ES2906110T3

ES2906110T3 - Vacunas contra el virus de la Hepatitis B

Info

Publication number: ES2906110T3
Application number: ES13814593T
Authority: ES
Inventors: Bertrand Victor Gilbert Georges; Carlton Bradley Brown
Original assignee: Altimmune UK Ltd
Current assignee: Altimmune UK Ltd
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2022-04-13
Anticipated expiration: 2033-12-20
Also published as: EP2935313A1; EA201591213A1; KR20220019846A; WO2014102540A1; JP6811014B2; KR20150098676A; US20230090379A1; GB201223386D0; EP2935313B1; JP2016505589A; US20200016263A1; DK2935313T3; JP2019034946A; CA2895459A1; US11918645B2; JP2021098711A; JP7187237B2; US20160106830A1; US10300132B2; CN114028553A

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB, comprendiendo la composición: un primer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, un segundo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25, un tercer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, un cuarto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, un quinto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, un sexto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 36, un séptimo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37, un octavo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 38 y un noveno péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 222, en donde cada péptido tiene hasta 60 aminoácidos de longitud.

Description

DESCRIPCIÓN

Vacunas contra el virus de la Hepatitis B

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición peptídica inmunogénica del VHB y al tratamiento del VHB usando la composición.

Antecedentes de la invención

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con el hígado en Europa y en todo el mundo. Se estima que 650.000 personas mueren cada año por insuficiencia hepática o carcinoma hepatocelular. A pesar de que los programas de vacunación han llevado a la disminución de infecciones por VHB de novo en muchos países, la hepatitis B crónica (HCB) es un problema de rápido crecimiento en Europa debido a la inmigración de portadores del ^vH^bdesde áreas endémicas.

Desde un punto de vista conceptual, la infección crónica por VHB puede clasificarse en tres fases (o tipos de respuestas inmunitarias): portador tolerante inmunitario, crónico inmunitario activo y crónico inactivo. Estas distintas fases de infección crónica se corresponden con patrones serológicos característicos y se correlacionan con la respuesta inmunitaria del paciente al VHB. En general, los pacientes con infección persistente por VHB crónica inmunoactiva reciben terapia contra el VHB.

Hay opciones de tratamiento limitadas disponibles para la hepatitis B crónica (CHB). La supresión de la replicación vírica con antivíricos tales como el interferón-alfa y los análogos de nucleósidos/nucleótidos (NUC) es la única forma de reducir la morbilidad y la mortalidad por infección crónica por VHB con el objeto final de mejorar la supervivencia. No obstante, la pérdida de HBsAg en suero y el desarrollo de anticuerpos anti-HBs (seroconversión) es el sello distintivo de una respuesta inmunológica exitosa a la infección por VHB y el resultado más cercano a la curación clínica. Solo el interferón-alfa ha sido capaz de inducir una pérdida significativa de HBsAg, pero en una proporción relativamente baja de pacientes (<10 %). Los interferones tienen un alto coste, una mala tolerabilidad y algunos genotipos del VHB siguen respondiendo mal al tratamiento.

En consecuencia, NUC siguen siendo las principales estrategias de tratamiento con cinco NUC aprobados en Europa para tratar CHB. Los fármacos más potentes y preferidos, tenofovir y entecavir, tienen un perfil de efectos secundarios muy favorable y son capaces de inducir la supresión del ADN del VHB en casi todos los pacientes. Sin embargo, se requiere terapia de por vida para la mayoría de los pacientes bajo la mayoría de las directrices nacionales e internacionales. Solo muy pocos pacientes HBeAg positivos y ningún paciente HBeAg negativo, son capaces de eliminar el HBsAg incluso después de varios años de tratamiento con n Uc . Actualmente se desconoce la seguridad a largo plazo de la terapia NUC. Por lo tanto, se necesitan con urgencia conceptos que permitan el cese oportuno de la terapia NUC.

La vacunación terapéutica es una intervención prometedora para la hepatitis B como forma de inducir el control inmunitario sobre la enfermedad. Se ha demostrado que las respuestas de las células T son críticas para la eliminación de la infección aguda por VHB. Sin embargo, las vacunas terapéuticas contra el VHB basadas en HBsAg no han demostrado beneficio debido a la tolerancia inmunitaria inducida por los altos niveles de HBsAg circulante, incluso bajo un tratamiento antivírico eficaz. Se conocen combinaciones de péptidos de VHB para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB a partir del documento WO02/19986, no se ha demostrado efectividad terapéutica.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han identificado regiones del proteoma de VHB que tienen un alto grado de conservación entre diferentes genotipos de HBV y que tienen propiedades inmunogénicas inesperadamente mejores en comparación con otras regiones conservadas de manera similar de proteínas de VHB. En particular, los inventores han demostrado inesperadamente usando un ensayo in vitro que las secuencias peptídicas dentro de dominios particulares de la polimerasa de VHB y la proteína central de VHB pueden provocar una respuesta en PBMC de pacientes con VHB infectados crónicamente infectados con diferentes genotipos de VHB y/o de pacientes con VHB infectados crónicamente de diferentes etnias. En particular, los inventores han identificado sorprendentemente una región inmunodominante en el dominio terminal de la polimerasa de VHB.

La invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB, comprendiendo la composición:

un primer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, un segundo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: un tercer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28,

un cuarto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33,

un quinto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34,

un sexto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 36,

un séptimo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37, un octavo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 38 y un noveno péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 222,

en donde cada péptido tiene hasta 60 aminoácidos de longitud.

Cada uno de los péptidos puede estar enlazado a un vector de fluorocarbono.

La composición puede comprender además un adyuvante.

La composición es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en PBMC de al menos dos individuos de diferentes etnias y de dos individuos infectados con diferentes genotipos de VHB.

La composición es capaz de provocar una respuesta inmunitaria: (a) en PBMC de dos, tres o todos de: un individuo infectado con el genotipo A del VHB, un individuo infectado con el genotipo B del VHB, un individuo infectado con el genotipo C del VHB y un individuo infectado con el genotipo D de VHB; y/o en PBMC de dos, tres o todos de: un individuo oriental o hindú infectado con el VHB, un individuo caucásico infectado con el VHB y un individuo africano o árabe infectado con VHB.

La invención proporciona la composición de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB, particularmente para el tratamiento de pacientes HBeAg negativos o pacientes HBeAg positivos. La composición de la invención puede usarse en combinación con: (i) interferón-alfa y/o análogos de nucleósidos/nucleótidos (NUC); y/o (ii) anticuerpos bloqueantes anti-PD1, anticuerpos bloqueantes anti-CTLA4, anticuerpos bloqueantes anti-PDIL, anticuerpos bloqueantes anti-LAG3, anticuerpos bloqueantes anti-TIM3 y/o ciclofosfamida. El tratamiento con la composición puede dar como resultado la pérdida de HBsAg o la seroconversión de HBsAg.

La invención también proporciona la composición de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de enfermedad hepática en fase terminal o carcinoma hepatocelular o para su uso en el tratamiento o la prevención de infección por el virus de la hepatitis D (VHD).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una comparación de las respuestas de IFN^yen sujetos con infección crónica por VHB en fase de control inmunitario o experimentando tratamiento activo. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon (5 pg/péptido/ml) en un ensayo ELISpot de IFN^yde 18 h con uno de los grupos 1 a 23 de los péptidos superpuestos que representan regiones específicas del proteoma del VHB.

La Figura 2 muestra la especificidad de las respuestas de IFN^ya conjuntos de péptidos cortos derivados de VHB en sujetos infectados por VHB agrupados por genotipos de VHB infectantes. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon (5 pg/péptido/ml) en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con uno de los grupos 1 a 23 de los péptidos superpuestos que representan regiones específicas del proteoma del VHB.

La Figura 3 muestra las respuestas de IFNy a grupos de péptidos cortos derivados de VHB en sujetos infectados crónicamente por VHB agrupados por fondo étnico. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon (5 pg/péptido/ml) en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con uno de los grupos 1 a 23 de los péptidos superpuestos que representan regiones específicas del proteoma del VHB.

La Figura 4 muestra gráficos de puntos representativos de la producción de IFNy de células T CD4 y CD8 en PBMC de sujetos con VHB crónico y control sanos después de la estimulación con polimerasa de VHB y grupos de péptidos cortos derivados del núcleo. Las PBMC de los sujetos se estimularon durante 10 días con una biblioteca de grupo de péptidos cortos (0,1 pg/péptido/ml), seguido de estimulación durante la noche (5 pg/péptido/ml) con el grupo 2 o 14 de péptidos cortos derivados del VHB, que representan regiones de la polimerasa y el núcleo del VHB, respectivamente. Los resultados se expresan como células productoras de IFNy, como porcentaje de las poblaciones de células T CD3/CD4 o CD3/CD8 parentales. Se usó estimulación en medio de cultivo o PMA/ionomicina como controles negativo y positivo respectivamente y la estrategia de activación se basó en la producción de IFNy de control negativo.

La Figura 5 es una comparación de las respuestas de IFNy a grupos de péptidos cortos derivados de VHB que representan péptidos de 35-40 unidades monoméricas en PBMC de sujetos sanos y sujetos negativos para HBeAg infectados crónicamente por HBV en fase de control inmunitario o sometidos a tratamiento activo. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), Las PBMC se reestimularon (5 pg/péptido/ml) en un ensayo ELISpot de IFN^yde 18 h con uno de los grupos 24 a 46 de los péptidos superpuestos, representando cada uno regiones de 35 40 unidades monoméricas del proteoma del VHB.

La Figura 6 muestra la especificidad de las respuestas de IFNy a conjuntos de péptidos cortos derivados de VHB que representan péptidos de 35-40 unidades monoméricas en sujetos infectados por VHB agrupados por genotipo de VHB infectantes. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), Las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con uno de los grupos 24 a 46 de los péptidos superpuestos, representando cada uno regiones específicas del proteoma del VHB.

La figura 7 muestra las respuestas de IFN^ya grupos de péptidos cortos derivados de VHB que representan péptidos de 35-40 unidades monoméricas en sujetos infectados con VHB HBeAg negativos crónicos agrupados por fondo étnico. Después de un cultivo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos superpuestos derivados de VHB (0,1 pg/péptido/ml), Las PBMC se reestimularon (5 pg/péptido/ml) en un ensayo ELISpot de IFN^yde 18 h con uno de los grupos 24 a 46 de los péptidos superpuestos, representando cada uno regiones de 35-40 unidades monoméricas del proteoma del VHB.

La Figura 8 es un resumen de las respuestas de citocinas por PBMC de sujetos infectados con VHB a grupos de péptidos cortos individuales que representan péptidos de 35-40 unidades monoméricas. Después de un cultivo a corto plazo de 10 días con una biblioteca de grupos de péptidos cortos derivados del VHB, Se cultivaron PBMC de sujetos infectados por VHB con eAg negativo crónico (n = 7-14) durante la noche con uno de los grupos de péptidos de VHB 25, 38, 26, 39, 42, 43, 28 y 31 (que representan los péptidos P113, P753, P151, P797, P856, P877, P277 y P376) a una concentración final de 5 pg/péptido/ml. Las células se tiñeron para la expresión extracelular de CD3, CD4 y CD8, seguido de la expresión intracelular de IFNy, IL-2 y TNFa. Las células se evaluaron mediante citometría de flujo. La expresión de citocinas se normalizó a controles negativos de medias para cada sujeto. Los datos representan la expresión media de cada citocina evaluada. La amplitud de las respuestas se muestra encima de cada barra apilada.

La Figura 9 muestra el número de células formadoras de manchas de IFNy (valores medios) medidas en PBMC de infectados por VHB crónicos (ya sean portadores inactivos HBeAg negativos o sujetos tratados HBeAg negativos). Después de un cultivo de 10 días con los nueve péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con péptidos individuales a una concentración de 5 pg/ml. La Figura 10 muestra la frecuencia de respondedores al ensayo IFNy ELISpot en respuesta a los péptidos del VHB medidos en PBMC de infectados por el VHB crónicos (ya sean portadores inactivos HBeAg negativos o sujetos tratados HBeAg negativos). Después de un cultivo de 10 días con los nueve péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con péptidos individuales a una concentración de 5 pg/ml.

La Figura 11 muestra el número de células formadoras de manchas de IFN^y(valores medios) medidas en PBMC de sujetos infectados crónicamente por VHB agrupados por genotipos de ^vH^binfectantes. Después de un cultivo de 10 días con los nueve péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de IFN^yde 18 h con péptidos individuales a una concentración de 5 pg/ml.

La Figura 12 muestra el número de células formadoras de manchas de IFNy medidas (valores medios) en PBMC de sujetos infectados crónicamente por VHB agrupados por fondo étnico. Después de un cultivo de 10 días con los nueve péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y Np 1266(K)) (0,1 pg/péptido/ml), las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de If Ny de 18 h con péptidos individuales a una concentración de 5 pg/ml.

La Figura 13 muestra la frecuencia de células T CD4+ y CD8+ productoras de citocinas en PBMC de VHB crónico después de la estimulación con péptidos derivados de v Hb . Las Figuras 13A, 13B, 13C, 13D y 13E corresponden a resultados obtenidos para grupos de individuos infectados por los genotipos del VHB A, B, C, D y no A/B/C/D respectivamente. Después de un cultivo de 10 días con los nueve péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) (0,1 pg/péptido/ml), Las PBMC se reestimularon en un ensayo ELISpot de IFNy de 18 h con péptidos individuales a una concentración de 5 pg/ml. Los resultados se expresan como células productoras de citocinas, como un porcentaje de las poblaciones de células T CD3/CD4 o CD3/CD8 parentales. Se usó estimulación en medio de cultivo o PMA/ionomicina como controles negativo y positivo respectivamente y la estrategia de activación se basó en la producción de IFNy de control negativo.

La Figura 14 muestra la producción de IFN^ypor esplenocitos de ratones BALB/c (n=7) inmunizados con FP-02.1 o NP02.1. El gráfico representa el número de células formadoras de manchas de IFN^ypor 106 esplenocitos medidos en respuesta a los 9 componentes peptídicos de las vacunas. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando pruebas de la t pareadas, ns = no significativo.

La Figura 15 muestra la producción de IFN^ypor esplenocitos de ratones BALB/c (n=7) inmunizados con FP-02.1 o NP02.1. El gráfico representa el número de células formadoras de manchas de IFNy por 106 esplenocitos medidos en respuesta a cada de uno de los 9 componentes peptídicos de las vacunas. Las barras representan las respuestas medias acumuladas a cada péptido individual.

La Figura 16 muestra que FP02.1 promueve respuestas de células T contra epítopos de CTL restringidos por moléculas MHC de clase I después de una sola inmunización.

La Figura 17 muestra la producción de IFNy por ratones BALB/c inmunizados con FP-02.1 o NP02.1. Número de IFNy SFC/106 esplenocitos producidos en respuesta a una mezcla de los nueve péptidos para cada población de esplenocitos.

Breve descripción del listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 a 38 y 40 a 72 son las secuencias de aminoácidos de las regiones de la secuencia de VHB de referencia que se muestra en SEQ ID NO: 39 de la polimerasa de VHB como se muestra en la Tabla 1 a continuación.

continuación

SEQ ID NO: 39 es una secuencia de proteína VHB virtual construida por coensamblaje lineal del dominio terminal de polimerasa (posiciones 1 a 181), el dominio de transcriptasa inversa de polimerasa (posición 182 a 549) el dominio H de RNasa de polimerasa (posición 550 a 702), la proteína núcleo (posición 703 a 914), la proteína X (posición 915 a 1068) y la proteína de superficie (posiciones 1069 a 1468). La secuencia del proteoma se obtuvo a partir del consenso de secuencias consenso generadas a partir de las secuencias consenso del genotipo A, B, C y D.

SEQ ID NO: 73 a 219 son las secuencias de aminoácidos de péptidos cortos dentro de cada uno de los grupos 1 a 46. SEQ ID NO: 220 es la secuencia de aminoácidos del grupo 5.

Descripción detallada de la invención

Composición peptídica

un primer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, un segundo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 25,

un tercer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, un cuarto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 33, un quinto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 34, un sexto péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 36, un séptimo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 37, un octavo péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 38 y un noveno péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 222,

en donde cada péptido tiene hasta 60 aminoácidos de longitud.

Secuencias peptídicas

La composición de la invención comprende péptidos que comprenden o consisten en las siguientes secuencias:

VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK (SEQ ID NO: 24);

PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF (SEQ ID NO: 25);

KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR (SEQ ID NO: 28);

PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR (SEQ ID NO: 33);

RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK (SEQ ID NO: 34), KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK (SEQ ID NO: 36);

SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK (SEQ ID NO: 37);

LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK (SEQ ID NO: 38);

KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK (SEQ ID NO: 222).

Cada péptido tiene una longitud de hasta 60 aminoácidos, tal como de hasta 40 aminoácidos.

El péptido puede incluir secuencias adicionales. Las secuencias adicionales pueden facilitar la fabricación o formulación del péptido o mejorar la estabilidad del péptido. Por ejemplo, el péptido puede comprender uno o más aminoácidos adicionales, normalmente en el extremo N y/o el extremo C para potenciar la carga neta positiva del péptido y/o para reducir la hidrofobicidad del péptido. La carga positiva neta puede aumentarse de tal manera que el péptido tenga un punto isoeléctrico mayor o igual a 7. Por ejemplo, en algunos de los péptidos, se añaden dos o tres aminoácidos cargados positivamente (arginina y/o lisina) al extremo N y/o C de uno o más de los péptidos de la composición. Por ejemplo, pueden añadirse tres restos de lisina al extremo N y/o C de uno o más de los péptidos. Los aminoácidos positivos generalmente se añaden al extremo o extremos de los péptidos que tienen una hidrofobicidad global de más del 65 %, una carga neta de menos de cero y/o incluyen una agrupación de aminoácidos hidrófobos. Los ejemplos particulares de péptidos que incluyen restos de lisina N- y/o C-terminales se muestran en SEQ ID NO: 34 a 38 y 222.

Cuando el péptido está enlazado a un fluorocarbono, el extremo del péptido, tal como el extremo que no está conjugado al fluorocarbono u otra fijación, pueden alterarse, por ejemplo, para promover la solubilidad de la construcción de fluorocarbono-péptido a través de la formación de micelas. Para facilitar la síntesis a gran escala de la construcción, los restos de aminoácidos N- o C-terminales del péptido pueden modificarse. Cuando el péptido deseado es particularmente sensible a la escisión por peptidasas, el enlace peptídico normal puede reemplazarse por un mimético peptídico no escindible. Dichos enlaces y métodos de síntesis son bien conocidos en la técnica.

El péptido puede ser un péptido nativo. El péptido puede modificarse para aumentar la longevidad, tal como la semivida o la persistencia en el sitio de administración, del péptido in vivo o para dirigir el péptido a las células presentadoras de antígenos. Por ejemplo, el péptido inmunogénico puede contener uno o más aminoácidos no naturales y/o enlaces covalentes no naturales para conectar covalentemente aminoácidos adyacentes. En determinadas realizaciones, los aminoácidos no convencionales, no naturales también pueden incorporarse en los péptidos inmunogénicos con la condición de que no interfieran con la capacidad del péptido para interactuar con las moléculas del MHC y permanezcan teniendo reactividad cruzada con las células T que reconocen las secuencias naturales. Pueden usarse aminoácidos no naturales para mejorar la resistencia de los péptidos a la proteasa o la estabilidad química. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen D-aminoácidos y modificaciones de cisteína.

El péptido puede acoplarse a un vehículo, tal como una proteína vehículo o un vector de suministro. Los vectores de suministro adecuados incluyen lipopéptidos, por ejemplo, cadenas de acilo graso tales como una cadena de monopalmitoílo, virosomas, liposomas y péptidos de penetración celular, tales como penetratina y transactivador de transcripción (TAT).

Uno o más y preferentemente todos, de los péptidos de VHB en la composición para uso de acuerdo con la invención están preferentemente enlazados covalentemente a un vector de fluorocarbono.

Combinaciones de péptidos

La composición para su uso de acuerdo con la invención comprende múltiples péptidos. La composición comprende ocho péptidos, comprendiendo cada uno una secuencia de al menos 15 aminoácidos contiguos de una de SEQ ID NO: 1 a 4 como se define en las reivindicaciones y adicionalmente un péptido que comprende una secuencia de al menos 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 55 como se define en las reivindicaciones. Específicamente, la composición comprende:

un tercer péptido que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28,

en donde cada péptido tiene hasta 60 aminoácidos de longitud.

Genotipos del VHB

La combinación de secuencias peptídicas en la composición proporciona epítopos, preferentemente ambos epítopos CD8+ y CD4+, presente en múltiples genotipos del VHB. Los genotipos del VHB incluyen los genotipos A, B, C, D, E y F. Por ejemplo, los péptidos largos pueden comprender epítopos de al menos dos genotipos de VHB, tales como A y D (los genotipos de mayor prevalencia en Europa) o B y C (los genotipos de mayor prevalencia en Asia). Más preferentemente, la composición comprende epítopos de al menos tres genotipos del VHB, tales como, por ejemplo, A, B y C, A, B y D, A, C y D o B, C y D. Lo más preferentemente, la composición comprende epítopos de al menos los genotipos del VHB A, B, C y D. Además de incluir cualquier combinación de epítopos de cualquier combinación de uno o más de los genotipos A, B, C y D, la composición puede comprender epítopos de los genotipos E, F y/o G. Esto puede determinarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, usando un ensayo in vitro de PBMC como se describe en el presente documento.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una composición capaz de provocar una respuesta inmunitaria en PBMC de dos, tres, cuatro o todos de: un individuo infectado con el genotipo A del VHB, un individuo infectado con el genotipo B del VHB, un individuo infectado con el genotipo C del VHB, un individuo infectado con el genotipo D del VHB y un individuo infectado con otro genotipo del VHB.

En un aspecto, la composición para su uso de acuerdo con la invención también puede provocar una respuesta in vitro en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos un individuo infectado crónicamente con el genotipo A del VHB, un individuo infectado crónicamente con el genotipo B del VHB, un individuo infectado crónicamente con el genotipo C del VHB y un individuo infectado crónicamente con el genotipo D del VHB. Esto puede determinarse mediante cualquier método adecuado, tal como un método descrito en los Ejemplos en el presente documento. Los individuos pueden ser de la misma o diferente etnia, preferentemente de al menos dos etnias diferentes. Los individuos pueden ser del mismo o diferente subtipo HLA, preferentemente al menos dos subtipos HLA diferentes.

Etnias

La invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB, capaz de provocar una respuesta inmunitaria en individuos de al menos dos, tal como tres o más etnias diferentes. Esto puede evaluarse usando un ensayo in vitro de PBMC como se describe en los Ejemplos. La composición para su uso de acuerdo con la invención puede ser capaz de provocar una respuesta inmunitaria en PBMC de dos, tres o todos de: un individuo oriental o hindú infectado con el VHB, un individuo caucásico infectado con el VHB y un individuo africano o árabe infectado con VHB.

Epítopos

Las moléculas HLA de clase I y de clase II son polimórficas y su frecuencia varía entre grupos étnicos. La mayor parte del polimorfismo se encuentra en la región de unión a péptidos y, como resultado, se cree que cada variante se une a un repertorio único de ligandos peptídicos. El polimorfismo de HLA representa un gran desafío para los diseñadores de vacunas, ya que el polimorfismo de HLA es la base para la unión diferencial de péptidos. Aún más, los alelos de HLA específicos se expresan en frecuencias dramáticamente diferentes en diferentes etnias.

A pesar de tales polimorfismos, las moléculas de HLA se unen a un conjunto superpuesto de péptidos y, por lo tanto, pueden agruparse en consecuencia en supertipos (Lund et al (2004) Immunogenetics 55(12):797-810, Sette et al (1999) Immunogenetics 50(3-4):201-212). Un supertipo se define como una familia de diferentes moléculas de HLA que tienen un repertorio de unión de péptidos similar y, en consecuencia, comparten conjuntos superpuestos de péptidos. En otras palabras, es probable que un péptido que se une a un alelo de HLA que pertenece a un supertipo dado presente una actividad de unión a los otros miembros del supertipo.

La capacidad de unión de los péptidos para diferentes alelos de HLA de clase II puede determinarse usando un ensayo competitivo heterólogo usando un péptido trazador biotinilado específico para cada alelo de HLA de clase II como se describe en Texier et al (2000) J Immunol 164:3177-3184, Texier et al (2001) Eur J Immunol 31:1837-1846 y Castelli et al (2002) J Immunol 169:6928-6934.

Los siguientes nueve alelos de HLA de clase II representan supertipos principales o grupos de HLA basados en análisis de secuencias y especificidades de motivos de unión como se describe en Lund et al (2004) Immunogenetics 55(12)797-810 y Greenbaum et al (2011) Immunogenetics 63(6):325-35: HLA-DR1 (al*01:01;01*01:01), HLA-DR3 (a1*01:01;P1 *01:01), HLA-DR4 (a1*01:01;P1*04:01), HLA-DR7 (a1*01:01;P1*07:01), HLA-DR11 (a1*01:01;P1*11:01), HLA-DR13 (a1*01:01;P1*13:01), HLA-DR15 (a1*01:01;P1*15:01), HLA-DR51 (a1*01:01;p5*01:01) y HLA-DP4 (a1*01:03;p1*04:01). Estos alelos tienen una alta prevalencia en diferentes etnias (véase Wilson et al (2001) J Virol. 75(9):4195-4207).

Un péptido presente en una composición para su uso de acuerdo con la invención normalmente se une a al menos dos, preferentemente al menos tres, de los nueve alelos principales de HLA de clase II, tal como a al menos dos, preferentemente al menos tres, de los siete alelos de HLA de clase II descritos en el Ejemplo 10. Uno o más de los péptidos presentes en la composición pueden unirse al menos a cuatro, cinco, seis, siete, ocho o todos de los nueve alelos de HLA principales de clase II o al menos cuatro, cinco, seis o todos de los siete alelos de HLA de clase II descritos en el Ejemplo 10. La composición para su uso de acuerdo con la invención comprende péptidos que pueden unirse a al menos siete, al menos ocho o todos de los nueve de los principales alelos de HLA de clase II descritos anteriormente, tal como a todos de los siete alelos de HLA de clase II descritos en el Ejemplo 10.

El número de registros de unión a HLA de clase I contenidos en cada péptido puede determinarse determinando la capacidad del péptido para unirse a una gama de moléculas de HLA de clase I que se producen con frecuencia. La unión de HLA de clase I puede medirse usando el ensayo de unión de péptidos REVEAL® MHC de ProImmune (ProImmune Ltd, Oxford, RU). El ensayo de unión de péptidos REVEAL™ MHC mide la capacidad de cada péptido para estabilizar el complejo ternario MHC-péptido para HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*3501 representante de los principales supertipos de HLA de clase I. A cada péptido analizado se le otorga una puntuación en relación con un péptido de control de aprobación/rechazo y también se compara con un péptido de control positivo.

Las moléculas HLA de clase I se unen a péptidos cortos que tienen una longitud que varía de 8 a 11 aminoácidos. En teoría, 102 péptidos cortos (27 x 8 unidades monoméricas, 26 x 9 unidades monoméricas, 25 x 10 unidades monoméricas y 24 x 11 unidades monoméricas) podrían derivar de secuencias peptídicas de 35 unidades monoméricas. Para limitar el número de péptidos a probar, los ensayos de unión pueden llevarse a cabo usando solo péptidos nonaméricos (la longitud más frecuente para los péptidos de unión de HLA de clase I) con una buena puntuación de predicción basada en algoritmos disponibles públicamente.

Los siguientes alelos de HLA de clase I están altamente representados en poblaciones humanas y (2) pertenecen a supertipos de HLA bien definidos (http://bioinformatics.nmdp.org/): HLA-A*0101, HLA-A*0201, HLA-A*0301, HLA-A*2402, HLA-B*0702, HLA-B*0801, HLA-B*3501 y HLA-A*1101.

Un péptido presente en la composición para su uso de acuerdo con la invención normalmente comprende péptidos más cortos que se unen a al menos uno, preferentemente al menos dos o al menos tres de estos alelos de HLA de clase I, tal como a los primeros siete alelos de clase I enumerados anteriormente y preferentemente a los siete alelos de HLA de clase I mencionados en el Ejemplo 9. Uno o más de los péptidos presentes en la composición pueden comprender péptidos más cortos que se unen a al menos cuatro, cinco, seis o todos de los siete alelos de HLA de clase I. La composición para su uso de acuerdo con la invención comprende preferentemente péptidos que comprenden péptidos más cortos que pueden unirse a al menos cinco, al menos seis o todos de los siete alelos de HLA de clase I descritos anteriormente.

Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención comprende los péptidos como se define en las reivindicaciones que comprenden uno o más epítopos de células T que se unen a diferentes alelos de MHC para proporcionar una amplia cobertura de población. La composición comprende péptidos que se sabe o se prevé que contienen uno o más motivos de unión a MHC relacionados con alelos de MHC muy frecuentes en un grupo étnico específico o entre múltiples grupos étnicos. La composición comprende uno o más epítopos promiscuos de células T c D4+ y CD8+ que se unen a más de una variante alélica. La combinación de secuencias de péptidos en la composición proporciona epítopos de células T que se unen a diferentes subtipos de HLA.

En un aspecto, la composición para su uso de acuerdo con la invención también provoca una respuesta in vitro en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de al menos dos individuos con diferentes subtipos de HLA. La composición puede provocar una respuesta inmunitaria en al menos tres, cuatro, cinco, seis o siete individuos teniendo cada uno un genotipo HLA diferente, quienes pueden ser Individuos de diferentes etnias.

Fluorocarbono

El fluorocarbono puede comprender una o más cadenas derivadas de perfluorocarbono o radicales mixtos de fluorocarbono/hidrocarburo y puede ser saturado o insaturado, teniendo cada cadena de 3 a 30 átomos de carbono. Por lo tanto, las cadenas en la unión de fluorocarbono son normalmente saturadas o insaturadas, preferentemente saturadas. Las cadenas en el enlace de fluorocarbono pueden ser lineales o ramificadas, pero preferentemente son lineales. Cada cadena tiene normalmente de 3 a 30 átomos de carbono, de 5 a 25 átomos de carbono o de 8 a 20 átomos de carbono. Para enlazar covalentemente el vector de fluorocarbono al péptido, un grupo reactivo, o ligando, por ejemplo, -CO-, -NH-, S, O o cualquier otro grupo adecuado se incluye en el vector. El uso de dichos ligandos para lograr enlaces covalentes es bien conocido en la técnica. El grupo reactivo puede estar ubicado en cualquier posición del vector de fluorocarbono.

El acoplamiento del vector de fluorocarbono al péptido puede lograrse a través de grupos funcionales tales como -^{OH, -SH, -COOH y -NH}2^{, presentes de forma natural o introducidos en cualquier sitio del péptido. Algunos ejemplos}de tales enlaces incluyen enlaces amida, hidrazona, disulfuro, tioéter y oxima.

Opcionalmente, puede incorporarse un elemento espaciador (peptídico o no peptídico) para permitir la escisión del péptido del elemento de fluorocarbono para su procesamiento dentro de una célula presentadora de antígeno y para optimizar la presentación estérica del péptido. El espaciador también puede incorporarse para ayudar en la síntesis de la molécula y mejorar su estabilidad y/o solubilidad. Algunos ejemplos de espaciadores incluyen polietilenglicol (PEG) o aminoácidos tales como lisina o arginina que pueden escindirse mediante enzimas proteolíticas.

En una realización, el péptido enlazado a fluorocarbono puede tener la estructura química CmFn-CyHx-(Sp)-R o derivados de la misma, donde m = 3 a 30, n < 2m 1, y = 0 a 15, x < 2y, (m y) = 3 a 30 y Sp es un resto espaciador químico opcional y R es un péptido inmunogénico. Normalmente m y n satisfacen la relación 2m-1 < n < 2m 1 y preferentemente n = 2m 1. Normalmente x e y satisfacen la relación 2y-2 < x < 2y y preferentemente x = 2y. Preferentemente el resto CmFn-CyHx es lineal.

Se prefiere que m sea de 5 a 15, más preferentemente de 8 a 12. También se prefiere que y sea de 0 a 8, más preferentemente de 0 a 6 o de 0 a 4. Se prefiere que el resto CmFn-CyHx esté saturado (es decir, n = 2m 1 y x = 2y) y sea lineal y que m = 8 a 12 e y = 0 a 6 o 0 a 4.

En un ejemplo particular, el vector de fluorocarbono deriva de ácido 2H, 2H, 3H, 3H-perfluoroundecanoico de la siguiente fórmula:

Por lo tanto, una fijación de fluorocarbono preferida es el resto CsF17(CH2)2- saturado lineal que deriva de CbF17(CH2)2COOH.

Algunos ejemplos adicionales de fijaciones de fluorocarbono tienen las siguientes fórmulas: C6F13(CH2)2-, ^{C7F15(CH2)2-, CgF}1^g(CH2⁾2^{-, C5Fn(CH2)3-, C6F13(CH2)3-, C7F15(CH2)3-, CsF17(CH2)3- y CgF1g(CH2)3- que derivan de}C6F13(CH2)2COOH, C7F15(CH2)2COOH, C9F19(CH2)2COOH, C10F21(CH2)2COOH, C5F11(CH2)3COOH, C6F13(CH2)3COOH, C7F15(CH2)3COOH, C^bF17(CH2)3COOH y C9F19(CH2)^bCOOH respectivamente.

Los ejemplos preferidos de estructuras adecuadas para las construcciones vector-antígeno de fluorocarbono tienen la fórmula:

o

en la cual Sp y R son como se definen anteriormente. En determinadas realizaciones Sp deriva de un resto de lisina y tiene la fórmula -CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-. Preferentemente R es uno cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 14, preferentemente R es uno cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 6. El grupo amino del aminoácido N-terminal de cada péptido, por ejemplo, SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5 o 6, forma un enlace amida con el grupo carboxi C-terminal del espaciador de fórmula -CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-.

En el contexto de la actual invención, la unión de fluorocarbono puede modificarse de tal manera que el compuesto resultante todavía sea capaz de suministrar el péptido a las células presentadoras de antígenos. Por lo tanto, por ejemplo, varios de los átomos de flúor pueden reemplazarse por otros átomos de halógeno tales como cloro, bromo o yodo. Además, es posible reemplazar varios de los átomos de flúor con grupos metilo y aún conservar las propiedades de la molécula descrita en el presente documento.

Los péptidos pueden enlazarse al vector de fluorocarbono a través de un resto espaciador. El resto espaciador es preferentemente un resto de lisina. Este resto espaciador puede estar presente además de cualquier resto de lisina terminal como se describió anteriormente, para que el péptido pueda, por ejemplo, tener un total de cuatro restos de lisina N-terminales. En consecuencia, la formulación preferida para su uso de acuerdo con la invención puede comprender péptidos enlazados a fluorocarbono en los cuales los péptidos tienen un resto de lisina C-terminal o N-terminal, preferentemente un resto de lisina N-terminal. La lisina terminal en los péptidos está preferentemente unida ^{a un fluorocarbono que tiene la fórmula C}8^F17 ^(CH2⁾2^{COOH. El fluorocarbono está preferentemente acoplado a la}cadena épsilon del resto de lisina N-terminal.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprendan al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más péptidos inmunogénicos, cada uno opcionalmente unido covalentemente a su propio vector de fluorocarbono.

Otros componentes

La composición de la invención puede comprender un inmunógeno adicional. El inmunógeno puede ser un antígeno de células B. El antígeno de células B puede servir para estimular una respuesta de anticuerpos contra el VHB. Una composición farmacéutica de la invención puede, por ejemplo, comprender uno o más péptidos unidos a fluorocarbono, que puede estimular una respuesta de células T y un antígeno de células B.

Los inmunógenos adecuados que actúan como antígenos de células B incluyen antígenos proteicos tales como el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) o el antígeno central de la hepatitis B (HBcAg o HBeAg)

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende dos o más péptidos, tales como los péptidos enlazados a fluorocarbonos, que comprende además un adyuvante y/u opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente puede ser un estabilizante o un agente de carga necesario para una liofilización eficiente. Algunos ejemplos incluyen sorbitol, manitol, polivinilpirrolidona y mezclas de los mismos, preferentemente manitol. Otros excipientes que pueden estar presentes incluyen conservantes tales como antioxidantes, lubricantes, crioconservantes y aglutinantes bien conocidos en la técnica.

Un adyuvante es un agente que es capaz de modular la respuesta inmunitaria dirigida a un antígeno coadministrado mientras que tiene pocos o ningún efecto directo cuando se administra solo. Dichos adyuvantes pueden ser capaces de potenciar la respuesta inmunitaria en términos de magnitud y/o perfil de citocinas. Algunos ejemplos de adyuvantes incluyen: refinamientos naturales o derivados sintéticamente de componentes naturales de bacterias como el adyuvante de Freund y sus derivados, derivados de muramildipéptido (MDP), CpG, monofosforil lípido A; otros agentes adyuvantes o potenciadores conocidos tales como saponinas, sales de aluminio y citocinas; adyuvantes de aceite en agua, adyuvantes de agua en aceite, complejo inmunoestimulante (ISCOM), liposomas, nano y micropartículas formuladas; toxinas y toxoides bacterianos; inulina, particularmente gamma inulina; y agonistas de TLR.

Preferentemente, el adyuvante puede seleccionarse del grupo que consiste en: Peptidoglucano (tales como TDM, MDP, muramildipéptido, murabutida); solución de alumbre (tales como hidróxido de aluminio, ADJUMER™ (polifosfaceno) o gel de fosfato de aluminio); glucanos; algamulina; tensioactivos (tales como escualano, Tween 80, Pluronic o escualeno); gel de fosfato de calcio; toxinas o toxoides bacterianos (tales como holotoxina colérica, proteína de fusión toxina-colérica-Al-proteína-A-D-fragmento, subunidad B de la toxina colérica o copolímeros en bloque); liposomas que contienen citocinas; adyuvantes de agua en aceite (tales como el adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund o Montanide tales como ISA 51 o ISA 720); adyuvantes de aceite en agua (tal como MF-59); adyuvantes basados en inulina; citocinas (tales como interferón-gamma; interleucina-beta; interleucina-2; interleucina-7 o interleucina-12); ISCOM (tal como iscomatrix); microesferas y micropartículas de cualquier composición; y agonistas de los receptores tipo Toll (tales como CpG, ligandos de TLR 1-10 humano, ligandos de TLR 1-13 murino, ISS-1018, IC31, Imidazoquinolinas, Poli(I:C), Monofosforil lípido A, Ribi529, toxina colérica, toxina termolábil, Pam3Cys o Flagelina).

Preparación de composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención pueden prepararse solubilizando al menos un péptido, tal como un péptido enlazado a fluorocarbono, en ácido acético o en otros disolventes como una primera etapa en la formulación de un producto farmacéutico. Los ejemplos de otros disolventes que pueden usarse para dispersar uno o más de los péptidos unidos a fluorocarbono en la mezcla incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS), propan-2-ol, ferc-butanol, acetona y otros disolventes orgánicos. En el documento WO2012/090002 se describen enfoques para solubilizar conjugados de péptido-vector de fluorocarbono.

El péptido o péptido enlazado a fluorocarbono usado como material de partida normalmente se deseca. Los péptidos y los péptidos unidos a fluorocarbonos que comprenden péptidos de menos de 20 aminoácidos y/o que tienen menos del 50 % de restos hidrófobos pueden solubilizarse en un disolvente que no sea ácido acético. El ácido acético se usa normalmente cuando el péptido tiene más de 20 aminoácidos y/o tiene más del 50 % de restos hidrófobos.

La concentración de péptido enlazado a fluorocarbono en la solución normalmente es de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, tal como aproximadamente 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 2,5 mM o 5 mM. Un ejemplo de una concentración adecuada es aproximadamente 10 mg/ml.

Los componentes de entrada pueden combinarse juntos de manera homogénea en las proporciones deseadas con cualquier agregado disperso, esterilizado y presentado en un formato adecuado para su administración. Dichos ejemplos podrían incluir la introducción de una etapa de post-combinación o post-dilución de vórtex y/o sometimiento a ultrasonidos para facilitar la solubilización. Otras permutaciones del flujo del proceso de fabricación podrían incluir la filtración estéril que se realiza en una fase anterior del proceso o la omisión de la liofilización para permitir una presentación final líquida.

Cuando los diferentes péptidos o péptidos enlazados a fluorocarbonos se solubilizan por separado, por ejemplo, en diferentes disolventes o en diferentes concentraciones de ácido acético, los péptidos solubilizados o los péptidos enlazados a fluorocarbonos se combinan para crear una mezcla de péptidos o péptidos enlazados a fluorocarbonos. El adyuvante opcional y/o uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables también pueden añadirse al péptido solubilizado/péptido enlazado a fluorocarbono o mezcla de péptidos/péptidos enlazados a fluorocarbono. Normalmente, los péptidos enlazados a fluorocarbono solubilizados se mezclan con el excipiente y/o el adyuvante. Después de la solubilización y la mezcla, la solución de péptido o péptidos enlazados a fluorocarbono puede diluirse. Por ejemplo, la mezcla puede diluirse en agua.

La solución que contiene los péptidos o los péptidos enlazados con fluorocarbono se esteriliza preferentemente. Se prefiere particularmente la esterilización cuando la formulación está destinada a uso sistémico. Puede usarse cualquier medio adecuado de esterilización, tales como la esterilización UV o la esterilización por filtro. Preferentemente, se usa la esterilización por filtración. La filtración estéril puede incluir un filtro de 0,45 pm seguido de un tren de filtros de grado esterilizante de 0,22 pm.

La esterilización puede llevarse a cabo antes o después de la adición de excipientes y/o adyuvantes.

La composición para su uso de acuerdo con la invención puede estar en forma seca, tal como liofilizada.

La composición para su uso de acuerdo con la invención puede ser una solución acuosa, por ejemplo, una solución acuosa formada al disolver un liofilizado u otra formulación seca en un medio acuoso. La solución acuosa está normalmente a pH neutro.

El secado de la formulación facilita el almacenamiento a largo plazo. Puede usarse cualquier método de secado adecuado. Se prefiere la liofilización, pero pueden usarse otros métodos de secado adecuados, tales como secado al vacío, secado por pulverización, secado por pulverización por congelación o secado en lecho fluido. El procedimiento de secado puede dar como resultado la formación de una torta amorfa dentro de la cual se incorporan los péptidos o los péptidos enlazados a fluorocarbono.

Para el almacenamiento a largo plazo, la composición estéril puede liofilizarse. La liofilización puede lograrse mediante secado por congelación. El secado por congelación normalmente incluye la congelación y después el secado. Por ejemplo, la mezcla de péptidos enlazados a fluorocarbono puede congelarse durante 2 horas a -80 °C y secarse por congelación en una máquina de secado por congelación durante 24 horas.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables para su uso de acuerdo con la invención pueden ser composiciones sólidas. La composición de péptido enlazado a fluorocarbono puede obtenerse en forma de polvo seco. Una torta resultante de la liofilización puede molerse en forma de polvo. Una composición sólida para su uso de acuerdo con la invención, por lo tanto, puede tomar la forma de partículas que fluyen libremente. La composición sólida normalmente se proporciona en forma de polvo en un vial sellado, ampolla o jeringa. Si es por inhalación, el polvo puede proporcionarse en un inhalador de polvo seco. La matriz sólida puede proporcionarse alternativamente como un parche. Un polvo puede comprimirse en forma de comprimido.

La composición peptídica o de péptido enlazado a fluorocarbono seca, por ejemplo, liofilizada, puede reconstituirse antes de la administración. Como se usa en el presente documento, el término "reconstitución" se entiende que significa la disolución del producto de vacuna seco antes de su uso. Después del secado, tal como liofilización, el péptido inmunogénico, por ejemplo, el producto de péptido enlazado a fluorocarbono, preferentemente se reconstituye para formar una suspensión homogénea isotónica a pH neutro. La formulación normalmente se reconstituye en la fase acuosa, por ejemplo añadiendo agua para inyección, solución tampón de histidina (tal como tampón L-histidina 28 mM), bicarbonato sódico, Tris-HCl o solución salina tamponada con fosfato (PBS). La formulación reconstituida normalmente se dispensa en recipientes estériles, tales como viales, jeringas o cualquier otro formato adecuado para su almacenamiento o administración.

La composición puede almacenarse en un recipiente, tal como un vial estéril o una jeringa, antes de su uso.

Usos médicos

La invención proporciona la composición de la invención para su uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En particular, la composición de la invención se proporciona para su uso en un método de tratamiento o prevención de la infección por VHB. La composición de la invención provoca una respuesta inmunitaria que también puede ser útil en la profilaxis del VHB. La composición de la invención es preferentemente para su uso como una vacuna terapéutica para tratar individuos infectados con VHB. La composición de la invención es particularmente útil en el tratamiento de pacientes con infección por VHB crónica persistente, pero también puede usarse para tratar pacientes inmunotolerantes o portadores crónicos inactivos.

La presente invención proporciona una vacuna terapéutica como una tecnología disruptiva para el tratamiento del VHB crónico (CHB). Las composiciones de la invención potencian las respuestas de células T antivíricas que conducen al control inmunitario espontáneo de la infección por VHB. Esto permite el cese de la terapia NUC antivírica y podría conducir potencialmente a la curación serológica de la infección por VHB. La disminución de HBsAg se usa como un predictor de un resultado clínico mejorado a largo plazo. Los niveles de HBsAg pueden relacionarse con el número de hepatocitos infectados con VHB y están determinados por la actividad transcripcional del ADNccc intrahepático controlado por diversas citocinas. El tratamiento usando una composición de la invención puede conducir a la pérdida de HBsAg o a la seroconversión de HBsAg.

Las composiciones de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de pacientes con CHB tratados con NUC. Los péptidos también representan un tratamiento asequible para los pacientes con HBeAg positivo en los países en desarrollo que tal vez no puedan permitirse el lujo de un tratamiento NUC a largo plazo. La vacunación de pacientes tratados con NUC, ADN-VHB suprimidos, HBeAg negativos en particular con las composiciones peptídicas de la invención facilita y acelera la eliminación de HBsAg. Los pacientes HBeAg positivos también pueden ser tratados. Las composiciones de la invención también pueden usarse para tratar portadores inactivos de VHB.

La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con el hígado. Las composiciones de la invención se proporcionan para su uso en el tratamiento de insuficiencia hepática, hepatopatía terminal y carcinoma hepatocelular.

Las composiciones de la invención son útiles en la vacunación de pacientes con hepatitis delta (VHD), la forma más grave de hepatitis vírica, para quienes no existe una terapia aprobada y que solo se produce como una coinfección en individuos HBsAg positivos.

También se describe el uso de la composición farmacéutica de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de la infección por VHB, particularmente CHB, para tratar o prevenir insuficiencia hepática, enfermedad hepática en fase terminal o carcinoma hepatocelular, o para tratar o prevenir VHD.

De forma similar, se describe un método para tratar o prevenir la infección por VHB en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad profiláctica o terapéutica de una composición de la presente divulgación.

La composición para su uso de acuerdo con la invención puede administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico o profiláctico. Por ejemplo, el segundo agente puede comprender otro inmunógeno (tales como un antígeno globular o un antígeno recombinante o natural), para estimular aún más una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para estimular una respuesta inmunitaria humoral donde el péptido unido a fluorocarbono estimula una respuesta inmunitaria celular, al VHB. Se entiende que el segundo agente puede ser un antígeno de células B. Los antígenos de células B adecuados incluyen HBsAg, AgHBc y AgHBe.

En una realización preferida, el segundo agente es un agente conocido por su uso en un tratamiento terapéutico existente contra el VHB. El agente terapéutico existente contra el VHB puede ser un interferón, tal como el interferón-alfa o NUC, tales como entecavir y tenofovir. El tratamiento terapéutico del VHB puede ser un tratamiento que bloquee los tipos de células supresoras. Los agentes útiles en dichos tratamientos de bloqueo incluyen anticuerpos bloqueadores anti-PDl, anticuerpos bloqueantes anti-PDIL, anticuerpos bloqueantes anti-LAG3, anticuerpos bloqueantes anti-TIM3, anticuerpos bloqueantes anti-CTLA4 y ciclofosfamida.

Cuando se usa un segundo agente terapéutico o agente profiláctico junto con una composición de la invención, la administración puede ser simultánea o separada en el tiempo. La composición para su uso de acuerdo con la invención puede administrarse antes, junto con o después del segundo agente terapéutico.

Las composiciones para su uso de acuerdo con la invención pueden administrarse a un sujeto humano o animal in vivo usando una diversidad de rutas y técnicas conocidas. Por ejemplo, la composición puede proporcionarse como una solución, suspensión o emulsión inyectable y se administra por vía parenteral, subcutánea, oral, epidérmica, intradérmica, intramuscular, interarterial, intraperitoneal, inyección intravenosa usando una aguja y una jeringa convencionales, o usando un sistema de inyección de chorro líquido. La composición puede administrarse por vía tópica a la piel o al tejido de las mucosas, tales como por vía oral, por vía intratraqueal, por vía intestinal, por vía sublingual, por vía rectal o por vía vaginal, o se proporciona como un pulverizado finamente dividido adecuado para administración respiratoria o pulmonar. En una realización preferida, las composiciones se administran por vía intramuscular.

La composición puede administrarse a un sujeto en una cantidad que sea compatible con la composición de dosificación y que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La administración de la composición de la invención puede ser con un propósito "profiláctico" o "terapéutico". Como se usa en el presente documento, el término "terapéutico" o "tratamiento" incluye uno o más de los siguientes: la prevención de la infección o reinfección; la reducción o eliminación de síntomas; y la reducción o eliminación completa de un patógeno. El tratamiento puede efectuarse profilácticamente (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

La elección del vehículo, si se requiere, es frecuentemente una función de la vía de administración de la composición. Dentro de esta invención, las composiciones pueden formularse para cualquier vía y medio de administración adecuados. Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen aquellos usados en composiciones adecuadas para administración oral, ocular, rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, transdérmica).

La composición puede administrarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo como un líquido, sólido o aerosol. Por ejemplo, las formulaciones orales pueden adoptar la forma de emulsiones, jarabes o soluciones o comprimidos o cápsulas, que pueden tener un recubrimiento entérico para proteger el componente activo de la degradación en el estómago. Las formulaciones nasales pueden ser aerosoles o soluciones. Las formulaciones transdérmicas pueden adaptarse para su sistema de administración particular y pueden comprender parches. Las formulaciones para inyección pueden ser soluciones o suspensiones en agua destilada u otro disolvente o agente de suspensión farmacéuticamente aceptable.

La dosificación apropiada de la vacuna profiláctica o terapéutica a administrar a un paciente se determinará en la clínica. Sin embargo, como una guía, una dosis humana adecuada, que puede depender de la vía de administración preferida, puede ser de 1 a 1000 |jg, tal como aproximadamente 100 |jg, 200 |jg o 500 |jg. Pueden ser necesarias múltiples dosis para lograr un efecto inmunológico o clínico, que, si se requiere, se administrará normalmente entre 2 y 12 semanas de diferencia. Cuando se requiere potenciar la respuesta inmunitaria durante períodos más prolongados, pueden aplicarse dosis de repetición con un intervalo de 1 mes a 5 años.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1: Evaluación de la inmunogenicidad ex vivo de conjuntos de péptidos cortos derivados del VHB en PBMC humanas (solo para ilustración)

Métodos y materiales

Poblaciones

Sujetos infectados por VHB

Noventa y nueve sujetos, definidos clínicamente como infectados crónicamente con VHB, se inscribieron en un protocolo aprobado por REC en Imperial Healthcare NHS Trust, el Hospital NHS Foundation Trust de Chelsea y Westminster y Barts y el London NHS Trust en Londres. Tras el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos, se recogió sangre venosa fresca y se aislaron y crioconservaron PBMC y plasma en las 18 horas posteriores a la extracción de sangre. Estos sujetos se ajustaban a los siguientes criterios: Buena salud general, tratamiento específico del VHB: inhibidores de análogos de nucleósidos o nucleótidos antivíricos y/o terapia con interferón cuando esté clínicamente indicado, Estado clínico (infección crónica por VHB, HBeAg negativo y ALT normal, elevación persistente o intermitente), VIH negativo, VHC negativo y VHD negativo.

Sujetos control sanos

Se obtuvieron PBMC crioconservadas de 17 sujetos de CTL Technologies. Estos sujetos se ajustaban a los siguientes criterios: Buena salud general, No vacunados contra el VHB, Antígeno de superficie del VHB negativo, Anticuerpos centrales del VHB negativos, VIH negativos y VHC negativos

Cultivo a corto plazo de PBMC

Un vial de PBMC de cada sujeto (que contiene 1x107 células) se descongeló y se determinó el número de linfocitos usando un contador de células manual automatizado Scepter™. Las PBMC se cultivaron en 2 ml de medio de cultivo (CM: RPMI-1640 Glutamax suplementado con suero AB humano al 5 %) en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una concentración de 1 x 106 células/ml durante un total de 11 días. Las células se estimularon con un conjunto de péptidos que contenía 144 péptidos cortos derivados del VHB superpuestos (SEQ ID NO: 73 a 210 y SEQ ID NO: 214 a 219), que varían en longitud de 15-20 aminoácidos y en superposición de 10 a 13 aminoácidos, a una concentración final de 0,1 pg/péptido/ml. En el Día 4, se añadieron IL-2 e IL-15 a los cultivos a concentraciones finales de 10 UI/ml y 10 ng/ml respectivamente. En el Día 10, las células se lavaron dos veces en CM y se cultivaron con 10 UI/ml de IL-2 durante 1 día adicional. En el Día 11, las células se lavaron dos veces en CM, se contaron y se incorporaron en un ensayo ELISpot de IFNy humano o tinción de citocinas intracelulares.

Ensayo ELISpot de IFNy humano

Se recubrieron placas de filtro de PVDF multipantalla de noventa y seis pocillos (Millipore) durante la noche a 4 °C con 100 pl (1:80) de mAb de captura de IFN^yantihumano (R&D Systems). A continuación, las placas se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1 % y sacarosa al 5 % durante 2 h a 4 °C. Las células se sembraron en pocillos por triplicado a 5x104 PBMC/pocillo. Las concentraciones finales de antígeno usadas fueron: 22 conjuntos de péptidos cortos derivados del VHB (véase a continuación; obsérvese que el grupo 22 no pudo prepararse como péptidos con SEQ ID NO: 212 y 213 no pudieron dispersarse debido a la insolubilidad) y control de péptido negativo de 35 unidades monoméricas de VIH-3: 5 pg/péptido/ml; PHA control positivo: 1 pg/ml. Las placas ELISpot se ^{incubaron durante 18 h a 37 °C, 5 % de CO}2 ^{en un ambiente humidificado. Las placas se lavaron después y se}incubaron con 100 pl (1:80) de mAb de detección de IFNy antihumano biotinilado (R&D Systems) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se incubaron con una fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (1:80) durante 1 h seguido de un sustrato (30 min) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems). Las manchas desarrolladas se contaron usando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe).

continuación

Ensayo de tinción de citocinas intracelulares

Las células se colocaron en placa en una placa de fondo redondo de 96 pocilios a 5x105 PBMC/pocillo con estimulación de grupos de péptidos derivados de VHB a concentraciones finales de 5 pg/péptido/ml. La placa se ^{incubó a 37 °C en una incubadora al 5 % de CO}2 ^{durante 20 h. Para las 3 h finales del ensayo, se añadió}PMA/ionomicina a los pocillos respectivos y se añadió tapón de Golgi a todos los pocillos. Las células se recogieron y se lavaron con PBS BSA al 0,1 % (tampón de lavado) y se tiñeron con anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8 (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Después de otro lavado, las células se fijaron y se permeabilizaron con 100 pl de solución BD Cytofix/Cytoperm durante 20 minutos a 4 °C, seguido de dos lavados con solución 1x BD Perm/Wash. Finalmente, las células se tiñeron con ant-IL-2-FITC, anti-IFNY-PE y anti-TNFa PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences). La selección se basó en muestras estimuladas con medio para cada sujeto.

Determinación del genotipo del VHB infectante

Inicialmente se empleó un método de PCR anidado seguido de secuenciación directa de nucleótidos para el genotipado del VHB. Sin embargo, debido a la baja carga vírica en plasma de la mayoría de las muestras, no pudo determinarse el genotipo del VHB usando este método. Posteriormente se empleó el kit de inmunoensayo enzimático (EIA) del genotipo del VHB IMMUNIS®. Este ensayo usó cuatro epítopos dependientes del genotipo en la región PreS2 del HBsAg, determinándose los genotipos serológicamente mediante combinaciones positivas/negativas de cuatro EIA que eran específicos para cada uno de los epítopos.

Resultados

La etapa inicial en la identificación de regiones de interés en el proteoma del VHB fue la comparación de las respuestas IFN^yELISpot de PBMC de sujetos sanos no infectados con el VHB, no vacunados con los de sujetos HBeAg negativos infectados crónicamente por VHB - portadores inactivos en fase de control sostenido de la enfermedad y sujetos HBeAg negativos infectados crónicamente por VHB en tratamiento. Después de un cultivo a corto plazo con una biblioteca de péptidos cortos superpuestos (15-20 unidades monoméricas superpuestos por 10 13 aminoácidos), que representa aproximadamente el 70 % del proteoma del VHB, Las PBM^cse volvieron a estimular durante la noche con grupos de estos péptidos cortos que representan regiones específicas de interés dentro de la polimerasa del VHB, el núcleo, X y antígenos de superficie respectivamente. A continuación, se evaluaron las respuestas de IFN^ya estos conjuntos de péptidos usando un ensayo ELISpot de IFN^yhumano.

Se descubrió que los grupos que representan un número de regiones antigénicas estimulan las respuestas de IFN^yque eran específicas de los sujetos con VHB crónico. Específicamente, la estimulación con grupos que representan regiones terminales de la polimerasa del VHB (grupo 2 y grupo 3) y regiones del núcleo del VHB (grupos 14-17) dieron como resultado la mayor magnitud y cobertura de la población de las respuestas de IFNy en los sujetos infectados con el VHB (Figura 1). En un menor grado, los grupos 4 a 9 y los grupos 11 a 13 también tienden a promover respuestas de células T específicas del VHB.

Con el fin de establecer el papel del genotipo infectante del VHB en la naturaleza de las respuestas específicas del VHB a grupos cortos de péptidos, se determinó el genotipo del VHB infectante para cada sujeto. Esto se determinó mediante la evaluación del epítopo del antígeno de superficie del VHB en muestras de plasma. Las respuestas de IFN^yde PBMC tanto del control inmunitario como de los sujetos infectados por el VHB tratados se agruparon posteriormente de acuerdo con los genotipos del VHB A, B, C y D. Algunos sujetos no se clasificaron en estos genotipos debido a las limitaciones de sensibilidad del ensayo y la posible evaluación de sueros raros. Por lo tanto, estos sujetos no se incluyeron en esta evaluación. Los perfiles de respuesta entre los cuatro genotipos mostraron similitudes en cuanto a que las regiones que mostraban la mayor magnitud de respuestas de IFN^yestaban generalmente en la polimerasa terminal y en las regiones centrales del proteoma del VHB (Figura 2). Los grupos 2, 3, 10, 12, 14, 15, 16 y 17 parecen proporcionar respuestas frente a múltiples genotipos.

Con el fin de establecer el papel de los antecedentes genéticos del sujeto hospedador en la naturaleza de las respuestas específicas del VHB a grupos de péptidos cortos, los sujetos del estudio se agruparon según su origen étnico. Posteriormente se compararon las respuestas de IFN^yde PBMC de sujetos con control inmunitario y sujetos infectados con VHB tratados en tres grupos étnicos amplios, a saber, africano/árabe, caucásico y oriental/hindú. Los perfiles de respuesta entre los grupos étnicos volvieron a mostrar similitudes a través de la mayor magnitud de respuesta de IFN^y, con una alta cobertura de población asociada, encontrándose frente a grupos de la polimerasa terminal y las regiones centrales del proteoma del VHB (Figura 3). El grupo caucásico parecía diferir ligeramente de los otros dos grupos étnicos en que se encontró que la magnitud promedio de las respuestas a una serie de grupos era más alta en el grupo de sujetos tratados, en comparación con aquellos bajo control inmunológico. Los grupos 2, 3, 10, 14, 15, 16, 17 y 21 tienden a promover respuestas en múltiples grupos étnicos.

Finalmente, para describir más detalladamente el tipo de respuestas de IFNy por parte de PBMC a las agrupaciones de péptidos cortos, las células cultivadas a corto plazo se reestimularon durante la noche para la tinción de citocinas intracelulares. Después se evaluaron las células para la expresión de CD3, CD4, CD8 e ⁱFN^ypor citometría de flujo. Se hizo una comparación de las respuestas de ⁱFN^ya los conjuntos de péptidos cortos 2 y 14 en PBMC de sujetos sanos e infectados crónicamente por VHB (Figura 4). Estos fueron dos de los grupos de péptidos que provocaron las respuestas específicas de VHB más fuertes en el ensayo ELISpot de IFNy. De acuerdo con el ensayo IFNy ELISpot, se encontró una mayor expresión de IFNy específicamente en PBMC de sujetos infectados crónicamente por VHB. Aún más, se descubrió que esto era una respuesta dual de células T CD4 y CD8.

Ejemplo 2: Evaluación de la inmunogenicidad ex vivo de conjuntos de péptidos cortos asociados a densígeno derivados del VHB en PBMC humanas (solo para ilustración)

Métodos y materiales

Poblaciones

Sujetos infectados por VHB

104 sujetos, definidos clínicamente como infectados crónicamente con VHB, se inscribieron en un protocolo aprobado por REC en Imperial Healthcare NHS Trust, el Hospital NHS Foundation Trust de Chelsea y Westminster y Barts y el London NHS Trust en Londres. Tras el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos, se recogió sangre venosa fresca y se aislaron y crioconservaron PBMC y plasma en las 18 horas posteriores a la extracción de sangre. Estos sujetos se ajustaban a los siguientes criterios: Buena salud general, tratamiento específico del VHB: inhibidores de análogos de nucleósidos o nucleótidos antivíricos y/o terapia con interferón cuando esté clínicamente indicado, Estado clínico (infección crónica por VHB, HBeAg negativo y ALT normal, elevación persistente o intermitente), VIH negativo, VHC negativo y VHD negativo.

Sujetos control sanos

Cultivo a corto plazo de PBMC

Un vial de PBMC de cada sujeto (que contiene 1x107 células) se descongeló y se determinó el número de linfocitos usando un contador de células manual automatizado Scepter™. Las PBMC se cultivaron en 2 ml de medio de cultivo (CM: RPMI-1640 Glutamax suplementado con suero AB humano al 5 %) en placas de cultivo celular de 24 pocillos a una concentración de 1 x 106 células/ml durante un total de 11 días. Las células se estimularon con un conjunto de péptidos que contenía 144 péptidos cortos derivados del VHB superpuestos (SEQ ID NO: 73 a 210 y SEQ ID NO: 142 a 147), que varían en longitud de 15-20 aminoácidos y en superposición de 10 a 13 aminoácidos, a una concentración final de 0,1 pg/péptido/ml. En el Día 4, se añadieron IL-2 e IL-15 a los cultivos a concentraciones finales de 10 Ul/ml y 10 ng/ml respectivamente. En el Día 10, las células se lavaron dos veces en CM y se cultivaron con 10 Ul/ml de IL-2 durante 1 día adicional. En el Día 11, las células se lavaron dos veces en CM, se contaron y se incorporaron en un ensayo ELISpot de IFNy humano o tinción de citocinas intracelulares.

Ensayo ELISpot de IFNv humano

Se recubrieron placas de filtro de PVDF multipantalla de 96 pocillos (Millipore) durante la noche a 4 °C con 100 pl (1:80) de mAb de captura anti-IFNv humano (R&D Systems). A continuación, las placas se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1 % y sacarosa al 5 % durante 2 h a 4 °C. Las células se sembraron en pocillos por triplicado a 5x104 PBMC/pocillo. Las concentraciones finales de antígeno usadas fueron: 23 conjuntos de péptidos cortos asociados a Densígeno derivados del VHB (véase a continuación): 5 pg/péptido/ml; Control positivo de grupo de péptidos CEF: 1 pg/péptido/ml; PHA control positivo: 1 pg/ml. Las placas ELISpot se incubaron durante 18 h a ^{37 °C, 5 % de CO}2 ^{en un ambiente humidificado. Las placas se lavaron después y se incubaron con 100 pl (1:80) de}mAb de detección de IFN^yantihumano biotinilado (R&D Systems) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se incubaron con una fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (1:80) durante 1 h seguido de un sustrato (30 min) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems). Las manchas desarrolladas se contaron usando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe).

T l I n ifi i n i n l r 24 4

continuación

Ensayo de tinción de citocinas intracelulares (ICS)

Determinación del genotipo del VHB infectante

Resultados

Después de la detección de las respuestas a los conjuntos de péptidos cortos derivados del VHB, se identificaron regiones de interés de 35-40 unidades monoméricas. Estas regiones se evaluaron adicionalmente con vistas a usar péptidos de 35-40 unidades monoméricas en una vacuna. La evaluación adicional implicó el rediseño de grupos de péptidos cortos usados anteriormente para la reestimulación después de un cultivo a corto plazo. Los péptidos cortos terminales que se extendían más allá de las regiones de interés de 35-40 unidades monoméricas se retiraron de las agrupaciones para reflejar con mayor precisión los péptidos que se usarían en una vacuna. Después de un cultivo a corto plazo con la biblioteca de péptidos, como antes, estos conjuntos de péptidos cortos se usaron después para la reestimulación en ensayos ELISpot e ICS de IFN^yhumano.

La reestimulación con los grupos 24 a 46 indicó respuestas dominantes de células T específicas del VHB a regiones de polimerasa terminal (grupo 25 y grupo 26) y regiones centrales (grupos 38 y 39 y grupo 41 a 43) del proteoma del VHB (Figura 5). También se encontró una respuesta específica del VHB después de la estimulación con el grupo 45 de la región superficial. Las regiones de polimerasa correspondientes al grupo 28, grupo 32, grupo 33, grupo 36 y grupo 37 también dieron una respuesta significativa de células T.

Las respuestas de IFN^yELISpot a los conjuntos 24 a 46 se agruparon de acuerdo con el genotipo del VHB infectante (Figura 6). Los grupos 27, 28, 29, 32, 35, 36 dan cada uno respuestas predominantes contra el genotipo C. Los grupos 25 y 26 dan una respuesta predominante contra el genotipo D. Los grupos 30 y 31 dan una respuesta predominante contra el genotipo B. Los grupos 38, 42, 43 y 44 dan una respuesta predominante frente al genotipo A. Algunos grupos tienden a promover respuestas frente a más de un genotipo: dos genotipos para los grupos 26, 32, 33, 36 y 43, tres genotipos para los grupos 37, 38, 41 y 42 o incluso cuatro genotipos para el grupo 25.

Las respuestas de IFN^yELISpot a los conjuntos 24 a 46 se agruparon de acuerdo con el genotipo del VHB infectante (Figura 7). Los grupos 28, 29 y 30 dan una respuesta predominante en etnias oriental/hindú. Los grupos 25, 33, 34, 35 y 37 dan respuestas predominantes en caucásicos. Los grupos 38, 39, 41, 42 y 43 dan una respuesta predominante en etnias africanas/árabes. Algunos grupos tienden a promover respuestas en más de un grupo étnico: dos grupos étnicos para cada uno de los grupos 26, 39 y 43 o tres grupos étnicos para cada uno de los grupos 25, 38 y 42.

Los resultados se resumen en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4: Resumen de las respuestas predominantes de péptidos de regiones seleccionadas del proteoma del VHB frente a diferentes genotipos del VHB (A, B, C y D) y en pacientes de diferentes etnias (OI = oriental/hindú, C = caucásico, AA = africano/árabe). Cuando una región provoca una respuesta inmunitaria n r m l i l n i l HB m l i l ni l r r min n in i n n ri

Se seleccionaron ocho grupos para un análisis adicional de las respuestas de células T mediante tinción de citocinas intracelulares. Se estimularon PBMC de entre 7 y 14 sujetos (según la cantidad de células disponibles después del ensayo IFNy ELISpot) durante la noche con uno de los ocho grupos y se tiñeron las células para la expresión de CD3, CD4 y CD8 de superficie, junto con la expresión intracelular de IFN^y, TNFa e IL-2 (Figura 8). Se encontró expresión de IFN^yen ambas poblaciones de células T CD8 y CD4, con una amplitud de respuesta respectiva a 5/8 y 8/8 de los conjuntos de péptidos evaluados. De forma similar, la expresión de TNFa se encontró en poblaciones de células T CD8 y CD4 con una amplitud de respuesta del conjunto de péptidos de 3/8 y 6/8 respectivamente. Se descubrió que las células T CD8 no expresan ⁱL-2 después de la estimulación del grupo de péptidos, sin embargo, las células T CD4 expresaron IL-2 después de la estimulación con 7 de los 8 grupos.

Ejemplo 3: Construcción de péptidos de VHB enlazados a fluorocarbono

Los péptidos que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 24, 25, 28, 33, 34, 36, 37 y 38 y 222 se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida de FMOC (cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo). La cadena de fluorocarbono (CsF17(CH2)2COOH) se incorporó después en la cadena épsilon de una lisina N-terminal adicional de cada péptido para derivar el péptido unido a fluorocarbono. Los péptidos unidos a fluorocarbono purificados o los péptidos no modificados se obtuvieron mediante escisión en presencia de ácido trifluoroacético (TFA) y una purificación final mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC). Todas las preparaciones tenían una pureza del 90 % o superior.

FA-P113: K(FA)-VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK-NH2 (SEQ ID NO: 24);

FA-P151: K(FA)-PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF-NH2 (SEQ ID NO: 25);

FA-P376: K(FA)-KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSWRR-NH2 (SEQ ID NO: 28);

FA-753(K): K(FA)-KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK-NH2 (SEQ ID NO: 36);

FA-P856(K): K(FA)-LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK-NH2 (SEQ ID NO: 38);

FA-P877: K(FA)-PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR-NH (SEQ ID NO: 33);

FA-P277(K): K(FA)-RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK-NH2 (SEQ ID NO: 34),

FA-P797(K): K(FA)-SPHHTALRQAILSWGELMTLATWYGSNLEDPASRDKKK-NH2 (SEQ ID NO: 37);

^{FA-P1266(K): K(FA)-KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSW WTSLNFLKKK-NH}2 ^{(SEQ ID NO: 222)}

NP113: VGPLTVNEKRRLKLIMPARFYPNVTKYLPLDKGIK (SEQ ID NO: 24);

NP151: PEHVVNHYFQTRHYLHTLWKAGILYKRETTRSASF (SEQ ID NO: 25);

NP376: KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLLAQFTSAISSVVRR (SEQ ID NO: 28);

NP753(K): KKKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYRKKK (SEQ ID NO: 36);

NP856(K): LTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTKKK (SEQ ID NO: 38);

NP877: PPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRR (SEQ ID NO: 33);

NP277(K): RVSWPKFAVPNLQSLTNLLSSNLSWLSLDVSAAFYHKKK (SEQ ID NO: 34),

NP797(K): SPHHTALRQAILSWGELMTLATWVGSNLEDPASRDKKK (SEQ ID NO: 37);

NP1266(K): KKKGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLKKK (SEQ ID NO: 222).

Ejemplo 4: Formulación de péptido VHB largo

Un candidato a vacuna, FP02.1, compuesto por los nueve péptidos derivados de HBV conjugados con fluorocarbono preparados como se describe en el Ejemplo 3, se formuló como se describe a continuación. Las condiciones para la solubilización de péptidos se describen en la Tabla 5. Brevemente, cada uno de los nueve péptidos conjugados con fluorocarbono se pesó en un vial de vidrio de 5 ml. Cada péptido se solubilizó después con ácido acético del 2 al 12 % en soluciones acuosas para lograr una concentración de péptido de 10 mg. Las soluciones de péptidos (3,9 ml para cada péptido) se combinaron en un recipiente estéril de 150 ml antes de que se añadieran 3,9 ml de una solución de ácido acético al 10 % en agua. Después de agitar con un agitador magnético durante 2 minutos, se añadieron 39 ml de solución de manitol al 9,0 % en agua. Después de agitar con un agitador magnético durante 2 minutos adicionales, la solución se filtró usando un filtro Millex de 0,22 pm y 33 mm. Se enviaron 1,2 ml de la solución filtrada a viales de vidrio de 2 ml esterilizados en autoclave. La recuperación de la filtración medida por RP-HPLC fue > 95 %. Los viales se congelaron a -80 °C durante una hora. A continuación, las muestras se liofilizaron durante 36 horas. La ventilación de secado por congelación se realizó en nitrógeno y el taponamiento de los viales se realizó a una presión entre 40 y 60 kPa (400 y 600 mbar). La cantidad de péptido fue de 600 pg por péptido por vial; tras la reconstitución con 1,2 ml, la concentración final fue de 500 pg/péptido/ml.

T l n i i n l iliz i n r l r r i n FP 21

Ejemplo 5: Los péptidos y mezclas de VHB preferidos son inmunogénicos en portadores crónicos de VHB independientemente del estadio de la enfermedad, el genotipo del virus VHB y la etnia de los sujetos.

Métodos y materiales

Poblaciones

40 sujetos, definidos clínicamente como infectados crónicamente con VHB, se inscribieron en un protocolo aprobado por REC en Imperial Healthcare NHS Trust, el Hospital NHS Foundation Trust de Chelsea y Westminster y Barts y el London NHS Trust en Londres. Tras el consentimiento informado por escrito de todos los sujetos, se recogió sangre venosa fresca y se aislaron y crioconservaron PBMC y plasma en las 18 horas posteriores a la extracción de sangre. Estos sujetos se ajustaban a los siguientes criterios: Buena salud general, tratamiento específico del VHB: inhibidores de análogos de nucleósidos o nucleótidos antivíricos y/o terapia con interferón cuando esté clínicamente indicado, Estado clínico (infección crónica por VHB, HBeAg negativo y ALT normal, elevación persistente o intermitente), VIH negativo, VHC negativo y v Hd negativo.

Cultivo a corto plazo de PBMC

Un vial de PBMC de cada sujeto (que contiene 1x107 células) se descongeló y se determinó el número de linfocitos usando un contador de células manual automatizado Scepter™. Las PBMC se cultivaron en 2 ml de medio de cultivo (CM: RPMI-1640 Glutamax suplementado con suero AB humano al 5 %) en placas de cultivo celular de 24 pocilios a una concentración de 1 x 106 células/ml durante un total de 11 días. Las células se estimularon con una mezcla de los nueve péptidos largos derivados del VHB descritos en el Ejemplo 3.

Cada péptido se usó a una concentración final de 0,1 pg/péptido/ml. En el Día 4, se añadieron IL-2 e IL-15 a los cultivos a concentraciones finales de 10 Ul/ml y 10 ng/ml respectivamente. En el Día 10, las células se lavaron dos veces en CM y se cultivaron con 10 Ul/ml de IL-2 durante 1 día adicional. En el Día 11, las células se lavaron dos veces en CM, se contaron y se incorporaron en un ensayo ELISpot de IFN^y(interferón gamma) humano o tinción de citocinas intracelulares.

Ensayo ELISpot de IFNy humano

Se recubrieron placas de filtro de PVDF multipantalla de 96 pocillos (Millipore) durante la noche a 4 °C con 100 pl (1:80) de mAb de captura anti-IFNY humano (R&D Systems). A continuación, las placas se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1 % y sacarosa al 5 % durante 2 h a 4 °C. Las células de cultivos a corto plazo se sembraron en pocillos por triplicado a 5x104 PBMC/pocillo. Las concentraciones finales de antígeno usadas fueron: 5 pg/ml para cada péptido individual; PHA control positivo: 1 pg/ml. Las placas ELISpot se incubaron durante 18 h a 37 °C, 5 % de CO2 ^{en un ambiente humidificado. Las placas se lavaron después y se incubaron con 100 pl (1:80) de}mAb de detección de IFNy antihumano biotinilado (R&D Systems) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se incubaron con una fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (1:80) durante 1 h seguido de un sustrato (30 min) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems). Las manchas desarrolladas se contaron usando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe).

Ensayo de tinción de citocinas intracelulares

Las células del cultivo a corto plazo se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a 5x105 PBMC/pocillo con estimulación de 9 péptidos largos derivados de VHB (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), Np797(K), NP856(K), NP877 y Np 1266(K)) a concentraciones finales de 5 pg/ml. La placa se incubó a 37 °C en una incubadora al 5 % de CO2 durante 20 h. Para las 3 h finales del ensayo, se añadió PMA/ionomicina a los pocillos respectivos y se añadió tapón de Golgi a todos los pocillos. Las células se recogieron y se lavaron con PBS BSA al 0,1 % (tampón de lavado) y se tiñeron con anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8 (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Después de otro lavado, las células se fijaron y se permeabilizaron con 100 pl de solución BD Cytofix/Cytoperm durante 20 minutos a 4 °C, seguido de dos lavados con solución 1x BD Perm/Wash. Finalmente, las células se tiñeron con ant-IL-2-FITC, anti-IFNY-PE y anti-TNFa PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences) durante 30 minutos a 4 °C. Las muestras se adquirieron en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences). La selección se basó en muestras estimuladas con medio para cada sujeto.

Determinación del genotipo del VHB infectante

Resultados

Todos los péptidos promovieron respuestas de células T detectables en portadores de VHB, ya sea portadores inactivos negativos para HBeAg y sujetos tratados negativos para HBeAg (véanse las Figuras 9 y 10). Entre los diferentes péptidos probados, NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) y NP877 promueven el más alto nivel de respuestas en ambas poblaciones de pacientes y en la mayor proporción de sujetos. Sorprendentemente, la respuesta acumulada a NP113 y NP151 es mayor en ambas poblaciones en comparación con cualquier otra combinación de dos péptidos probados. Aún más, la respuesta acumulada a NP113, NP151 y NP376 induce el nivel más alto de respuesta en ambas poblaciones en comparación con cualquier otra combinación de tres péptidos probada. Como se muestra en la Figura 11, todos los péptidos probados promueven respuestas de células T de reactividad cruzada en los cuatro genotipos de VHB. Los péptidos NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) y NP877 promueven las respuestas más altas a través de los cuatro genotipos A, B, C y D en comparación con los péptidos NP2777(K) y NP1226(K). Sorprendentemente, P113 promueve la respuesta de células T más alta a través de los cuatro genotipos en comparación con todos los demás péptidos.

La Figura 12 muestra que todos los péptidos promueven respuestas de células T en todos los grupos étnicos probados. Los péptidos NP113, NP151, NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K) y NP877 promueven las respuestas más altas en los tres grupos étnicos en comparación con NP277(K) y NP1266(K).

Además, los nueve péptidos muestran la capacidad de promover respuestas de células T CD4 y/o CD8 productoras de citocinas Th1 como se mide por tinción de citocinas intracelulares en todos los genotipos de VHB (Figura 13). Ejemplo 6: Superioridad de los péptidos conjugados con fluorocarbono en comparación con los péptidos no conjugados en su capacidad para promover respuestas de células T in vivo

Métodos y materiales

La inmunogenicidad en ratones de FP02.1 (que contiene nueve péptidos conjugados con fluorocarbono) se comparó con la de NP02.1 (que contiene nueve péptidos no conjugados equivalentes). Se inmunizaron ratones hembra BALB/c (n = 7/grupo) por vía intramuscular con FP02.1 a una dosis de 50 |jg por péptido en un volumen de 50 j l o con NP02.1 (que contiene los péptidos del VHB no conjugados (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), Np856(K), NP877 y Np 1266(K)) a una dosis equimolar (respecto a FP02.1) de 43,8 jg por péptido en un volumen de 50 jl. Los ratones se inmunizaron el día 0 y se sacrificaron el día 14. Los esplenocitos se estimularon in vitro con 5 jg/ml/péptido de una mezcla de cada uno de los nueve péptidos del VHB descritos en el Ejemplo 3 durante 18 horas en un ensayo ELISpot.

Como alternativa, se estimularon los esplenocitos in vitro con 5 jg/ml/péptido de nueve péptidos individuales durante 18 horas en un ensayo ELISpot. Se contó el número de células formadoras de manchas de IFNy+ (SFC). Después se lavaron las placas con PBS, se incubaron con un anticuerpo marcado con peroxidasa de detección de IFNy, seguido de un sustrato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las manchas desarrolladas se contaron utilizando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe) para cuantificar el número de SFC IFNy+. Resultados

Se observaron respuestas de células T de magnitud significativamente mayor en ratones inmunizados con la mezcla de péptidos conjugados con fluorocarbono (FP02.1) en comparación con la mezcla equivalente de péptidos no conjugados (NP02.1) (véase la Figura 14). Debido a la restricción del MHC en el modelo singénico BALC/C, las respuestas inmunitarias estuvieron dominadas por cuatro de los 9 péptidos contenidos en la vacuna (péptidos NP113, NP151, NP376 y NP1266(K); véase la Figura 15).

Las respuestas inducidas por FP02.1 estuvieron dominadas por los péptidos NP113, NP151, NP376 y NP1266(K). Sorprendentemente, las respuestas inmunitarias contra el péptido P113 y P376 solo se observaron con la formulación que contenía los péptidos conjugados con fluorocarbono (véase la Figura 15).

En conclusión, la conjugación de un vector de fluorocarbono con las secuencias peptídicas derivadas del VHB promueve respuestas de células T más altas y más amplias en comparación con los péptidos no conjugados equivalentes.

Ejemplo 7: Los péptidos conjugados con fluorocarbono promueven una respuesta de células T CTL/CD8+ Métodos y materiales

La calidad de la respuesta inmunitaria inducida por FP02.1 (que contiene nueve péptidos conjugados con fluorocarbono) se evaluó en ratones. Se inmunizaron ratones hembra BALB/c (n = 7/grupo) por vía intramuscular con FP02.1 a una dosis de 25 jg por péptido en un volumen de 50 jl. Los ratones se inmunizaron el día 0 y se sacrificaron el día 14.

Los esplenocitos se estimularon in vitro con un epítopo CTL derivado del péptido NP113 (CTL1 KYLPLDKGI) o bien un epítopo CTL derivado de NP151 (CTL 2 HYFQ^tR^hYL) en concentraciones que van de 101 a 10-9 jg/ml durante 18 horas en un ensayo ELISpot. Se contó el número de SFC IFNy+. Después se lavaron las placas con PBS, se incubaron con un anticuerpo marcado con peroxidasa de detección de IFNy, seguido de un sustrato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las manchas desarrolladas se contaron utilizando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe) para cuantificar el número de SFC IFNy+.

Resultados

Como se muestra en la Figura 16, FP02.1 promueve respuestas de células T contra epítopos de CTL restringidos por moléculas MHC de clase I después de una sola inmunización.

Ejemplo 8: Sinergia entre fluorocarbono-péptidos contenidos en una misma formulación

Métodos y materiales

Se evaluó la inmunogenicidad de FA-P113 en ratones administrado en ratones solo o como parte de una formulación conjunta con otros péptidos conjugados con fluorocarbono (FP02.1). Se inmunizaron ratones hembra BALB/c (n = 7/grupo) por vía intramuscular con FA-P113 a una dosis de 25 jg o FP02.1 a una dosis de 25 jg por péptido en un volumen de 50 pl. Los ratones se inmunizaron el día 0 y se sacrificaron el día 14. Los esplenocitos se estimularon in vitro con 5 pg/ml de NP113 (no conjugado con un vector de fluorocarbono) durante 18 horas en un ensayo ELISpot. Se contó el número de SFC IFNy+. Después se lavaron las placas con PBS, se incubaron con un anticuerpo marcado con peroxidasa de detección de IFNy, seguido de un sustrato, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las manchas desarrolladas se contaron utilizando un sistema de recuento de placas automatizado (CTL Europe) para cuantificar el número de SFC IFN^y+.

Resultados

Se observó una mayor magnitud de respuestas de células T específicas de NP-113 en ratones inmunizados con la mezcla de péptidos conjugados con fluorocarbono (FP02.1) que con FA-P113 solo (véase la Figura 17).

Ejemplo 9: Los péptidos y combinaciones de VHB preferidos contienen epítopos que tienen la capacidad de unirse a una amplia gama de moléculas de HLA de clase I

Métodos y materiales

Se usó el ensayo de unión Prolmmune REVEAL para determinar la capacidad de los péptidos cortos de nueve aminoácidos (derivados de los péptidos largos NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) de unirse a uno o más alelos de MHC de clase I y estabilizar el complejo MHC-péptido. La detección se basa en la presencia o ausencia de la conformación nativa del complejo MHC-péptido. Los alelos de HLA de clase I altamente frecuentes (HLA-A*0201, A*0301, A*1101, A*2402, B*0702, B*0801 y B*3501) fueron seleccionados. La unión a moléculas del MHC se comparó con la de un epítopo de células T conocido, un péptido de control positivo, con propiedades aglutinantes muy fuertes. Todos los nonámeros potenciales para cada péptido del VHB (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753(K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)), excepto aquellos que contenían lisinas extra que no estaban presentes en las secuencias de consenso del VHB, se sintetizaron con una pureza >90 %. La puntuación del péptido de prueba se informa cuantitativamente como un porcentaje de la señal generada por el péptido de control positivo, y se indica que el péptido tiene un resultado putativo de aprobación o fallo. Se consideran buenos aglutinantes aquellos péptidos con puntuaciones del 45 % del control positivo según lo definido por Prolmmune.

Resultados

Los resultados que se muestran en la Tabla 6 representan el número de nonámeros derivados de cada péptido largo del VHB (NP113, NP151, NP277, NP376, NP753, NP797, NP856, NP877 y NP1266) que tienen una puntuación de unión >= 45 % para cada alelo del HLA. Todos los péptidos largos del VHB contienen al menos seis epítopos que tienen la capacidad de unirse a al menos 4 alelos. Cualquier combinación de seis péptidos largos contiene epítopos nonámeros que tienen la capacidad de unirse a todos los alelos probados.

Tabla 6: Número de nonámeros derivados de cada péptido largo del VHB (NP113, NP151, NP277(K), NP376, NP753 (K), NP797(K), NP856(K), NP877 y NP1266(K)) que tienen una puntuación de unión >= 45 % para cada alelo del HLA de clase I. (a) representa el número total de epítopos de unión detectados para cada péptido ^

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por VHB, comprendiendo la composición:

en donde cada péptido tiene hasta 60 aminoácidos de longitud.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde cada uno del primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo y noveno péptidos está enlazado a un vector de fluorocarbono.

3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un adyuvante.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada uno del primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo y noveno péptidos consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 24, 25, 28, 33, 34, 36, 37, 38 y 222, respectivamente.