JP7235785B2 - B型肝炎ウイルスに対するワクチン - Google Patents
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Description
配列番号1~38及び配列番号40~72は、以下の表1に示されているHBVポリメラーゼの配列番号39に示されている参照HBV配列の領域のアミノ酸配列である。
本発明は、集団カバレッジ及びHBV遺伝子型カバレッジに関して広範な適用性がある、多エピトープの(multiepitopic)CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞免疫応答を誘発できる、広範な免疫原性を有するペプチド配列を含む組成物を提供する。本発明は、長さが15~60アミノ酸の少なくとも1種のペプチドを含む医薬組成物であって、前記ペプチドが、HBVポリメラーゼの末端ドメイン、HBVポリメラーゼの逆転写酵素ドメイン、HBVポリメラーゼのRNaseHドメイン配列又はHBVコアタンパク質、の少なくとも15個の連続したアミノ酸の断片を含む、医薬組成物を提供する。ペプチドは、長さが15~60アミノ酸であり、配列番号1~4に示されている配列のうちの1つの少なくとも15個の連続したアミノ酸の配列を含むペプチドから選択される。ペプチドは、少なくとも1つのCD8+ T細胞エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+ T細胞エピトープを含む。ペプチドは、in vitroアッセイにおいて、慢性HBV感染症の少なくとも1個体由来の末梢血単核細胞(PBMC)において応答を誘発する。
本発明の組成物は、配列番号1~4のうちの1つからの少なくとも15個の連続したアミノ酸、例えば、少なくとも20、25、29、30、31、32、33、34又は35アミノ酸を含む1種以上のペプチドを含んでよい。配列番号1、2及び3はHBVポリメラーゼ配列である。配列番号4はHBVコアタンパク質配列である。
本発明の組成物は、多数のペプチドを含んでよい。したがって、組成物は、少なくとも2種、例えば、少なくとも3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種又はそれ以上のペプチドを含んでよく、それぞれが、上記の通り配列番号1~4のうちの1つの少なくとも15個の連続したアミノ酸の配列を含む。組成物は、上記の通り配列番号55の少なくとも15個の連続したアミノ酸の配列を含むペプチドをさらに含んでよい。
組成物中のペプチド配列の組合せにより、多数のHBV遺伝子型に存在するエピトープ、好ましくはCD8+エピトープとCD4+エピトープの両方がもたらされる。HBV遺伝子型としては、遺伝子型A、B、C、D、E及びFが挙げられる。例えば、長いペプチドは、少なくとも2つのHBV遺伝子型、例えばA及びD(ヨーロッパにおいて最も大きく蔓延している遺伝子型)又はB及びC(アジアにおいて最も大きく蔓延している遺伝子型)などに由来するエピトープを含んでよい。組成物は、少なくとも3種のHBV遺伝子型、例えば、A、B及びC、A、B及びD、A、C及びD、又はB、C及びDなどに由来するエピトープを含むことがより好ましい。組成物は、少なくともHBV遺伝子型A、B、C及びDに由来するエピトープを含むことが最も好ましい。遺伝子型A、B、C及びDのうちの1種以上の任意の組合せに由来するエピトープの任意の組合せを含むことに加えて、組成物は、遺伝子型E、F及び/又はGに対するエピトープを含んでよい。これは、任意の適切な手段によって、例えば、本明細書に記載のin vitro PBMCアッセイを使用することによって決定することができる。
(i)配列番号14、15、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号14、17、18、21又は67の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(iii)配列番号14、16、60、19、20又は22の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び
(iv)配列番号14、15、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド。
(i)配列番号20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号17又は18の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(iii)配列番号16、60又は19の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び
(iv)配列番号14又は15の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド。
本発明は、少なくとも2種、例えば、3種又はそれ以上の異なる民族性の個体において免疫応答を誘発できる組成物を提供する。これは、実施例に記載のin vitro PBMCアッセイを使用して評価することができる。本発明の組成物は、HBVに感染しているアジア人若しくはインド人の個体、HBVに感染している白人の個体、及びHBVに感染しているアフリカ人若しくはアラブ人の個体のうちの2個体、3個体又は全個体由来のPBMCにおいて免疫応答を誘発でき得るものである。
(i)配列番号14、16、60、17、18、20、21、67又は22の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号14、15、19、20、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び
(iii)配列番号14、15、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド。
(i)配列番号16、60、17、18の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号14、15又は19の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び (iii)配列番号14、15、20、21、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド。
HLAクラスI分子及びHLAクラスII分子は多型的であり、それらの頻度は民族グループの間で変動する。多型の大部分はペプチド結合性領域内に位置し、その結果として、各バリアントは独特のペプチドリガンドのレパートリーに結合すると考えられている。HLA多型は示差的なペプチド結合の基礎をなすので、HLA多型はワクチン設計者にとっての主要な問題を表す。さらに、特定のHLA対立遺伝子は、異なる民族性において劇的に異なる頻度で発現される。
フルオロカーボンは、ペルフルオロカーボン又は混合フルオロカーボン/炭化水素基に由来する1つ以上の鎖を含んでよく、飽和型であっても不飽和型であってもよく、各鎖が3~30個の炭素原子を有する。したがって、フルオロカーボン結合における鎖は、典型的には、飽和型又は不飽和型であり、飽和型であることが好ましい。フルオロカーボン結合における鎖は、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、直鎖状であることが好ましい。各鎖は、典型的には、3~30個の炭素原子、5~25個の炭素原子、又は8~20個の炭素原子を有する。フルオロカーボンベクターとペプチドを共有結合により連結するために、反応性基又はリガンド、例えば、-CO-、-NH-、S、O又は任意の他の適切な基をベクター内に含める。共有結合による連結を実現するための、そのようなリガンドの使用は当技術分野において周知である。反応性基は、フルオロカーボンベクター上の任意の位置に位置してよい。
本発明は、本発明の組成物に有用なペプチドも提供する。ペプチドは、上記のペプチドのうちのいずれか1つであってもよい。特に、本発明は、配列番号24~33及び配列番号221に示されている配列のうちの1つ、又は配列番号24~33及び配列番号221に示されている配列のうちの1つと少なくとも80%同一、例えば、少なくとも85%、90%、95%又は98%同一である配列を含む、長さが40アミノ酸、50アミノ酸又は60アミノ酸までのペプチドを提供する。ペプチドは、上記の通り追加的なアミノ酸を含んでよい。特定の一実施形態では、本発明は、配列番号34~38及び配列番号222のうちの1つに示されている配列を有するペプチドを提供する。本発明の特に好ましいペプチドは、配列番号24、25、28、30、31、32、33、34、36、37及び38に示されている配列を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
本発明の組成物は、追加的な免疫原を含んでよい。免疫原は、B細胞抗原であってよい。B細胞抗原は、HBVに対する抗体応答を刺激するために役立ち得る。本発明の医薬組成物は、例えば、T細胞応答を刺激することができる、フルオロカーボンと連結した1種以上のペプチドと、B細胞抗原とを含んでよい。
本発明の医薬組成物は、医薬製品の製剤化の第1のステップとして、フルオロカーボンと連結したペプチドなどの少なくとも1種のペプチドを酢酸又は他の溶媒中に可溶化することによって調製することができる。フルオロカーボンと連結したペプチドの1つ以上をブレンド中に分散させるために使用し得る他の溶媒の例としては、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、プロパン-2-オール、tert-ブタノール、アセトン及び他の有機溶媒が挙げられる。フルオロカーボンベクター-ペプチドコンジュゲートを可溶化するための手法は、WO2012/090002に記載されている。
本発明は、療法によるヒト又は動物の体の治療において使用するための本発明の組成物を提供する。特に、HBV感染症を治療又は予防する方法において使用するための本発明の組成物が提供される。本発明の組成物は、HBV予防法においても有用であり得る免疫応答を誘発する。本発明の組成物は、HBVに感染している個体を治療するための治療用ワクチンとして使用するために好ましい。本発明の組成物は、持続性慢性HBV感染症の患者の治療において特に有用であるが、免疫寛容性患者又は非活動性慢性キャリアを治療するためにも使用することができる。
ヒトPBMCにおける、HBV由来の短いペプチドプールのex vivoにおける免疫原性の評価
方法及び材料
集団
HBV感染症の被験体
慢性HBV感染症であると臨床的に定義された99人の被験体を、Imperial Healthcare NHS Trust、Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust、及びBarts and the London NHS Trust in Londonにおける、RECにより承認されたプロトコールに登録した。全ての被験体から書面でのインフォームドコンセントを得た後、新鮮な静脈血を採取し、PBMC及び血漿を単離し、血液採取の18時間以内に凍結保存した。これらの被験体は以下の基準に合致した:全体的な健康状態が良好であること、HBVに特異的な治療:抗ウイルスヌクレオシド(ヌクレオチド)類似体阻害剤及び/又はインターフェロン療法(臨床的に示された場合)、臨床的状態(慢性HBV感染症、HBeAg陰性、並びにALTの正常な、持続的若しくは断続的な上昇)、HIV陰性、HCV陰性及びHDV陰性。
17人の被験体由来の凍結保存されたPBMCをCTL Technologiesから得た。これらの被験体は以下の基準に合致した:全体的な健康状態が良好であること、HBVに対するワクチン接種を受けていないこと、HBV表面抗原陰性、HBVコア抗体陰性、HIV陰性及びHCV陰性。
各被験体由来のPBMCのバイアル1つ(細胞1×107個を含有する)を解凍し、Scepter(商標)手持ち型自動細胞計数器を使用してリンパ球数を決定した。PBMCを、24ウェルの細胞培養プレートにおいて、2mLの培養培地(CM: 5%ヒトAB血清を補充したRPMI-1640 Glutamax)中、1mL当たり細胞1×106個の濃度で合計11日間培養した。細胞を、長さが15~20アミノ酸にわたり、10~13アミノ酸が重複している重複したHBV由来の短いペプチド144種(配列番号73~210及び配列番号214~219)を含有するペプチドプールを1mL当たりペプチド当たり0.1μgの最終濃度で用いて刺激した。4日目に、IL-2及びIL-15を、培養物にそれぞれ最終濃度10 IU/mL及び10ng/mLまで加えた。10日目に、細胞をCM中で2回洗浄し、10 IU/mLのIL-2と一緒にさらに1日培養した。11日目に、細胞をCM中で2回洗浄し、計数し、ヒトIFNγ ELISpotアッセイ又は細胞内サイトカイン染色に組み込んだ。
96ウェルマルチスクリーンPVDFフィルタープレート(Millipore)を、100μl(1:80)の抗ヒトIFNγ捕捉mAb(R&D Systems)を用いて4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、1% BSA及び5%スクロースを補充したPBSを用いて4℃で2時間ブロッキングした。細胞を、3連のウェルに、ウェル当たりPBMC 5×104個でプレーティングした。使用した最終的な抗原の濃度は、HBV由来の短いペプチドプール22種(以下を参照されたい、配列番号212及び213のペプチドとして調製することができなかったプール22は不溶性のために分散できなかった)及びHIV-3 35mer陰性ペプチド対照: 1mL当たりペプチド当たり5μg、PHA陽性対照: 1μg/mLであった。ELISpotプレートを、加湿した環境下、5% CO2、37℃で18時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、100μl(1:80)のビオチン化抗ヒトIFNγ検出用mAb(R&D Systems)と一緒に室温で2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、製造者(R&D Systems)の説明書に従って、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ(1:80)と一緒に1時間、その後、基質と一緒に(30分)インキュベートした。発生したスポットを、自動プレート計数システム(CTL Europe)を使用して計数した。
細胞を、96ウェル丸底プレートにウェル当たりPBMC 5×105個でプレーティングし、HBV由来のペプチドプール、最終濃度1mL当たりペプチド当たり5μgによって刺激した。プレートを、5% CO2のインキュベーター中、37℃で20時間インキュベートした。アッセイの最後の3時間については、PMA/イオノマイシンをそれぞれのウェルに加え、ゴルジプラグ(Golgi plug)を全てのウェルに加えた。細胞を回収し、PBS+0.1% BSA(洗浄緩衝液)で洗浄し、抗CD3、抗CD4及び抗CD8(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。さらに洗浄した後、細胞を固定し、BD Cytofix/Cytoperm溶液100μLを用いて4℃で20分透過処理し、その後、1×BD Perm/Wash溶液で2回洗浄した。最後に、細胞を、抗IL-2-FITC、抗IFNγ-PE及び抗TNFα PerCP-Cy5.5(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。試料をFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得した。ゲーティングは、各被験体についての培地で刺激した試料に基づいた。
HBV遺伝子型決定のために、ネステッドPCR法、その後に直接ヌクレオチド配列決定を最初に使用した。しかし、大多数の試料由来の血漿中のウイルス負荷量が低いことに起因して、この方法を使用してHBV遺伝子型を決定することはできなかった。その後、IMMUNIS(登録商標)HBV遺伝子型酵素イムノアッセイ(EIA)キットを使用した。このアッセイでは、HBsAgのPreS2領域内の4種の遺伝子型依存性エピトープを使用し、エピトープのそれぞれに特異的な4つのEIAの陽性/陰性の組合せによって遺伝子型を血清学的に決定した。
HBVプロテオーム内の対象領域を同定する最初のステップは、HBVに感染していない、ワクチン接種を受けていない健康な被験体由来のPBMCのIFNγ ELISpot応答と、疾患の持続的制御期(sustained control phase)にある慢性HBV感染症のHBeAg陰性の非活動性キャリア被験体由来のPBMCのIFNγ ELISpot応答、及び治療中の慢性HBV感染症のHBeAg陰性被験体由来のPBMCのIFNγ ELISpot応答を比較することであった。HBVプロテオームのおよそ70%を表す重複した短いペプチド(15~20mer、10~13アミノ酸が重複したもの)のライブラリーと一緒に短期培養した後、それぞれHBVのポリメラーゼ、コア、X及び表面抗原内の対象とする特定の領域を表すこれらの短いペプチドのプールを用いてPBMCを一晩再刺激した。次いで、これらのペプチドプールに対するIFNγ応答を、ヒトIFNγ ELISpotアッセイを使用して評価した。
ヒトPBMCにおける、HBV由来のDensigenに関連する短いペプチドプールのex vivoにおける免疫原性の評価
方法及び材料
集団
HBV感染症の被験体
慢性HBV感染症であると臨床的に定義された104人の被験体を、Imperial Healthcare NHS Trust、Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust、及びBarts and the London NHS Trust in Londonにおける、RECにより承認されたプロトコールに登録した。全ての被験体から書面でのインフォームドコンセントを得た後、新鮮な静脈血を採取し、PBMC及び血漿を単離し、血液採取の18時間以内に凍結保存した。これらの被験体は以下の基準に合致した:全体的な健康状態が良好であること、HBVに特異的な治療:抗ウイルスヌクレオシド(ヌクレオチド)類似体阻害剤及び/又はインターフェロン療法(臨床的に示された場合)、臨床的状態(慢性HBV感染症、HBeAg陰性、並びにALTの正常な、持続的若しくは断続的な上昇)、HIV陰性、HCV陰性及びHDV陰性。
17人の被験体由来の凍結保存されたPBMCをCTL Technologiesから得た。これらの被験体は以下の基準に合致した:全体的な健康状態が良好であること、HBVに対するワクチン接種を受けていないこと、HBV表面抗原陰性、HBVコア抗体陰性、HIV陰性及びHCV陰性。
各被験体由来のPBMCのバイアル1つ(細胞1×107個を含有する)を解凍し、Scepter(商標)手持ち型自動細胞計数器を使用してリンパ球数を決定した。PBMCを、24ウェルの細胞培養プレートにおいて、2mLの培養培地(CM: 5%ヒトAB血清を補充したRPMI-1640 Glutamax)中、1mL当たり細胞1×106個の濃度で合計11日間培養した。細胞を、長さが15~20アミノ酸にわたり、10~13アミノ酸が重複している、重複したHBV由来の短いペプチド144種(配列番号73~210及び配列番号142~147)を含有するペプチドプールを1mL当たりペプチド当たり0.1μgの最終濃度で用いて刺激した。4日目に、IL-2及びIL-15を、培養物にそれぞれ最終濃度10 IU/mL及び10ng/mLまで加えた。10日目に、細胞をCM中で2回洗浄し、10 IU/mLのIL-2と一緒にさらに1日培養した。11日目に、細胞をCM中で2回洗浄し、計数し、ヒトIFNγ ELISpotアッセイ又は細胞内サイトカイン染色に組み込んだ。
96ウェルマルチスクリーンPVDFフィルタープレート(Millipore)を、100μl(1:80)の抗ヒトIFNγ捕捉mAb(R&D Systems)を用いて4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、1% BSA及び5%スクロースを補充したPBSを用いて4℃で2時間ブロッキングした。細胞を、3連のウェルに、ウェル当たりPBMC 5×104個でプレーティングした。使用した最終的な抗原の濃度は、HBV由来のDensigenに関連する短いペプチドプール23種(以下を参照されたい): 1mL当たりペプチド当たり5μg、 CEFペプチドプール陽性対照: 1mL当たりペプチド当たり1μg、 PHA陽性対照: 1μg/mLであった。ELISpotプレートを、加湿した環境下、5% CO2、37℃で18時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、100μl(1:80)のビオチン化抗ヒトIFNγ検出用mAb(R&D Systems)と一緒に室温で2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、製造者(R&D Systems)の説明書に従って、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ(1:80)と一緒に1時間、その後、基質と一緒に(30分)インキュベートした。発生したスポットを、自動プレート計数システム(CTL Europe)を使用して計数した。
細胞を、96ウェル丸底プレートにウェル当たりPBMC 5×105個でプレーティングし、最終濃度1mL当たりペプチド当たり5μgのHBV由来のペプチドプールによって刺激した。プレートを、5% CO2のインキュベーター中、37℃で20時間インキュベートした。アッセイの最後の3時間については、PMA/イオノマイシンをそれぞれのウェルに加え、ゴルジプラグ(Golgi plug)を全てのウェルに加えた。細胞を回収し、PBS+0.1% BSA(洗浄緩衝液)で洗浄し、抗CD3、抗CD4及び抗CD8(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。さらに洗浄した後、細胞を固定し、BD Cytofix/Cytoperm溶液100μLを用いて4℃で20分透過処理し、その後、1×BD Perm/Wash溶液で2回洗浄した。最後に、細胞を、抗IL-2-FITC、抗IFNγ-PE及び抗TNFα PerCP-Cy5.5(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。試料をFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得した。ゲーティングは、各被験体についての培地で刺激した試料に基づいた。
HBV遺伝子型決定のために、ネステッドPCR法、その後に直接ヌクレオチド配列決定を最初に使用した。しかし、大多数の試料由来の血漿中のウイルス負荷量が低いことに起因して、この方法を使用してHBV遺伝子型を決定することはできなかった。その後、IMMUNIS(登録商標) HBV遺伝子型酵素イムノアッセイ(EIA)キットを使用した。このアッセイでは、HBsAgのPreS2領域内の4種の遺伝子型依存性エピトープを使用し、エピトープのそれぞれに特異的な4つのEIAの陽性/陰性の組合せによって遺伝子型を血清学的に決定した。
HBV由来の短いペプチドプールに対する応答のスクリーニングの後に、35~40merの対象領域が同定された。これらの領域を、35~40merのペプチドをワクチンに使用することを目的としてさらに評価した。さらなる評価には、短期培養した後の再刺激のため以前使用した短いペプチドプールの再設計が伴った。ワクチンに使用するペプチドをより正確に反映するために、35~40merの対象領域を超えて伸長した末端の短いペプチドをプールから除去した。前と同様にペプチドライブラリーと一緒に短期培養した後、次いで、これらの短いペプチドプールをヒトIFNγ ELISpotアッセイ及びICSアッセイにおける再刺激のために使用した。
フルオロカーボンと連結したHBVペプチドの構築
配列番号24、25、28、33、34、36、37及び38及び222に示されているアミノ酸配列を有するペプチドをFMOC(フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド)固相合成によって合成した。次いで、フルオロカーボン鎖(C8F17(CH2)2COOH)を各ペプチドの追加的なN末端リシンのイプシロン鎖に組み込んでフルオロカーボンと連結したペプチドを誘導した。トリフルオロ酢酸(TFA)の存在下での切断及び逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)による最終的な精製により、精製された、フルオロカーボンと連結したペプチド又は修飾されていないペプチドを得た。全ての調製物の純度は90%以上であった。
FA-P113: K(FA)-VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK-NH2 (配列番号24);
FA-P151: K(FA)-PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF-NH2(配列番号25);
FA-P376: K(FA)-KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR-NH2 (配列番号28);
FA-753(K): K(FA)-KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK-NH2 (配列番号36);
FA-P856(K): K(FA)-LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK-NH2 (配列番号38);
FA-P877: K(FA)-PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR-NH2(配列番号33);
FA-P277(K): K(FA)-RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK-NH2 (配列番号34),
FA-P797(K): K(FA)-SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK-NH2 (配列番号37);
FA-P1266(K): K(FA)-KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSW WTSLNFLKKK-NH2 (配列番号222)
NP113: VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK (配列番号24);
NP151: PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF (配列番号25);
NP376: KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR (配列番号28);
NP753(K): KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK (配列番号36);
NP856(K): LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK (配列番号38);
NP877: PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR (配列番号33);
NP277(K): RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK (配列番号34),
NP797(K): SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK (配列番号37);
NP1266(K): KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK (配列番号222).
長いHBVペプチド製剤
実施例3に記載の通り調製した、フルオロカーボンとコンジュゲートしたHBV由来のペプチド9種で構成されるワクチン候補FP02.1を下記の通り製剤化した。ペプチド可溶化の条件は表5に記載されている。簡単に述べると、フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチド9種のそれぞれを秤量して5mlのガラスバイアルに入れた。次いで、水中2~12%の酢酸溶液を用いて各ペプチドを可溶化して10mgのペプチド濃度を実現した。ペプチド溶液(各ペプチドについて3.9ml)を150mlの滅菌容器中にブレンドした後に、水中10%酢酸溶液3.9mlを加えた。磁気撹拌器を用いて2分撹拌した後、水中9.0%マンニトール溶液39mLを加えた。磁気撹拌器を用いてさらに2分撹拌した後、溶液を、0.22μm 33mm Millexフィルターを使用して濾過した。濾過された溶液1.2mLをオートクレーブ処理した2mlのガラスバイアル中に送り出した。RP-HPLCによって測定された濾過回収率は>95%であった。バイアルを-80℃で1時間にわたって凍結させた。次いで、試料を36時間にわたってフリーズドライした。窒素下でフリーズドライ換気を実施し、400~600mbarの圧力でバイアルの栓止めを行った。ペプチドの量は、バイアル当たりペプチド当たり600μgであり、1.2mLで再構成した際、最終濃度は1ml当たりペプチド当たり500μgであった。
好ましいHBVペプチド及び混合物は、慢性HBVキャリアにおいて、疾患の病期、HBVウイルスの遺伝子型及び被験体の民族性に関係なく免疫原性である
方法及び材料
集団
慢性HBV感染症であると臨床的に定義された40人の被験体を、Imperial Healthcare NHS Trust、Chelsea and Westminster Hospital NHS Foundation Trust、及びBarts and the London NHS Trust in Londonにおける、RECにより承認されたプロトコールに登録した。全ての被験体から書面でのインフォームドコンセントを得た後、新鮮な静脈血を採取し、PBMC及び血漿を単離し、血液採取の18時間以内に凍結保存した。これらの被験体は以下の基準に合致した:全体的な健康状態が良好であること、HBVに特異的な治療:抗ウイルスヌクレオシド(ヌクレオチド)類似体阻害剤及び/又はインターフェロン療法(臨床的に示された場合)、臨床的状態(慢性HBV感染症、HBeAg陰性、並びにALTの正常な、持続的若しくは断続的な上昇)、HIV陰性、HCV陰性及びHDV陰性。
各被験体由来のPBMCのバイアル1つ(細胞1×107個を含有する)を解凍し、Scepter(商標)手持ち型自動細胞計数器を使用してリンパ球数を決定した。PBMCを、24ウェルの細胞培養プレートにおいて、2mLの培養培地(CM: 5%ヒトAB血清を補充したRPMI-1640 Glutamax)中、1mL当たり細胞1×106個の濃度で合計11日間培養した。細胞を、実施例3に記載のHBV由来の長いペプチド9種の混合物を用いて刺激した。
96ウェルマルチスクリーンPVDFフィルタープレート(Millipore)を、100μl(1:80)の抗ヒトIFNγ捕捉mAb(R&D Systems)を用いて4℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを、1% BSA及び5%スクロースを補充したPBSを用いて4℃で2時間ブロッキングした。短期培養物由来の細胞を、3連のウェルに、ウェル当たりPBMC 5×104個でプレーティングした。使用した最終的な抗原の濃度は、それぞれのペプチドについて5μg/mL、 PHA陽性対照: 1μg/mLであった。ELISpotプレートを、加湿した環境下、5% CO2、37℃で18時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、100μl(1:80)のビオチン化抗ヒトIFNγ検出用mAb(R&D Systems)と一緒に室温で2時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、製造者(R&D Systems)の説明書に従って、ストレプトアビジンとコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ(1:80)と一緒に1時間、その後、基質と一緒に(30分)インキュベートした。発生したスポットを、自動プレート計数システム(CTL Europe)を使用して計数した。
短期培養物由来の細胞を、96ウェル丸底プレートにウェル当たりPBMC 5×105個でプレーティングし、HBV由来の長いペプチド9種(NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K))、最終濃度5μg/mLによって刺激した。プレートを、5% CO2のインキュベーター中、37℃で20時間インキュベートした。アッセイの最後の3時間については、PMA/イオノマイシンをそれぞれのウェルに加え、ゴルジプラグ(Golgi plug)を全てのウェルに加えた。細胞を回収し、PBS+0.1% BSA(洗浄緩衝液)で洗浄し、抗CD3、抗CD4及び抗CD8(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。さらに洗浄した後、細胞を固定し、BD Cytofix/Cytoperm溶液100μLを用いて4℃で20分透過処理し、その後、1×BD Perm/Wash溶液で2回洗浄した。最後に、細胞を、抗IL-2-FITC、抗IFNγ-PE及び抗TNFα PerCP-Cy5.5(BD Biosciences)を用いて4℃で30分染色した。試料をFACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得した。ゲーティングは、各被験体についての培地で刺激した試料に基づいた。
HBV遺伝子型決定のために、ネステッドPCR法、その後に直接ヌクレオチド配列決定を最初に使用した。しかし、大多数の試料由来の血漿中のウイルス負荷量が低いことに起因して、この方法を使用してHBV遺伝子型を決定することはできなかった。その後、IMMUNIS(登録商標) HBV遺伝子型酵素イムノアッセイ(EIA)キットを使用した。このアッセイでは、HBsAgのPreS2領域内の4種の遺伝子型依存性エピトープを使用し、エピトープのそれぞれに特異的な4つのEIAの陽性/陰性の組合せによって遺伝子型を血清学的に決定した。
全てのペプチドにより、HBeAg陰性の非活動性キャリア及びHBeAg陰性の治療を受けている被験体のいずれのHBVキャリアにおいても検出可能なT細胞応答が促進された(図9及び10参照)。種々の試験されたペプチドの中でも、NP113、NP151、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)及びNP877により、両方の患者集団において、且つ最高の割合の被験体で最高レベルの応答が促進される。驚いたことに、NP113及びNP151に対する累積的な応答は、両方の集団において、試験された2種のペプチドの他の組合せのいずれと比較しても高い。さらに、NP113、NP151及びNP376に対する累積的な応答により、両方の集団において、試験された3種のペプチドの他の組合せのいずれと比較しても、最高レベルの応答が誘導される。図11に示されている通り、試験されたペプチドの全てにより、4種のHBV遺伝子型の全てにわたって交差反応性T細胞応答が促進される。ペプチドNP113、NP151、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)及びNP877により、4種の遺伝子型A、B、C 及びD全てにわたって、ペプチドNP2777(K)及びNP1226(K)と比較して最も高い応答が促進される。驚いたことに、P113により、4種の遺伝子型全てにわたって、他の全てのペプチドと比較して最も高いT細胞応答が促進される。
フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチドの、コンジュゲートしていないペプチドと比較した、in vivoでT細胞応答を促進するそれらの能力における優位性
方法及び材料
FP02.1(フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチド9種を含有する)のマウスにおける免疫原性をNP02.1(同等のコンジュゲートしていないペプチド9種を含有する)と比較した。雌BALB/cマウス(群当たりn=7)を、FP02.1を体積50μL中ペプチド当たり50μgの用量で用いて、又はNP02.1(コンジュゲートしていないHBVペプチド(NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K)を含有する)を体積50μL中ペプチド当たり43.8μgの等モル用量(FP02.1と比較して)で用いて筋肉内に免疫した。マウスを0日目に免疫し、14日目に屠殺した。脾細胞を、実施例3に記載の9種のHBVペプチドのそれぞれの混合物をペプチド当たり1mL当たり5μgで用いてELISpotアッセイにおいて18時間にわたってin vitroで刺激した。
フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチドの混合物(FP02.1)を用いて免疫したマウスにおいて、コンジュゲートしていないペプチドの同等の混合物(NP02.1)を用いて免疫したマウスと比較して、有意に大きな規模のT細胞応答が観察された(図14参照)。同系BALC/CモデルにおけるMHC拘束性に起因して、免疫応答は、ワクチンに含有された9種のペプチドのうちの4種によるものが優位を占めた(ペプチドNP113、NP151、NP376及びNP1266(K)、図15参照)。
フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチドにより、CTL/CD8+ T細胞応答が促進される
方法及び材料
FP02.1(フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチド9種を含有する)によって誘導される免疫応答の質をマウスにおいて評価した。雌BALB/cマウス(群当たりn=7)を、FP02.1を体積50μL中ペプチド当たり25μgの用量で用いて筋肉内に免疫した。マウスを0日目に免疫し、14日目に屠殺した。
図16に示されている通り、FP02.1により、単回免疫後のMHCクラスI分子によって制限されるCTLエピトープに対するT細胞応答が促進される。
同じ製剤に含有されるフルオロカーボン-ペプチド間の相乗作用
方法及び材料
マウスに単独で、又は他のフルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチドとの共製剤(co-formulation)の一部として(FP02.1)投与したFA-P113の免疫原性をマウスにおいて評価した。雌BALB/cマウス(群当たりn=7)を、FA-P113を25μgの用量で用いて、又はFP02.1を体積50μL中ペプチド当たり25μgの用量で用いて筋肉内に免疫した。マウスを0日目に免疫し、14日目に屠殺した。脾細胞を、5μg/mLのNP113(フルオロカーボンベクターとコンジュゲートしていない)を用いてELISpotアッセイにおいて18時間にわたってin vitroで刺激した。IFNγ+SFCの数を計数した。次いで、プレートをPBSで洗浄し、製造者の説明書に従って、IFNγ検出用ペルオキシダーゼ標識抗体と一緒にインキュベートし、その後、基質と一緒にインキュベートした。発生したスポットを、自動プレート計数システム(CTL Europe)を使用して計数して、IFNγ+SFCの数を数量化した。
フルオロカーボンとコンジュゲートしたペプチドの混合物(FP02.1)を用いて免疫したマウスにおいて、FA-P113を単独で用いて免疫したマウスよりも大規模のNP-113特異的T細胞応答が観察された(図17参照)。
好ましいHBVペプチド及び組合せは、広範囲のHLAクラスI分子に結合する能力を有するエピトープを含有する
方法及び材料
ProImmune REVEAL結合アッセイを使用して、9アミノ酸の短いペプチド(HBVの長いペプチドNP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K)に由来する)の、1種以上のMHCクラスI対立遺伝子に結合し、MHC-ペプチド複合体を安定化する能力を決定した。検出は、MHC-ペプチド複合体のネイティブなコンフォメーションの有無に基づく。頻度が高いHLAクラスI対立遺伝子(HLA-A*0201、A*0301、A*1101、A*2402、B*0702、B*0801、及びB*3501)を選択した。MHC分子への結合を、非常に強力な結合特性を有する陽性対照ペプチドである公知のT細胞エピトープの結合と比較した。コンセンサスHBV配列に存在しない余分のリシンを含有するもの以外の、各HBVペプチド(NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K))についての全ての潜在的な九量体を>90%の純度で合成した。試験ペプチドのスコアは陽性対照ペプチドによって生成されるシグナルに対する百分率として定量的に報告され、ペプチドは推定される合否結果を有すると示される。良好な結合性物質は、ProImmuneによって定義される陽性対照に対するスコアが45%であるペプチドであるとみなされる。
表6に示されている結果には、各HLA対立遺伝子に対して結合スコア≧45%を有する、HBVの長いペプチドのそれぞれ(NP113、NP151、NP277、NP376、NP753、NP797、NP856、NP877及びNP1266)に由来する九量体の数が示されている。全ての長いHBVペプチドは、少なくとも4種の対立遺伝子に結合する能力を有する少なくとも6個のエピトープを含有する。6種の長いペプチドの任意の組合せは、試験した全ての対立遺伝子に結合する能力を有する九量体エピトープを含有する。
好ましいHBVペプチド及び組合せは、広範囲のHLAクラスII分子に結合する能力を有するエピトープを含有する
方法
ProImmune REVEAL(登録商標)MHC-ペプチド結合アッセイを使用して、HBVの長いペプチドのそれぞれ(NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K))の、1種以上のMHCクラスII対立遺伝子に結合し、MHC-ペプチド複合体を安定化する能力を決定した。頻度が高いHLAクラスII対立遺伝子HLA-DR1(α1*01:01;β1*01:01)、HLA-DR15(α1*01:01;β1*15:01)、HLA-DR3(α1*01:01;β1*01:01)、HLA-DR4(α1*01:01;β1*04:01)、HLA-DR11(α1*01:01;β1*11:01)、HLA-DR13(α1*01:01;β1*13:01)及びHLA-DR7(α1*01:01;β1*07:01)を選択した。各ペプチドに、公知のT細胞エピトープである陽性対照ペプチドと比較したスコアを与えた。試験ペプチドのスコアは陽性対照ペプチドによって生成されるシグナルに対する百分率として定量的に報告され、ペプチドは推定される合否結果を有すると示される。良好な結合性物質は、Proimmuneによって定義されるスコアが陽性対照に対して≧15%であるペプチドであるとみなされる。
表7の結果には、HBVの長いペプチドのそれぞれ(NP113、NP151、NP277(K)、NP376、NP753(K)、NP797(K)、NP856(K)、NP877及びNP1266(K))のHLAクラスII対立遺伝子の範囲にわたる結合スコアが示されている。HBVペプチド9種のうち6種が少なくとも1種のHLA対立遺伝子に≧15%のスコアで結合する。NP113、NP151及びNP376は、4種以上の異なるHLAクラスII対立遺伝子に結合する。驚いたことに、P113は、全部で6種の対立遺伝子に結合する。ペプチドNP113とNP877の組合せは、試験したHLAクラスII対立遺伝子の全てに結合する。
本開示は以下の実施形態を包含する。
[1] 配列番号1~4に示されている配列のうちの1つ又は配列番号1~4に示されている配列のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を有する配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸の配列を含むペプチドから選択される、長さが15~60アミノ酸の少なくとも2種のペプチドを含む医薬組成物であって、各ペプチドが、少なくとも1つのCD8+ T細胞エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+ T細胞エピトープを含み、各ペプチドが、in vitroアッセイにおいて、慢性HBV感染症の少なくとも1個体由来の末梢血単核細胞(PBMC)において応答を誘発する、医薬組成物。
[2] 前記ペプチドが、配列番号1~4に示されている配列のうちの1つの少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチドから選択される、実施形態1に記載の組成物。
[3] 配列番号1~3に示されている配列のうちの1つの少なくとも15個のアミノ酸を含む少なくとも1種のペプチド、及び配列番号4に示されている配列の少なくとも15個のアミノ酸を含む少なくとも1種のペプチドを含む、実施形態1又は2に記載の組成物。
[4] 前記ペプチドの少なくとも1種が、配列番号24~33のうちの1つに示されている配列、又は配列番号24~33に示されている配列のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~3のいずれかに記載の組成物。
[5] 少なくとも1種のペプチドが、ペプチドの正味の正電荷を増加させるため、及び/又は疎水性を低下させるために、N末端及び/又はC末端に1つ以上の追加的なアミノ酸をさらに含む、実施形態1~4のいずれかに記載の組成物。
[6] 配列番号34~38のうちの1つに示されている配列を含むペプチドを含む、実施形態5に記載の組成物。
[7] 民族性が異なる少なくとも2個体由来のPBMC及び感染しているHBV遺伝子型が異なる2個体由来のPBMCにおいて免疫応答を誘発できるものである、実施形態1~6のいずれかに記載の組成物。
[8] HBV遺伝子型Aに感染している個体、HBV遺伝子型Bに感染している個体、HBV遺伝子型Cに感染している個体、及びHBV遺伝子型Dに感染している個体のうちの2個体、3個体又は全個体由来のPBMCにおいて免疫応答を誘発できるものである、実施形態7に記載の組成物。
[9] 以下の群:
(i)配列番号14、15、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号14、17、18、21又は67の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(iii)配列番号14、16、60、19、20又は22の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び
(iv)配列番号14、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド
の少なくとも2つから選択される少なくとも1種のペプチドを含む、実施形態8に記載の組成物。
[10] HBVに感染しているアジア人若しくはインド人の個体、HBVに感染している白人の個体、及びHBVに感染しているアフリカ人若しくはアラブ人の個体のうちの2個体、3個体又は全個体由来のPBMCにおいて免疫応答を誘発できるものである、実施形態7~9のいずれかに記載の組成物。
[11] 以下の群:
(i)配列番号14、16、60、17、18、20、21、67又は22の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、
(ii)配列番号14、15、19、20、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド、及び
(iii)配列番号14、15、20、21、67、22又は23の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチド
の少なくとも2つから選択される少なくとも1種のペプチドを含む、実施形態10に記載の組成物。
[12] 配列番号1に示されている配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸の断片を含む、長さが15~60アミノ酸の1種以上のペプチドを含む、実施形態1~11のいずれかに記載の組成物。
[13] 配列番号5、6、14又は15に示されている配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含むペプチドを含む、実施形態12に記載の組成物。
[14] 配列番号80、81、82、83、86、87、88又は89のうちの1つに示されている配列を含むペプチドを含む、実施形態12又は13に記載の組成物。
[15] 配列番号24又は25に示されている配列を含むペプチドを含む、実施形態12~14のいずれかに記載の組成物。
[16] 2~10種の前記ペプチドを含む、実施形態1~15のいずれかに記載の組成物。
[17] 配列番号24、25、27、28、33、34、35、36、37及び38に示されている配列を含む10種のペプチドのうちの少なくとも2種を含む、実施形態1~16のいずれかに記載の組成物。
[18] 配列番号55に示されている配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸の配列、又は配列番号55に示されている配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、長さが15~60アミノ酸の少なくとも1種のペプチドであって、該ペプチドが少なくとも1つのCD8+ T細胞エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+ T細胞エピトープを含み、in vitroアッセイにおいて、慢性HBV感染症の少なくとも1個体由来の末梢血単核細胞(PBMC)において応答を誘発するものである、少なくとも1種のペプチドをさらに含む、実施形態1~17のいずれかに記載の組成物。
[19] 前記ペプチドが、配列番号221又は配列番号222に示されている配列を含む、実施形態18に記載の組成物。
[20] 配列番号24、25、28、33、34、36、37、38及び222に示されている配列を含むペプチドを含む、実施形態19に記載の組成物。
[21] 前記ペプチドがフルオロカーボンベクターと連結している、実施形態1~20のいずれかに記載の組成物。
[22] HBc抗原、HBe抗原、又はHBs抗原をさらに含む、実施形態1~21のいずれかに記載の組成物。
[23] アジュバントをさらに含む、実施形態1~22のいずれかに記載の組成物。
[24] HBV感染症の治療又は予防において使用するための、実施形態1~23のいずれかに記載の組成物。
[25] HBeAg陰性患者の治療において使用するための、実施形態21に記載の組成物。
[26] HBeAg陽性患者の治療において使用するための、実施形態21に記載の組成物。
[27] (i)インターフェロン-アルファ及び/若しくはヌクレオシド/ヌクレオチド類似体(NUC)、並びに/又は(ii)抗PD1遮断抗体、抗PD1L遮断抗体、抗LAG3遮断抗体、抗TIM3遮断抗体、抗CTLA4遮断抗体及び/若しくはシクロホスファミド、と組み合わせた実施形態20~22のいずれかに記載の使用のための、実施形態21~23のいずれかに記載の組成物。
[28] 前記治療が、HBsAg消失又はHBsAgセロコンバージョンをもたらす、実施形態21~24のいずれかに記載の組成物。
[29] 末期の肝疾患又は肝細胞癌の治療又は予防において使用するための、実施形態1~20のいずれかに記載の組成物。
[30] D型肝炎ウイルス(HDV)感染症の治療又は予防において使用するための、実施形態1~20のいずれかに記載の組成物。
[31] 配列番号1~4のいずれか1つに示されている配列又は配列番号1~4に示されている配列のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を有する配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含む、長さが15~60アミノ酸のペプチドであって、少なくとも1つのCD8+ T細胞エピトープ及び/又は少なくとも1つのCD4+ T細胞エピトープを含み、in vitroアッセイにおいて、慢性HBV感染症の少なくとも1個体由来の末梢血単核細胞(PBMC)において応答を誘発できるものである、ペプチド。
[32] 配列番号5、6、14又は15に示されている配列の少なくとも15個の連続したアミノ酸を含む、実施形態28に記載のペプチド。
[33] 配列番号24~38に示されている配列のうちの1つ又は配列番号24~38に示されている配列のうちの1つに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含むペプチド。
[34] フルオロカーボンベクターと共有結合により連結している、実施形態28~30のいずれかに記載のペプチド。
[35] HBV感染症を治療又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に治療有効量の実施形態1~20のいずれかに記載の組成物を投与することを含む、方法。
[36] HBVを治療又は予防するための医薬の製造における、実施形態1~20のいずれかに記載の組成物の使用。
Claims (13)
- HBVポリメラーゼ、コアタンパク質又は表面抗原からのHBV遺伝子型A、B、C、又はDコンセンサス配列の少なくとも15個の連続アミノ酸を有する、長さ25~60アミノ酸の免疫原性ペプチドの組み合わせを含む医薬組成物であって、各ペプチドが、該ペプチドの細胞内送達のためにカーボンベクターと共有結合により連結しており、該カーボンベクターが3~30個の炭素原子を含む鎖を含み、その少なくとも1つがフッ素、塩素、臭素又はヨウ素により置換されており、該組成物が、
前記免疫原性ペプチドの組み合わせとして、
配列番号24に示されているアミノ酸配列を含む第1ペプチド、
配列番号25に示されているアミノ酸配列を含む第2ペプチド、
配列番号28に示されているアミノ酸配列を含む第3ペプチド、
配列番号33に示されているアミノ酸配列を含む第4ペプチド、
配列番号34に示されているアミノ酸配列を含む第5ペプチド、
配列番号36に示されているアミノ酸配列を含む第6ペプチド、
配列番号37に示されているアミノ酸配列を含む第7ペプチド、
配列番号38に示されているアミノ酸配列を含む第8ペプチド、及び
配列番号222に示されているアミノ酸配列を含む第9ペプチド、
を含む、前記医薬組成物。 - アジュバントをさらに含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記カーボンベクターと連結したペプチドが、化学構造CmFn-CyHx-(Sp)-R
[式中、m=3~30であり、n≦2m+1であり、y=0~15であり、x≦2yであり、(m+y)=3~30であり、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rが前記免疫原性ペプチドである]
を有する、請求項1に記載の組成物。 - 該ペプチドの組み合わせが、約0.1mM~約10mMの濃度で溶液中に存在する、請求項1に記載の組成物。
- 組成物が乾燥した形態である、請求項1に記載の組成物。
- HBV感染症を治療又は予防するための、請求項1~5のいずれか1項に記載の組成物。
- HBVポリメラーゼ、コアタンパク質又は表面抗原からのHBV遺伝型A、B、C、又はDコンセンサス配列の少なくとも15連続アミノ酸を有する、長さが25~60アミノ酸の免疫原性ペプチドの組み合わせを含む医薬組成物であって、
前記免疫原性ペプチドの組み合わせとして、
配列番号24に示されているアミノ酸配列を含む第1ペプチド、
配列番号25に示されているアミノ酸配列を含む第2ペプチド、
配列番号28に示されているアミノ酸配列を含む第3ペプチド、
配列番号33に示されているアミノ酸配列を含む第4ペプチド、
配列番号34に示されているアミノ酸配列を含む第5ペプチド、
配列番号36に示されているアミノ酸配列を含む第6ペプチド、
配列番号37に示されているアミノ酸配列を含む第7ペプチド、
配列番号38に示されているアミノ酸配列を含む第8ペプチド、及び
配列番号222に示されているアミノ酸配列を含む第9ペプチド、
を含み、
各ペプチドが、化学構造CmFn-CyHx-(Sp)-R
[式中、m=3~30であり、n≦2m+1であり、y=0~15であり、x≦2yであり、(m+y)=3~30であり、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rが前記免疫原性ペプチドである]、
を有するフルオロカーボン鎖に連結されている、前記医薬組成物。 - フルオロカーボン鎖がC8F17(CH2)2(Sp)-Rを有する、請求項7に記載の組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項7に記載の組成物。
- 該ペプチドの組み合わせが、約0.1mM~約10mMの濃度で溶液中に存在する、請求項7に記載の組成物。
- 組成物が乾燥した形態である、請求項7に記載の組成物。
- HBV感染症を治療又は予防するための請求項7~12のいずれか1項に記載の組成物。
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