JP2021520414A - Ｔ細胞を誘発するワクチン組成物の組合せ及びその使用 - Google Patents

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Abstract

それを必要とする対象において抗原特異的なT細胞を誘発する応答を増強するための組合せワクチン及び方法が本明細書で提供される。本方法は、全身性ワクチン接種を、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含有する第1組成物、及び/又は、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを有する第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原特異的なCD8+T細胞を誘発するための抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、並びに任意選択で免疫モジュレーター組成物を含む第3組成物と組み合わせる。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容がその全体においてそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている、2018年4月4日に出願した米国仮特許出願第62/652,478号、及び2018年4月04日に出願した第62/652,484号の優先権を主張する。
本出願は一般的に、プライム用量（prime dose）、及び/又は異種（heterologous）ブースト用量（boost dose）、並びに任意選択で免疫阻害剤用量を含む組合せワクチン、並びに、抗原特異的CD8+T細胞応答を誘発する方法に関係する。
ワクチンは、その能力が、細胞内病原体及びがんにより誘発される疾患に対抗して重要な役割を果たすことが知られている強固なCD4+及び/又はCD8+T細胞応答を促進させることに限定されている。その唯一の例外が結核に対抗するBCGワクチンであり、BCGワクチンは、主にT細胞の誘発により防御を行っているようである。
感染細胞又は腫瘍細胞のクリアランスに直接寄与する、十分な規模のCD4+及び/又はCD8+T細胞並びにエフェクター機能を誘発するように設計されたT細胞を誘発するワクチンを生成するためにかなりの努力が払われてきた。送達システム又は組換えウイルスベクターと組み合わせて合成ペプチド又はDNAを使用するワクチンは、細胞内に抗原を送達する又は発現する能力をもたらすことにより、細胞媒介性免疫を誘発するという特別な目的がある。しかし、抗原/免疫原/ペプチドのプライム用量及びブースト用量が同じ送達担体及び/又はベクターを介して免疫系に提示される同種プライム-ブーストレジメンは、強固で、持続性のある抗ウイルス及び抗腫瘍T細胞免疫の生成における能力が限定されているため、有意な臨床効果を実証できていない。
異なる送達担体及び/又はベクターを使用する異種プライム-ブーストワクチン接種は、T細胞免疫誘発のための同種プライム-ブーストと比較して、以下の理由で有望な戦略を意味する:i)抗ウイルスベクター抗体応答の減弱は、ワクチン-抗体免疫複合体を介したワクチンのクリアランスを介して、標的抗原に対抗する免疫を妨害することが知られている、及びii)免疫応答を異なる方式で刺激し、相乗的に働く異なるワクチン技術が期待されている。異種プライム-ブースト手法は様々な組成のワクチンを考察してきたが、最近では臨床開発のためのDNA/ウイルスベクター又はウイルスベクター/ウイルスベクターの組合せに主に焦点を絞っている。強く、持続性のあるT細胞免疫を刺激することが期待される、異種プライム/ブーストワクチン戦略は、急性及び慢性ウイルス感染症、がん、アレルギー及び自己免疫には特に興味深いものである。
がん又は慢性ウイルス感染症に対抗するワクチンとは、他の治療法と比較して、高い特異性、好ましい安全性プロファイル、容易に入手可能な適応性及び生涯にわたる抗腫瘍免疫の保証を提供するための興味深い手法を意味する。T細胞ワクチンが大きく改善されたとしても、全体的には、これらは依然として進行がん又は慢性ウイルス感染症を有する患者において単剤治療としていかなる臨床的利点も提供できていない。
がん及び慢性ウイルス感染症の状況で、免疫抑制機構は、ワクチン免疫療法からもたらされる抗原特異的T細胞のエフェクター活性を阻止又は減少させる。これら免疫抑制機構は、抑制性骨髄性細胞、腫瘍関連マクロファージ、T制御性細胞及び/又はT細胞上に発現される阻害性受容体により直接的又は間接的に発揮され得る。結果的に、抗免疫抑制剤、例えば、チェックポイント遮断阻害剤、抑制性骨髄性細胞阻害剤、又は抑制性骨髄性細胞の再プログラミング若しくは再分極に関与する化合物とは、ワクチン免疫療法からもたらされる抗原特異的T細胞の誘発及び抗ウイルス又は抗腫瘍機能を改善する可能性を有するクラスの治療用薬物を意味する。加えて、T細胞、サイトカイン若しくは免疫刺激剤により発現される共刺激受容体を標的とする薬剤などの免疫賦活剤もまた、ワクチン免疫療法からもたらされる抗原特異的T細胞の誘発及び抗ウイルス機能又は抗腫瘍機能を改善するために使用することができる。
よって、特にがん及び慢性感染症の状況で、細胞媒介性免疫応答を誘発するより強固なワクチン組成物に対する必要性が存在する。
本明細書に提供されている一部の実施形態は、組合せワクチン及び異種プライムブースト投与レジメンを投与する方法を含み、この場合、プライム用量のワクチン組成物はブースト用量と異なるが、ただし、各用量が1つ以上のCD8+T細胞エピトープ(同じもの)を含むものとする。言い換えると、ワクチン組成物は、少なくとも1つの共通のCD8+T細胞エピトープを有するポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物はT細胞を誘発するワクチン組成物である。ワクチンは、防御抗体応答をもたらすB細胞に対する補助がCD4+T細胞のみの場合と比較して、細胞媒介性エフェクター機序を介して病原体又は腫瘍クリアランスに直接寄与する十分な規模のCD4+及び/又はCD8+T細胞並びに必要な表現型又はエフェクター機能を誘発するように設計されている。
ある特定の実施形態では、a)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、及びb)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を含む組合せワクチンが提供される。実施例1を参照されたい。第1又は第2組成物のうちのいずれかがプライム組成物又はブースト組成物であってよい。ある特定の実施形態では、組合せワクチンは、抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤を含む免疫モジュレーターをさらに含んでもよい。
一部の実施形態では、非複製ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルス（poxvirus）ベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはE1及びE3欠損アデノウイルスベクターである。
例示的実施形態では、組合せワクチンは、がんワクチン又は慢性感染症ワクチン(予防用又は治療用)として免疫応答を誘発する方法に使用される。がんワクチンに関しては、患者に特異的な抗原を見出すのはさほど難題ではないが(ただし、依然として重要ではある)、必要とされる免疫応答を誘発するより免疫原性な方法を開発することは、自己抗原に対する免疫学的耐性（immunological tolerance）を破壊する必要があるので難題である。出願人らは本明細書で免疫原性の高い投与レジメンを提供し、本明細書で試験したネズミ（murine）腫瘍モデルにおいて、この異種投与レジメンは、同種投与と比較すると共力剤（synergist）である。実施例3及び図1〜2を参照されたい。
したがって、それを必要とする対象において免疫応答(例えば、抗原CD8+T細胞応答)を誘発する方法であって、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、及びフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書で提供される。第1組成物又は第2組成物のうちの1つはプライム用量として投与され、他方の第1組成物又は第2組成物のうちの1つはブースト用量として投与されるが、ただし、第1組成物と第2組成物の両方が投与されるものとする。
本明細書に提供されるさらなる実施形態は、組合せワクチン及び組合せワクチンのこれらの組成物を投与する方法であって、この組合せがT細胞を誘発するワクチン組成物、及び免疫チェックポイント阻害剤又は骨髄由来の抑制細胞(MDSC)阻害剤から選択される免疫阻害剤を含む組成物を含む、方法を含む。T細胞を誘発するワクチン組成物は、防御抗体応答をもたらすB細胞に対する補助がCD4+T細胞のみの場合と比較して、細胞媒介性エフェクター機序を介して病原体又は腫瘍のクリアランスに直接寄与する十分な規模のCD4+及び/又はCD8+T細胞並びに必要な表現型又はエフェクター機能を誘発するように設計されたワクチンである。一部の実施形態では、ワクチン組成物は、少なくとも1つのCD8+T細胞エピトープを有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、本発明のT細胞を誘発するワクチン組成物は、非複製ウイルスベクター又はフルオロカーボン連結ペプチド(複数可)のいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、又は、b)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、及びc)抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含む組合せワクチンが提供される。
一部の実施形態では、抗免疫抑制剤は、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL1、GAL3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、CD244、ADAM17、COX2、PGE-2、iNOS2、PDE5、c-kit、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ（Caspase）-8、CCL2、RON、ROS、又はS100A8/A9を標的とする。一部の実施形態では、抗免疫抑制剤は、ペムブロリズマブ(KEYTRUDA)、ニボルマブ(OPDIVO)、セミプリマブ(LIBTAYO)、アテゾリズマブ(TECENTRIQ)、アベルマブ(BAVENCIO)、デュルバルマブ(IMFINZI)イピリムマブ(YERVOY)、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、KN035、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100又はJS001である。
ある特定の他の実施形態では、抗免疫抑制剤は、PGE-2、COX2、NOS2、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ-8、CCL2、RON、ROSS100A8/A9又は肝臓-X核内受容体を標的とするMDSC阻害剤である。一部の実施形態では、MDSC阻害剤は、PF-5480090、INCB7839、ニトロ-アスピリン、SC58236、セレコキシブ、IPI-549、PLX3397、BLZ945、GW2580、RG7155、IMC-CS4、AMG-820、ARRY-382、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、N-ヒドロキシ-ノル-L-アルギニン（N-hydroxy-nor-L-Arg）、イマチニブ、z-IETD-FMK、トラベクテジン、エムリカサン、抗CCL2抗体(カルルマブ又はABN912)、タスクイニモド（Tasquinimod）、ASLAN002、IMC-RON8、又はGW3965である。
ある特定の実施形態では、免疫賦活剤は、Toll様受容体(TLR)3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、STING、cGAS、IFR3、IL-2受容体、IL12受容体又はIFN-アルファ受容体を標的とする。ある特定の実施形態では、免疫賦活剤は、IMO-2125、SD-101、DV281、ADZ1419、PF-3512676(AGATOLIMOD)、CMP-001、レフィトリモド、IC31、MEDI9197、RO6864018、RO7020531、GS-9620、AZD8848、LFX453、CV8102、モトリモド(VTX-2337)、BDB001、HILTONOL、KIN131A、MK-4621(RGT100)、イナリギビル(Inarigivir、SB9200)、MIW815(ADU-S100)、MK-1454、BMS-986301、SB11285、IL-2、IL-12、又はIFN-αである。
一部の実施形態では、非複製ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはE1及びE3欠損アデノウイルスベクターである。
ある特定の実施形態では、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原のペプチドをコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含む組合せワクチンが本明細書で提供される。ある特定の他の実施形態では、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含むワクチン組成物が本明細書で提供される。
例示的実施形態では、組合せワクチンは、がんワクチン又は慢性感染症ワクチン(予防用又は治療用)として、免疫応答を誘発する方法に使用されている。出願人らは、免疫原性の高い投与レジメンであって、本明細書で試験したネズミ腫瘍モデルにおいて、免疫モジュレーター又はT細胞を誘発するワクチン組成物単独と比較して、T細胞を誘発するワクチンが、免疫チェックポイント阻害剤又は骨髄由来の抑制細胞(MDSC)阻害剤から選択される免疫モジュレーターとの共力剤である、投与レジメンを本明細書で提供する。実施例5及び7を参照されたい。
したがって、それを必要とする対象において免疫応答(例えば、抗原CD8+T細胞応答)を誘発する方法であって、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原若しくは免疫原のペプチドをコードしている非複製ウイルスベクターを含む組成物を投与するステップ、又はフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む組成物を投与するステップであって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、ステップ、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む組成物を別個に投与するステップを含む方法が本明細書で提供される。
本明細書の一部に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示の1つ以上の実施形態を、詳細な説明及び実施例セクションと一緒に例示し、本開示の原理及び実施を説明するように機能する。
プライム用量の投与から24日後、各グループに対して計算した、脾臓細胞100万個当たりのIFN-γ生成細胞(スポット形成細胞、SFC)の数として表現された、4個のペプチドに対する累積的IFN-γELISpot応答を示す図である。グループ5(プライム用量としてAdGP70及びブースト用量としてPepGP70)及び6(プライム用量としてPepGP70及びブースト用量としてAdGP70)は、同種プライムブーストグループ(グループ1〜4)と比較して共力剤作用を示す異種プライムブースト投与レジメングループである。実施例1及び3を参照されたい。 プライム用量の投与から24日後、デキストラマー染色に対して陽性のCD8+T細胞のパーセンテージを示す図である。グループ1〜4の動物を同種プライムブースト投与レジメン(AdGP70又はPepGP70)の対象下におき、グループ4及び5の動物を異種プライムブースト投与レジメンの対象下においた。AdGP70をプライム用量として、PepGP70をブースト用量として(グループ5)、又は、PepGP70をプライム用量として、AdGP70をブースト用量として(グループ6)投与した。実施例3を参照されたい。 個々に又はプライム-ブースト組合せとして試験したワクチン組成物PepGP70及びAdGP70が、抗腫瘍免疫応答を促進するこれらの能力において抗PD1処置との相乗作用を発揮することを示す図であり、試験では抗原特異的CD8+T細胞を6日目(D6)及び20日目(D20)に測定した。グループ1の動物にはPepGP70(プライム及びブースト用量として)＋抗PD1を投与した。グループ2の動物にはAdGP70(プライム及びブースト用量として)＋抗PD1を投与した。グループ3の動物にはAdGP70をプライム用量として、PepGP70をブースト用量としてプラス抗PD1を投与した。グループ4の動物にはPepGP70をプライム用量として、AdGP70をブースト用量として＋抗PD1を投与した。グループ5の動物には抗PD1のみを投与した(対照)。グループ6の動物にはいかなる処置も施さなかった(対照)。AH1ペプチドはT細胞エピトープSPSYVYHQF(配列番号72)であり、GP70-472及びGP70-CM中に存在する。実施例1、2及び5を参照されたい。 FP-OVAワクチンに対するIFN-γELISpot応答を、賦形剤グループと比較して(図4A)、及び、E.G7-OVA腫瘍モデルに対抗する、FP-OVAワクチンの全生存率（overall survival）という点での抗腫瘍活性を、賦形剤と比較して示す図である(図4B)。図4Bの動物は、24日目にE.G7-OVA細胞による誘発を行い、事前に投与されたワクチン組成物が腫瘍成長による死亡に対抗する防御を提供した。実施例6を参照されたい。 E.G7-OVA腫瘍モデルに対抗する、FP-OVAワクチンの腫瘍成長の阻止という点での抗腫瘍活性(図5B)を、賦形剤と比較して(図5A)示すずである。図5Bの動物は、24日目にE.G7-OVA細胞による誘発を行い、0日目及び14日目に事前投与されたワクチン組成物が腫瘍成長に対抗する防御を提供した。実施例6を参照されたい。 E.G7-OVA腫瘍モデルに対抗する、FP-OVAワクチンの全生存率という点での抗腫瘍活性(グループ1及び2)を、賦形剤(グループ3)と比較して示す図であり、動物にE.G7-OVA細胞による誘発を行った後で、動物にワクチン組成物が投与され、これによりワクチン組成物の治療効果が実証された。 個々に又は抗PD1と組み合わせて試験したワクチン組成物PepGP70又はAdGP70は、抗腫瘍免疫応答を促進するこれらの能力において抗PD1処置との相乗作用を発揮することを示す図であり、試験では腫瘍サイズを数日の期間にわたり測定した。グループ1(AdGP70)では腫瘍のない動物が43%のみであったが、これに対してグループ2(AdGP70＋抗PD1)では腫瘍のない動物が79%得られた。グループ3(PepGP70)では腫瘍のない動物が15%のみであったが、これに対してグループ4(PepGP70＋抗PD1)では腫瘍のない動物が62%得られた。抗PD1単独では、腫瘍のない動物は29%のみ得られた。実施例7を参照されたい。 各グループ:免疫チェックポイント阻害剤抗PD1と組み合わせた、及び組み合わせない、アデノウイルスベクターGP70(図8A)、及びフルオロカーボン連結GP70ペプチド(図8B)、に対する全生存率を示す図である。実施例7を参照されたい。
序文
本発明は、T細胞応答の増強を誘発させるための組成物及び方法を提供する。特に、本発明の組合せワクチンは、持続性ウイルス感染症及びがんを制御する上で、T細胞媒介性免疫を予防的又は治療的に誘発する。提供される方法及び組成物は、T細胞応答の誘発をもたらす異種ワクチンプライム用量及びブースト用量を投与することを含み、この場合、「異種」とは、ブースト用量とは異なるプライム用量を意味するが、ただし、両方とも少なくとも1つの、又は1つより多くの同じT-細胞エピトープを含むものとする。ある特定の実施形態では、異種とは、抗原/免疫原/ペプチドが、異なる送達担体及び/又はベクターを介して免疫系に提示されるプライム用量及びブースト用量を意味する。出願人らは、異なるT細胞を誘発するワクチンの投与(例えば、抗原をコードしているウイルスベクター、及びこの抗原発現ウイルスベクターとT細胞エピトープを共有して含むペプチドを含有するミセル)は、抗原特異的なT細胞応答の誘発を相乗的にブーストすることを見出した。実施例3を参照されたい。一部の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、1つ以上の同じCD8+T細胞エピトープを含む。ある特定の実施形態では、プライム用量及び/又はブースト用量のポリペプチドもまた1つ以上のCD4+T細胞エピトープを含む。
抗原/免疫原の配列は同じでなくてもよいが、プライム及びブースト用量の少なくとも1つ以上のT細胞エピトープにおいて重複が存在しなければならない(例えば、一方は全長であってよく、他方は全長抗原から誘導される、キメラペプチドを含めた短いペプチドであってよい)。これらのT細胞エピトープは、例えば、公開された報告に基づいて（complied from）クラスI及び/若しくはクラスII MHC分子に結合することが知られているペプチド配列を含有するデータベース若しくはウェブサイト(例えば、SYFPEITHIウェブサイト)を含めた、公開された参考文献から得たものを含む当技術分野で周知の技術、又はアルゴリズム、例えば、人工神経ネットワーク(ANN)若しくは安定化したマトリックス法(SMM)(例えば、免疫エピトープデータベース及び分析資源ウェブサイトを使用)を使用して抗原又は免疫原に同定することができる。実施例1を参照されたい。一部の実施形態では、プライム及びブースト用量は、1つ以上の共有されたCD8+T細胞エピトープを含む。
ある特定の実施形態では、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、及びフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を含む組合せワクチンが本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、第1組成物がプライム用量であり、第2組成物がブースト用量である。ある特定の他の実施形態では、第1組成物がブースト用量であり、第2組成物がプライム用量である。
本明細書で使用される場合、「異種投与レジメン」は、プライム用量及びブースト用量を意味し、抗原/免疫原/ペプチドは異なる送達担体及び/又はベクターを介して免疫系に提示される。例えば、本発明において、第1組成物(プライム用量又はブースト用量のいずれかとして)は、ウイルスベクターに組み込まれた（viral vectored）抗原又は免疫原を含み、第2組成物(プライム用量又はブースト用量のいずれかとして)はフルオロカーボン連結ペプチドを含み、このペプチドはウイルスベクターに組み込まれた抗原又は免疫原と共通した1つ以上のT細胞エピトープを含む。言い換えると、ある特定の実施形態では、本発明の組合せワクチンは、2つの異なるT細胞を誘発するワクチン組成物（two different T cell inducing vaccine compositions）であって、各組成物は同じ抗原に対抗して抗原特異的なCD8+T細胞を誘発する。
出願人らは、アデノウイルスベクターに組み込まれた抗原及びフルオロカーボン連結ペプチドを有する異種投与レジメン(少なくとも1つのプライム用量及び少なくとも1つのブースト用量が投与される)は、アデノウイルスベクターに組み込まれた抗原又はフルオロカーボン連結ペプチドのいずれかを有する同種投与レジメンと比較して、誘発された免疫応答の共力剤作用を提供することを見出した。実施例3、並びに図1及び2を参照されたい。図1及び2のグループ5及び6は、異種投与レジメンを投与した動物を、同種投与レジメンを投与した動物を表すグループ1〜4と比較して表している。異種プライム用量及びブースト用量の投与は、図1及び2で実証されているように、抗原特異的なCD8+T細胞応答を誘発する。
ある特定の実施形態では、本発明の組合せワクチンは腫瘍を処置するための治療剤として、及び/又はがんに対抗する予防剤として使用される。本発明の組合せワクチンの共力剤作用を使用して、ある特定の腫瘍を処置することができる。実施例4を参照されたい。ある特定の他の実施形態では、本発明の組合せワクチンは、慢性感染症を処置するための治療剤として使用されている。
ある特定の実施形態では、本発明の組合せワクチンは、抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーター組成物を含む第3組成物をさらに含む。ある特定の免疫チェックポイントタンパク質、例えば、T細胞上のPD1及び腫瘍細胞上のPD-L1は、免疫応答がこれら腫瘍に対して沈黙し続けるのを助け、PD1がPD-L1に結合された場合、その相互作用は、T細胞がこれら腫瘍細胞を死滅させるのを阻害する。したがって、抗免疫抑制剤により、ある特定の免疫チェックポイントタンパク質の相互作用を遮断することによって、T細胞が腫瘍細胞を死滅させることが可能となる。本発明は、抗原特異的なCD8+T細胞、例えば、腫瘍又はがん型(例えば、黒色腫、リンパ腫、肺がんなど)に対して特異的ながん抗原又はウイルス抗原を誘発する異種投与レジメンの共力剤作用を、抗免疫抑制剤、例えば、がん細胞を死滅させるようT細胞に非特異的に信号を送る免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせる。
一部の実施形態では、抗免疫抑制剤はMDSC阻害剤である。骨髄由来の抑制細胞(MDSC)は、骨髄細胞系列から誘導される免疫細胞の異種起源のグループであり、ある特定の病的状態、例えば、慢性感染症及びがんにおいて拡大する。これらはまたある特定の自己免疫疾患においてある役割を果たし得る。MDSCは、免疫刺激特性よりもむしろ強い免疫抑制活性を保有し、T細胞及びある特定の抗原提示細胞(APC)と相互作用して、これらの機能を調節する。MDSCはT細胞(CD8+とCD4+T細胞の両方)の公知の抑制剤であり、自己免疫疾患及びがんにおいて耐性誘発を媒介する。したがって、MDSC活性の阻害剤は、ある特定の病態における耐性の破壊を助けることができる。本発明は、腫瘍又はがん型に対して特異的な、例えば、がん又はウイルス抗原などの抗原に特異的なCD8+T細胞を誘発する異種投与レジメンの共力剤作用を、免疫耐性原性MSDCを阻害し、誘発されたCD8+T細胞によるより強固な免疫応答を可能にすることで耐性の破壊を助ける骨髄由来の抑制細胞(MDSC)阻害剤と組み合わせる。
出願人らは、第2組成物(フルオロカーボン連結ペプチド)がプライム用量として投与され、第1組成物(非複製ウイルスベクターに組み込まれた抗原又は免疫原)がブースト用量として投与される場合、免疫チェックポイント阻害剤、抗PD1と組み合わせた本発明の異種投与レジメンの共力剤作用を見出した。実施例5及び図3を参照されたい。ある特定の実施形態では、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルであって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドがi)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)ブースト用量の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)ブースト用量のCD8+T細胞エピトープ(例えば、PepGP70)のうちの1つ以上を含有する、ミセルがプライム用量として投与され、CD8+T細胞エピトープ(例えば、AdGP70)のうちの1つ以上を含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターが、免疫チェックポイント阻害剤抗PD1の投与と組み合わせてブースト用量として投与される。フルオロカーボン連結ペプチドは両親媒性であり、ある特定の溶媒中でミセルを自然に形成し、これらのミセルは、動物又はヒトに投与された場合、プロセシングのため抗原提示細胞(APC)により優先的に摂取される。それぞれの開示が本明細書に参照により組み込まれている、米国特許第7,687,455号及び第9,119,811号を参照されたい。
出願人らは、第1又は第2ワクチン組成物のいずれかを第3組成物、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与することにより、これらの組成物の単独投与と比較して、誘発された免疫応答の相乗効果が得られることを見出した。実施例7、並びに図7、8A及び8Bを参照されたい。図7のグループ2及び4は、組合せワクチンが投与された動物を、2種のT細胞を誘発するワクチン組成物のいずれかを単独投与された動物を表すグループ1及び3と比較して表している。組合せワクチンの投与はまた、図8A及び8Bで実証されているように、単一の処置が施された動物と比較して、動物の全生存率を増加させた。
ある特定の実施形態では、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含む組合せワクチンが本明細書で提供される。ある特定の他の実施形態では、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含む組合せワクチンが本明細書で提供される。
一部の実施形態では、第1組成物は、非複製ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクターを含む。すべての利用可能な、複製不全のウイルスベクターの中で、アデノウイルスは、組換え抗原へのT細胞応答に対する刺激が最も強力である。一部の実施形態では、第2組成物はフルオロカーボン連結ペプチドを含む。
定義
本明細書で使用される場合、「a」又は「an」という用語は、特許文献に共通するように、「少なくとも1つ」又は「1つ以上」の他のいかなる事例又は用法とは無関係に、1つ又は1つより多くを含むように使用される。
本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、非独占的なものを指し、又は、別途示されていない限り、「A又はB」は「BではなくA」「AではなくB」及び「AとB」を含むように使用される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は述べられた量と、およそ等しい、ほぼ等しい、ほとんど等しい、若しくは等しい量の付近の量である、又は述べられた量と等しい量、例えば、述べられた量のプラス/マイナス約5%、約4%、約3%、約2%又は約1%の量を指すように使用されている。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、抗原に対する身体の免疫応答を増強する物質を指し、本開示では、アジュバントは、第1組成物、第2組成物及び/又は第3組成物の組合せにより誘発される細胞媒介性免疫応答を増強する。本明細書で使用される場合、アジュバントは、第1組成物、第2組成物及び/又は第3組成物のいずれか又はすべてと組み合わされる。アジュバントは、本開示の第3組成物とははっきりと異なる。細胞が媒介する免疫応答を増強するために使用することができるアジュバントの例として、これらに限定されないが、Toll様受容体(TLR)アゴニスト、例えば、TLR2、TLR3、TLR7、TLR8、若しくはTLR9のアゴニスト、又はSTING、cGAS、NOD1、NOD2若しくはIRF3のアゴニストが挙げられる。
「投与」とは、本開示のワクチン組成物又は組合せを対象に導入することを意味する。「投与」はまた、本開示の組成物を対象に提供するという行為(例えば、処方することにより)を指すこともできる。「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞媒介性免疫応答を誘発する、投与される化合物の量を指す。この用語はまた、処置される状態の症状の1つ以上をある程度緩和又は予防する本発明の組成物又は組合せの量を指す。本開示の組成物で直接処置することができる状態/疾患に関連して、治療有効量は、疾患に罹る傾向があり得るが、未だ経験しておらず、また状態/疾患の症状も示していない動物において状態/疾患が生じることを予防する(予防的処置)、状態/疾患の症状を軽減する、状態/疾患の範囲を減退させる、状態/疾患を安定化する(例えば、悪化させない)、状態/疾患の拡散を予防する、状態/疾患進行を遅延又は減速させる、状態/病態を回復又は寛解させる、及びこれらの組合せの作用を有する量を指す。「有効量」という用語は、化合物の非存在下で生じ得る反応とははっきりと異なる反応をもたらす、投与される化合物の量を指す。本開示の免疫療法化合物を含む本開示の実施形態に関連して、「有効量」とは、レシピエントの免疫学的応答を、化合物を投与せずに予想され得る応答よりも増加させる量である。
「動物」という用語は、鳥と共に、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、家畜、及び他の任意の哺乳動物を含めた哺乳動物の対象を指す。本明細書で言及された場合、「動物」という用語はまた、新生児、胚形成期及び胎児段階を含めたすべての発達段階の個々の動物を含む。
「宿主」又は「生物」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト、哺乳動物(例えば、ネコ、イヌ、ウマなど)、昆虫、生細胞、及び他の生命体を含む。生命体は、例えば、単一真核細胞のように単純であってもよいし、哺乳動物のように複雑であってもよい。本開示の実施形態が関係する典型的な宿主は哺乳動物、特に霊長類、特にヒトである。獣医学的用途に対しては、多種多様な対象、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタなどの家畜、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなどの家禽類、及び飼いならした動物、特にペット、例えば、イヌ及びネコが適している。研究用途に対しては、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター)、ウサギ、霊長類、及びブタ、例えば純系ブタなどを含む多種多様な哺乳動物が適切な対象となり得る。さらに、in vitro用途、例えば、in vitroの研究用途に対しては、上記対象の体液及び細胞試料、例えば、哺乳動物(特に霊長類、例えば、ヒトなど)の血液、尿、若しくは組織試料、又は獣医学的用途に対して記述された動物の血液、尿、若しくは組織試料が使用に適している。状態(複数可)に「罹りやすい」宿主は、これらの状態の1つ以上の明白な症状を示さないが、遺伝的に、生理学的に、又はさもなければこれらの状態の1つ以上を発症する危険性を有する宿主と定義できる。
「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書で交換可能なように言及することができる。しかし、これら用語は以下の通り区別することができる。「タンパク質」は通常、細胞内での転写、翻訳、及び翻訳後改変の最終生成物を指す。本明細書で使用される場合「ポリペプチド」は「タンパク質」又は「ペプチド」を指すことができる。「ペプチド」は、「タンパク質」とは対照的に、通常アミノ酸の短い、通常100以下のアミノ酸の長さのポリマーである。
本発明の組成物、製剤及び方法は、本発明の構成成分及び成分、並びに本明細書に記載されている他の成分を、含む、これらから本質的になる、又はこれらからなることができる。本明細書で使用される場合、「〜から本質的になる」は、組成物、製剤及び方法が追加のステップ、構成成分又は成分を含み得ることを意味するが、ただし、これは追加のステップ、構成成分又は成分が特許請求された組成物、製剤及び方法の基本的及び新規の特徴を物質的に変えない場合のみに限る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用された場合、「構成される」という用語は、特定の任務を実施する又は特定の構成を採用するように構築又は構成されたシステム、装置、又は他の構造について記載していることにもまた注目されたい。「構成される」という用語は、他の類似の句、例えば、配置及び構成される、構築及び配置される、適応及び構成される、適応される、構築される、製造される及び配置されるなどと交換可能なように使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒトアデノウイルス」という用語は、アデノウイルス(Adenoviridae)ファミリーのすべてのヒトアデノウイルスを包含することを意図し、これにはマストアデノウイルス属(Mastadenovirus genera)のメンバーが含まれる。今日までに、51種を超えるヒト血清型のアデノウイルスが同定されている(例えば、Fieldsら、Virology 2、67章(第3版、Lippincott-Raven Publishers)を参照されたい)。アデノウイルスは血清群A、B、C、D、E、又はFのものであってよい。ヒトアデノウイルスは、血清型1(Ad1)、血清型2(Ad2)、血清型3(Ad3)、血清型4(Ad4)、血清型5(Ad5)、血清型6(Ad6)、血清型7(Ad7)、血清型8(Ad8)、血清型9(Ad9)、血清型10(Ad10)、血清型11(Ad11)、血清型12(Ad12)、血清型13(Ad13)、血清型14(Ad14)、血清型15(Ad15)、血清型16(Ad16)、血清型17(Ad17)、血清型18(Ad18)、血清型19(Ad19)、血清型19a(Ad19a)、血清型19p(Ad19p)、血清型20(Ad20)、血清型21(Ad21)、血清型22(Ad22)、血清型23(Ad23)、血清型24(Ad24)、血清型25(Ad25)、血清型26(Ad26)、血清型27(Ad27)、血清型28(Ad28)、血清型29(Ad29)、血清型30(Ad30)、血清型31(Ad31)、血清型32(Ad32)、血清型33(Ad33)、血清型34(Ad34)、血清型35(Ad35)、血清型36(Ad36)、血清型37(Ad37)、血清型38(Ad38)、血清型39(Ad39)、血清型40(Ad40)、血清型41(Ad41)、血清型42(Ad42)、血清型43(Ad43)、血清型44(Ad44)、血清型45(Ad45)、血清型46(Ad46)、血清型47(Ad47)、血清型48(Ad48)、血清型49(Ad49)、血清型50(Ad50)、血清型51(Ad51)、又はこれらの組合せであり得るが、これらの例に限定されない。ある特定の実施形態では、アデノウイルスは血清型5(Ad5)である。
本明細書で使用される場合「免疫モジュレーター」は、免疫の制御、疾患の安定化及び潜在的な根絶を達成するために患者の免疫系を利用することを目標とする一連の処置を指す。例えば、免疫モジュレーターは、耐性(例えば、慢性感染症又はある特定の自己免疫疾患に存在し得るものなど)を破壊するために使用される物質、又は外来性若しくは自己(例えば、がん)抗原に対抗する宿主細胞媒介性免疫応答を誘発若しくは増強する免疫抑制細胞を不活化するために使用される物質、又は外来性若しくは自己(例えば、がん)抗原に対抗する宿主細胞媒介性免疫応答を誘発若しくは増強するためにも使用される免疫刺激物質であってよい。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、T細胞経路をモジュレートする物質を含み、抗腫瘍又は抗ウイルス免疫応答を再活性化させる可能性を有する。
「医薬組成物」は、本明細書に記載されているワクチン化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容される塩のうちの1つ以上と、他の化学成分、例えば、薬学的に許容される担体及び賦形剤との混合物を指す。医薬組成物の1つの目的は化合物の生物への投与を容易にすることである。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生物に著しい刺激（irritation）を引き起こさず、投与されたワクチン組成物の生物学的活性及び特性を取り消すことのない担体又は希釈剤を指す。
「処置する」、「処置している」、及び「処置」という用語は、有益又は所望の臨床結果を得るための手法である。具体的には、有益又は所望の臨床結果は、これらに限定されないが、検出可能又は検出不能に関わらず、症状を軽減する、疾患の範囲を減退させる、疾患を安定化する(例えば、悪化させない)、疾患進行を遅延又は減速させる、疾患の拡散を実質的に予防する、病態を回復又は寛解させる、及び緩解(部分的又は全部)させることを含む。加えて、「処置する」、「処置している」、及び「処置」はまた、処置を受けなかった場合予想された生存と比較して、延命することを意味することができ、並びに/又は疾患及び/若しくは疾患に起因する有害作用に対する部分的又は完全な治癒という点から治療剤であることができる。本明細書で使用される場合、「予防的に処置する」又は「予防的に処置している」という用語は、宿主において、疾患/状態又は1つ以上のその症状を完全に、実質的に、又は部分的に予防することを指す。同様に、「状態の開始を遅らせる」はまた、「予防的に処置する」に含まれてもよく、状態に罹りやすい患者において、状態が実際に発症する前の時間を増加させる行為を指す。
本明細書で言及された場合、「ワクチン」は、抗原又はベクターを、例えば、アジュバント、遅延放出化合物、溶媒などを含めたワクチン製剤の他の構成成分と共に含むことができる。ワクチンは感染症を予防又は処置するために慣習的に使用されているが、ワクチンはまた、シグナル伝達ペプチド又はタンパク質又はこれらの受容体と結合することにより、及びある特定の異常な細胞型、例えば、腫瘍に特有の抗原を遮断することにより、代謝産物の機能を改変することができる。したがって、本発明の実施形態では、抗原のソース又はその機能に関わらず、健康を改善する、例えばがんに対抗する免疫を付与することに望ましい生理機能を変える抗原を含めた任意の抗原に対する免疫応答を改善するワクチンを提供する。
本明細書で言及された場合、「ベクター」は、抗原に対する遺伝子コード、又はその一部分を有するが、抗原それ自体ではない。例示的態様では、ベクターはウイルスベクター又は細菌ベクターを含むことができる。本明細書で言及された場合、「抗原」とは、ヒト及び/又は動物を含む対象において特異的な免疫応答を誘発する物質を意味する。抗原は、死滅させた、減衰させた若しくは生きた生物全体、生物のサブユニット若しくは一部分、免疫原性特性を有する挿入部を含有する組換えベクター、宿主動物への提示により免疫応答を誘発することが可能なDNAの小片若しくは断片、ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、又はこれらの任意の組合せを含み得る。様々な態様では、抗原はウイルス、細菌、生物のサブユニット、自己抗原、又はがん抗原である。
組合せワクチン
第1組成物及び第2組成物を含む組合せワクチンであって、これらの組成物がT細胞媒介性免疫を誘発するための異種プライム用量及びブースト用量として機能する組合せワクチンが本明細書で提供される。第1組成物及び第2組成物は、同じである1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含む。ある特定の実施形態では、第1又は第2組成物は、全長抗原若しくは免疫原、又はその断片を含んでもよく、これらのそれぞれはまた本明細書で「ポリペプチド」とも呼ばれる。ある特定の実施形態では、プライム用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、全長抗原又は免疫原を含み、ブースト用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、その断片、例えば、キメラペプチドを含めたペプチドを含む。ある特定の他の実施形態では、プライム用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、抗原又は免疫原の断片、例えば、キメラペプチドを含めたペプチドを含み、ブースト用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、全長抗原又は免疫原を含む。ある特定の他の実施形態では、プライム用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、抗原又は免疫原の断片、例えば、キメラペプチドを含めたペプチドを含み、ブースト用量(第1又は第2組成物のいずれかとして)は、抗原又は免疫原の断片、例えば、キメラペプチドを含めたペプチドを含む。異種とは、ここで使用される場合、抗原又は免疫原を指すのではなく、抗原又は免疫原に連結した送達ベクター又は担体を指す。
一部の実施形態では、第1組成物及び第2組成物は、送達ベクター又は担体を含み、送達ベクター又は担体は、ペプチド、親油性の鎖、又は非複製ウイルスベクターを含む発現ベクターを含むことができる。ある特定の実施形態では、担体は、1つ以上のハロゲン原子で場合によって置換されている炭化水素鎖であってよい。ある特定の実施形態では、担体はフルオロカーボン鎖であってよい。ある特定の実施形態では、送達ベクターは、非複製ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターから選択されるものなどであってよい。ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはE1及び/又はE3欠損アデノウイルスベクターである。ある特定の実施形態では非複製アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスベクターである。
第1組成物及び第2組成物を含む組合せワクチンであって、第1組成物が、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含み、第2組成物がフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含み、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、組合せワクチンが本明細書で提供される。第1又は第2組成物のいずれかがプライム又はブースト用量であってよい。異種投与レジメンを提供するため、第1組成物及び第2組成物のそれぞれは、それを必要とする動物に、一方をプライム用量として、他方をブースト用量として投与されなければならない。
本明細書に提供されているさらなる実施形態は、第1組成物又は第2組成物、及び第3組成物を含む組合せワクチンであって、第1又は第2組成物がT細胞免疫を誘発し、第3組成物が抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターであり、これらが組み合わさって抗原特異的T細胞応答を増強する、組合せワクチンである。第1組成物及び第2組成物は1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含む。ある特定の実施形態では、第1又は第2組成物は、それぞれ本明細書で「ポリペプチド」とも呼ばれている、全長抗原若しくは免疫原、又はその断片を含み得る。ある特定の実施形態では、第1組成物は全長抗原又は免疫原を含む。ある特定の他の実施形態では、第1組成物は抗原の断片、例えば、キメラペプチドを含むペプチドを含む。ある特定の実施形態では、第2組成物は全長抗原又は免疫原を含む。ある特定の他の実施形態では、第2組成物は、抗原又は免疫原の断片、例えば、キメラペプチドを含めたペプチドを含む。
第1組成物又は第2組成物、及び第3組成物を含む組合せワクチンであって、第1組成物が1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含み、第2組成物がフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含み、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有し、第3組成物が抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む、組合せワクチンが本明細書で提供される。
抗原及び免疫原
抗原又は免疫原(これらは本明細書で交換可能なように使用することができる)の選択は、ヒト又は動物モデルのいずれかにおいて、抗原に対抗するT細胞応答が防御用及び/治療用であることが判明しているかどうか、又は防御用及び/若しくは治療用であると予想されるかどうかにより決定される。抗原の異なる分離株（isolate）の間で見出された多形性（polymorphism）の程度、並びに高度に保存された抗原、HLA分子の多形性、又は抗原内に高度に保存されたエピトープもまた抗原を選択する要素である。高度に保存された抗原T細胞エピトープ並びに異なる集団及び/又は少数民族グループの人々にわたるHLA分子の多形性に基づくT細胞ワクチン組成物については、その内容が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第8,642,531号及び米国特許公開第2016/0106830号を参照されたい。また、その内容が本明細書に参照により組み込まれている米国特許公開第2016/0199469号、段落[0121]〜[0134]を参照されたい。ある特定の実施形態では、合成ワクチン抗原を生成する1つ以上の抗原からの保存された領域、又は保存されたエピトープの組合せである抗原もまた選択され得る[Goodman ALら、New candidate vaccines against blood-stage Plasmodium falciparum malaria: prime-boost immunization regimens incorporating human and simian adenoviral vectors and poxviral vectors expressing an optimized antigen based on merozoite surface protein 1. Infection and Immunity、2010年;78巻(11号):4601〜12頁; Letourneau Sら、Design and pre-clinical evaluation of a universal HIV-1 vaccine.、PLoS ONE、2007年;2巻(10号):e984]。ある特定の実施形態では、組合せは、第1若しくは第2ワクチン組成物中のペプチド若しくはポリペプチドのプールの形態、又は第1若しくは第2ワクチン組成物中のキメラペプチド若しくポリペプチドとしての形態であってよい。ある特定の実施形態では、第1及び第2ワクチン組成物は、免疫回避の可能性を減少させるために1つより多くの抗原を含む。2つ以上の抗原を含むT細胞オンコロジーワクチンについては、その内容が本明細書に参照により組み込まれている米国特許公開第2016/0199469号を参照されたい。
抗原内のT細胞エピトープは、バイオインフォマティクスの予測及び実験的確認のいずれかにより、又は完全な抗原配列を網羅するペプチドライブラリーを使用した実験による手法を取ることにより同定することができる。T細胞エピトープ(CD8+及びCD4+の両方)の同定に関するさらなる開示については実施例1を参照されたい。しかし、一般的HLA型により提示されるエピトープの知識は、臨床的研究及びワクチン開発におけるT細胞応答の詳細な表現型研究を行う上で役に立ち得るが、抗原内に含有されているすべての可能なエピトープの完全な知識は必要とされない。本発明のワクチン組成物、第1及び/又は第2組成物は、少なくとも1つのCD8+T細胞エピトープを含む。ある特定の実施形態では、第1及び第2組成物は、少なくとも2、3、4、5又は少なくとも6つのCD8+T細胞エピトープを含む。ある特定の他の実施形態では、第1及び/又は第2ワクチン組成物は1つ以上のCD4+T細胞エピトープをさらに含む。ワクチン組成物中のポリペプチドの形態の抗原は、同定に対して利用可能なツールを使用して同定されていない1つ以上のT細胞エピトープを含んでもよいことを理解されたい。
一部の実施形態では、抗原/免疫原は、配列保存及び/又はCD8+及びCD4+T細胞エピトープの存在に基づき選択され得る全長抗原配列から誘導されたより小さな部分又はポリペプチドに対応し得る。CD4+及び/又はCD8+T細胞エピトープは、HLAクラスI及び/若しくはHLAクラスII結合配列を同定するバイオインフォマティクスツール、ヒトPBMC試料を使用するin vitroアッセイ又はin vitro HLAクラスI及び/若しくはHLAクラスII結合アッセイを使用して同定することができる。免疫原は、同じ病原体由来の単一又は複数の抗原配列から誘導されるより小さな配列部分又はポリペプチドの人工的連結により生成することができる。連結配列を合成ペプチド免疫原の生成に使用してもよいし、又は対応するDNA配列をアデノウイルスベクターに組み込んでもよい。
ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原は病原体、がん抗原又は自己抗原由来のものである。ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原は新抗原（neoantigen）である。本明細書で使用される場合、「新抗原」は野生型に対して1つ以上のアミノ酸の変化を有する公知の宿主タンパク質を指し、宿主免疫系にこれを異物と認識させることが可能となる。新抗原は、各患者特有のものであってよく、したがって、本明細書で使用される場合、個々の患者から同定した臨床的変異体を含むタンパク質変異体と呼ぶこともできる。ヒト臨床的変異体は、ヒトの変異と表現型との関係の報告の公共アーカイブを提供する周知のデータベースを使用して同定することができる。Landrum MJら、ClinVar: public archive of interpretations of clinically relevant variants.、Nucleic Acids Res、2016年1月、4巻;44号(D1):D862〜8頁。これらの新抗原又は臨床的変異体をCD8+T細胞エピトープに対してマッピングし、これによって、本発明の組合せワクチンの開発が可能となる。抗原又は免疫原のT細胞エピトープをマッピングするための周知のツールを使用することに関する開示が実施例1に提供されている。
ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原は、がんの発症をもたらすことが公知のもの(よって、がん細胞表面に発現し得る)を含む病原体由来のものである。一部の実施形態では、病原体はウイルス、真菌、寄生生物、又は細菌である。ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原は、EBV、HPV、HTLV-1、MCPvV、KSHV又はHERVから選択されるウイルス由来のものである。これらウイルスのそれぞれはがん又は腫瘍成長を誘発することが公知である。ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原はHCV(C型肝炎ウイルス)又はHBV(B型肝炎ウイルス)のウイルス由来のものである。
ある特定の実施形態では、抗原又は免疫原は以下のうちのいずれか1つ以上であってよい:EBV(EBNA1、LMP1、LMP2及びBARF1)、HPV(E1〜E7)、HTLV-1(tax)、MCPyV(ラージT、スモールT)、KSHV(Orf73、Orf57、K10.5、及びK12)、CMV(糖タンパク質B及びホスホタンパク質65)、BKV((ラージT、スモールT)、JCV(ラージT、スモールT)、SV40(ラージT、スモールT)、HERV(Env、Gag、Pol)、HMTV(Env、Gag、Pol)、HIV-1(Env、Gag、Pol、Nef、Tat、Vif)、HCV(Core、NS3、NS4、NS5)、HBV(Core、Pol、Env及びX)、インフルエンザ(HA、NP、NA、M1、PB1、PB2、PA)、HRV(VP1-4、2A-C、3A-D)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)(Ag85A、ASAT-6、RpfE、CFP-10)及び熱帯熱マラリア原虫(Mycobacterium tuberculosis)(MSP-1、AMA-1、RTS、S、Pfs25)（MSP-1. AMA-1, RTS,S, Pfs25）。
一部の実施形態では、抗原は、例えば、ウイルスを含む病原体に対抗して免疫応答を誘発する。例示的なウイルスとして、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、感冒ウイルス若しくははしかウイルス、ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、水痘、ヒトパピローマウイルス(HPV)、肝炎ウイルス、又は他の公知のウイルス性病原体が挙げられる。
一部の実施形態では、抗原は細菌性病原体に対抗して免疫応答を誘発する。例示的な細菌として、桿菌(Bacillus)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、連鎖球菌(Streptococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、クレブシエラ(Klebsiella)、ヘモフィルス(Haemophilus)、マイコプラズマ(Mycoplasm)及び/又は炭疽菌(Bacillus anthracis)が挙げられる。ある特定の実施形態では、抗原は真菌病原体に対抗して免疫応答を誘発する。一部の実施形態では、真菌として、アスペルギルス(Aspergillus)、カンジダ(Candida)、クリプトコッカス(Cryptococcus)、ヒストプラスマ(Histoplasma)、プネウモキスチス(Pneumocystis)、及び/又はスタキボトリス(Stachybotrys)が挙げられる。
一部の実施形態では、抗原はアレルゲン、又は腫瘍関連抗原を含むことができる。またさらなる態様では、抗原は、疾患に関連するタンパク質の1つ以上のエピトープを含むポリペプチド、ペプチド、又はそのパネルを含み得る。例えば、適切なポリペプチド、ペプチド、又はそのパネルは、病原体に関連するタンパク質の1つ以上のエピトープを含み得る。適切なポリペプチドは、病原体又はその断片の対応するタンパク質の全長アミノ酸配列を含み得る。
組合せワクチンの第1組成物
一部の実施形態では、第1組成物は、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである。例示的実施形態では、非複製ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。E1及び/又はE3配列の欠損又は破壊は非複製アデノウイルスベクターを結果として生じる。
一部の実施形態では、組成物及び製剤は、ベクター、すなわちウイルスベクターを含む。本明細書で言及される場合、「ウイルスベクター」とは、抗原に対する遺伝子が組み込まれ、抗原を発現する操作されたウイルスである。ウイルスベクターは非複製であってよく、宿主及び環境に対して安全である。細胞への送達を実施するために、任意のウイルスベクターを本発明の組成物、製剤及び方法に組み込むことができることを認識されたい。
例示的なウイルスベクターとして、中でもアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アデノ随伴ウイルスが挙げられる。多くのこのようなウイルスベクターが当技術分野で利用可能である。本明細書に記載されているベクターは、当業者に広く利用可能な標準的な組換え技術を使用して構築することができる。このような技術は一般的な分子生物学の参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Press)、Gene Expression Technology (Methods in Enzymology、185巻、D.Goeddel編、1991年、Academic Press、San Diego、Calif.)及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innisら、1990年、Academic Press、San Diego、Calif.)に見出すことができる。
ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはアデノウイルスであり、例えば、アデノウイルスがウシアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ヒト以外の霊長類アデノウイルス、ニワトリアデノウイルス、又はブタ(porcine)又はブタ(swine)アデノウイルスであるものを含む。ある特定の実施形態では、非複製ウイルスベクターはヒトアデノウイルスである。
一部の実施形態では、非複製アデノウイルスベクターは、真核細胞への遺伝子導入及びワクチン開発に対して、並びに動物モデルにおいて特に有用である。
一部の実施形態では、当業者には公知であり、抗原又は免疫原を含み、発現することができる哺乳動物への投与のために調製される任意のアデノウイルスベクター(Adベクター)は、本出願の組成物において、及び方法に使用することができる。このようなAdベクターは、米国特許第6,706,693号、第6,716,823号、第6,348,450号、又は米国特許公開第2003/0045492号、第2004/0009936号、第2005/0271689号、第2007/0178115号、第2012/0276138号(全体が本明細書に参照により組み込まれている)のAdベクターのいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは非複製又は複製不全で、複製のためにE1活性の補足を必要としてもよい。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスベクターは、E1欠陥、E3欠陥、及び/又はE4欠陥のアデノウイルスベクター、又はウイルス遺伝子が欠損している「中身のない」アデノウイルスベクターを含み得る。E1突然変異は、E1欠陥アデノウイルス突然変異体が非許容細胞内では複製不能であるため、ベクターの安全性マージンを上昇させる。E3突然変異は、アデノウイルスがMHCクラスI分子を下方制御する機序を破壊することにより、抗原の免疫原性を増強する。E4突然変異は後期遺伝子発現を抑制することによりアデノウイルスベクターの免疫原性を減少させ、よって同じベクターを利用して繰り返し再ワクチン接種を行うことを可能にし得る。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスベクターはE1及び/又はE3欠陥ベクターである。
「中身のない」アデノウイルスベクター複製は、ヘルパーウイルス及びE1aとCreの両方を発現する特別なヒト293細胞株を必要とし、これは天然の環境には存在しない状態である。ベクターのウイルス遺伝子は剥奪されており、よってワクチン担体としてのベクターは非免疫原性であり、再ワクチン接種のために複数回植菌することができる。「中身のない」アデノウイルスベクターはまた導入遺伝子を適用させるための36kb空間を含有し、よって多くの抗原遺伝子の細胞への共同送達を可能にする。特定の配列モチーフ、例えば、RGDモチーフを、その感染性を増強するためにアデノウイルスベクターのH-Iループに挿入することができる。アデノウイルス組換え体は、特定の導入遺伝子又は導入遺伝子断片を、以下に記載されているようなアデノウイルスベクターのいずれかにクローニングすることにより構築することができる。アデノウイルス組換えベクターは、免疫付与剤として使用するための非侵襲性モードで脊椎動物の表皮細胞の形質導入のために使用される。アデノウイルスベクターはまた、侵襲性投与方法、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下注射に使用することもできる。
一部の実施形態では、目的の組合せワクチンの抗原又は免疫原を発現する非複製ウイルスベクターを含む第1組成物は、哺乳動物への投与に対して製剤化することができる。投与量、投与経路、製剤、アジュバント、及び組換えウイルス及びそれからの発現生成物に対する使用に関して、本発明の組成物は、非経口又は粘膜投与に対して、好ましくは皮内、皮下、鼻腔内又は筋肉内経路により使用することができる。粘膜投与が使用される場合、経口、眼又は経鼻の経路を使用することが可能である。
目的のアデノウイルスベクターを含み得る製剤は、医薬的又は獣医学的技術の当業者には周知の標準的技術に従い調製することができる。このような製剤は、年齢、性別、体重、及び投与経路などの要素を考慮に入れて、臨床的技術における当業者に周知の投与量で、及び技術により投与することができる。製剤は単独で投与してもよいし、又は組成物、例えば、「他の」免疫学的組成物、若しくは弱毒化ワクチン、不活化ワクチン、組換えワクチン若しくは治療用組成物と共に、共投与若しくは逐次的に投与してもよく、これによって、多価体又は「カクテル」又は本発明の組成物の組合せ及びこれらを利用する方法を提供する。一部の実施形態では、製剤は、スクロースを抗凍結剤として及びポリソルベート80を非イオン性界面活性剤として含んでもよい。ある特定の実施形態では、製剤は、フリーラジカル酸化阻害剤エタノール及びヒスチジン、金属イオンキレート化剤エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、又は同等の活性を有する他の薬剤(例えば、金属-イオン触媒されたフリーラジカル酸化を遮断又は阻止する)をさらに含む。
製剤は、粘膜投与、例えば、経口、経鼻、眼などへの投与などのための液体調製物、懸濁剤などの製剤及び、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与(例えば、注射可能な投与)のための調製物、例えば、滅菌懸濁剤又は乳剤で存在してもよい。このような製剤において、アデノウイルスベクターは、適切な担体、希釈剤、又は賦形剤、例えば、滅菌水、生理的食塩水などと混合してもよい。製剤はまた凍結乾燥又は凍結されていてもよい。製剤は、投与経路及び所望の調製に応じて、補助物質、例えば、湿潤化剤又は乳化剤、pH緩衝剤、アジュバント、保存剤などを含有することができる。製剤は、少なくとも1種のアジュバント化合物を含有することができる。
標準的なテキスト、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE」、第17版、1985年を参考にして、過度の実験を行うことなく、適切な調製物を調製することができる。
組合せワクチンの第2組成物
一部の実施形態では、第2組成物は、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含み、フルオロカーボンに連結した各ペプチドは、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する。
一部の実施形態では、ペプチドは、20〜60のアミノ酸、例えば、25〜50のアミノ酸、30〜40のアミノ酸、例えば、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44又は45のアミノ酸長を有する。ある特定の実施形態では、ペプチドは追加の短いアミノ酸配列を含み得る。追加の配列は、ペプチドの製造又は製剤化を容易にする、又はペプチド安定性を増強することができる。例えば、ペプチドは1つ以上の追加のアミノ酸を、通常N末端及び/又はC末端に含むことによって、ペプチドの正味の正電荷を増強する、及び/又はペプチドの疎水性を減少させることができる。正味の正電荷は、ペプチドが7に等しいかそれより大きい等電点を有するように増加させることができる。
ある特定の実施形態では、1つ以上の、例えば、2又は3つの正荷電アミノ酸(アルギニン及び/又はリシン)を、組成物中の1つ以上のペプチドのN末端及び/又はC末端に加える。例えば、3つのリシン残基(KKK)を1つ以上のペプチドのN末端及び/又はC末端に加えることができる。表2を参照されたい。正荷電アミノ酸は通常、65%超の全疎水性、ゼロ未満の正味電荷を有し、及び/又は疎水性アミノ酸のクラスターを含むペプチドの終端部(複数可)に加える。
ペプチドがフルオロカーボンに連結している実施形態では、ペプチドの末端、例えば、フルオロカーボンにコンジュゲートしていない末端など、又は他の結合物（attachment）、を変えて、例えば、ミセルの形成を介して、フルオロカーボンペプチド構造体の溶解度を促進することができる。構造体の大規模合成を容易にするために、ペプチドのN末端又はC末端アミノ酸残基を改変することができる。所望のペプチドがペプチダーゼによる切断に特に感受性がある場合、正常なペプチド結合を切断不可能なペプチド模倣体に置き換えることができる。このような結合及び合成方法は当技術分野で周知である。
ペプチドは天然ペプチドであってよい。天然ペプチドは遊離の又は改変された先端を有し得る。in vivoでのペプチドの、半減期などの寿命若しくは投与部位における持続性を増加させるため、又はペプチドを抗原提示細胞に方向づけるためにペプチドを改変することもできる。例えば、免疫原性ペプチドは、1つ以上の非自然発生のアミノ酸及び/又は隣接するアミノ酸を共有結合するための非自然発生の共有結合を含有することができる。ある特定の実施形態では、非標準的、非自然発生のアミノ酸を免疫原性ペプチドに組み込むこともできるが、ただし、これらがHLA分子と相互作用するペプチドの能力を妨げず、天然配列を認識するT細胞との交差反応性を依然として有するものとする。非天然アミノ酸は、プロテアーゼに対するペプチド耐性又は化学的安定性を改善するために使用することができる。非天然アミノ酸の例としてDアミノ酸及びシステイン改変が挙げられる。
一部の実施形態では、第2組成物は、フルオロカーボン鎖と連結した複数のペプチドを含んでもよい。したがって、組成物は、少なくとも2個、例えば、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、又はこれより多くのペプチドを含んでもよい。例示的実施形態では、第2組成物は4個のペプチドを含み、これらのそれぞれはフルオロカーボン鎖に連結している。実施例1を参照されたい。
ペプチドががん患者のT細胞においてペプチド特異的な応答を誘発することができるかどうかに関わらず、慢性感染症を有する患者であるか、又は健康な対象であるかは、任意の適切な手段により、通常適切なアッセイにおいて、前記患者又は対象から採取した末梢血単核細胞(PBMC)の試料を試験することにより決定することができる。よって、T細胞応答は試料中にin vitroで検出される。適切なアッセイは、試験ペプチドとのインキュベーション後にT細胞の活性化を測定又は検出することができる。T細胞の活性化は通常サイトカイン、例えばIFN-γの分泌で示すことができ、サイトカインの分泌は任意の適切なアッセイ、通常イムノアッセイ、例えば、ELISA又はELISpotにおいて検出することができる。患者又は対象のT細胞応答の規模は、同じアッセイ、例えば、試験ペプチドとのインキュベーション後の試料中の、試料全体、又は特定の細胞で放出されたサイトカインの量を定量化することにより決定することができる。適切なアッセイはさらに以下及び実施例に記載されている。
ある特定の実施形態では、本発明の第2組成物は、健康な対象及び/又はがん患者のうちの少なくとも20%において特定のCD8+T細胞応答を誘発するペプチド(複数可)を含む。健康な対象又はがん患者由来のヒト末梢血単核細胞(PBMC)においてペプチド特異的なT細胞応答を測定するための免疫学的アッセイは、サイトカインELISpot、例えば、IFN-γELISpotアッセイ又はフローサイトメトリーを使用する細胞内サイトカイン染色の手段により行うことができる。アッセイは、新鮮な又は凍結したPBMCのいずれかで実施することができる。アッセイは、単一ペプチド又はいくつかの抗原性ペプチドを含む組成物と共にインキュベートしたPBMCのin vitro培養物において短期間経過後に、又はex vivoで実施することができる。短期in vitro培養物中のペプチド(複数可)の量はペプチド1個当たり0.001μgから100μg/ペプチドまで変動し得る。短期in vitro培養に対するインキュベーション時間は、5〜15日の間で、例えば、7〜13日又は9〜11日であってよい。短期in vitro培養は、サイトカイン、例えば、IL-2、IL-15及びIL-7、好ましくはIL-2及びIL-15のうちの1つ以上の存在下で実施することができる。短期in vitro培養はT制御性細胞及び/又はNK細胞の枯渇後に実施することができる。このような細胞の枯渇はPBMCががん患者由来のものである場合特に望ましいこともある。短期in vitro培養は、IL-10中和抗体、抗PD1抗体、抗CTLA-4抗体、抗OX-40抗体、抗GITR抗体、デニロイキン、ディフティトックス、キナーゼ阻害剤、及び/又は、TLR2、TLR3、TLR7、TLR8及びTLR9のアゴニストを含む、toll受容体アゴニストの存在下で実施することができる。
ある特定の実施形態では、担体は、1個以上のハロゲン原子で置換されている炭化水素鎖である。一部の実施形態では、担体は、本明細書で「フルオロカーボン鎖」と呼ばれる、1個以上のフッ素原子で置換されている炭化水素鎖である。
フルオロカーボンは、パーフルオロカーボン又は混合フルオロカーボン/炭化水素基（radical）から誘導された1つ以上の鎖を含むことができ、各鎖が3〜30個の炭素原子を有する飽和又は不飽和であってよい。よって、フルオロカーボン結合物の鎖は通常飽和又は不飽和であり、好ましくは飽和である。フルオロカーボン結合物の鎖は直鎖又は分枝であってよいが、好ましくは直鎖である。各鎖は通常、3〜30個の炭素原子、5〜25個の炭素原子、又は8〜20個の炭素原子を有する。フルオロカーボンベクターをペプチドに共有結合で連結するために、反応性基、又はリガンド、例えば-CO-、-NH-、S、O又は任意の他の適切な基がベクターに含まれている。共有結合を達成するためのこのようなリガンドの使用は当技術分野で周知である。反応性基はフルオロカーボンベクター上の任意の位置に位置し得る。
フルオロカーボンベクターのペプチドへのカップリングは、自然に存在する又はペプチドの任意の部位に導入された官能基、例えば、-OH、-SH、-COOH及び-NH2を介して達成することができる。このような連結の例として、アミド、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル及びオキシム結合が挙げられる。
任意選択で、スペーサーエレメント(ペプチド又は非ペプチド)を、抗原提示細胞内でのプロセシングのため及びペプチドの立体的付与を最適化するためのフルオロカーボンエレメントからのペプチドの切断を可能にするために組み込むことができる。スペーサーはまた分子の合成を補助するため、並びにその安定性及び/又は溶解度を改善するために組み込むこともできる。スペーサーの例として、タンパク質分解酵素により開裂（cleave）され得るポリエチレングリコール(PEG)又はアミノ酸、例えば、リシン又はアルギニンなどが挙げられる。
ある特定の実施形態では、フルオロカーボン連結ペプチドは、化学構造CmFn-CyHx-(Sp)-R又はその誘導体(式中、m=3〜30、n≦2m+1、y=0〜15、x≦2y、(m+y)=3〜30、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rは免疫原性ペプチドである)を有することができる。通常m及びnは2m-1≦n≦2m+1の関係を満たし、好ましくはn=2m+1である。通常x及びyは2y-2≦x≦2yの関係を満たし、好ましくはx=2yである。好ましくはcmFn-cyHx部分は直鎖である。
一部の実施形態では、mは5〜15であり、より好ましくは8〜12である。他の実施形態では、yは0〜8であり、より好ましくは0〜6又は0〜4である。一部の実施形態では、CmFn-CyHx部分は飽和しており(すなわち、n=2m+1及びx=2yである)及び直鎖であり、m=8〜12及びy=0〜6又は0〜4である。
ある特定の実施形態では、フルオロカーボンベクターは、以下の式の2H,2H,3H,3H-パーフルオロウンデカン酸から誘導される:
Figure 2021520414
一部の実施形態では、フルオロカーボン結合物は、C8F17(CH2)2COOHから誘導される直鎖飽和部分C8F17(CH2)2-である。ある特定の実施形態では、フルオロカーボン結合物は以下の式:C6F13(CH2)2-、C7F15(CH2)2-、C9F19(CH2)2-、C10F21(CH2)2-、C5F11(CH2)3-、C6F13(CH2)3-、C7F15(CH2)3-、C8F17(CH2)3-及びC9F19(CH2)3-を有し、これらはそれぞれC6F13(CH2)2COOH、C7F15(CH2)2COOH、C9F19(CH2)2COOH、C10F21(CH2)2COOH、C5F11(CH2)3COOH、C6F13(CH2)3COOH、C7F15(CH2)3COOH、C8F17(CH2)3COOH及びC9F19(CH2)3COOHから誘導される。
一部の実施形態では、フルオロカーボンベクター抗原構造体に適した構造の例は、式:
Figure 2021520414
 (式中、Sp及びRは上で定義された通りである)を有する。ある特定の実施形態ではSpはリシン残基から誘導され、式-CONH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-を有する。一部の実施形態では、Rは、15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有するペプチドである。
ある特定の実施形態では、生成した化合物がペプチドを抗原提示細胞に依然として送達可能であるようにフルオロカーボン結合物が改変されていてもよい。よって、例えば、いくつかのフッ素原子が他のハロゲン原子、例えば、塩素、臭素又はヨウ素により置き換えられていてもよい。加えて、いくつかのフッ素原子がメチル基又は水素で置き換えられていて、かつ、本明細書に記載されている分子の特性を依然として保持していることが可能である。
一部の実施形態では、ペプチドは、スペーサー部分を介してフルオロカーボンベクターに連結していてもよい。一実施形態ではスペーサー部分はリシン残基である。このスペーサー残基は、ペプチドが、例えば、合計4つのN末端リシン残基を有し得るように、上に記載されているような任意の末端リシン残基に加えて存在することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本発明の第2組成物は、ペプチドがC末端又はN末端リシン残基、好ましくはN末端リシン残基を有するフルオロカーボン連結ペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチドの末端リシンは式C8F17(CH2)2COOHを有するフルオロカーボンに連結している。一部の実施形態では、フルオロカーボンはN末端リシン残基のエプシロン鎖にカップリングしている。
一部の実施形態では、第2組成物は、それ自体のフルオロカーボンベクターに連結した少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個、又はそれより多くの免疫原性ペプチドを含む。
組合せワクチンの第3組成物
一部の実施形態では、第3組成物は免疫モジュレーターを含む。免疫モジュレーターは、免疫の制御、疾患の安定化及び潜在的な根絶を達成するために患者の免疫系を利用することを目標とする一連の処置(例えば物質又は化合物)を含む。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、T細胞経路をモジュレートし、抗腫瘍又は抗ウイルス免疫応答を再活性化する可能性を有する免疫チェックポイント遮断抗体を含む。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、これに限定されないが、イピリムマブ（イピリムマブは、細胞傷害性T-リンパ球抗原4(CTLA-4)と呼ばれるチェックポイント分子を遮断する転移性黒色腫の処置に対して認可された、最初にFDA認可された免疫チェックポイント抗体である）、並びに共抑制受容体、例えば、CTLA-4、PD-1、Lag-3、Tim-3、TIGIT及び/又はVistaを標的とする他の化合物(例えば抗体)を含む。
一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、例えば、これらに限定されないが、グルココルチコイド誘発性TNFR(GITR;CD357)、CD27、OX40(CD134)、ICOS(CD278)又は4-1BB(CD137)を含めた腫瘍壊死因子受容体(TNFR)から選択される、T細胞により発現される共刺激受容体を標的とする物質を含み、これら糖タンパク質のアゴニスト抗体とのライゲーションが活性化信号をリンパ球に活発に伝える。
ある特定の実施形態では、免疫モジュレーターは、抑制性骨髄性細胞の阻害剤、例えば、PDL1、PDL2、VISTA、B7-1、CD47、CD200、GLA1、GAL3、CLECG4又はSIRPaを含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、アゴニストクラスばかりでなく、またアンタゴニスト分子に対する標的も表す、一連のToll様受容体(TLR)及びNOD様受容体(NLR)を標的とする化合物を含む。さらなる実施形態では、免疫モジュレーターは、T細胞応答をモジュレートすることが知られているサイトカイン、例えば、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン、IL-2、IL-7、又はIL-12を含む。
一部の実施形態では、第3組成物は、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA又はCD244を標的とする免疫チェックポイント阻害剤を含む。例えば、PD1を標的とする方法を提供する実施例5を参照されたい。
一部の実施形態では、第3組成物は、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、REGN2810、BMS-936558、SHR1210、KN035、IBI308、PDR001、BGB-A317、BCD-100、又はJS001から選択される免疫チェックポイント阻害剤を含む。
他の実施形態では、第3組成物は、ADAM17、PEG-2、PDE5、COX2、iNOS2、PDE5、c-kit、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ-8、CCL2、RON、ROS、S100A8/A9又は肝臓-X核受容体を標的とするMDSC阻害剤を含む。
一部の実施形態では、MDSC阻害剤は、PF-5480090、INCB7839、ニトロ-アスピリン、SC58236、セレコキシブ、IPI-549、PLX3397、BLZ945、GW2580、RG7155、IMC-CS4、AMG-820、ARRY-382、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、N-ヒドロキシ-ノル-L-アルギニン、イマチニブ、z-IETD-FMK、トラベクテジン、エムリカサン、抗CCL2抗体(カルルマブ、又はABN912)、タスクイニモド、ASLAN002、IMC-RON8、又はGW3965である。例えば、Flemingら、「Targeting Myeloid-Derived Suppressor Cells to Bypass Tumor-Induced Immunosuppression」Front Immunol.、2018年; 9巻: 398頁を参照されたい。
一部の実施形態では、免疫阻害剤は、投与のために適当な水溶液に製剤化され、第3組成物は第1又は第2ワクチン組成物のいずれかと別個の組成物で投与される。一部の実施形態では、免疫阻害剤組成物は、第1及び/又は第2ワクチン組成物と異なる時間及び日に投与される。
使用の方法
一部の実施形態では、ワクチン組成物の異種プライム及びブースト用量の投与を介して抗原CD8+T細胞応答を誘発する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、これらの方法は、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、及びフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を投与するステップを含み、第1組成物又は第2組成物のうちの一方がプライム用量として投与され、第1組成物又は第2組成物のうちの他方がブースト用量として投与されるが、ただし、第1組成物と第2組成物の両方が投与されるものとする。
一部の実施形態では、プライム及びブースト用量は、少なくとも7日間あけて、少なくとも14日間、又はより長い期間あけて投与される。一部の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約7日間あけて、約14日間あけて、約20日間あけて、約25日間あけて、約30日間あけて、約35日間あけて、約40日間あけて、約45日間あけて、約50日間あけて、約55日間あけて、約60日間あけて、又は約65日間あけて投与される。有利には、用量は、約40日間あけて、約41日間あけて、約42日間あけて、約43日間あけて、約44日間あけて、約45日間あけて、約46日間あけて、約47日間あけて、約48日間あけて、約49日間あけて、又は約50日間あけて投与される。ある特定の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約1週間あけて、約2週間あけて、約3週間あけて、約4週間あけて、約5週間あけて、約6週間あけて、約7週間あけて、約8週間あけて、約9週間あけて、約10週間あけて、約11週間あけて、又は約12週間あけて投与される。ある特定の他の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約1カ月間あけて、約2カ月間あけて、約3カ月間あけて、約4カ月間あけて、約5カ月間あけて、約6カ月間あけて、約7カ月間あけて、約8カ月間あけて、約9カ月間あけて、約10カ月間あけて、約11カ月間あけて、又は約12カ月間あけて投与される。
ある特定の実施形態では、方法は、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、又は、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を投与するステップと、免疫モジュレーターを含む第3組成物を別個に投与するステップを含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーター（immune modulator）は抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される。免疫調節物質（immunomodulator）は、第1及び/又は第2組成物により誘発される細胞媒介性免疫応答を増強する。
一部の実施形態では、第1又は第2ワクチン組成物は、少なくとも7日間あけて、少なくとも14日間、又はより長い期間あけて投与されるプライム及びブースト用量として投与される。一部の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約7日間あけて、約14日間あけて、約20日間あけて、約25日間あけて、約30日間あけて、約35日間あけて、約40日間あけて、約45日間あけて、約50日間あけて、約55日間あけて、約60日間あけて、又は約65日間あけて投与される。有利には、用量は約40日間あけて、約41日間あけて、約42日間あけて、約43日間あけて、約44日間あけて、約45日間あけて、約46日間あけて、約47日間あけて、約48日間あけて、約49日間あけて又は約50日間あけて投与される。ある特定の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約1週間あけて、約2週間あけて、約3週間あけて、約4週間あけて、約5週間あけて、約6週間あけて、約7週間あけて、約8週間あけて、約9週間あけて、約10週間あけて、約11週間あけて、又は約12週間あけて投与される。ある特定の他の実施形態では、プライム用量及びブースト用量は、約1カ月間あけて、約2カ月間あけて、約3カ月間あけて、約4カ月間あけて、約5カ月間あけて、約6カ月間あけて、約7カ月間あけて、約8カ月間あけて、約9カ月間あけて、約10カ月間あけて、約11カ月間あけて、又は約12カ月間あけて投与される。
一部の実施形態では、第3組成物、免疫モジュレーターは第1又は第2ワクチン組成物と同じ日に投与される。一部の実施形態では、第3組成物は、複数日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日又は少なくとも6日投与される。一部の実施形態では、第3組成物は、第1又は第2ワクチン組成物のプライム用量とブースト用量との間に少なくとも1回、及び第1又は第2組合せワクチンのブースト用量後に少なくとも1回投与される。例示的実施形態では、第3組成物は、第1又は第2ワクチン組成物のプライム用量の投与から4、7、11、15、18及び22日後に投与される。
一部の実施形態では、組合せワクチンはそれを必要とする対象に投与される。一部の実施形態では、それを必要とする対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、又は魚である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト、伴侶動物又は飼いならした動物又は食料生産動物若しくは飼料生産動物又は家畜又は狩猟動物又はレース用動物又はスポーツ用動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ若しくはブタ若しくはウマ、又はさらには家禽、例えば、シチメンチョウ、アヒル又はニワトリである。ある特定の実施形態では、脊椎動物はヒトである。
本明細書で使用される場合、免疫学的有効量は、それを必要とする対象に投与された場合、送達された抗原に免疫応答をもたらす組合せワクチンの組成物の量又は濃度である。ある特定の実施形態では、組合せワクチン若しくはワクチン組成物の免疫学的有効量は、抗原特異的なCD8+T細胞応答をもたらす。
本発明の方法は、予防接種として疾患を予防するため、又は治療用ワクチン接種として疾患を処置するために適切に適用され得る。本発明の組合せワクチンは、それを必要とする対象に、プライム用量及びブースト用量として単独で、又は免疫阻害剤組成物と組み合わせて投与することができる。さらに本発明の組合せワクチンは、それを必要とする対象に、プライム用量又はブースト用量として、免疫阻害剤組成物と組み合わせて投与することができる。免疫モジュレーター組成物は、組合せワクチンの第3のはっきりと異なる組成物であり、第1ワクチン組成物及び/又は第2ワクチン組成物のいずれかと同じ日及び時間に、又は異なる日に投与され得る。例示的実施形態では、免疫モジュレーター組成物は第1ワクチン組成物の後に投与される。
ある特定の実施形態では、組合せワクチンは、それを必要とする対象に、がんを処置又は予防するのに使用するために投与される。一部の実施形態では、組合せワクチンは、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、脳がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん（kidney cancer）、卵巣がん、骨髄腫がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、頭頸部がん、直腸結腸がん、腎がん（renal cancer）、食道がん、黒色腫皮膚がん及び/又は前立腺がんの患者に対する治療剤又は予防剤として使用される。これらのがん細胞は、新抗原又はウイルス抗原に発現することができ、ワクチン組成物は、特定のがん/腫瘍の生物学（biology）に応じて1つ以上のCD+8T細胞エピトープを含む適当なポリペプチドを含むことになる。
ある特定の実施形態では、組合せワクチンは、それを必要とする対象に、慢性感染症を処置又は予防することに使用するために投与される。一部の実施形態では、組合せワクチンは、慢性感染症を有する個体、又は慢性感染症を引き起こす病原体への曝露の危険性を有する個体に対する治療剤又は予防剤として使用される。このような病原体として、これらに限定されないが、HIV、B型肝炎及びD型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス及びヒトTリンパ向性ウイルスIII型（human T-lymphotropic virus type III）が挙げられる。
組合せワクチンは、様々な公知の経路及び技術を使用して、ヒト又は動物対象にin vivoで投与することができる。例えば、組合せワクチンの組成物は、注射可能な溶液、懸濁剤又は乳剤として提供されてもよく、従来の針及びシリンジを使用して、又は液体ジェット式注射システムを使用して、非経口、皮下、経口、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内注射を介して投与される。組合せワクチンの組成物は、皮膚又は粘膜組織に、例えば、経鼻的、気管内、腸内、舌下、直腸に若しくは経膣により局所的に投与されてもよく、又は呼吸器若しくは肺投与に適した微細に分割されたスプレーとして、例えば、ミストで提供される。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は筋肉内投与される。
組合せワクチン組成物は、対象に、予防及び/又は治療に有効な投与量組成と適合性のある量で投与することができる。本発明の組成物の投与は、「予防用」又は「治療用」のいずれかの目的のためのものであってよい。本明細書で使用される場合、「治療用」又は「処置」という用語は、以下のうちのいずれか1つ以上を含む:感染症の予防、慢性感染症の処置、腫瘍形成/発がんの予防、症状の削減若しくは排除、及び/又は腫瘍若しくはがんの削減若しくは完全な排除。
一部の実施形態では、組合せワクチンは、がん抗原又はがんに関連するウイルス抗原を含み、処置は、予防的(がんの確定診断前)又は治療的(がんの診断後)であってよい。治療的処置は、ステージI、II、III、又はIVのがん、手術前又は手術後の治療介入に施すことができる。処置は疾患の無増悪生存期間又は全生存率及び/又はクリアランスを改善するための術後の維持療法又は長期的処置であってよい。
担体の選択は、これが必要であれば、多くの場合組成物の送達経路の機能である。本発明の範囲内で、組成物は、任意の適切な経路及び投与手段に対して製剤化することができる。薬学的に許容される担体又は希釈剤は、経口、眼、直腸、経鼻、局所的(口腔及び舌下を含む)、経膣又は非経口(皮下、筋肉内の、静脈内、皮内、経皮を含む)投与に適した組成物に使用されているものを含む。
組成物は、任意の適切な形態、例えば、液体、固体又はエアロゾルとして投与することができる。例えば、経口製剤は、乳剤、シロップ剤又は液剤又は錠剤又はカプセル剤の形態を取ることができ、これらを腸溶性コーティングして、胃での分解から活性成分を保護する。経鼻の製剤化はスプレー、ミスト又は液剤であってよい。経皮製剤は、これらの特定の送達システムに適応させることができ、パッチを含み得る。注射用の製剤は、蒸留水又は別の薬学的に許容される溶媒又は懸濁化剤中の液剤又は懸濁剤であってよい。
患者に投与する予防用又は治療用のワクチンの適当な投与量は臨床で決定されることになる。元のプライム及びブースト用量を超えた複数回用量が免疫学的又は臨床効果を達成するために必要とされ得る。必要とされる場合、これらは通常1〜12週間あけて投与される。長期間にわたり免疫応答のブーストが必要とされる場合、1カ月〜5年の間をあけた繰返し用量が適用されてもよい。
[実施例]
以下の実施例は、本明細書で提供される実施形態をどのように使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提案されたものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものでも、以下の実施例が実施されたすべての実験又は唯一の実験であることを意味することを意図するものでもない。使用されている数(例えば、量、温度など)に関して正確さを確実にするよう努力が払われてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差があることも認識されたい。別途示されていない限り、部は容量部で、温度は摂氏で示されている。記載されている方法におけるばらつきは、実施例が例示しようとしている基本的態様を変更せずに作製することができることを理解されたい。
[実施例1]
異種プライム及びブースト用量組合せを含む組合せワクチンの調製:第1組成物(非複製ウイルスベクター組成物)及び第2組成物(フルオロカーボン連結ペプチド組成物)
非複製ウイルスベクター組成物
AdGP70は、E1及びE3(ΔE1E3)の欠損により複製欠陥が付与され、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター下でGP70(エンベロープ(Env)タンパク質ネズミ白血病ウイルス-MuLV-GenBankアクセッション番号ABC94931.1)の発現を可能にする組換えアデノウイルス血清型5ベクターとして設計した。最初に、Genscript(Piscataway、NJ)においてpAdHighγシャトルベクター(Altimmune Inc)のHindIII/XbaI制限酵素認識部位へ、哺乳動物細胞における発現のために化学的に合成したコドン最適化GP70遺伝子をクローニングした後、シャトルプラスミドを得た。導入遺伝子を含有するpAdHighγシャトルベクターと、pAdEasy-1アデノウイルス5骨格プラスミドとの間の組換えを、ゲノムプラスミドpAdGP70の生成のために、カナマイシン選択下、大腸菌(E.coli)株BJ5183で実施した。pAdEasy-1プラスミドは、ヌクレオチド1〜3,533(E1遺伝子を包含)及びヌクレオチド28,130〜30,820(E3を包含)を除くすべてのAd5配列を含有する。選択したゲノムプラスミドpAdGP70は、コロニー単離を介して、カナマイシン選択下で、大腸菌株DH10B細胞に再変換した。選択したpAdGP70コロニーを増幅し、精製した。PacI線状化し、精製したpAdGP70ゲノムプラスミドを、アデノウイルスパッケージング細胞株HEK293に形質移入することにより、AdGP70組換えアデノウイルスベクター種子を生成した。AdGP70ベクターをHEK293細胞上で増殖させ、塩化セシウム勾配上での超遠心分離により精製した。精製されたAd5ベクターを0.22μm細孔サイズの濾過で滅菌し、A195アデノウイルス貯蔵緩衝液中で、-80℃で貯蔵した。HEK293細胞上でAdeno-X rapid titer kit(Clontech、Mountain View、CA)を使用することによりAdGP70力価(4×1011ifu/ml)を決定した。in vivo投与前、AdGP70をPBS中で4×1010ifu/mlまでさらに希釈した。
配列番号1:ネズミ白血病ウイルスGP70タンパク質配列-アクセッション番号ABC94931.1
Figure 2021520414
Figure 2021520414
抗原中に存在するT細胞エピトープは、公開されたエピトープ、人工神経ネットワーク(ANN)若しくは安定化したマトリックス方法(SMM)(Immune Epitope Database and Analysis Resourceウェブサイトを使用)又はSYFPEITHIウェブサイト(公開された報告に基づいてクラスI及びクラスIIのMHC分子に結合することが知られている7000種超のペプチド配列を含むデータベースである)を含む様々な方法を使用して同定することができる。人工神経ネットワーク(ANN)、及び予測IC50カットオフ<50nMを使用した安定化したマトリックス方法(SMM)、及び閾値>20を使用したSYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)を使用して、ネズミクラスI及びクラスIIのMHC分子(H-2Kd、H-2Dd、H-2Ld、IAd及びIEd)に対する高親和性結合ペプチドを予測することによりGP70由来のT細胞エピトープを同定した。これらの方法の組合せを使用して同定したGP70タンパク質配列のT細胞エピトープが表1に提供されている。
Figure 2021520414
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Figure 2021520414
フルオロカーボン連結ペプチド組成物
フルオロカーボン連結ペプチド組成物(PepGP70)は、GP70（エンベロープ(Env)タンパク質ネズミ白血病ウイルス(MuLV)）から誘導された4個のフルオロカーボン改変ペプチド(GP70-142、GP70-196、GP70-472、GP70-CM)を含有する。GP-70-142、GP70-196、GP70-472、GP70-CMの配列は表1及び表2に提示されている。人工神経ネットワーク(ANN)、並びに予測IC50カットオフ<50nMを使用した安定化したマトリックス方法(SMM)(www.iedb.org/)、並びに閾値>20を使用したSYFPEITHI(www.syfpeithi.de/)及び公開された情報を使用して、ネズミクラスI及びクラスIIのMHC分子(H-2Kd、H-2Dd、H-2Ld、IAd及びIEd)に対する高親和性結合ペプチドの予測に基づき、4個のペプチドを選択した。GP70-142、GP70-196、GP70-472、GP70-CMを固相ペプチド合成(SPPS)により得た。すべてのペプチドは、標準的な9-フルオレニルメトキシカルボニル(fluorenyhnethoxycarbonyl)(Fmoc)化学反応を使用して樹脂上にペプチドを作って、American Peptide Company(Sunnyvale、CA)で合成した。フルオロカーボン改変ペプチドを導き出すための選択的に脱保護したC末端又はN末端の追加のリシンのエプシロン鎖上への2H,2H,3H,3H-パーフルオロウンデカン酸フルオロカーボン鎖(C8F17(CH2)2COOH)の組込み。側鎖保護基の切断及び除去後、粗生成物ペプチドを冷たいエーテルから沈殿させ、濾過によって収集した。RP-HPLCで純度を評価すると、すべてのペプチドについて90%を上回った。凍結乾燥したフルオロカーボン連結ペプチドを-20℃で貯蔵した。ペプチドGP-70-142、GP70-196、GP70-472、GP70-CMを可溶化し、ブレンドし、マンニトール/水 溶液を加え、0.22μmフィルターを使用して濾過し、凍結乾燥してペプチド1個当たり1400μgを含有する個々のバイアルを生成した後、PepGP70を得た。凍結乾燥したPepGP70を-20℃で貯蔵した。in vivo投与の前に、凍結乾燥したPepGP70バイアルをODN1585(TLR9アゴニスト;Invivogen、Toulouse、France)を含有する1.4mlの28mM L-ヒスチジンで再構成して、100μg/ODN1585/ml及び1000μg/ペプチド/mlの強度をもたらした。
Figure 2021520414
GP70タンパク質配列から誘導された上記ペプチドは、タンパク質の上記全長配列(配列番号1)において下線が引かれており、T細胞エピトープは表1に同定されている。GP70-472及びGP70-CMは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープSPSYVYHQF(配列番号72)(デキストラマー中AH1とも呼ばれる)を含有する。KKKはリンカーであり、全長GP70タンパク質配列には存在しない。GP70-CMは、CTLエピトープ(CD8+エピトープ)、KKKリンカー及びT-ヘルパーリンパ球(HTL)エピトープを含有するキメラペプチドである。
したがって、異種プライムブースト投与レジメンのための組合せワクチンであって、組合せが、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、及びフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)第1組成物中の抗原又は免疫原のうちの1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する、第2組成物を含み、第1又は第2組成物のいずれかがプライム組成物又はブースト組成物である組合せワクチンが本明細書で提供される。
[実施例2]
T細胞ワクチン組成物と免疫モジュレーター組成物の組合せを含む組合せワクチンの調製:第1組成物(非複製ウイルスベクター組成物)又は第2組成物(フルオロカーボン連結ペプチド組成物)及び第3組成物(免疫モジュレーター組成物)
非複製ウイルスベクター組成物(第1組成物)及びフルオロカーボン連結ペプチド組成物(第2組成物)を実施例1に開示された通りに調製した。
免疫モジュレーター組成物
免疫モジュレーター組成物は、本明細書中に開示されたもののうちのいずれかであってよく、適当な水溶液中で提供することができる。本発明の実施例では、抗PD-1はPBS中で提供され、以下に開示された通り、別個に及び上記に開示された第1又は第2ワクチン組成物のいずれかとは異なる時間点で投与された。
したがって、CD8+T細胞応答を誘発し、腫瘍サイズを減少させることに使用するための組合せワクチンであって、組合せが、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、又は、フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原のうちの1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する、第2組成物、及び抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を含む組合せワクチンが本明細書で提供される。第1又は第2組成物は第3組成物とは別個に投与される。
ある特定の実施形態では、a)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、b)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、及びc)抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物から選択される2〜3種の組成物を含む組合せワクチンであって、第1組成物及び第2組成物が選択される場合、第1又は第2組成物のいずれかはプライム組成物又はブースト組成物である組合せワクチンが本明細書で提供される。
[実施例3]
非複製ウイルスベクター組成物及びフルオロカーボン連結ペプチド組成物を使用して抗原特異的なCD8+T細胞応答を誘発する、異種組合せワクチン
AdGP70(非ウイルスベクター組成物)及びPepGP70(フルオロカーボン連結ペプチド組成物)の調製は実施例1において開示されており、AdGP70はGP70(配列番号1)を発現する複製不全のアデノウイルスベクターであり、PepGP70はフルオロカーボン鎖に個々に結合し、ミセル中に存在する4個のペプチド(配列番号:68〜71)の組合せである。
AdGP70及びPepGP70組成物の同種プライム/ブースト投与と、異種プライム/ブースト投与の比較を実施し、BALB/cマウスにおける1又は2回の投与後のAdGP70及びPepGP70組成物の免疫原性を、AdGP70とPepGP70の異種プライム/ブースト組合せと比較した。皮下経路を使用して、プライム用量の投与とブースト用量の投与との間に14日の間隔をあけてマウスに免疫を付与した。グループ1(n=8)には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を0日目に皮下投与した。グループ2(n=8)には50μlのAdGP70(2×109ifu)を0日目に皮下投与した。グループ3(n=8)には、50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を0日目及び14日目に皮下投与した。グループ4(n=8)には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を0日目及び14日目に皮下投与した。グループ5(n=8)には50μlのAdGP70(2×109ifu)及びPepGP70(50μg/ペプチド)を0日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。グループ6(n=8)には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)及びAdGP70(2×109ifu)を1日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。最終投与から10日後(24日目の測定)、各動物から脾臓細胞を単離し、2つのタイプのイムノアッセイを介して処理した:(1)個々の動物におけるGP70-特異的T細胞の頻度を評価するin vitroのIFN-γELISpotアッセイ(図1)、及び(2)gp70から誘導されたH-2Ld-抑制エピトープ(AH1ペプチド、配列SPSYVYHQF(配列番号72))に特異的なCD8+T細胞の頻度を測定するためのフローサイトメトリーによるデキストラマー染色アッセイ。図1及び2を参照されたい。
治験はいくつかの疾患に対抗するT細胞を誘発するワクチンの効果を実証しており、防御的T細胞応答を評価するための多くの手法が使用され得るが、ワクチン免疫原性を判定するために最も適切な手段としてELISpotアッセイが確立された。Slota M.ら、ELISpot for measuring human immune responses to vaccines.、Expert Rev Vaccines、2011年;10巻(3号):299〜306頁。IFN-γELISpotアッセイのため、ELISpotプレート(MSIPS4510 Merck Millipore)は、無菌条件下、5μg/mlでPBS中で希釈した100μl/ウェルの捕捉IFN-γ抗体(Mouse IFNg ELISPOTペア、BD、ref 551881)でプレコートし、4℃で終夜インキュベートした。コーティング抗体を除去し、プレートを洗浄し、次いで、10%ウシ胎児血清(GIBCO、ref 10270-098)、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(GIBCO、ref 11548876)を補充したRPMI Glutamax 1640(GIBCO、ref 11548876)で構成される200μL/ウェルの完全培地を用いて室温で2時間インキュベートした。培地を除去した後、プレコートしたELISpotプレートに、1ウェル当たり200μlの容積での、それぞれ個々のペプチド10μg/ml(GP-70-142、GP70-196、GP70-472、GP70-CM)又は4つのペプチド混合物のいずれかの存在下で、陽性対照としてはコンカナバリン(eBiosciences、ref 00-4978-03)の存在下で、1ウェル当たり5×105個の細胞の濃度で完全培地中の脾臓細胞懸濁液を加えた。陰性対照としては培地のみを使用した。各試験条件は二回反復で達成した。加湿環境下、37℃、5%CO2で18時間プレートをインキュベートした。細胞を完全に除去するための脱イオン水(DI)での2回の洗浄ステップ後、プレートをELISpot洗浄緩衝液(1×Dulbecco's PBS、Gibco、Fisher cat#11540486)、0.05%Tween(登録商標)20 Fisher cat#10113103)で十分に洗浄した。次いで、ELISpotプレートを、10%ウシ胎児血清2μg/mlを補充したPBS中で希釈した100μl/ウェルの抗IFN-g検出抗体(マウスIFNg ELISPOTペア、BD、ref 551881)と共に室温で2時間インキュベートした。検出抗体溶液を廃棄し、プレートをELISpot洗浄緩衝液で洗浄してから、100μL/ウェルの希釈したストレプトアビジン-HRP(BD(商標)ELISPOTストレプトアビジン-HRP、Cat.No.557630)と共に室温で1時間インキュベートした。ストレプトアビジン-HRP溶液を除去し、プレートをELISpot洗浄緩衝液で洗浄した。100μLの最終基質溶液(AEC)を各ウェルに加えた。スポット発生を15〜20分モニターし、ウェルをDI水で洗浄することにより基質反応を停止させた。次いでプレートを暗所で、終夜室温で空気乾燥させた。ELISPOT分析器:ImmunoSpot(登録商標)ELISpotプレートリーダー(CTL-Europe GmbH、Germany)を使用してスポット計数を実施した。スポット形成細胞、SFC/ウェルを計数して、特異的刺激に応答してIFN-γを生成する細胞の数を定量化した。
図1を参照されたい。図1は、プライム用量の投与から24日後の時点で各グループに対して計算した、脾臓細胞100万個当たりのIFN-γ生成細胞(スポット形成細胞、SFC)の数として表現された、4個のペプチドへの累積的IFN-γELISpot応答を示している。グループ5及び6は、同種プライムブーストグループと比較して、共力剤作用を示す異種プライムブーストグループである。
デキストラマーアッセイのため、AH1ペプチド(GP70から誘導されたCD8+T細胞エピトープ、配列:SPSYVYHQF(配列番号73))を用いて調製したH-2Ldデキストラマー、又はNP118-126ペプチド(LCMVの核タンパクから誘導されたCD8+T細胞エピトープ、配列:RPQASGVYM(配列番号74))を用いて調製した無関係な対照H-2Ldデキストラマー(両方ともフィコエリスリン(PE)で標識されている)でネズミ脾臓細胞を染色した。デキストラマー試薬は、最適化された数のMHC-ペプチド複合体及び蛍光色素を有するデキストランポリマー骨格からなり、これにより抗原特異的なT細胞（デキストランポリマーにより運ばれるMHC/ペプチド複合体を特異的に認識するT細胞受容体を有する）を検出する能力がもたらされるは。フローサイトメトリー分析に対する細胞染色プロセスは以下の通り記載されている。グループ1〜6の動物から採取した個々の脾臓細胞(1×106個の細胞)を、96ウェルプレート内で、10%ウシ胎児血清(GIBCO、ref 10270-098)、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(GIBCO、ref 11548876)を補充したRPMI Glutamax 1640(GIBCO、ref 11548876)で構成される200μlの完全培地中で培養した。プレートは、加湿環境下、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。インキュベーション後、個々のマウスから採取した脾臓細胞をグループごとにプールし、染色緩衝液(5%ウシ胎児血清、2mM EDTA及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したDPBS1X)を用いて、1300rpm、4℃で6分間遠心分離することにより、洗浄した。脾臓細胞を1:200に希釈した抗マウスCD16/32抗体を含有する25μlの冷たい染色緩衝液と共に、4℃で10分間インキュベートすることによりFc受容体を遮断（block）した。次いで、細胞を、関係するAH-1/H-2Ldデキストラマー(Immudex、ref JG3294-OPT)又は無関係なNP118-126/H-2Ldデキストラマー(Immudex、ref JG2750-OPT)のいずれかで染色した。染色緩衝液中の25μlの1:2.5の適当な予め希釈したデキストラマーをFc受容体を遮断した細胞に加え、その後4℃で30分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、抗マウスCD4 Pe-Cy7(Ozyme、ref BLE100422)、抗マウスCD8a BV510(Ozyme、ref BLE100752)、抗マウスCD44 BV650(Ozyme、ref BLE103049)、抗マウスCD62 LBV711(Ozyme、ref BLE104445)、抗マウスCD45 APC(Ozyme、ref BLE103112)、抗マウスPD1 PERCP-Cy5.5(Ozyme、ref BLE109119)、抗マウスCD69 APC-eFluor780(eBioscience、ref 47-0691-80)及びViability Dye eFluor(商標)520(eBioscience、ref 65-0867-14)を含有する2×抗体カクテルを染色緩衝液中で調製した。50μlの抗体カクテルをデキストラマー染色した細胞に加え、その後4℃で20分間インキュベーションを行った。染色ステップ後、細胞は、1300rpm、4℃で6分間遠心分離することにより染色緩衝液で2回洗浄し、200μlの染色緩衝液中に再懸濁させてから、フローサイトメトリーを取得し、分析した。生きたCD45+CD8細胞に対してゲート通過事象を収集した。図2は、デキストラマー染色に対して陽性のCD8+T細胞のパーセンテージを示している。
図2を参照されたい。図2は、プライム用量の投与から24日後のデキストラマー染色に対して陽性のCD8+T細胞のパーセンテージを示している。グループ5及び6は、同種プライムブーストグループと比較して共力剤作用を示す異種プライムブーストグループである。
ELISpotアッセイから得た結果は、PepGP70又はAdGP70の単回投与と2回の投与を比較して、IFN-γを生成する脾臓細胞の数の増加を実証している。驚くことに、異種プライム-ブースト用量の投与(AdGP70、これに続いてPepGP70又はこの反対)は、AgGP70又はPepGP70を用いた同種プライム-ブースト用量の投与と比較して、より強い末梢性免疫応答が誘発された。図1及び2を参照されたい。データは、異種プライム-ブースト用量の投与で組み合わせた場合、CD8+T細胞応答を含めたより強固なT細胞応答を促進するこれらの能力において、2種の異なるタイプの免疫原の間に予期せぬ相乗効果があることを明らかにした。結果はまた、PepGP70を最初に使用し、これに続いてAdGP70を投与する異種プライム-ブーストレジメンが、デキストラマーイムノアッセイで明らかにされたように、抗原-CD8+T細胞の誘発に対してより好ましい状態を表すことを示している。図2を参照されたい。
したがって、異種用量レジメンを使用して、それを必要とする対象において免疫応答を誘発する方法であって、1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含む抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、及びフルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)ウイルスベクターの抗原又は免疫原内の1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含む、第2組成物を投与するステップを含み、抗原特異的なCD8+T細胞応答が誘発される方法が本明細書で提供される。第1組成物又は第2組成物は、プライム用量として投与され、第1組成物又は第2組成物のうちの1つはブースト用量として投与されるが、ただし、第1組成物と第2組成物の両方が投与されるものとする。
[実施例4]
異種投与レジメンにおける非複製ウイルスベクター組成物及びフルオロカーボン連結ペプチド組成物の使用
CT26腫瘍細胞を負荷（challenge）したBALB/cマウスにおける抗腫瘍活性を評価することにより、AdGP70とPepGP70との間の相乗効果を試験した。週齢6〜8週の雌のBALB/cマウスを実験に使用する。0日目に、100μlのPBS中の2×104個のCT26細胞をマウス側腹部に皮下注射する。AdGP70及びPepGP70のワクチン組成物を実施例1に従い調製し、製剤化されたワクチンを50μlの注射可能な溶液として調製する。プライム用量とブースト用量が14日間あけて投与されるプライム/ブーストスケジュールに従い組成物を皮下投与する。
グループ1には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を1日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。グループ2には50μlのAdGP70(2×109ifu)を7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。グループ3にはワクチン50μlのAdGP70(2×109ifu)及びPepGP70(50μg/ペプチド)のみを7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。グループ4には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)及び50μlのAdGP70(2×109ifu)を1日目及び14日目にそれぞれ皮下投与した。グループ5は処置を施さなかった。
両方のワクチンPepGP70及びAdGP70は、個々に又は抗腫瘍応答を促進するためのプライム-ブースト組合せとして試験した。プライム/ブースト組合せからなるワクチンレジメンは、個々に試験したPepGP70及びAdGP70と比較して、抗腫瘍応答をより良好に促進する。
[実施例5]
異種投与レジメンにおける、免疫チェックポイント阻害剤(抗PD1)と組み合わせた、非複製ウイルスベクター組成物及びフルオロカーボン連結ペプチド組成物の使用
AdGP70(非ウイルスウイルスベクター組成物)及びPepGP70(フルオロカーボン連結ペプチド組成物)の調製は実施例1において開示されており、AdGP70はGP70を発現する複製不全のアデノウイルスベクター(配列番号1)であり、PepGP70はフルオロカーボン鎖に個々に結合し、ミセル中に存在する4個のペプチド(配列番号:68〜71)の組合せであり、免疫チェックポイント阻害剤組成物の調製は実施例2に開示されている。
CT26腫瘍細胞を負荷したBALB/cマウスにおいてワクチン誘発性免疫応答を評価することによって、抗PD1処置と組み合わせたAdGP70とPepGP70との間の相乗効果を試験した。週齢6〜8週の雌のBALB/cマウス(1グループ当たりn=12)を実験に使用した。動物の腫瘍細胞植菌部位を剪毛できるようにケタミン-ドミトール(0.7/80mg/kg)混合物で動物を麻酔下におき、アンチセダン(2mg/kg)の注射により覚醒を誘発した。0日目に、100μlのPBS中の2×104個のCT26細胞をマウス側腹部に皮下注射した。
AdGP70及びPepGP70のワクチン組成物は、製剤化したワクチンを50μlの注射可能な溶液として調製した実施例1に従い調製した。組成物は、プライム用量とブースト用量が7日間あけて投与されるプライム/ブーストスケジュールに従い皮下投与した。この腫瘍実験モデルでは、ブースト用量は、強固な免疫応答が固定されて（is mounted）、腫瘍に対抗する免疫応答作用が確実に検出されるよう、典型的な14日の代わりに7日後に投与される。免疫-チェックポイント阻害剤組成物、抗PD1(抗CD279-クローンRMP1-14、InVivoPlus、Euromedex、ref BP0146-100mg;GoInVivo、Ozyme、ref BLE114115)の6種の注射を腹腔内経路で投与した。
グループ1(n=12)には、50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与し、100μl中の200μgの抗マウスPD1を7日目、11日目、14日目、18日目、22日目及び25日目に腹腔内投与した。グループ2(n=12)には、50μlのAdGP70(2×109ifu)を7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与し、100μl中の200μgの抗マウスPD1を7日目、11日目、14日目、18日目、22日目及び25日目に腹腔内投与した。グループ3(n=12)にはワクチン50μlのAdGP70(2×109ifu)及びPepGP70(50μg/ペプチド)のみを7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与し、100μl中の200μgの抗マウスPD1を7日目、11日目、14日目、18日目、22日目及び25日目に腹腔内投与した。グループ4(n=12)には、50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)及び50μlのAdGP70(2×109ifu)を7日目及び14日目にそれぞれ皮下投与し、100μl中の200μgの抗マウスPD1を7日目、11日目、14日目、18日目、22日目及び25日目に腹腔内投与した。グループ5には100μl中の200μgの抗マウスPD1を7日目、11日目、14日目、18日目、22日目及び25日目に腹腔内投与した。グループ6(n=12)には処置を施さなかった。
デキストラマーアッセイのために、6日目(D6)又は20日目(D20)に収集したPBMCを、フィコエリスリン(PE)で標識したAH1ペプチド(GP70から誘導されたCD8+T細胞エピトープ、配列:SPSYVYHQF(配列番号73))を用いて調製したH-2Ldデキストラマーで染色した。フローサイトメトリー分析用細胞染色プロセスは以下の通り記載されている。グループ1〜6の動物から採取した200μlの全血試料を、眼窩後採血技術（retro orbital bleeding technique）を介してEDTAコーティングしたチューブに収集し、数回反転させて血栓形成を防止した。製造業者が推奨する通り(eBiosciences、ref 00-4300-54)複数種RBC溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。グループ1〜6の動物から得た個々のPBMC試料を、96ウェルプレート内で、10%ウシ胎児血清、(GIBCO、ref 10270-098)、及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(GIBCO、ref 11548876)を補充したRPMI Glutamax 1640(GIBCO、ref 11548876)で構成される200μlの完全培地内で培養した。プレートを加湿環境下、37℃、5%CO2で終夜インキュベートした。赤血球の溶解、インキュベーションが完了した後、個々のマウスからのPBMCを、1300rpm、室温で6分間遠心分離することにより、染色緩衝液(5%のウシ胎児血清、2mM EDTA及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したDPBS1X)で洗浄した。脾臓細胞を、1:200に希釈した抗マウスCD16/32抗体を含有する25μlの冷たい染色緩衝液と共に4℃で10分間インキュベートすることによって、Fc受容体を遮断した。次いで、関係するAH-1/H-2Ldデキストラマー(Immudex、ref JG3294-OPT)又は無関係なNP118-126/H-2Ldデキストラマー(Immudex、ref JG2750-OPT)のいずれかで細胞を染色した。染色緩衝液中25μlの1:2.5の適当な予め希釈したデキストラマーをFc受容体遮断した細胞に加え、その後、4℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、抗マウスCD4 Pe-Cy7(Ozyme、ref BLE100422)、抗マウスCD8a BV510(Ozyme、ref BLE100752)、抗マウスCD44 VioBlue抗マウス(Miltenyi、ref 130-102-443)、抗マウスPD1 PERCP-Cy5.5(Ozyme、ref BLE109119)、CD25 PEeFluor 610(eBioscience、ref 61-0251-82)、CD11b Alexa 700(eBioscience、ref 56-0112-82)及びViability Dye eFluor(商標)520(eBioscience、ref 65-0867-14)を含有する2×抗体カクテルを染色緩衝液中に調製した。50μlの抗体カクテルをデキストラマー染色した細胞に加え、その後4℃で20分間インキュベートした。染色ステップ後、1300rpm、4℃で6分間遠心分離することにより、細胞を染色緩衝液で2回洗浄した。表面染色した細胞を、製造業者が推奨する通り調製した200μlの固定/透過作業用溶液(固定/透過及び透過緩衝液セットキット、eBioscience、ref 00-5523-00)に再懸濁させ、4℃で25分間インキュベートした。次いで、1300rpm、4℃で6分間遠心分離することにより、細胞を1×透過緩衝液で洗浄してから、抗マウスパーフォリンAPC(eBioscience、ref 17-9392-80)で染色した。50μlの予め希釈したパーフォリンAPCをデキストラマー染色した細胞に加え、その後4℃で20分間のインキュベーションを行った。1300rpm、4℃で6分間遠心分離することにより、細胞を1×透過緩衝液で2回洗浄し、次いで染色緩衝液に再懸濁させてから、フローサイトメトリーを取得し、分析した。生きたデキストラマー+ CD8+細胞に対してゲート通過事象を収集した。図3は、6日目(D6)及び20日目(D20)における各グループに対する中央値として表現されたデキストラマー染色に対して陽性のCD8+T細胞のパーセンテージを示している。
図3に提示されたように、個々に又はプライム-ブースト組合せとして試験したワクチン組成物PepGP70及びAdGP70は両方とも抗腫瘍免疫応答を促進するこれらの能力において、抗PD1処置との相乗作用を発揮し、図3では、抗原特異的CD8+T細胞を6日目(D6)及び20日目(D20)に測定した。PepGP70を用いたプライム及びAdGP70を用いたブーストからなる組合せワクチンは、抗PD1処置と共に、他のワクチンレジメンと比較してずっと高い応答を促進している。すべてのワクチン投与レジメン(グループ1〜4)が抗PD1との相乗作用を発揮しているが、プライム用量としてPepGP70及びブースト用量としてAdGP70を用いた投与レジメン(グループ4)は、同種投与レジメンワクチン(グループ1及び2)と比較して相乗効果を実証した。
[実施例6]
抗原特異的CD4+及びCD8+T細胞応答及び抗腫瘍活性を誘発するための、同種投与レジメンにおけるフルオロカーボン連結ペプチド組成物の使用
GP70ペプチドの代わりにOVAペプチドを使用したことを除いては、実施例1の開示に従いフルオロカーボン連結ペプチド(FP-OVA)組成物を調製した。FP-OVAは、CD4+T細胞エピトープ(Ova323-339、配列ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号76))及びCD8+T細胞エピトープ(アミノ酸位置257-264、配列SIINFEKL(配列番号77))を含有するオボアルブミン由来ペプチド(配列ISQAVHAAHAEINEAGRESIINFEKLTEWT(配列番号75))で構成される。
この実験では、0日目及び14日目に、100μl中の200μgのFP-OVAワクチン(グループ1)又は100μlの賦形剤溶液(グループ2)を、雌のC57BL/6マウス(n=15/グループ)の皮下にワクチン接種した。24日目、各グループ中の5匹のマウスを屠殺して、ELISpotアッセイを用いて免疫応答を測定した。ワクチン組成物に対する免疫応答を以下の通り測定した:脾臓を収集し、IFNγELISpotアッセイにおいて、細胞を1ng/mlのOVA-CTLエピトープ(Ova257-264、配列SIINFEKL(配列番号:77)(CD8+T細胞エピトープ))又は10μg/mLのOVA-HTL(Ova323-339、配列ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号76)(CD4+T細胞エピトープ))で刺激した。IFNγスポット形成細胞(SFC)の数をカウントした。図4Aは、個々のマウスに対する、対照ウェル値の引き算後の、OVA-CTL又はOVA-HTLに応答して生成されたIFNγスポット形成細胞(SFC)の数／106個の脾臓細胞(線は中央応答値（median response value）を表している)を示している。データは、Kolmogorov-Smirnov正規度試験を使用してパラメトリックとして定義し、Student's t検定(P<0.001=***)を使用して統計分析を実施した。
24日目に、各グループの10匹の残りのマウスに、2×106個のE.G7-OVA細胞、ニワトリオボアルブミン(OVA)の相補DNAを安定的に形質移入し、よってOVAエピトープを独自の抗原として発現するマウス胸腺腫EL4細胞を皮下注射した。負荷されたマウスは、腫瘍サイズが150mm2に到達した時点で処分した。図4Bは、2つの異なるグループにおいて時間の経過と共に測定した全生存率を示している。図5は、賦形剤グループ(図5A)及びワクチングループ(図5B)において時間の経過と共に測定した腫瘍成長を示している。図4及び5は、フルオロカーボン連結ペプチドの有効性を実証しており、このペプチドは、がんに対抗する予防剤としての独自のがん抗原である。
第2の実験では、雌のC57BL/6マウス(n=10/グループ)に、0日目に、一方の側腹部に2×106個のE.G7-OVA細胞を皮下注射し、50日目に、生き残っている動物の反対の側腹部に2×106個のE.G7-OVA細胞の2度目の投与を行った。次いで、グループ1には、1日目及び8日目に100μl中の200μgのFP-OVAワクチンを皮下投与した。グループ2には、3日目に(少なくとも1匹の動物において触知可能な腫瘍の検出日に対応)及び10日目に100μl中の200μgのFP-OVAワクチンを皮下投与した。グループ3には、1日目及び8日目に、100μlの賦形剤を皮下投与した。負荷されたマウスは、腫瘍サイズが150mm2に到達した時点で処分した。図6は、異なるグループにおいて時間の経過と共に測定した全生存率を示しており、グループ1及び2のそれぞれは少なくとも60%の生存率を有し、フルオロカーボン連結ペプチドの有効性を実証し、このペプチドはがんに対する治療剤としての独自のがん抗原である。
[実施例7]
免疫チェックポイント阻害剤(抗PD1)と組み合わせた非複製ウイルスベクター組成物又はフルオロカーボン連結ペプチド組成物の使用
AdGP70(非ウイルスウイルスベクター組成物)及びPepGP70(フルオロカーボン連結ペプチド組成物)の調製は実施例1において開示されており、AdGP70はGP70(配列番号1)を発現する複製不全のアデノウイルスベクターであり、PepGP70はフルオロカーボン鎖に個々に結合し、ミセル中に存在する4個のペプチド(配列番号:68〜71)の組合せであり、免疫チェックポイント阻害剤組成物の調製は実施例2に開示されている。
BALB/cマウスにおいて、CT26結腸がん腫瘍に対抗するこれらそれぞれの抗腫瘍活性を評価することによって、AdGP70又はPepGP70と、抗PD1処置との間の相乗効果を試験した。6〜8週の雌のBALB/cマウス(1グループ当たりn=12)を実験に使用した。動物の腫瘍細胞植菌部位を剪毛できるように、ケタミン-ドミトール(0.7/80mg/kg)の混合物で動物を麻酔下におき、アンチセダン(2mg/kg)の注射により覚醒を誘発した。0日目に、100μl PBS中の2×104個のCT26細胞をマウス側腹部に注射した。最初の陽性腫瘍検出日を決定するために腫瘍触診を週5回実施した。固形腫瘍が検出されたら、そのサイズを週およそ3回測定した。腫瘍サイズ測定は、2つの寸法についてキャリパで実施し、式:L*l^2/2;(L=長い軸及びl=短い軸)に従い容量を決定した。以下の人道的エンドポイントに従い動物を屠殺した:腫瘍容積≧2000mm3、壊死性又は潰瘍化した腫瘍の存在、一時的な疲はい又は猫背の姿勢を含む移動性の損失、呼吸を含む極めて重要な生理機能の障害、有意な腹部膨満又は1週間に>20%の体重減少。
製剤化されたワクチン組成物を、実施例1及び2に従い50μlの注射可能な溶液として調製し、プライム用量とブースト用量が投与14日間あけて投与されるプライム/ブーストスケジュールに従い皮下投与した。免疫チェックポイント、抗PD1(抗CD279-クローンRMP1-14、InVivoPlus、Euromedex、ref BP0146-100mg;GoInVivo、Ozyme、ref BLE114115)の6種の注射を腫瘍発症後の3又は4日ごとに腹腔内経路で投与した。
グループ1(n=15)にはワクチン組成物の調製物のみ、50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を1日目及び15日目にそれぞれ投与した。グループ2(n=14)には、50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)を1日目及び15日目にそれぞれ投与し、4日目、7日目、11日目、15日目、18日目及び22日目に200μgの抗マウスPD1を100μlの送達用量で投与した(抗CD279-クローンRMP1-14)。グループ3(n=14)にはワクチン調製物のみ、50μlのAdGP70(2×109ifu)を0日目及び14日目にそれぞれ投与した。グループ4(n=15)には、50μlのAdGP70(2×109ifu)を0日目及び14日目にそれぞれ投与し、4日目、7日目、11日目、15日目、18日目及び22日目に200μgの抗マウスPD1を100μlの送達用量で投与した(抗CD279-クローンRMP1-14)。グループ5(n=15)には、TLR9アゴニストのみを含有する50μlのワクチン調製物を1日目及び日15日目にそれぞれ投与し、4日目、7日目、11日目、15日目、18日目及び22日目に200μgの抗マウスPD1を100μlの送達用量で投与した(抗CD279-クローンRMP1-14)。グループ6(n=12)は処置を施さなかった。結果は図7(個々の動物における腫瘍容積)及び図8A及び8B(各グループに対する全生存率)に提示されている。
組成物PepGP70とAgGP70は両方とも、図7及び図8A及び8Bにそれぞれ提示されている通り、腫瘍成長の遅延及び全生存率の改善と共に抗腫瘍活性を促進している。加えて、両方のワクチン組成物は、ワクチン組成物又は抗PD1処置のみを投与した動物と比較して、優れた全生存率及び腫瘍成長プロファイルの遅延を示す抗PD1との組合せ処置により恩恵を受ける。
[実施例8]
骨髄由来の抑制細胞(MDSC)阻害剤組成物と組み合わせた非複製ウイルスベクター組成物又はフルオロカーボン連結ペプチド組成物の使用
CT26腫瘍細胞を負荷したBALB/cマウスにおいて抗腫瘍活性を評価することにより、MDSC阻害剤と組み合わせたAdGP70又はPepGP70を試験した。週齢6〜8週の雌のBALB/cマウスを実験に使用する。0日目、100μlのPBS中の2×104個のCT26細胞をマウス側腹部に皮下注射する。AdGP70及びPepGP70ワクチン組成物は、実施例1に従い調製し、製剤化したワクチンは50μlの注射可能な溶液として調製する。組成物は、プライム用量とブースト用量が14日間あけて投与されるプライム/ブーストスケジュールに従い、個々の動物にある用量のAdGP70又はある用量のPepGP70のいずれかが皮下投与される。
グループ1には50μlのPepGP70(50μg/ペプチド)が1日目及び14日目に皮下投与され、MDSC阻害剤が毎日腹腔内に投与される。グループ2には、50μlのAdGP70(2×109ifu)が1日目及び14日目に皮下投与される。グループ3にはMDSC阻害剤が毎日腹腔内に投与される。グループ4には処置を施さない。

Claims (72)

  1. a)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物、
    b)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物、及び
    c)抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物、
    から選択される2〜3種の組成物を含む組合せワクチンであって、第1組成物及び第2組成物が選択される場合、第1又は第2組成物のいずれかがプライム組成物又はブースト組成物である、組合せワクチン。
  2. 抗免疫抑制剤が、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL1、GAL3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、CD244、ADAM17、COX2、PGE-2、iNOS2、PDE5、c-kit、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ-8、CCL2、RON、ROS、又はS100A8/A9を標的とする、請求項1に記載の組合せワクチン。
  3. 抗免疫抑制剤が、PD1又はPDL1を標的とする、請求項2に記載の組合せワクチン。
  4. 抗免疫抑制剤が抗PD1又は抗PDL1抗体である、請求項2に記載の組合せワクチン。
  5. 免疫賦活剤が、Toll様受容体(TLR)3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、STING、cGAS、IFR3、IL-2受容体、IL12受容体又はIFN-アルファ受容体を標的とする、請求項1に記載の組合せワクチン。
  6. 非複製ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである、請求項1に記載の組合せワクチン。
  7. 非複製ウイルスベクターが、E1及びE3欠損アデノウイルスベクターである、請求項6に記載の組合せワクチン。
  8. 第1、第2又は第3組成物が、非経口、経口、眼、直腸、経鼻、経皮的、局所的又は経膣投与用に製剤化される、請求項1に記載の組合せワクチン。
  9. 抗原又は免疫原が病原体由来のものである、請求項1に記載の組合せワクチン。
  10. 病原体が、ウイルス、真菌、寄生生物、又は細菌である、請求項9に記載の組合せワクチン。
  11. ウイルスが、EBV、HPV、HTLV-1、MCPvV、KSHV、HERV、HCV又はHBVである、請求項10に記載の組合せワクチン。
  12. 抗原又は免疫原ががん抗原である、請求項1に記載の組合せワクチン。
  13. 第1組成物がプライム組成物であり、第2組成物がブースト組成物である、請求項1に記載の組合せワクチン。
  14. 第2組成物がプライム組成物であり、第1組成物がブースト組成物である、請求項1に記載の組合せワクチン。
  15. フルオロカーボン連結ペプチドのフルオロカーボン部分が、3〜30個の炭素原子のフルオロカーボン鎖である、請求項1に記載の組合せワクチン。
  16. フルオロカーボン鎖の1つ以上のフッ素部分が塩素、臭素、ヨウ素、水素又はメチル基で置換されている、請求項15に記載の組合せワクチン。
  17. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造CmFn-CyHx-(Sp)-R(式中、m=3〜30、n≦2m+1、y=0〜15、x≦2y、(m+y)=3〜30、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)を有する、請求項1に記載の組合せワクチン。
  18. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造
    Figure 2021520414
     (式中、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)
    によるものである、請求項1に記載の組合せワクチン。
  19. 第2組成物のフルオロカーボン連結ペプチドが、少なくとも1つのMHCクラスII結合エピトープ及び少なくとも1つのMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項1に記載の組合せワクチン。
  20. 第1、第2又は第3組成物のそれぞれが、独立して、1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤又はアジュバントをさらに含む、請求項1に記載の組合せワクチン。
  21. アジュバントが、TLR2、TLR3、TLR7、TLR8又はTLR9、STING、cGAS、IFR3、NOD1又はNOD2のアゴニストである、請求項20に記載の組合せワクチン。
  22. 第1、第2又は第3組成物が、液体、乳剤、固体、エアロゾル、ミスト又は気体の形態である、請求項1に記載の組合せワクチン。
  23. 第1及び第2組成物が選択される、請求項1に記載の組合せワクチン。
  24. 第1組成物又は第2組成物のうちの1つが選択され、かつ、第3組成物が選択される、請求項1に記載の組合せワクチン。
  25. それを必要とする対象において免疫応答を誘発する方法であって、
    a)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原又は免疫原をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、及び
    b)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、ii)第1組成物の抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、iii)抗原又は免疫原由来の第1組成物のCD8+T細胞エピトープのうちの1つ以上を含有する、第2組成物を投与するステップを含み、
    第1組成物又は第2組成物のうちの1つがプライム用量（prime dose）として投与され、第1組成物又は第2組成物のうちの1つがブースト用量（boost dose）として投与されるが、ただし、第1組成物と第2組成物の両方が投与されるものとし、
    これによって、抗原特異的なCD8+T細胞応答が誘発される、方法。
  26. プライム用量及びブースト用量が少なくとも14日間あけて投与される、請求項25に記載の方法。
  27. 第2組成物がプライム用量であり、第1組成物がブースト用量である、請求項25に記載の方法。
  28. 第1組成物がプライム用量であり、第2組成物がブースト用量である、請求項25に記載の方法。
  29. 対象が哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、又は魚である、請求項25に記載の方法。
  30. 対象がヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、シチメンチョウ、アヒル又はニワトリである、請求項2に記載の方法。
  31. 抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を投与するステップをさらに含む、請求項25に記載の方法。
  32. 抗免疫抑制剤が、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL1、GAL3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、CD244、ADAM17、COX2、PGE-2、iNOS2、PDE5、c-kit、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ-8、CCL2、RON、ROS、又はS100A8/A9を標的とする、請求項31に記載の方法。
  33. 抗免疫抑制剤がPD1又はPDL1を標的とする、請求項31に記載の方法。
  34. 抗免疫抑制剤が抗PD1又は抗PDL1抗体である、請求項31に記載の方法。
  35. 免疫賦活剤が、Toll様受容体(TLR)3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、STING、cGAS、IFR3、IL-2受容体、IL12受容体又はIFN-アルファ受容体を標的とする、請求項31に記載の方法。
  36. 第3組成物を投与するステップが、第1組成物の投与後に実施される、請求項31に記載の方法。
  37. 抗原又は免疫原が病原体由来のものである、請求項25に記載の方法。
  38. 病原体がウイルス、真菌、寄生生物、又は細菌である、請求項37に記載の方法。
  39. ウイルスがEBV、HPV、HTLV-1、MCPvV、KSHV、HERV、HCV又はHBVである、請求項38に記載の方法。
  40. 抗原又は免疫原ががん抗原である、請求項25に記載の方法。
  41. 誘発させる免疫応答が、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、脳がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん（kidney cancer）、卵巣がん、骨髄腫がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、頭頸部がん、直腸結腸がん、腎がん（renal cancer）、食道がん、黒色腫皮膚がん及び/又は前立腺がんの患者に対する治療的又は予防的処置である、請求項25に記載の方法。
  42. 誘発させる免疫応答が、慢性感染症を有する又は慢性感染症を引き起こす病原体への曝露の危険性を有する対象に対する治療的又は予防的処置であり、病原体が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、又はヒトTリンパ向性ウイルスIII型（human T-lymphotropic virus type III）から選択される、請求項25に記載の方法。
  43. 第1及び/又は第2組成物の投与経路が、非経口、皮下、経口、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内、経鼻、気管内、腸内、舌下、直腸又は経膣から選択される請求項26に記載の方法。
  44. 非複製ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである、請求項25に記載の方法。
  45. 非複製ウイルスベクターがE1及び/又はE3欠損アデノウイルスベクターである、請求項44に記載の方法。
  46. フルオロカーボン連結ペプチドのフルオロカーボン部分が3〜30個の炭素原子のフルオロカーボン鎖である、請求項25に記載の方法。
  47. フルオロカーボン鎖の1つ以上のフッ素部分が、塩素、臭素、ヨウ素、水素又はメチル基で置換されている、請求項46に記載の方法。
  48. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造CmFn-CyHx-(Sp)-R(式中、m=3〜30、n≦2m+1、y=0〜15、x≦2y、(m+y)=3〜30、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)を有する、請求項25に記載の方法。
  49. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造
    Figure 2021520414
     (式中、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)
    によるものである、請求項25に記載の方法。
  50. 第2組成物のフルオロカーボン連結ペプチドが、少なくとも1つのMHCクラスII結合エピトープ及び少なくとも1つのMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項25に記載の方法。
  51. それを必要とする対象において免疫応答を誘発する方法であって、
    a)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する抗原若しくは免疫原、又はその断片をコードしている非複製ウイルスベクターを含む第1組成物を投与するステップ、又は、
    b)フルオロカーボン連結ペプチドを含有するミセルを含む第2組成物であって、フルオロカーボンに連結した各ペプチドが、
    i)15〜75のアミノ酸残基長を有し、
    ii)抗原又は免疫原由来のものであり、かつ、
    iii)1つ以上のCD8+T細胞エピトープを含有する、第2組成物を投与するステップ、及び
    c)抗免疫抑制剤又は免疫賦活剤から選択される免疫モジュレーターを含む第3組成物を別個に投与するステップを含み、
    これによって、抗原特異的なCD8+T細胞応答が誘発される、方法。
  52. 対象が、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、又は魚である、請求項51に記載の方法。
  53. 対象が、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、シチメンチョウ、アヒル又はニワトリである、請求項51に記載の方法。
  54. 抗免疫抑制剤が、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TCR、LAG3、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3、GAL1、GAL3、GAL9、ADORA、CD276、VTCN1、IDO1、KIR3DL1、HAVCR2、VISTA、CD244、ADAM17、COX2、PGE-2、iNOS2、PDE5、c-kit、ARG1、PI3K、CSF-1R、カスパーゼ-8、CCL2、RON、ROS、又はS100A8/A9を標的とする、請求項51に記載の方法。
  55. 抗免疫抑制剤がPD1又はPDL1を標的とする、請求項51に記載の方法。
  56. 抗免疫抑制剤が抗PD1又は抗PDL1抗体である、請求項51に記載の方法。
  57. 免疫賦活剤が、Toll様受容体(TLR)3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9、NOD1、NOD2、STING、cGAS、IFR3、IL-2受容体、IL12受容体又はIFN-アルファ受容体を標的とする、請求項51に記載の方法。
  58. 第3組成物を投与するステップが、第1又は第2組成物の投与後に実施される、請求項51に記載の方法。
  59. 抗原又は免疫原が病原体由来のものである、請求項51に記載の方法。
  60. 病原体がウイルス、真菌、寄生生物、又は細菌である、請求項59に記載の方法。
  61. ウイルスが、EBV、HPV、HTLV-1、MCPvV、KSHV、HERV、HCV、又はHBVである、請求項60に記載の方法。
  62. 抗原又は免疫原が、がん抗原である、請求項51に記載の方法。
  63. 誘発させる免疫応答が、非小細胞肺がん、乳がん、肝臓がん、脳がん、胃がん、膵臓がん、腎臓がん、卵巣がん、骨髄腫がん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、頭頸部がん、直腸結腸がん、腎がん、食道がん、黒色腫皮膚がん及び/又は前立腺がんの患者に対する治療的又は予防的処置である、請求項51に記載の方法。
  64. 誘発させる免疫応答が、慢性感染症を有する又は慢性感染症を引き起こす病原体への曝露の危険性を有する対象に対する治療的又は予防的処置であり、病原体が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、又はヒトTリンパ向性ウイルスIII型から選択される、請求項51に記載の方法。
  65. 第1又は第2組成物及び第3組成物の投与経路が、非経口、皮下、経口、表皮、皮内、筋肉内、動脈内、腹腔内、静脈内、経鼻、気管内、腸内、舌下、直腸又は経膣から独立して選択される、請求項51に記載の方法。
  66. 非複製ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、はしかウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、又は水胞性口内炎ウイルスベクターである、請求項51に記載の方法。
  67. 非複製ウイルスベクターが、E1及び/又はE3欠損アデノウイルスベクターである、請求項66に記載の方法。
  68. フルオロカーボン連結ペプチドのフルオロカーボン部分が、3〜30個の炭素原子のフルオロカーボン鎖である、請求項51に記載の方法。
  69. フルオロカーボン鎖の1つ以上のフッ素部分が、塩素、臭素、ヨウ素、水素若しくはメチル基で置換されている、請求項68に記載の方法。
  70. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造CmFn-CyHx-(Sp)-R(式中、m=3〜30、n≦2m+1、y=0〜15、x≦2y、(m+y)=3〜30、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)を有する、請求項51に記載の方法。
  71. フルオロカーボン連結ペプチドが、構造
    Figure 2021520414
     (式中、Spは任意選択の化学的スペーサー部分であり、Rはペプチドである)
    によるものである、請求項51に記載の方法。
  72. 第2組成物のフルオロカーボン連結ペプチドが、少なくとも1つのMHCクラスII結合エピトープ及び少なくとも1つのMHCクラスI結合エピトープを含む、請求項51に記載の方法。
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