレン製の96−U形状のウエル培養プレート(Costar)中に、、1ウエル当たり100μlの量で、分配する。天然合成ペプチド(Neosystem)をHL−1培地(Biowhittaker)中に稀釈し、次いで、1ウエル当たり100μlの量で添加して、25μg/mlの最終濃度を得る。
培養プレートを、湿った雰囲気および5%のCO2下、37℃で72時間インキュベートする。トリチウム化メチル−チミジン(Amersham)をHL−1培地(Amersham)中に稀釈し、次いで25μl中1μCurieの割合で、各ウエルへ添加する。16時間のインキュベーション後、細胞を、TOMTECシステムを備えるガラスファイバーフィルター(Wallac)上において回収する。次いで、トリチウム化チミジンの取り込み(incorpoaration)を、ベータカウンター(Wallac 140 microbeta counter)を使用して測定する。
この分析の結果を下記の表VIIIに示す。
Figure 2005527513
Figure 2005527513
これらの分析結果は、同系Balb/cおよびC57bl/6マウスに皮下注射された両方の構築タイプ(N末端位およびC末端位)が、HCVペプチド配列−特異的リンパ増殖応答を誘発し得るを示す。
B/液性応答
A/において使用したN末端位での3つのリポペプチドは、マウスにおいて液性応答を誘発するためにアッセイした。3つの天然ペプチドおよびモンタニド ISA 720(montanide ISA 720)もまたコントロールとしてアッセイした。
マウスを、1.2mg(100μgと同等のPamベクターリポペプチド+マンニトール+Tween、あるいはモンタニド(montanide)の存在下での天然ペプチドの混合物100μg)の皮下投与によって免疫化した。免疫化続いての第15日および第29日でのリコール(recall)を行った。血清を、第1回の抗原投与後、第14、28および42日でサンプリングした。
抗原特異的免疫グロブリンの定量分析を以下のように行った:
ペプチド抗原を、10μg/mlの濃度で、0.1Mリン酸緩衝液(pH8.2)中に溶解させる。1ウエル当たりこの溶液100μlを、96ウエルMaxisorb(NUNC)培養プレート中に添加する。4℃で一晩インキュベーションしそしてPBS−0.01%Tween緩衝液において2回洗浄した後、ウエルを、ウシ血清アルブミン(BSA)を3%含有するPBS緩衝液の存在下で飽和する。室温で2時間インキュベートした後、ウエルを、PBS−Tween緩衝液中で洗浄した(wash out)。次いで、1/100に稀釈した血清100μlを添加して4℃で一晩インキュベートした。PBS−Tween中で3回洗浄を行う。ペルオキシダーゼで標識された二次抗体(マウス抗IgG(H+L)、Sanofi Pasteur)を、室温で1時間、1ウエル当たり100μlの割合で、PBS−BSA 1%緩衝液中でインキュベートする。PBS−tween中で4回洗浄後、反応を、曝露緩衝液(revelation buffer)(過ホウ酸ナトリウムを含むリン酸−クエン酸緩衝液、SIGMA)中に稀釈されたオルトフェニルジアミンジヒドロクロリド(OPD, SIGMA)の存在下に曝露する。暗所中での30分間インキュベーション後、反応を、1ウエル当たり50μlの割合で1M HCLの存在下で停止させる。読み取り(reading)を、492nmの波長で行う。結果を下記の表IX中に示す。
Figure 2005527513
使用したリポペプチドは、2つのリコール(recalls)によって続けられる免疫化を続ける、これら同一のマウスモデル中での特異的抗体の産生によって特徴付けられる液性応答を誘発し得ないことを示す。この結果は、これら同一配列が、油性アジュバント(例えば、モンタニド ISA 720n)の存在下で投与される場合に、非常に重要な抗体応答(これは、第1免疫化(first immunisation)からである場合に検出可能である)を誘発するという点で、なおいっそう新規である。この結果は、リポペプチドが、細胞性タイプの応答の方向において非常に明確に免疫に向けられていることを示す。
C/PamおよびCCholベクターの比較
リポペプチドの混合物の免疫原性を、マウスにおいて評価した。上記実施例2および3に示される異なる製剤(3リポペプチド、Pamベクター;3リポペプチド+グリコミメティック、Pamベクター;3リポペプチド、CCholベクター;3リポペプチド+グリコミメティック、CCholベクター)をアッセイした。
1)舌下免疫化プロトコル
注射可能な調製物(H22 ppi)のために5μlの水に溶解させた各脂質混合物480μgを用いて、マウスを舌下免疫化する。リコールを、以前と同一条件下で、第1免疫化後第14日に行う。14日後、動物を殺し、脾臓を回収し、そして脾臓細胞を、10μg/mlの濃度で、異なる天然ペプチド(単独または混合)の存在下で培養する。
2)培養上清中に産生されるインターロイキン−2(IL−2)の定量分析
マウスIL−2特異的一次抗体(ラット抗−マウスIL−2、Pharmingen 18161D)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH6.2)中そして2μg/mlの濃度でインキュベートする。1ウエル当たり50μlのこの溶液を、Maxisorb(NUNC)96−ウエル培養プレートへ添加する。4℃で一晩インキュベートしそして洗浄をPBS−0.01%Tween緩衝液中2回行った後、該ウエルを、ウシ血清アルブミン(BSA)を3%含有するPBS緩衝液の存在下で飽和する。室温で2時間インキュベーション後、2回洗浄を、PBS−Tween緩衝液中で行う。次いで、100μlの培養上清を添加し、そして4℃で一晩インキュベートする。組換えマウスIL−2稀釈範囲を、PBS−1%BSA(20ng〜0.3pg)中で調製し、そしてこの調製物100μlを各ウエルに配置する。次いで、PBS−Tween中で3回洗浄を行う。
マウスIL−2特異的ビオチン化二次抗体(ビオチンラット抗−マウスIL−2、Pharmingen 18172D)を、室温で1時間、1ウエル当たり100μlの割合で、PBS−1%BSA緩衝液中においてインキュベートする。PBS−Tween中で3回洗浄後、PBS−Tween中に1mg/mlまで稀釈されたストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(Jackson Immunoresearch)を、室温で30分間、100μlの容積で各ウエルへ添加する。PBS−Tween中で4回洗浄後、反応を、曝露緩衝液(revelation buffer)(過ホウ酸ナトリウムを含むリン酸−クエン酸緩衝液、SIGMA)中に稀釈されたオルトフェニルジアミンジヒドロクロリド(OPD, SIGMA)の存在下に曝露する。暗所中での30分間インキュベーション後、反応を、1ウエル当たり50μlの割合で1M HCLの存在下で停止させる。読み取り(reading)を、492nmの波長で行う。
3)別の舌下免疫化プロトコル
マウス(Balb/c)を、5μlのリポペプチド混合物(約40μgのリポペプチドと等価の480μgの粉末)の舌下投与によって免疫化した。リコールを、同量のリポペプチド混合物で、この第1免疫化後第14日に行う。5 Balb/cマウス(IFFA-CREDO)のグループを、4つの製剤:[3リポペプチド+グリコミメティック、CCholベクター];[3リポペプチド、CCholベクター];[3リポペプチド+グリコミメティック、Pamベクター];[3リポペプチド+グリコミメティック、Pamベクター]の各々について形成させた。
リコール後第7日に、マウスを殺し、脾臓を回収し、そして動物の各群に従ってグループ化する。各グループのマウスの細胞を、個々にまたは混合物で開始して異なる天然ペプチド(濃度10μg/ml)を使用して再刺激する。細胞培養後24時間に、上清を回収して、それらのIL−2含有率を定量する。結果を、上清1ml当たりのIL−2のピコグラムで示す。
下記の表Xは、マウスにおける異なるリポペプチド混合物についての免疫原性分析を示す。
Figure 2005527513
得られた結果は、CCholベクターによる脂質化(lipidation)から得られるリポペプチドは、Pamベクターによる脂質化から得られるリポペプチドよりも良好な応答を誘発することを示す。
これらのCCholリポペプチドは、それらが粘膜に(mucosally)、そして特には舌下に投与される場合、特に免疫原性であると判る。
実施例5:サル免疫不全ウイルス(SIV)に対するCTLタイプ応答を誘発するリポペプチドワクチンの能力の、マカク(Macaque)における評価
1)ヒドラジノペプチドの合成
特許出願PCT/FR01/02787の実施例1は、サル免疫不全ウイルス(SIV)のNefおよびGag蛋白質から誘導されるペプチド配列からの、α−ヒドラジノアセティック基によって官能化されたペプチドの合成を記載している。
ここで使用されるペプチド配列は、SIV1配列(下記の表XIの新規の配列を参照のこと)以外は、特許出願PCT/FR01/02787に記載されるものと同一である。
Figure 2005527513
*特許出願番号PCT/FR01/02787に記載されるSIV 1配列と比較して、ここに示されるSIV 1’配列は、110位および112位に2つの突然変異を含む)。
2)親油性ベクターの合成
親油性ベクターは、実施例1に記載のベクターIIIaである。
3)リポペプチドの合成
特許出願PCT/FR01/02787の実施例8は、ヒドラジノペプチドおよび親油性ベクターをカップリングするための方法を記載している。
このように合成されるリポペプチドの名称および分子量は、以下の表XIIに与えられる:
Figure 2005527513
4)リポペプチドの混合物の調製
RP−HPLCを使用し、そして短い勾配(short gradient)を使用して、実施例1に記載されるようなイオン交換に続いて、3)で得られた凍結乾燥化リポペプチドの混合物を、5%酢酸溶液へ溶解し、その後、0.22ミクロンメンブラン(SLGV, Millipore)上で滅菌濾過を行う。
5)ワクチン用量(doses)の調製
マンニトール−Tween製剤:
工程4)後、マンニトール、ならびに10単位用量の調製のために十分な量のTween80を導入し、この用量当たりの組成は以下の通りである:
・1用量は、3.5mgペプチド当量(1ペプチド当たり0.5mg)、または約4.2mgのリポペプチドを示す。
・アピロジェニックマンニトール(apyrogenic mannitol):1用量当たり約42mg。
・ポリソルベート80:1用量当たり約1mg
・1用量当たりの粉末の総量:約47mg
・−20℃で保存。
得られる用量を、溶液中のこの製剤で置換することによって、僅かに乳白光を発する溶液が得られる。
脂質化したマンニトール−グリコミメティック製剤
混合物は、ヒドラジノペプチド(トリフルオロアセテート)(1ヒドラジノペプチド当たり5.8mg)の混合物の同時脂質化(simultaneous lipidation)(実施例3、パート3’)におけるように)によって調製され、ここへ、分枝したグリコミメティック([(Qui)4AKHdz])、12.9mg)を添加する。
脂質化後、混合物を稀釈し、次いで凍結乾燥させた。トリフルオロアセテート対イオンを、短い勾配を使用して、RP−HPLCによって、アセテート対イオンで置換した。
凍結乾燥後、粉末を水および5%酢酸中に溶解し、その後、該調製物を0.22μメンブラン(SLGV, Millipore)上での滅菌濾過に供する。マンニトールを、11単位用量の調製物に十分な量で導入し、この調製物の1用量当たりの組成は以下の通りである:
・1用量は、3.4mgペプチド当量+グリコミメティック(1ペプチド当たり0.5mg)または約4.2mgのリポペプチドを示す
・アピロジェニックマンニトール(apyrogenic mannitol):1用量当たり約42mg。
・1用量当たりの粉末の総量:約47mg
・−20℃で保存。
得られる用量を、溶液中のこの製剤で置換することによって、僅かに乳白光を発する溶液が得られる。
7)マンニトールTween製剤のマカクにおける研究
1単位用量(unit dose)は、1動物当たり使用され、そして注射によって投与される。該用量は、注射可能な調製物の場合、水中に稀釈され(1用量当たり1ml)、乳白光を発する溶液が得られる。
生成物(添加剤無し)を、10ポイントの注射(1ポイント当たり100μl)で皮内(4マカク)、筋内(4マカク)投与した。3週間隔で3回注射を行い、そして最後の注射後2ヶ月にリコールを投与した。プレ免疫化の間、第3免疫化後15日およびリコール後14日に採取した血液サンプルにおいて、免疫応答をアッセイした。
該ペプチドによる全ての血液単核細胞(PBMC、末梢血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells))の前もってのインビトロ再刺激に続いて、ガンマインターフェロン(γ−IFN)を分泌する循環しているエフェクター(effectors)およびそれらの前駆体の数を、ELISPOTアッセイを使用して評価することにより、免疫化効率をアッセイした。
PBMCの調製:
PBMCを、リンパ球分離培地(lymphocyte separation medium)(Flow Laboratories, Glasgow, UK or Pharmacia, Uppsala, Suede)上の勾配における遠心分離によって単離し、そして直ちに使用する。
インビトロにおける再刺激:
PBMC(16.106細胞)を、5百万/mlで完全RPMI 1640培地に配置し、そして4百万細胞の4チューブにアリコートし、これを、リポペプチド(10μg/ml)と共に37℃で一晩インキュベートする。
いくつかの細胞系を作製する:
系0:ペプチド無し;
系1:SIV1 HzPam (LP1)およびSIV2 HzPam (LP2)有り;
系2:SIV3 HzPam (LP3)、SIV4 HzPam (LP4)およびSIV5 HzPam (LP5)有り;
系3:SIV6 HzPam (LP6)およびSIV 7HzPam (LP7)有り。
次の日に1回洗浄後、細胞系を、1ml当たり2百万細胞の割合および1ウエル当たり2mlの割合で、24ウエル培養プレートに配置する。第3および7日に、インターロイキン2(IL−2、10UI/mL)を、第7日での培地の交換と共に、添加する。これらのエフェクターを、培養の第12日後にアッセイし、そしてアッセイの直前に2回洗浄した。
ELISPOT−IFN−アッセイ:
ニトロセルロースの96ウエル培養プレート(Millipore)を、先ず、マウス抗サルIFN−γモノクローナル抗体(mabtech clone GZ-4)と共に4℃で一晩感作する(リン酸緩衝溶液中1/1000稀釈:最終段階で、濃度1マイクログラム/ml)。滅菌PBS緩衝溶液での洗浄およびCO2雰囲気下37℃での2時間の完全培地による飽和後、1ml当たり5マイクログラムの最終濃度で、異なるペプチド有り(以下の段落を参照のこと)、IL−2無しで、(または、ネガティブコントロールの場合はペプチド無しで)、エフェクター細胞を二重で配置する(1ウエル当たり100000細胞)。インキュベーションを37℃で24時間維持する。次いで、培養プレートを、PBSで、次いでPBS−0.05%Tweenで数回洗浄する。この洗浄後、培養プレートを、PBS−0.05%Tween、1%BSA(mabtech clone 7-B6-1, 1マイクログラム/ml、最終段階)中で1/1000まで稀釈したビオチン化マウス抗サルγ−IFNモノクローナル抗体と共に、4℃で一晩または37℃で2時間インキュベートする。
数回の洗浄後、反応を、1ml当たり2.5マイクログラムの割合で、アルカリ性エクストラアビジン−ホスフェート(Extravidine-phosphatase)(SIGMA)によって曝露する(インキュベーション 室温で1時間)。追加洗浄後、測定可能な着色(colouration)を、15〜30分間、ニトロブルーテトラゾリウムサブストレート(BioRad)を用いて発色する。次いで、培養プレートを水でリンスし、そして乾燥する。アッセイの読み取りを、×40実体顕微鏡(Leica MZ6)を使用してスポット(コントラストのついた中心および拡散したアウトライン)をカウントすることによって行う。各々の紫色のスポットは、γ−IFNを分泌する細胞、即ちSFC(スポット形成細胞(Spot Forming Cell))に対応する。
ELISPOTアッセイのために使用する小さいペプチドの混合物:
(9〜15マーの混合物):
L3.P1 (nef 155-178のエピトープ) = 156-165 ; 168-177; 165-174
L3.P2 (nef 155-178のエピトープ) = 157-165 ; 169-178 ; 166-174
L3.P3 (nef 155-178のエピトープ) = 158-167 ; 162-171 ; 167-175
L4.P1 (nef 201-225のエピトープ) = 201-211 ; 205-213 ; 211-219 ; 215-225
L4.P2 (nef 201-225のエピトープ) = 201-210 ; 205-212 ; 214-223 ; 210-219
L4.P3 (nef 201-225のエピトープ) = 203-211 ; 206-215 ; 215-223 ; 204-212
L5.P1 (nef 221-247のエピトープ) = 222-229 ; 236-244 ; 225-233
L5.P2 (nef 221-247のエピトープ) = 224-233 ; 239-247.
Mix6 (nef 201-225のエピトープ) = 201-211 ; 205-213 ; 211-219 ; 215-225 ; 201-210 ; 205-212
L7P1 (gag 246-281のエピトープ) = 250-257 ; 255-263 ; 261-269 ; 268-276 ; 253-262。
8)結果:
以下の表XIIIは、各動物について、第3免疫化後15日またはリコール後14日に有意な様式でSFCを検出することを可能にしたペプチド混合物を示す:
Figure 2005527513
第1グループ(マカク1053, 1059, 1060, 1066)は、皮内投与された7リポペプチドの混合物を受容した。結果は2マカク(1053および1066)において陽性応答を示し、これらは小さなペプチド各々の1プール(pool)を認識する。これらの応答は、最後の免疫化後15日に見ることができる。第2グループ(マカク1051, 1062, 1068, 1077)は、筋内投与された7リポペプチドの混合物を受容した。4マカクのうち3つが小さなペプチドの1プールに対してCD8応答を示し(2マカク、1051および1062)、第3番目は3プールに対して向けられた応答を有した(マカク1077)。これらの応答は、マカク1051および1062の場合には最後の免疫化後15日に、そしてマカク1051, 1062および1077の場合にはリコール後15日に見ることが出来た。動物1051から得られた細胞系2で得られた詳細な結果は、図1に示される。

Claims (27)

  1. ワクチンの製造のための、少なくともリポペプチドを含む混合物の使用であって、前記リポペプチドは、非ペプチド性質の少なくとも1つの親油性ベクターへヒドラゾン結合によって連結されたペプチド化合物によって構成されており、そして以下の一般式(I):
    [((R1)(R2i)D−H]j−P (I)
    [式中、
    (R1)(R2iDは該親油性ベクターを示し、ここで:
    − iは0または1を示し、
    − iが0に等しい場合、Dは結合を示し、
    − iが1に等しい場合、Dは、飽和、不飽和または芳香族の、単または多環式ヘテロ環を示し、
    − R1およびR2は、同一であるかまたは異なり得、各々、式L−f−E−f’(式中、Lは脂質の残基を示し、Eはスペーサーを示し、そしてfおよびf’は、各々、LとE並びにEとDを連結する官能基を示す)を有する基を示し、そして
    − Pは、該ペプチド化合物を示し、
    − Hは、該親油性ベクターによって保有されるアルデヒド官能基と該ペプチド化合物によって保有されるヒドラジン誘導体官能基との間での溶液中における連結によって形成される該ヒドラゾン結合を示し、
    − jは、1〜3を示す]
    を有することを特徴とする、使用。
  2. iが0に等しく、jが1に等しく、そしてLが、ステロール、ステロール誘導体、あるいは4〜30炭素原子を含む飽和または不飽和の、直鎖または分枝鎖の炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項1に記載の使用。
  3. 前記ステロール誘導体がコレステロール誘導体であり、そして前記炭素鎖が式CH3−(CH214−に対応することを特徴とする、請求項2に記載の使用。
  4. Eが、1〜18の炭素原子ならびに適用可能な場合は1〜16のヘテロ原子および/またはカルボニル基、ヘテロ環、ヘテロアリール、炭素環およびアリールから選択される1〜7の基を含む、直鎖、分枝鎖または環式の、飽和または不飽和の炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
  5. fが−CO−NH−または−CO−O−結合を示し、そしてf’が−NH−CO−または−O−CO−結合を示すことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
  6. 前記親油性ベクターが式(II):
    Figure 2005527513
    に対応することを特徴とする、請求項5に記載の使用。
  7. 前記親油性ベクターが式(III):
    Figure 2005527513
    [式中、Lは、請求項1〜3のいずれか1項に定義される通りである]
    に対応することを特徴とする、請求項5に記載の使用。
  8. 式(III)において、Lが式CH3−(CH214−を有する炭素鎖を示すことを特徴とする、請求項7に記載の使用。
  9. 該ペプチド化合物Pが、1またはそれ以上のペプチド抗原および1またはそれ以上のペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックによって形成される群から選択されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用。
  10. 該ペプチド抗原が、ペプチドならびにグリコペプチドおよびシュードペプチドを含むペプチド誘導体によって形成される群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の使用。
  11. 前記ペプチド性質のデンドリマー性のグリコミメティックが、以下の一般式(IV):
    (B2M)m(XN)nA (IV)
    に対応し、
    式中:
    − B2は、以下の1またはそれ以上の一般式(a)または(b):
    Figure 2005527513
    [式中、R1、R2、R3およびR4は、互いに独立して、水素原子または保護基を示し、そしてWは、結合、あるいは1〜18の炭素原子ならびに場合によっては酸素、硫黄および窒素から選択される1〜12の原子を含む、直鎖、分枝鎖または環状の、飽和または不飽和の炭素鎖(該炭素鎖は、場合によっては1〜16のハロゲン原子によって置換されている)を示す]に対応し、
    − Xは、1〜6のアミノ酸を含む、X’オリゴペプチドの残部を示し、
    − Aは、リシン、ヒドロキシリシン、セリン、スレオニン、システイン、オルニチン、アスパラギン酸およびグルタミン酸によって形成される群から選択される、同じかまたは異なるアミノ酸の鎖を含む、少なくも三官能性のA’化合物の残部を示し、
    − mは、1〜32の整数であり、
    − nは、0〜32の整数であり、そして、
    MおよびNは、各々、それぞれ、B2とAとの間(n=0の場合)またはB2とXとの間(nが0とは異なる場合)、そしてXとAとの間(nが0とは異なる場合)の連結基を示し、そして、互いに独立して、オキシム、ヒドラゾン、アミド、エステル、チオエステル、ヒドラジド、ヒドロキサメート、エーテル、チオエーテル、アミン、カーボネート、カルバメート、チオカーボネート、チオカルバメート、ウレア、チオウレアおよびチアゾリジン官能基から選択される官能基を含むことを特徴とする、請求項9に記載の使用。
  12. 一般式(IV)を有する化合物が、mが4〜16の整数であり、nが2〜8の整数であり、Xが2〜4のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドの残部を示し、そしてAが2〜8のリシン残基を含みかつデンドリマーの形態をとる鎖の残部であり、そしてB2が(−)−シキミ酸および(−)−キナ酸から選択される1またはそれ以上のコンポーネントの残部を示すようなものであることを特徴とする、請求項11に記載の使用。
  13. 前記リポペプチドの混合物が、1〜20の異なるリポペプチド、好ましくは1〜10の異なるリポペプチドを含むことを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用。
  14. 該リポペプチドが複合ミセル(composite micelles)の形態であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
  15. 該ペプチド化合物が、感染因子(infectious agent)または癌から誘導される抗原によって構成されていることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用。
  16. 該感染因子が、細菌、寄生生物またはウイルスタイプのものであることを特徴とする、請求項15に記載の使用。
  17. 該ウイルスタイプの感染因子がHIVウイルスまたはHCVウイルスであることを特徴とする、請求項16に記載の使用。
  18. 該ペプチド化合物が、HIVウイルスのGag、PolまたはNef蛋白質由来の配列であることを特徴とする、請求項17に記載の使用。
  19. 該リポペプチドの混合物が、HIVウイルスのGag、PolまたはNef蛋白質由来の少なくとも2つの配列を含有することを特徴とする、請求項18に記載の使用。
  20. 該リポペプチドの混合物が、ペプチドが以下の配列:
    − Gag 17−35
    − Gag 253−284
    − Pol 325−355
    − Nef 66−97 および
    − Nef 116−147
    を有するリポペプチドの混合物を含むことを特徴とする、請求項19に記載の使用。
  21. 該ワクチンが、経粘膜、経皮または筋肉内投与用に処方されることを特徴とする、前記請求項のいずれか1項に記載の使用。
  22. 該混合物が、更に、1またはそれ以上の臨床的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする、請求項21に記載の使用。
  23. 該賦形剤が、マンニトールまたはポリソルベート80、あるいはこれら2つの混合物であることを特徴とする、請求項22に記載の使用。
  24. 該感染因子HCVのペプチド化合物Pが、以下のペプチド配列:
    − HCV 1 HzAc:
    H-K(COCH2NHNH2)GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
    − HCV 2 HzAc:
    H-K(COCH2NHNH2)GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
    − HCV 3 HzAc:
    H-K(COCH2NHNH2)GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2
    によって構成されていることを特徴とする、請求項17に記載の使用。
  25. NS3 1007−1037と名付けられた以下の配列:
    H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
    を含むHCVウイルスの天然ペプチド配列。
  26. NS3 1174−1195と名付けられた以下の配列:
    H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
    を含むHCVウイルスの天然ペプチド配列。
  27. NS3 1524−1553と名付けられた以下の配列:
    H-KGAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2
    を含むHCVウイルスの天然ペプチド配列。

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