ES2638577T3 - Vectores adenovirales que codifican un patógeno o antígeno tumoral - Google Patents

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Abstract

Un vector adenoviral que comprende un promotor y una secuencia de ácido nucleico que codifica un patógeno o antígeno tumoral bajo el control de dicho promotor, donde dicho promotor comprende un elemento regulador del promotor IE1 del CMV y el potenciador del promotor IE1 de CMV y un fragmento de la región 5' no traducida del gen IE1 del CMV que incluye el intrón A y excluye el exón B y el intrón B, donde el elemento regulador, el potenciador y el fragmento de la región no traducida del gen IE1 del CMV del promotor tienen una longitud total de 1,9 kb y donde dicho antígeno no es un antígeno del parásito del paludismo murino.

Description

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murino P. berghei
El inserto del antígeno palúdico pre-eritrocítico cadena de múltiples epítopos-proteína de adhesión relacionada con la trombospondina (ME-TRAP) de P. falciparum (31, 32).
5 Una proteína de fusión de las regiones del antígeno de la etapa sanguínea de P. Falciparum MSP-1 denominado PfM117 Una proteína de fusión de las regiones del antígeno de la etapa sanguínea de P. Falciparum MSP-1 denominado PfM128
Ejemplo 1: Producción de vacunas de vectores de adenovirus que contienen antígenos de paludismo murinoy un antígeno de tuberculosis.
1.1 Aumento de la expresión del antígeno por el promotor del CMV en vectores AdHu5 recombinantes.
15 Se compararon vectores AdHu5 que codifican MSP-142 de P. yoelii de paludismo murino o el antígeno 85A de M. tuberculosis, usando vectores que impulsan la expresión del transgén por la versión "pequeña" de 0,6 kpb del promotor IE del CMV (sin intrón A) o la versión "larga" de 1,9 kbp del promotor (con el elemento regulador, potenciador e intrón A). Las versiones pequeña y larga del promotor se denominan SP y LP respectivamente. El nivel de expresión de antígeno por los vectores AdHu5 se ensayó in vitro mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (Figura 2). El nivel de expresión de antígeno se normalizó con el transcrito AdHu5 E4orf1. En ambos casos, se midieron niveles de expresión del antígeno significativamente más altos después de la infección de células 293A con vectores AdHu5 que expresaban antígeno bajo el control del promotor largo. El nivel global de expresión del antígeno puede ser dependiente del antígeno, dado que los vectores que codifican 85A expresaron niveles significativamente más altos de antígeno en comparación con cualquiera de los vectores que codifican MSP-142.
25 Estos resultados se confirmaron para los vectores que codifican MSP-142 mediante Western Blot (Figura 3). El antígeno MSP-142 incluye el epítopo PK (secuencia de aminoácidos IPNPLLGLD) como una fusión C-terminal. El antígeno se detecta usando el anticuerpo monoclonal anti-PK (también conocido como anti-V5) de Serotec (Oxford, Reino Unido).
1.2 Aumento de la inmunogenicidad de células T por los promotores del CMV en vectores AdHu5 recombinantes.
Se inmunizaron grupos BALB/c por vía intradérmica (i.d.) con 1010 vp de cada adenovirus y las respuestas se midieron en el bazo con respecto a los epítopos de células T, CD8+ y CD4+ conocidas 14 días después mediante ELISPOT de interferón gamma ex vivo (Figura 4). Los epítopos MSP-142 son todos epítopos de H-2d restringidos de
35 clase I (Figura 4a). p11 es un epítopo H-2d de clase I restringido conocido en 85A, mientras que p15 es uno restringido de clase II (Figura 4b). Las respuestas solo se detectaron contra epítopos conocidos en MSP-142 cuando los ratones fueron inmunizados con Ad42LP, mientras que las respuestas a 85A fueron inducidas por ambos vectores, tendiendo aquellos contra p15 a ser más fuertes en el grupo Ad85ALP. Estos datos se correlacionan con el nivel de expresión de antígeno medida mediante RT-PCR en tiempo real (Figura 2).
1.3 Aumento de la inmunogenicidad de anticuerpo por los promotores del CMV en vectores AdHu5 recombinantes.
Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c mice I.d. con 1010 vp de Ad42LP o Ad42SP. Se analizaron las respuestas de anticuerpos IgG enteras contra el extremo C de MSP-142 (MSP-119) mediante ELISA dos semanas más tarde
45 (Figura 5). No hubo respuestas detectables de anticuerpos contra MSP-119 después de la inmunización con Ad42SP, mientras que Ad42LP sensibilizó una respuesta significativamente más alta, con un título final de aproximadamente 1000. Esta respuesta, inducida por Ad42LP, continúa aumentando con el tiempo, alcanzando una meseta a las 6-8 semanas (Figura 6). Esta respuesta de anticuerpos puede reforzarse a un nivel significativamente más alto mediante MVA que codifica el mismo antígeno. Las respuestas de anticuerpos son significativamente más altas después de este régimen heterólogo de sensibilización-refuerzo con AdM. Si los ratones sensibilizados con Ad42LP son estimulados 8 semanas en lugar de 2 semanas más tarde (Figura 7).
1.4 Protección de ratones contra la exposición a P. yoelii en fase sanguínea letal mediante inmunización con AdMMSP-142.
55 La protección proporcionada por el régimen de sensibilización-refuerzo se investigó mediante el examen de la protección proporcionada por la inmunización con AdM-MSP-142 contra la exposición a P. Yoelii en fase sanguínea letal en ratones. Se inmunizó a los grupos de ratones BALB/c i.d. con 5 x 1010 de vp Ad42LP y se realizaron refuerzos con MVA que expresaba el mismo antígeno dos u ocho semanas después. Todos los regímenes de inmunización utilizaron el vector Ad42LP, y MVA que expresaba el mismo antígeno. Los ratones fueron expuestos
i.v. a 104 pRBC de P. yoelii 14 días después de la inmunización final. Los regímenes homólogos de sensibilizaciónrefuerzo se incluyeron como comparación. El 76 % de los ratones inmunizados con el régimen de AdM42 utilizando un intervalo de ocho semanas de sensibilización-refuerzo estaban completamente protegidos frente a una exposición letal a 104 glóbulos rojos parasitizados (pRBC) como se muestra en la Tabla 1.
65 Tabla 1
Régimen deinmunización
Nº. de ratones protegidos/expuestos % Protegidos Mediana (intervalo) del pico % deParasitemia de ratones protegidos
AdM42 (2 semanas)
0/6 0 % N/A
AdM42 (8 semanas)
4/5 + 4/6 + 5/6 76 % 1,2 %/0,004 %/27,7 %
MM42 (8 semanas)
0/3 0 % N/A
AdAd42 (8 semanas)
0/3 0 % N/A
No expuestos
0/4 + 0/4 + 0/4 0 % N/A
La tabla resume los resultados de los experimentos individuales y el nivel general de eficacia protectora. Se incluyen la mediana y el intervalo de parasitemia máxima de los ratones que sobrevivieron en cada grupo. El crecimiento exponencial del parásito da como resultado una parasitemia ≥ 80 % en fase sanguínea en 5-7 días después de la
5 infección en ratones no expuestos o desprotegidos, momento donde se sacrifican los ratones. Los ratones protegidos pueden controlar y, en última instancia, eliminar la infección del paludismo en fase sanguínea.
Estos resultados podrían replicarse en una segunda cepa de ratón y, en este caso, el 100 % de los ratones C57BL/6 sobrevivieron a la exposición, en comparación con ninguno de los controles no inmunizados no expuestos como se 10 muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
Régimen deinmunización
Nº. de ratones protegidos/expuestos % Protegidos Mediana (intervalo) del pico % deParasitemia de ratones protegidos
AdM42 (8 semanas)
6/6 100 % 14,7 %/3,7 %/56,4 %
No expuestos
0/6 0 % N/A
El 100 % de ratones BALB/c inmunizados con este régimen también fueron protegidos contra una exposición a 50 15 esporozoíntos de P. yoelii-el modo natural de la infección por paludismo (Figura 8).
1.5 Protección estéril de ratones a la exposición a esporozoítos de P. berghei mediante inmunización con AdHu5-PbCSP
20 El vector de AdHu5 recombinante para la proteína del circumsporozoíto (CSP) de P. berghei se generó con el antígeno bajo el control del promotor largo (33). Se inmunizó a los ratones BALB/c como se indica en la Tabla 3. Algunos grupos de ratones recibieron una sola inmunización i.d. de AdHu5 que expresan PbCSP y se expusieron dos u ocho semanas más tarde. Los grupos restantes se inmunizaron con regímenes de sensibilización-refuerzo heterólogos utilizando AdHu5 y MVA que expresaban PbCSP. El intervalo de tiempo en semanas entre las dos
25 inmunizaciones se indica entre paréntesis. Todos los regímenes de inmunización utilizaron el vector AdHu5 que expresaba PbCSP bajo el control del promotor largo. Los ratones fueron expuestos i.v. a 103 esporozoítos de P. berghei. La parasitemia en la fase sanguínea se monitorizó diariamente mediante frotis de sangre fina teñido con Giemsa a partir del día 5 en ratones expuestos. Los ratones están protegidos debido a la ausencia continuada de parasitemia patológica en sangre hasta el día 21. El 33 % de los ratones se protegió contra la exposición después de
30 una única inmunización con Ad-PbCSP y la infección dos semanas más tarde como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3
Régimen de inmunización
Intervalo de tiempo entre lainmunización y exposición Nº. de ratones protegidos/expuestos % de Protección
Ad-PbCSP
2 semanas 4/12 33 %
Ad-PbCSP
8 semanas 1/6 18 %
No expuestos
2 semanas/8 semanas. 0/12 0 %
Ad-MVA PbCSP (intervalo de sensibilización-refuerzo 2 semanas)
2 semanas 66 %
Ad-MVA PbCSP (intervalo de sensibilización-refuerzo de 8 semanas)
2 semanas 100 %
No expuestos
2 semanas 0 %
La inmunización con Ad-PbCSP induce una potente respuesta de las células T CD8+ contra el epítopo H-2d restringido de clase I, Pb9 (34). Si estos ratones son reforzados con MVA que codifica PbCSP ocho semanas más tarde, el 100 % de los ratones son refractarios a la exposición a esporozoítos de P. berghei Tabla 3 y Ref. (33).
5 Ejemplo 2 Producción de paludismo humano pre-eritrocítico (P. Falciparum) Vacunas antigénicas con vectores de adenovirus humanos y simios
La vacunación con vacunas pre-eritrocíticas ha demostrado ser particularmente prometedora para abordar el enorme problema de salud global de la paludismo (1,2) con cierta eficacia en ensayos clínicos de inmunidad a esta etapa del ciclo de vida del paludismo dirigida hacia el esporozoíto y al posterior esquizonte intrahepáticos (37). Anteriormente se ha demostrado que la respuesta inmunitaria celular es importante en la inmunidad pre-eritrocítica con células T CD8+ y la producción de IFN-gamma desempeñan un papel central en la protección del paludismo hepática (38). La proteína de adhesión relacionada con la trombospondina (TRAP) es un antígeno expresado en los esporozoítos que se ha demostrado anteriormente que induce una respuesta protectora de células T CD8+ (39). TRAP se probado
15 extensamente en ensayos clínicos de vacunas como una proteína de fusión con una cadena multiepítopo que contiene epítopos adicionales de células B, células T CD8+ y CD4+, conocida como ME.TRAP (40, 41). En seres humanos, se ha demostrado que los regímenes de sensibilización-refuerzo de FP9-MVA.ME.TRAP inducen respuestas de células T tanto CD8+ como CD4+ que conferían protección estéril en algunos voluntarios (42, 43). Los vectores adenovirales del serotipo humano 5 se han utilizado previamente en un modelo de ratón de P. yoelii de paludismo y han demostrado una inmunogenicidad excelente y una protección significativa después de solo una dosis única (44]. Sin embargo, una limitación importante que impide el uso de este serotipo en los seres humanos es la presencia omnipresente de AdH5, con infecciones infantiles frecuentes que dan como resultado seroconversión. Se ha informado que casi todos los adultos tienen anticuerpos contra AdH5 (45), y del 45 % al 80 % de los individuos poseen anticuerpos neutralizantes (NAB) contra el virus (46). Para eludir el problema de la inmunidad preexistente a
25 AdH5, ha aumentado el interés en el uso de serotipos adenovirales de origen simio que no circulan a niveles apreciables en poblaciones humanas, con una serie de estudios que demuestran la capacidad de estos vectores para provocar respuestas de células T CD8+ tanto en ratones como en modelos de primates no humanos de SARS (47] y el VIH (48, 49). En este trabajo actual, los inventores demuestran por primera vez en un modelo de paludismo de ratón que con el uso de un intrón A largo que contiene el promotor del CMV, como se ha definido anteriormente, cuatro vectores adenovirales de simio, AdC6, AdC7, AdC9 (también conocido como C68 (50)), puede inducir respuestas de células T CD8+ excelentes con frecuencia superan a AdH5. Además, se produjo inducción de altos niveles de protección estéril a una exposición con P. Berghei después de una sola vacunación con los vectores. Finalmente, en condiciones de inmunidad preexistente a los vectores adenovirales de simio de AdH5, se mantuvo un alto grado de
35 protección que se anuló con el uso del serotipo humano 5.
2.1 Materiales y métodos
Ratones e inmunizaciones
Se usaron ratones BALB/c hembra de 4 a 6 semanas de edad y se inmunizaron por vía intradérmica, que previamente se ha demostrado que provoca una mejor inmunogenicidad cuando se compara con otras vías, por ejemplo subcutánea, intramuscular (58). MVA.ME.TRAP (MVA) o FP9.ME.TRAP se administraron a una dosis de 1x106 o 1x107 ufp y adenovirus a una dosis de 1x109 o 1x1010partículas víricas (v.p.).
45 Vectores virales
Todos los vectores expresan el transgén ME.TRAP que se ha descrito previamente (40, 71). El inserto ME.TRAP es un transgén híbrido de 2398 pb que codifica una proteína de 789 aa. La cadena de ME contiene el epítopo de Pb9 de BALB/c H-2Kd entre un número de otros epítopos de células B y T (72). Los vectores adenovirales de simio (SAdV) y el vector AdHu5 se construyeron con una región del CMV langa portadora del intrón promovido como se describe (73). La construcción del MVA (71) y del FP9 (43) se ha descrito anteriormente.
IFNγ ELISPOT ex vivo
55 Se cultivaron esplenocitos tratados con ACK o PBMC se cultivaron durante 18-20 horas en placas de membrana IPVH (Millipore) con el inmunodominante H-2Kd-epítopo restringido de P9b (SYIPSAEKI) a una concentración final de 1 µg/ml. ELISPOT se realizó como se describió anteriormente (74). Para analizar la amplitud de la respuesta inmune, los esplenocitos se estimularon con grupos de péptidos de 20 unidades que se superponían por 10aa que abarcaban toda la longitud de TRAP (43,71) así como un grupo de péptidos que cubrían la cadena ME, todos a una concentración final de 5µg/ml.
Tinción intracelular de citocinas
65 Los esplenocitos tratados con ACK se incubaron durante 5 horas en presencia de 1 µg/ml de Pb9 y 2 µ/ml de Golgi-Plug (BD). La tinción intracelular de citocinas (ICS) se realizó con BD cytofix/cytoperm más el kit de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Los esplenocitos se tiñeron con una combinación adecuada de anticuerpos conjugados con fluorocromo, específicos de CD8 (clon 53-6.7, eBioscience), IFNγ (clon XMG1.2, eBioscience), CD27 (clon LG.7F9, eBioscience), CD43 (clon 1B11, BD/Pharmingen), CD127 (clon A7R34, eBioscience), IL-2 (cloneJES6-5H4, eBioscience), controles del isotipo de ratón Gg2a (eBR2a, eBioscience), Receptor de CD16/CD32 Fcgamma III/II 5 (2,4G2, BD/Pharmingen), anti-Granzima B (clon GB12, Caltag), Control de isotipo IgG1 Caltag). Cuando se usó CD62L (clon MEL-14, eBioscience), las células estimuladas se incubaron con el péptido TAPI-2 (Peptides International, USA) a una concentración final de 250 µM para prevenir que CD62L oculte la superficie celular. Para el mapeo de péptidos y la potencia en ratones C57BL/6, los esplenocitos se estimularon con grupos de péptidos que contenían 20 unidades superpuestas por 10, abarcando toda la secuencia de ME-TRAP. La concentración final fue
10 de 20 µg/ml. Las respuestas de CD4 y CD8 se rastrearon mediante citometría de flujo y se sintetizaron péptidos individuales después de un análisis en la base de datos SYFPEITHI para predecir los epítopos inmunodominantes. Tras la titulación, se usaron péptidos individuales a una concentración final de 5 µg/ml.
Los análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando un FACSCanto (BD Biosciences) y los datos se analizaron 15 con FACSDiva (BD) o Flow Jo (Tree Star).
Evaluación de la respuesta de células T CD8+ específica de antígeno mediante citometría de flujo
La frecuencia de células T IFNγ+ CD8+ se calculó restando los valores del control no estimulado, que nunca superó
20 el 0,1 % en ninguno de los experimentos. El número total de células específicas de antígeno se calculó como se ha descrito previamente (53). Para los marcadores fenotípicos investigados, cada marcador se comparó con un control de isotipo.
ELISA
25 Los anticuerpos IgG contra la región TRAP se analizaron mediante ELISA como se ha descrito previamente (43). Para este experimento, se obtuvo suero de grupos de al menos 3 ratones BALB/c después de 2 semanas de inmunización con vectores individuales. Los resultados se informaron como un factor de dilución necesario para una muestra con el fin de alcanzar la D.O. de un suero virgen.
30 Exposición a parásito
Se aislaron esporozoítos (spz) de Plasmodium berghei (clon 234 de la cepa ANKA) de las glándulas salivales de mosquitos hembra Anopheles stephensi Los parásitos se resuspendieron en medio RPMI-1640, recibiendo con cada
35 ratón un total de 1.000 spz mediante vía i.v. Se tomaron muestras de sangre diariamente desde el día 5 hasta el 20; los frotis se tiñeron con Giemsa y se examinaron para detectar la presencia de esquizontes dentro de los glóbulos rojos. La supervivencia se definió como la ausencia completa de parásitos en la sangre.
2.2 Resultados
40 Amplitud de la respuesta inmunitaria.
Se analizó la amplitud de la respuesta inmunitaria a ME.TRAP en ratones BALB/c (Figura 9a) y C57BL/6 (Figura 10a) mediante ELISPOT IFNγ. En BALB/c, la respuesta predominante se dirigió hacia el epítopo de Pb9 restringido a
45 H-2Kd-, mientras que en C57BL/6, la respuesta estaba presente en tres subpoblaciones; la cadena ME, TRAP 1 y TRAP 2. Un análisis adicional con tinción intracelular de citocinas y el uso de la base de datos SYFPEITHI permitió la caracterización de un epítopo DE CD4 en TRAP 1 (IHLYVNVFSNNAKEI), un epítopo DE CD8 en TRAP 2 (NVAFNRFLV) y un epítopo DE CD8 en la cadena ME (DASKNKEKAL).
50 cinética de la respuesta de células T CD8+ específica de Pb9.
La respuesta de células T CD8+ a Pb9 de los seis vectores se investigó en términos de expansión, contracción y generación de células de memoria. El adenovirus de simio (SAds) AdC7 (C7) AdC9 (C9) provocó las respuestas inmunes más fuertes, seguido de AdH5 (H5) (Figuras 9b, 9c, 9d). De los SAds, AdC6 (C6) fue el menos potente en
55 términos de producción de IFN-γ, pero todos los Ads indujeron una cinética de expansión de células T CD8+ similar, con una respuesta máxima aproximadamente 20 días después de la inmunización. Por otra parte, los poxvirus MVA y FP9 (que utilizan un promotor de poxvirus no CMV) indujeron una respuesta inmunitaria que alcanzó su máximo una semana después de la vacunación, con una disminución en la frecuencia de las células CD8+IFN-γ+ observada ya a las 2 semanas de la vacunación. La frecuencia de las células T CD8+IFN-γ+ el día 60 después de la vacunación
60 fue más altas en los ratones que fueron vacunados con un adenovirus, esto fue más evidente en los ratones inmunizados con C9 o H5. Por tanto, todos los vectores adenovirales comparten características similares en términos de resistencia y cinética de la respuesta de células T CD8+, con profundas diferencias en la cinética de expansión y contracción observada entre los vectores adenovirales y poxvirales.
Respuesta de células T CD8+ efectoras
Debido al corto intervalo entre la infección y la progresión a la enfermedad, las células T CD8+ efectoras pueden desempeñar un papel importante en la protección contra el paludismo. Por lo tanto, se investigó la adquisición de 5 funciones efectoras determinadas por la expresión de un número de marcadores fenotípicos, CD43 y Granzyme B. Se ha demostrado previamente que la expresión de CD43 está regulada por aumento durante la fase efectora de la respuesta de CD8 (51) mientras que la molécula efectora citolítica Granzyme B (GrB), está altamente expresada en células T CD8+ efectoras, con niveles más bajos observados en TEM and TCM (52), y es uno de los principales mecanismos que utilizan los CTL para matar las células infectadas. En general, los vectores adenovirales indujeron 10 un porcentaje significativamente mayor de CD8+IFN-gamma+CD43hi durante todo el curso de la respuesta inmunitaria en comparación con los vectores poxvirales. De forma interesante, los vectores poxvirales indujeron un bajo porcentaje de CD43hi ya una semana después de la vacunación, lo que sugiere una transición más rápida hacia la fase de memoria, especialmente con MVA. El día 60 después de la sensibilización, los ratones inmunizados con los vectores adenovirales todavía conservaban un porcentaje significativamente mayor de CD43hicuando se
15 compara con el homólogo poxviral (Figura 11a). Además, los niveles de GrB fueron significativamente menores en el grupo de MVA al día 20 (p <0,001), y al día 60 ambos vectores poxvirales fueron significativamente más bajos que C6 (p <0,05) (Fig. 11b, 11c). Estos resultados demuestran que en respuesta a los cuatro adenovirus hubo un desarrollo completo de una respuesta efectora con preservación de moléculas citolíticas durante largos períodos de tiempo, indicativo de la presencia de células TEM (52).
20 Marcadores funcionales y de memora fenotípicos de las células T CD8+ específicas de Pb9.
Uno de los objetivos principales de cualquier régimen de vacunación es la generación de células T CD8+ de memoria que son capaces de persistir in vivo y expandiéndose rápidamente al encontrarse con patógenos que proporcionan 25 protección. Hasta la fecha se ha sugerido que un número de moléculas diferentes corresponden a diferentes subtipos de células de memoria (53, 54). En este estudio actual, los inventores eligieron investigar varias de estas moléculas para determinar si los vectores individuales indujeron diferentes poblaciones de células de memoria. Durante la fase temprana de la respuesta, las células CD8+ IFN-γ+ generadas en respuesta a FP9 o MVA mostró un CD62Lhi, CD127hi y produjo IL-2, lo que confirma la rápida transición a un fenotipo TCM A la inversa, los vectores 30 adenovirales no indujeron un fenotipo de células T CD8+ de memoria centrales, incluso al día 60, con la mayoría de células CD8+IFN-γ+ que exhiben predominantemente un fenotipo de memoria efectora (CD62Llo, CD127hi y un porcentaje bajo de células productoras de IL-2) (Figura. 12a-d). De forma interesante, CD27 se mantuvo bajas en ratones vacunados con vectores adenovirales, mientras que el porcentaje de células CD27+ aumentó con el tiempo en respuesta a los vectores poxvirales. Dado que las células CD8+ CD27-se mantienen en respuesta a la
35 estimulación antigénica persistente (55), esto puede sugerir que se estaba produciendo una estimulación prolongada del antígeno en respuesta a los adenovirus. En resumen, estos resultados demuestran que la vacunación con vectores adenovirales induce predominantemente una respuesta TEM, como lo demuestra un fenotipo CD62Llo, CD127+, IL-2low además del porcentaje alto relativo de células CD43hi, así como niveles más altos de moléculas citolíticas 60 días después de la sensibilización.
40 Supervivencia tras una exposición a P. berghei.
Para evaluar el nivel de protección proporcionado por estos diferentes vectores, se expuso a los ratones a P. berghei como se muestra en la Tabla 1. Se inmunizó a los ratones BALB/c con vectores adenoviral es(1x1010 vp) y 45 poxvirales (1x107 ufp) y después se expusieron 14 días (n=12) y 60 días después (n=6) mediante administración i.v. de 1000 esporozoítos de Plasmodium berghei. La inmunidad preexistente a AdH5 se analizó después de inyectar a grupos de 6 ratones BALB/c 5x105 v.p. de AdH5 que codifica un transgén no relacionado (Ag85.A). 30 días después, se inmunizó a los mismos ratones con 1x1010 v.p. por ratón de AdH5, C6, C7 y C9 que codifican ME.TRAP. Se expuso a los ratones 14 días después de la última inmunización. Los números representan el porcentaje de animales
50 que sobrevivieron a la exposición. Las diferencias estadísticas se indican como: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p<0,001, y muestran comparación de regímenes individuales con el control virgen.
Tabla 1 Vector Día 14 (n=12) % Día 60 (n=6) % Inmunidad preexistente a H5 (día 14) (n=6) %
H583 *** 0 0
C667 ** 0 17 C7 83 *** 50 * 33 ** C9 92 *** 17 50 * MVA0 0 n.t. FP90 0 n.t. No
expuesto 0 0 0 s
En condiciones sin inmunidad previa a AdH5 (día 14), C9 proporcionó la mejor protección (92 ), seguido de C7, H5 (83 %) y, por último C6 (67 %), todas ellas significativamente más altas que el grupo control no expuesto (0 %, p <0,001). No se confirió protección mediante MVA o FP9 en el mismo momento. El día 60 después de la sensibilización, se logró una protección significativa con C7 (50 %) y C9 (17 %), pero no se observó protección
5 cuando se inmunizó a los ratones con H5 o C6. La capacidad de estos vectores para conferir protección en presencia de inmunidad preexistente a AdH5, que imitaría una situación humana donde se espera que al menos el 45 % de la población tenga NAB a AdH5, también se evaluó en este estudio. Se inmunizó a los ratones inicialmente con AdH5 que contenía un inserto no relacionado (antígeno 85A de Mycobacterium tuberculosis), que se siguió 4 semanas más tarde por los vectores Ads que codifican ME.TRAP. En presencia de inmunidad de AdH5 preexistente, la inmunización con H5 no proporcionó protección, mientras que C9 dio la mejor protección (50 %), seguida de C7 (33 %) y C6 (17 %). Ambos, C9 y C7 fueron significativamente más altos que lH5 y los controles no expuestos (p <0,05 y p <0,01, respectivamente).
RESPUESTAS DE CÉLULAS T A Pf TRAP
15 Para determinar que las respuestas inmunitarias son provocadas por el TRAP de P. Falciparum dentro del transgén ME-TRAP, se analizó la inmunogenicidad mediante tinción intracelular de citocinas en esplenocitos de ratones C57BL/6 tras la vacunación con todos los vectores. La técnica ELISpot mostró una respuesta inmunitaria provocada por tres subconjuntos (Figura 10a). El análisis por citometría de flujo reveló la presencia de un epítopo de CD4 y un epítopo de CD8 en la secuencia TRAP y un epítopo de CD8 en la cadena ME. Un análisis adicional utilizando la base de datos SYFPEITHI permitió la identificación de las secuencias peptídicas óptimas con fines de síntesis (56). Se observó una tendencia similar en términos de potencia de las respuestas de células T CD4+-y CD8+-con respecto a las respuestas de Pb9. C9 provocó las respuestas de células T TRAP más potentes, seguido de C7, H5 y, finalmente, C6. Ambos vectores poxvirales indujeron una respuesta inmunitaria más modesta medida a la semana
25 3 después de la vacunación (Fig. 10b).
ANTICUERPOS FRENTE A TRAP
La inducción de una respuesta de células B específica de TRAP por los vectores se evaluó en sueros de ratones vacunados. Todos los vectores adenovirales fueron capaces de inducir altos niveles de anticuerpos IgG contra la región TRAP, mientras que los vectores poxvirales provocaron bajos niveles de anticuerpos. Las respuestas más fuertes se alcanzaron mediante AdH5 (D.O.
imagen10=3930±14), seguido de dC7 ( imagen11=3358±256), AdC9 ( imagen12=2862±979), AdC6 ( imagen13=739±452); mientras que MVA ( imagen14=178±98) yFP9 ( =126±95) indujeron niveles mínimos de anticuerpos (Fig 13). Valores para AdH5, AdC7 y AdC9 fueron significativamente mayores que el resto del grupo.
imagen15
35
2.3 Discusión
Cada vez hay más pruebas de que las respuestas de las células T pueden ser un requisito fundamental para la protección contra enfermedades como el paludismo, SIDA, tuberculosis y cáncer. Las células T CD8+ Se ha demostrado que las células T desempeñan un papel central en la protección del estadio hepático de la infección por paludismo (57). Se ha demostrado que una serie de vacunas de subunidades, en forma de ADN desnudo y vectores virales, inducen fuertes respuestas de células T CD8+ en ratones (44), proporcionando protección contra el paludismo.
45 Los vectores adenovirales del serotipo humano 5 (AdH5) se han analizado en ratones como candidatos a vacunas para diversas enfermedades infecciosas (44, 58, 59). Estos vectores han mostrado una excelente inmunogenicidad de las células T CD8+en un régimen de sensibilización-refuerzo en combinación con vectores poxvirales y han conferido una protección significativa. Sin embargo, en el único estudio previo de los vectores adenovirales en el modelo de P. berghei, la protección mediante inmunización con AdH5 homólogo fue mínima (58). Debido a la presencia omnipresente de AdH5, un alto porcentaje de seres humanos desarrollan anticuerpos que hacen que la vacuna sea ineficaz. Para evitar este problema, los vectores adenovirales se han diseñado a partir de serotipos de chimpancé que no circulan en seres humanos. En estudios previos se ha demostrado la capacidad del adenovirus del chimpancé para provocar potentes respuestas inmunitarias mediadas por células T CD8+ y células B en modelos de rabia (50), SARS (47) y VIH 49), como regímenes de sensibilización o sensibilización-refuerzo heterogéneos en
55 ratones y primates.
El uso de tres vectores adenovirales de chimpancé, AdC6, AdC7 y AdC9 como una vacuna de paludismo preeritrocítica ha sido posible utilizando un intrón A que lleva un promotor largo. Los inventores han comparado estos vectores con AdH5 que también expresan un promotor largo y dos vectores poxvirales que se han usado ampliamente en ensayos clínicos en seres humanos MVA y FP9.
Los vectores adenovirales provocaron las respuestas de células T CD8+ más potentes. que alcanzaron su máximo en la semana 3, aunque mantuvieron una alta frecuencia de células específicas de Pb9 incluso 60 días después de la sensibilización. Por el contrario, los vectores poxvirales alcanzaron su máximo en la primera semana y luego se 65 contrajeron rápidamente. Tras el análisis de un número de marcadores fenotípicos, tales como CD43 y GrB, se demostró que Ads inducían una potente población efectora de células que era significativamente menor cuando los
ratones se inmunizaban con cualquiera de los vectores poxvirales. Además, se demostró que MVA induce un nivel más bajo de GrB, lo que sugiere un nivel globalmente reducido de la actividad citolítica. Por tanto, los vectores adenovirales fueron capaces de inducir una respuesta sostenida de células T CD8+ efectoras que se mantuvo en altos niveles durante al menos 60 días después de la sensibilización. Los marcadores fenotípicos adicionales
5 mostraron que los vectores poxvirales inducían la generación de, predominantemente, células T CD62L+, CD127+ CD8+, mientras que el fenotipo predominante de las células T CD8+ en respuesta a los vectores Ad fue CD62Ldull/-, CD127 durante un periodo de tiempo prolongado. Basándose en la expresión de estos marcadores, se pueden identificar tres subgrupos diferentes de células T CD8+ específicas de Ag: células T efectoras TE (CD62L-CD127-); células T de memoria efectoras TEM (CD62L CD127+) y células T de memoria centrales TCM (CD62L+CD127+) (60).
Los anticuerpos frente a la región TRAP también se evaluaron después de la vacunación de ratones BALB/c con cada vector. La potencia en términos de la respuesta de células B se correlacionó bien con la magnitud de las respuestas de células T CD8+. La protección contra P. Berghei en este sistema se basa en las respuestas de células T CD8+ dirigidas hacia un epítopo inmunodominante. Pb9. Los anticuerpos frente a TRAP no desempeñarían un
15 papel en la protección debido al hecho de que la secuencia de TRAP deriva de P. falciparum. Sin embargo, la presencia de anticuerpos podría añadir un beneficio adicional para mejorar la protección en las infecciones humanas con P. falciparum.
Los inventores muestran que los vectores adenovirales de simio utilizando un promotor largo provocaron potentes respuestas de células T CD8+ que son importantes en la protección en un modelo de paludismo pre-eritrocítico de ratón. En contraste con los serotipos de adenovirus humanos raros, tales como AdHu35 (70), la inmunogenicidad y la eficacia de estos vectores de simio es tan grande o mayor que AdH5. La comparación de los vectores adenovirales con dos vectores poxvirales, FP9 y MVA, demostró que los Ads eran capaces de sostener un alto número de células T CD8+ durante un largo período de tiempo que posteriormente resultó en la generación de un
25 alto número de células TEM. A la inversa, la inmunización con cualquiera de los vectores poxvirales indujo una alta proporción de células TCM muy temprano después de la inmunización. Además, todos los vectores adenovirales de simio indujeron niveles sobresalientes de protección durante la fase efectora de la respuesta en ausencia y presencia de inmunidad preexistente a AdH5, manteniéndose la protección durante un largo período de tiempo con un número de vectores. Estos datos demuestran por primera vez que una dosis única de una vacuna de subunidad es capaz de producir protección frente a P. berghei y destaca el potencial de los vectores adenovirales de simio para una futura aplicación como vacuna contra el paludismo en seres humanos.
Ejemplo 3 Vacunas de fase sanguínea contra paludismo por P. Falciparum
35 Basándose en los hallazgos del Ejemplo 1 que demuestran la sorprendente capacidad de un régimen de inmunización de sensibilización-refuerzo heterólogo con Ad-MVA para inducir una fuerte inmunidad protectora contra el paludismo en la fase sanguínea en un modelo de paludismo por P. yoelii murino, los inventores procedieron a generar vectores de adenovirus y MVA que codifican secuencias del gen MSP-1 del parásito del paludismo humano
P. falciparum. Este gen es dimórfico con dos tipos de secuencia de prevalencia. Tiene una estructura de bloques bien estudiada que permite la identificación de bloques conservados y variables.
El inserto PfM117 (véase la SEQ ID NO. 1) se ha diseñado como un inserto útil para la inmunización. Comprende los bloques de secuencias conservados 1, 3, 5 y 12 en el extremo N de una proteína de fusión, seguido por ambas copias del fragmento 33kd importante y en el extremo C de la proteína el fragmento 19Kd relativamente conservado. 45 El fragmento de 33 Kd es un componente inmunogénico bien estudiado del antígeno MSP1 que se sabe que contiene epítopos de células T. Sin embargo, es dimórfico con la divergencia sustancial de las secuencias entre los dos tipos principales, a menudo indicado por las etiquetas Wellcome y MAD20 en referencia a las cepas del parásito de las que derivaron las secuencias tempranas (Miller L.H. et al. Mol Biochem Parasitol. 1993, 59(1):1-14). En PfM117, la secuencia de la cepa Wellcome se encuentra en N-terminal a la secuencia de la cepa MAD20, e inmediatamente C-terminal a estos está la secuencia de 19Kd. Este último fragmento está altamente pero no completamente conservado entre cepas de parásitos de P. falciparum y se sabe que es el blanco de anticuerpos protectores. Sin embargo, algunos de estos anticuerpos protectores pueden ser inhibidos en su acción protectora por los llamados anticuerpos de bloqueo (Uthaipaibul et al. J Mol Biol. 2001; 307 (5): 1381-94]). Uthaipaibul et al. (2001) describen los cambios de aminoácidos que pueden realizarse en la secuencia canónica del fragmento de 19Kd que
55 permiten que los anticuerpos inhibidores actúen preferentemente sobre los anticuerpos bloqueantes, aumentando de este modo la probabilidad de que los anticuerpos inducidos a este fragmento sean protectores. Por lo tanto, dentro de este fragmento de 19 Kd se han alterado tres aminoácidos para evitar bloquear la unión del anticuerpo (Uthaipaibul et al. 3(2001)).
El inserto PfM128 (véase la SEQ ID NO. 3), es idéntico a la secuencia de PfM117 con una copia adicional de un fragmento de 19Kd insertado entre los dos fragmentos de 33Kd. Este fragmento adicional de 19Kd permite que una secuencia alélica alternativa de ese fragmento sea expresada por esta construcción potencialmente ampliando el intervalo de anticuerpos protectores o células T que podrían ser inducidos por PfM128 en comparación con PfM117.
65 Los inventores también construyeron una inserción adicional "PfM115" que es muy similar a la secuencia PfM117 en que comprende bloques secuenciales conservados 1, 3, 5 y 12,en el extremo N de la proteína de fusión PfMSP1,
seguidos por ambas copias del fragmento 33kd importante y en el extremo C de la proteína el fragmento de 19Kd relativamente conservado. Sin embargo, hay algunas diferencias de secuencias menores al final de los fragmentos de 33Kd en comparación con la secuencia corregida de PfM117. La secuencia de PfM115 se usó para generar vectores recombinantes de los serotipos C6, C7, C9 y AdHu5 (notación de las cepas como en el ejemplo 2)
5 utilizando de nuevo el promotor largo que contiene el intrón A. Se observó una buena estabilidad genética del vector. La potencia medida por inducción de anticuerpos (Figura 14) fue excelente. Además, se indujeron respuestas de células T CD4 y CD8 a grupos de péptidos que comprendían toda la secuencia de inserto de PfM115. El refuerzo con un vector MVA que codifica el mismo inserto condujo a respuestas mejoradas de anticuerpos y células T.
Un ensayo in vitro ampliamente utilizado para predecir la eficacia probable de las vacunas en fase contra P. falciparum es el ensayo de actividad inhibidora del crecimiento (GIA) (Bergmann-Leitner y col. Am J Trop Med Hyg. 2006, 75:437-42; Malkin et al. Infect Immun. 2005, 73:3677-85.) Este ensayo in vitro cuantifica el % de inhibición de crecimiento en % de parásitos del paludismo de P. falciparum en fase sanguínea cuando se cultivan en presencia de suero de ensayo y control. Se usa una reacción enzimática del parásito para cuantificar el crecimiento del parásito
15 después del período de tiempo de 40 horas del ensayo. Se espera que los animales inmunizados con las vacunas candidatas contra el paludismo en fase sanguínea desarrollen respuestas protectoras de anticuerpos. Por lo tanto, el suero de estos animales puede cribarse usando este ensayo para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento del parásito. Se han realizado esfuerzos considerables para estandarizar este ensayo, particularmente por el laboratorio NIH de C. Long. Los ratones fueron inmunizados con el inserto AdHu5-PfM115 y reforzados con la construcción de MVA correspondiente. Los sueros tomados en una hemorragia terminal mostraron un GIA de 46-52 %, medido por el laboratorio C. un nivel que representa una inhibición sustancial del crecimiento de parásitos en el estadio sanguíneo (Bergmann-Leitner y col. Am J Trop Med Hyg. 2006, 75, 437-42). Este resultado sugiere que un régimen de inmunización correspondiente usado en seres humanos mostrará eficacia protectora.
25 Para intentar aumentar aún más la inmunogenicidad y la probable eficacia protectora de las vacunas vectorizadas adenovirales, las vacunas vectorizadas AdHu5-PfM115 se coadministraron como una mezcla con la secuencia CpG 1826 (Brunner et al. J Immunol. 2000, 165, 6278-86). Los CpG se han estudiado bien como adyuvantes para vacunas basadas en proteínas pero no para vacunas vectorizadas (Daubenberger CA, Current Opinion in Molecular Therapy 2007; 9:45-52). Un estudio previo de una secuencia de CpG coadministrada con una vacuna de adenovirus que codifica un antígeno de tumor PSA condujo a una menor inmunogenicidad de células T que cuando se administró sin el CpG (Lubaroff et al. Vaccine 2006, 24: 6155-62). Sin embargo, la coadministración del oligonucleótido CpG 1826 con la vacuna AdHu5-PfM115 condujo a un aumento de las respuestas de las células T CD4 y CD8 según se midió mediante citometría de flujo (Figura 15). Esto sugiere que la coadministración de oligonucleótidos de CpG con ciertos vectores víricos, incluyendo vectores adenovirales promotores largos
35 heterólogos, puede conducir a una inmunogenicidad mejorada de células T para una variedad de inserciones antigénicas.
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