CN109803676A

CN109803676A - 初免靶向

Info

Publication number: CN109803676A
Application number: CN201780035877.6A
Authority: CN
Inventors: A·V·S·希尔; A·戈拉; A·沃尔特斯; A·斯宾塞
Original assignee: Oxford Innovation Co Ltd, University of
Current assignee: Oxford Innovation Co Ltd, University of; Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2019-05-24
Also published as: EP3442570A1; US20190175714A1; WO2017178809A1; US11065320B2

Abstract

本发明涉及包含至少第一组合物和第二组合物的试剂盒，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+T细胞表位，其用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)，皮内(i.d.)或气雾剂途径施用所述第一组合物，并通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径施用所述第二组合物，诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。本发明还涉及用途、方法和治疗。

Description

初免靶向

发明领域

本发明属于靶向免疫应答领域，特别是靶向肝脏的免疫应答。

发明背景

抗原特异性T细胞的诱导被认为对于保护免受许多细胞内病原体是重要的，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、结核分枝杆菌(Mtb)、疟原虫物种、利什曼原虫和其他病毒病原体。除了传染病之外，细胞适应性免疫对于清除表达肿瘤相关抗原的肿瘤也很重要。因此，许多新型疫苗策略的目标是产生大量旨在杀死受感染细胞的记忆CD8⁺ T细胞。

用病毒载体疫苗进行的异种的初免(prime)-加强免疫接种已被证明是产生大量循环T淋巴细胞的最有效策略之一。一种由肌内注射(i.m.)腺病毒(Ad)初免随后是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)i.m.加强免疫组成的疫苗接种方案能够显著增加循环中抗原特异性(Ag特异性)T细胞的总数以及它们的亲和力，使它们能够识别表达极低水平抗原的靶细胞(Estcourt,M.J.,et al.,Prime-boost immunization generates a high frequency,high-avidity CD8(+)cytotoxic T lymphocyte population.Internationalimmunology,2002.14(1):p.31-7)。该策略已成功地在各种疾病的临床前和人体临床试验中仅产生部分水平的保护性免疫。

由疟原虫物种引起的疟疾是世界上最重要的传染病之一，与高发病率和死亡率相关，特别是在撒哈拉以南非洲五岁以下儿童中。随着抗疟药物和抗药性的增加，迫切需要一种有效的高效疫苗接种方案。已经研究了针对疟原虫生命周期的不同阶段的各种不同的亚单位疫苗策略，迄今为止观察到的最大成功是子孢子和肝脏阶段疟疾候选物的。特别是RTS,S/AS01(一种诱导针对环子孢子(CS)蛋白的抗体的佐剂制剂中的蛋白质)以部分功效完成了III期现场试验，但尚未达到WHO的资格预审。

诱导针对疟疾的红细胞前期阶段的保护的另一种方法是产生针对感染的肝细胞的细胞免疫。已经证明了干扰素-γ⁺(IFNγ)CD8⁺ T细胞在小鼠中预防肝脏阶段疟疾的能力。为此，已经投入大量精力来优化病毒载体、异种的初免-加强免疫策略，其能够产生高频率的抗原(Ag)特异性CD8⁺ T细胞。在临床前和临床研究中均最有希望的方案包括腺病毒(Ad)病毒载体初免，其随后用表达相同抗原的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)加强免疫。除疟疾外，该策略还已临床上用于许多疾病，例如埃博拉病毒、结核分枝杆菌、HIV和流感。用异种的初免-加强免疫Ad和表达TRAP的MVA接种可诱导大量循环疟疾特异性CD8⁺ T细胞，在初次接触疟疾和暴露前的个体中具有一定程度的临床功效。但是为了获得更高水平的功效，最有可能需要更多数量的循环CD8⁺ T细胞，如小鼠中的情况。

尽管在过去20年取得了大量进展，但旨在诱导细胞介导的抗疟疾免疫力的疫苗可能受到与寄生虫生物学和肝脏微观解剖学相关的许多具有挑战性的时空因素的阻碍。因此，仍然迫切需要一种高效的抗疟疾疫苗，主要的疫苗接种策略主要针对疟原虫生命周期的红细胞前期、子孢子和肝脏阶段。已知产生高水平干扰素-γ的细胞毒性抗原特异性CD8+T细胞是保护性的，异种的初免-加强免疫病毒载体免疫是一种特别有效的诱导方法。因此，开发高效疟疾疫苗已成为主要的研究目标，特别是通过诱导针对恶性疟原虫感染的肝脏阶段的保护性CD8+ T细胞免疫。已经开发出基于黑猩猩腺病毒(ChAd)和MVA的病毒载体，其已经安全地用于超过一千个疟疾疫苗接种者，诱导非常大量的循环T细胞，并且在英国和非洲的II期临床试验中提供部分功效。然而，这种疫苗接种方法诱导特别高数量的循环CD8+ T细胞，这些细胞是功效所必需的并且与功效相关，但仍然只能提供针对小鼠和人类中子孢子攻击的部分保护(在受控的人类疟疾感染中针对异源菌株的20-30％无菌功效)。这是现有技术的问题。

先前有一些尝试将T细胞应答定位于尤其是粘膜表面，以及许多通过在粘膜部位免疫诱导粘膜免疫的尝试。但是，这种方法取得的成功有限。

多年来，在肝脏中诱导细胞免疫应答一直是一项研究挑战。这是一种待产生的极具挑战性的效果。

现有技术试图为某些类型的肝病提供保护的尝试已成功地在血液中产生高水平的应答。例如，发明人自己在免疫受试者以实现高免疫应答方面的工作已经引领该领域。然而，尽管有这些“同类最佳”免疫结果，但对于诸如疟疾等疾病仍然只有大约20％至25％的保护作用。因此，现有技术方法需要非常高的循环T细胞反应以实现有意义的保护。这是现有技术的问题。

已用作病毒载体的病毒包括但不限于Ad、MVA、牛痘病毒、其他痘病毒、腺病毒相关病毒、黄病毒、疱疹病毒和α病毒。然而，越来越多的证据表明，如果应答在空间上与感染部位或入口无关，那么大量循环T细胞的产生可能仍然不足以保护。重要的是，最近描述了一种新的记忆淋巴细胞子集，称为组织驻留T淋巴细胞(T_RM)。T_RM包含非再循环记忆T细胞群，其仍位于非淋巴组织中，例如粘膜组织、皮肤和内部器官，例如脑、肾、胰腺和肝脏。尽管在不同器官之间存在高度异质的群体，但在许多情况下，当T_RM存在于再感染部位时，它们能够加速对二次病原体暴露的保护，部分用作早期组织哨兵。然而，尚不知道通过疫苗接种强力诱导这种组织驻留记忆T细胞的可靠方法，这是现有技术的问题。

本发明试图克服与现有技术相关的问题。

发明概述

发明人研究了身体周围各种物理位置的T细胞。例如，通过在淋巴结和其他离散位置染色来研究T细胞。

发明人对研究和改进免疫方案感兴趣。通常，使用肌内和其他施用途径。然而，当发明人进行静脉内(I.V.)和随后的皮下(s.c.)施用实验时，他们惊讶地获得了显著的结果。特别是，通过提供I.V.第二(“靶”)免疫，取得了非常有效的结果，包括100％的疟疾疾病保护。

已知肝脏是免疫耐受器官，肝脏中特别难以诱导和/或维持免疫应答。因此，更令人惊讶的是，本发明人已经在产生靶向肝脏的免疫应答方面取得了其强有力的结果。

令人惊讶的是，本发明的方法导致在特定区域例如肝脏位置产生T细胞。更令人惊讶的是，那些T细胞保留在该位置，例如肝脏，并在那里发挥其作用。

因此，在一个方面，本发明提供试剂盒，其至少包含第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或口服途径施用所述第二组合物来诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

在一个方面，本发明涉及诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其中通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或口服途径施用所述第二组合物，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒在治疗或预防肝脏疾病中的用途。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、如上所述的方法或如上所述的用途，其中在施用所述第一组合物后约2周施用所述第二组合物。

适当地，所述第二种组合物是静脉内或皮下施用，优选静脉内施用的。

适当地，所述第一种组合物是肌内施用的。

适当地，所述第一种组合物是肌内施用的，所述第二种组合物是静脉内施用的。

适当地，所述第一组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

适当地，所述第二组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

适当地，所述第一组合物包含编码所述表位的腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的痘病毒载体。

适当地，所述第一组合物包含编码所述表位的猴或人腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体。

最适当地，所述猴或人腺病毒载体包含Ad5腺病毒载体。

适当地，免疫应答是CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答。

适当地，所述第一和第二组合物的至少一个表位来自相同的肝脏疾病抗原。

适当地，所述第一和第二组合物的至少一个表位是相同的。

适当地，所述第一和第二组合物是不同的。

适当地，所述第一和第二组合物是相同的。

当第一和第二组合物相同时，适当地，在受试者中发生抗载体免疫之前施用第二种组合物。当然，本领域技术人员将理解的是，不同的施用途径可能需要具有不同制剂的组合物(例如由于剂量/体积)，但如果合适，可以使用具有相同配制的组合物用于不同的施用途径。

适当地，抗原选自由以下组成的组：疟疾抗原、恶性疟原虫(P.falciparum)抗原、间日疟原虫(Plasmodium vivax)抗原、诺氏疟原虫(P.knowlesi)抗原、伯氏疟原虫(P.berghei)抗原、肝炎病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原和戊型肝炎病毒抗原。

适当地，疟原虫是恶性疟原虫、间日疟原虫或诺氏疟原虫。

在一个方面，本发明涉及用于施用如上所述组合物的装置，所述装置包含所述组合物的至少一个剂量。

一方面，本发明涉及包含第一容器和第二容器的试剂盒，所述容器各自含有包含至少一种肝病抗原表位的组合物，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，用于诱导受试者中的免疫应答，其中所述第一容器和所述第二容器用于通过不同途径将所述组合物施用于所述受试者。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒在诱导受试者中的免疫应答中的用途，其中将所述试剂盒的组合物施用于所述受试者。

在一个方面，本发明涉及制备如上所述的试剂盒的方法，该方法包括选择肝脏疾病抗原的至少一种表位，将所述表位与药学上可接受的载体一起混合，并配制适用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径、优选肌内(i.m.)途径施用的第一组合物，并配制适用于通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或口服途径、优选静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、最优选静脉内(i.v.)途径施用的第二组合物，

其特征在于，所述第一和第二组合物经配制用于不同途径施用。

在一个方面，本发明涉及治疗肝脏疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用如上所述的第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒，用于治疗肝脏疾病。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒在治疗肝脏疾病中的用途。

在一些实施方案中，本发明可用于治疗患者。这意味着患者实际上患有肝脏疾病而不是通过在患者生病之前诱导保护性免疫应答来预防。例如，本发明的一个应用可以是治疗由乙型肝炎和/或丙型肝炎引起的肝病患者。另一种应用可以是在CD8 T细胞不能进入受影响部位或在该部位处于“疲惫(exhaustion)”状态的情况或病症/疾病中的治疗。根据本发明的治疗将允许功能活化的CD8T细胞靶向正确的部位(例如肿瘤或慢性感染)。

适当地，所述容器包括注射器。适当地，所述容器是注射器。

进一步概述

在一个方面，本发明涉及试剂盒，其至少包含第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)或口服途径施用所述第二组合物来诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

其中通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹腔内(i.p.)或口服途径施用所述第二组合物，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述肝脏疾病抗原是来自或衍生自引起人、牲畜或伴侣动物的肝脏疾病的传染性病原体。

换句话说，我们描述了如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述表位是肝脏疾病抗原的CD8+ T细胞表位，所述肝脏疾病抗原衍生自引起人、牲畜或伴侣动物的肝脏疾病的传染性病原体。

本发明旨在使用新型免疫方法来预防或治疗影响人、牲畜和伴侣动物肝脏的传染病。这些都是目前从其他类型免疫中受益的靶人群或物种。本发明靶向的肝脏疾病抗原不需要在肝脏中引起疾病，但必须在感染的某个阶段在肝脏中表达，因此可能通过免疫靶向。这包括疟疾感染以及其他感染，例如由肝炎和其他一些病毒引起的感染。

这与Schneider 1998形成对比，Schneider 1998只使用了不会引起人类疾病的小鼠寄生虫抗原。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述表位是由来自人的肝脏肿瘤抗原的人HLA I类分子限制的CD8+ T细胞表位或肝癌新抗原表位。

换句话说，我们描述了如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述表位是由来自人的肝脏肿瘤抗原的人HLA I类分子限制的CD8+ T细胞表位或肝癌新抗原表位。

应当理解的是，本文所述的免疫方法可以在肝脏中产生有效的CD8+ T细胞免疫，可用于预防或治疗肝脏疾病，不仅仅是由感染性病原体引起的，而且也可以是由肿瘤和癌症引起的。因此，本发明包括使用新的免疫方法来靶向肿瘤、癌症和恶性肿瘤在肝脏中表达的抗原和表位。靶向表位可以来自任何描述的癌抗原，包括与肝脏中的病毒引起的癌症相关的病毒抗原，例如乙型肝炎表面抗原和/或核心抗原，以及经典的癌抗原，例如MAGE、5T4和NY-ESO抗原以及许多其他抗原，以及新抗原，现在已被充分描述为在广泛的肿瘤和恶性肿瘤中表达，并且由于与其他癌症抗原相比对这些抗原的耐受性降低，因此可能特别适合作为CD8+ T细胞的靶抗原。与人体中所有保护性CD8+ T细胞表位一样，相关肽适当地是由人HLA I类分子呈递给CD8+ T细胞的肽。

因此，本发明可以应用于肿瘤表位和/或感染性病原体表位。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述表位在每侧侧接有其天然侧翼序列的至少7个氨基酸。

换句话说，我们描述了如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述表位是在每侧与其天然侧翼序列的至少7个氨基酸侧接的CD8+ T细胞表位。

我们描述了一种用于在肝脏中诱导有效CD8+ T细胞应答的改进方法，其可以预防诸如疟疾之类的疾病。这种保护通常取决于CD8+ T细胞。适当地，保护可以包括识别最小的CD8+ T细胞表位，其长度通常为8-10个氨基酸，结合在MHC I类分子的沟中(在人类HLA I类分子中)。因此，适当地，CD8+ T细胞表位的长度为8-10个氨基酸。因此，适当地，CD8+ T细胞表位结合在MHC I类分子的沟中。因此，适当地，CD8+ T细胞表位结合在HLA I类分子的沟中。现在有相当多的证据表明这些最小表位的侧翼序列影响它们在细胞内的加工(例如LeGall et al.Portable flanking sequences modulate CTL epitope processing J ClinInvest.2007；117:3563-75)，因此改变的侧翼序列可能减少或防止这些表位呈递给T细胞。通过使用天然抗原中发现的天然侧翼序列可以避免这个问题，从而允许正确的加工。7个氨基酸或更多氨基酸的表位的每一侧的天然侧翼序列通常足以允许充分加工。可以通过检查合适的公开可用数据库(例如GenBank)找到天然序列。因此，在本发明的组合物中，用这种长度的天然侧翼序列提供(或编码)合适的表位。

该方法与Plebanski 1998形成对比，Plebanski 1998公开了恶性疟原虫CD8T细胞表位，但仅作为表位串，没有长达22个氨基酸(8+7+7)的个体表位。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述第一组合物不包含质粒DNA。

换句话说，我们描述了如上所述的试剂盒、方法或用途，其中第一组合物不是质粒DNA组合物，例如质粒DNA疫苗。

递送表位的多种组合物可用于本发明。这些在易于构建、制造和它们在人类中产生CD8+ T细胞应答的能力方面有所不同。质粒DNA组合物如疫苗组合物在20世纪90年代被发现并且最初被认为可用作诱导有效CD8+ T细胞应答的简单方法。然而，许多DNA组合物如疫苗组合物的临床试验未能诱导这种有效的T细胞应答。因此，适当地，质粒DNA组合物不用于本发明，例如不用于本发明的第一组合物中。适当地，载体如腺病毒载体、尤其是猴腺病毒载体用于本发明的组合物中，例如本发明的第一种组合物，其具有更有效的优点。

这与使用质粒DNA作为致敏免疫的Schneider 1998形成对比。

在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒、方法或用途，其中所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体，并且其中所述第二组合物包含所述载体的至少2×10⁶个噬斑形成单位。

换句话说，我们描述了如上所述的试剂盒、方法或用途，其中用作第二组合物的重组MVA的剂量是至少2×10⁶个噬斑形成单位。

本文公开了MVA和腺病毒载体均为合适的第二施用或“靶向”病毒载体。然而，在生物发光成像研究中，使用重组腺病毒而不是重组MVA鉴定了反映肝脏中转基因表达水平的更强信号。这部分反映了使用的MVA的低剂量水平，1×10⁶pfu而不是更高剂量的腺病毒载体。因此，适当地，应使用更高剂量的MVA，2×10⁶pfu或更多，以增强肝脏中相关抗原的表达水平。

这与Schneider 1998和Plebanski 1998都形成鲜明对比，他们使用1×10⁶pfu的MVA而且如此而已。

·Schneider 1998(Nature Medicine vol 4 pages 397-402)仅限于用质粒DNA进行i.m.初免。Schneider et al 1998中没有任何教导或动机来改变致敏组合物。相反，本发明集中于病毒载体作为致敏组合物。此外，本发明教导了腺病毒载体是最佳的。此外，本发明教导了“靶向”或加强组合物的i.v.递送(施用)是最佳的。发明人认为没有现有技术尝试过i.v.靶向方法。发明人提供的数据表明，使用本文教导的方法，结果从0％保护变成100％保护。此外，在Schneider et al 1998，静脉给予MVA没有改善。在现有技术中从来没有进行i.m.和i.v.给予MVA。相比之下，本发明人表明，诸如使用腺病毒载体的最佳方法将循环CD8+ T细胞归巢至肝脏。本发明人还表明，使用这种病毒载体方法比使用产生低得多的循环T细胞水平的DNA的现有技术方法产生更高水平的循环CD8+ T细胞。发明人认为本领域没有动机静脉内使用病毒载体如MVA，并且本领域没有证据表明静脉内给予病毒载体有任何益处。在现实生活的实际意义上，本发明已经进行了15年，并且由于最近的已知现有技术方法，这种新方法在很长一段时间内没有在本领域中使用。发明人认为没有现有技术尝试过i.v.至靶。Schneider et al 1998的第401页图3没有给予MVA iv加强免疫的动机，因为Schneider等人的图3和表4均显示皮内注射在免疫原性和功效方面与静脉注射非常相似，皮内注射使用和部署起来非常简单。因此，阅读者会有动机使用皮内而不是静脉内。此外，Schneider et al 1998的第400页图2显示DNA/MVA是最佳的，因此将没有动机将初免和加强免疫均改成病毒载体，因为其比DNA-MVA更差(Schneider et al 1998的图2的第1个柱vs图2的第4个柱)。此外，发明人意识到许多人类数据显示DNA-MVA在人类中不够好，因为功效远低于15％。这在现有技术中得到证实，例如McConkey et al 2003(Nature Medicinevol 9 page 729)公开了用DNA-MVA，DNA-MVA后的峰值免疫应答为162SFC/百万PBMC并且导致疟疾发作后寄生虫血症略有延迟；Ewer et al 2013(Nature Communications DOI10.1038/ncomms3836)公开了ChAd63-MVA诱导2646SFC/百万PBMC的峰值免疫应答，诱导21％的无菌功效和疟疾攻击后寄生虫血症的显著延迟。因此，本领域需要更好的，而本发明解决了这个需要。

另外的概述

·在一个方面，本发明涉及试剂盒，其至少包含第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其中所述第一和第二组合物各自包含编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体或痘病毒载体，

其用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径施用所述第二组合物来诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

·在一个方面，本发明涉及诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其中通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径施用所述第二组合物，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

·在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒在治疗或预防肝脏疾病中的用途。

·适当地，在施用所述第一组合物后约2周施用所述第二组合物。

·适当地，所述第二种组合物是静脉内或皮下施用，优选静脉内施用的。

·适当地，所述第一种组合物是肌内施用的。

·适当地，所述第一种组合物是肌内施用的，所述第二种组合物是静脉内施用的。

·适当地，所述第一组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

·适当地，所述第二组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

·适当地，所述第一组合物包含编码所述表位的腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的痘病毒载体。

·适当地，所述第一组合物包含编码所述表位的猴或人腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体。

·适当地，所述第一和第二组合物的病毒载体是相同的。这是本发明的令人惊讶的益处，因为在本发明之前在初免和随后的加强免疫/靶施用中使用相同的载体被认为是不实际的。

·适当地，免疫应答是CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答。

·适当地，所述第一和第二组合物的至少一个表位来自相同的肝脏疾病抗原。

·适当地，所述第一和第二组合物的至少一个表位是相同的。

·适当地，所述第一和第二组合物是不同的。

·适当地，所述第一和第二组合物是相同的。

·适当地，所述肝脏疾病抗原是来自或衍生自引起人、牲畜或伴侣动物的肝脏疾病的传染性病原体。

·适当地，“伴侣动物”是指选自狗、猫、马、鸟、兔和鱼的一种或多种动物。

·适当地，“牲畜动物”是指选自由以下组成的组的一种或多种动物：山羊、绵羊、牛、猪、骆驼、兔、鱼、骡、驴、水牛、鸡、火鸡、鸭、鹅和珍珠鸡。

·适当地，小鼠不是伴侣动物。适当地，提到“伴侣动物”时特别排除了小鼠。适当地，小鼠不是牲畜动物。适当地，提到“牲畜动物”时特别排除了小鼠。

·适当地，所述表位是由来自人的肝脏肿瘤抗原的人HLA I类分子限制的CD8+ T细胞表位或肝癌新抗原表位。

·适当地，所述表位在每侧与其天然侧翼序列的至少7个氨基酸侧接。

·适当地，所述第一组合物不包含质粒DNA。

·适当地，所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体，并且其中所述第二组合物包含至少2×10⁶个噬斑形成单位的所述载体。

·适当地，抗原选自由以下组成的组：疟疾抗原、恶性疟原虫(P.falciparum)抗原、间日疟原虫(Plasmodium vivax)抗原、诺氏疟原虫(P.knowlesi)抗原和伯氏疟原虫(P.berghei)抗原。

·适当地，抗原选自由以下组成的组：肝炎病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原和戊型肝炎病毒抗原。

·在一个方面，本发明涉及用于施用如上所述组合物的装置，所述装置包含至少一个剂量的所述组合物。

·在一个方面，本发明涉及试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述容器各自含有包含肝脏疾病抗原的至少一种表位的组合物，

其中所述表位是CD8+ T细胞表位，用于诱导受试者中的免疫应答，其中所述第一容器和所述第二容器用于通过不同途径向所述受试者施用所述组合物。

·在一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒在诱导受试者中的免疫应答中的用途，其中将所述试剂盒的组合物施用于所述受试者。

·在一个方面，本发明涉及制备如上所述的试剂盒的方法，该方法包括选择肝脏疾病抗原的至少一种表位，将所述表位与药学上可接受的载体一起混合，并配制适用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或气雾剂途径、优选肌内(i.m.)途径施用的第一组合物，并配制适用于通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、优选静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、最优选静脉内(i.v.)途径施用的第二组合物，

·在一个方面，本发明涉及治疗肝脏疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

·适当地，如上所述的试剂盒用于治疗肝脏疾病。

·适当地，如上所述的试剂盒的用途是在治疗肝脏疾病的用途。

发明详述

我们公开了一种新的“初免-靶向”免疫方法，该方法通过异种的施用途径例如通过将第二免疫施用途径由肌内改变为静脉内产生非常高的疫苗功效。

开发了一种新的疫苗策略，旨在初免外周CD8+ T细胞，例如在高免疫原性位点(例如肌肉)并随后用蛋白质加载的聚(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒或通过特定途径施用的重组病毒载体将它们靶向肝组织。在肝脏中产生耐久的抗原特异性CD8+ T细胞，其比使用肌内施用用于初免和加强免疫的常规异种的病毒载体方案增加10倍。重要的是，在肝脏阶段疟疾的伯氏疟原虫子孢子攻击模型中，发现该策略用各种临床相关抗原和小鼠品系导致前所未有的灭菌保护，大大改善了当前的方法。这种用于疟疾免疫的初免和靶免疫策略可以提供用于预防或免疫治疗由感染肝脏的病原体引起的疾病的一般方法。

关于诸如乙型肝炎或丙型肝炎的肝脏疾病，通常在现有技术中使用诱导针对病毒蛋白的抗体的方法实现预防性保护。然而，为了治疗受试者，需要T细胞。特别是，在疾病部位即肝脏中需要T细胞。本发明的一个优点是T细胞应答靶向肝脏。

用于诱导针对乙型肝炎或丙型肝炎抗原的抗体应答的组合物或疫苗通常涉及病毒蛋白与佐剂复合并通常通过注射施用于患者，以诱导抗体应答。相比之下，本发明集中于定位于特定组织例如肝脏中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL或CD8+ T细胞)的诱导，以便实际识别和清除细胞内病原体。用本免疫方案也成功产生了抗体应答；通过利用细胞和体液免疫应答，本发明极大地改善了目前的免疫方案(例如疫苗方案)。

适当地，抗原是肝脏疾病抗原。适当地，抗原是肝脏阶段抗原。适当地，肝脏疾病是由肝脏病原体引起的疾病。肝脏病原体包括具有肝脏阶段的病原体，例如疟疾寄生虫。因此，抗原适当地是由肝脏病原体携带的抗原。适当地，肝脏疾病可包括诸如肝癌的病症。显然，在疾病内在的感染原或侵袭性生物的意义上，肝癌不一定具有潜在的病原体。在讨论肝癌等肝病时，“病原体”或致病因子指的是一种或多种癌细胞(肿瘤细胞)本身，但也可能或者备选地是导致肝脏疾病或癌症的病毒或病原体抗原。因此，在这些实施方案中，抗原适当地是由肝脏中的癌细胞(肿瘤细胞)携带的抗原。适当地，“肝癌”是指位于肝脏中的实体癌或肿瘤。这可是已转移至和/或侵入肝脏的继发性肿瘤。或者，“肝癌”可以指位于肝脏中的包含原发性肝癌细胞的实体癌或肿瘤。最适当地，肝癌是指由肝细胞引起的原发性癌症。

·在广泛的方面，本发明涉及编码CD8 T细胞表位的任何初免剂和具有腺载体的静脉内增强免疫：因此广泛的方面，本发明涉及包含至少第一组合物和第二组合物的试剂盒，所述第一和第二组合物各自包含至少一种肝脏疾病抗原表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，其中所述第二组合物包含腺病毒载体，用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)，皮内(i.d.)或气雾剂途径施用所述第一组合物，并通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、优选通过静脉内(i.v.)途径施用所述第二组合物，诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

疟疾

广泛研究的小鼠疟疾寄生虫是伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)。人类最重要的疟疾寄生虫是恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)。人类病原体(恶性疟原虫(P.falciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、诺氏疟原虫(P.knowlesi))不会感染小鼠。因此，疟疾疾病的小鼠模型通常使用小鼠寄生虫伯氏疟原虫(P.berghei)。或者，疟疾疾病的小鼠模型涉及转基因伯氏疟原虫，例如表达恶性疟原虫TRAP(PfTRAP)抗原的伯氏疟原虫或类似地表达间日疟原虫TRAP(PvTRAP)的伯氏疟原虫。

抗原

本发明人使用一系列抗原(包括来自人疟疾寄生虫恶性疟原虫的各种抗原)提供了数据(参见下面的实施例)。卵清蛋白已被用作示例性抗原。类似地，表达卵清蛋白的伯氏疟原虫已经用于小鼠疾病模型中，以证明本发明的有利效果。

适当地，目标抗原的参考序列如下表所定义：

序列在此通过引用并入本文。

技术人员仅需要鉴定用作抗原的正确基因/蛋白质。所提供的指导并非旨在将本发明严格地限制于所提供的特定单个示例性序列。已知基因序列(以及蛋白质序列)在个体之间和/或病原体的菌株或分离株之间变化，例如，由于等位基因变异或个体之间的突变。所提供的信息帮助操作者通过使用合适的蛋白质/基因实施本发明。最终，实际使用或编码基因产物(合适的蛋白质)。因此，个体之间的次要或最小等位基因或突变差异并不重要，重要的是在本发明的组合物中使用或编码正确的抗原/表位。

适当地，在使用抗原名称的情况下，这意指来自上表的相应氨基酸或核酸序列。适当地，对于氨基酸序列，规范序列是优选的。适当地，对于核酸序列，优选最新的(例如编号最高的)核酸序列。

应当理解，本发明同样可以利用片段，例如这些抗原的表位或片段、变体或突变。适当地，任何此类片段、变体或突变沿着所述片段、变体或突变的全长具有与参考序列至少80％的序列同一性，沿着所述片段、变体或突变的全长的适当地90％、合适地95％、合适地98％的序列同一性。

可以使用本领域已知的任何合适的技术计算序列同一性。例如，用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit包(University of Wisconsin,U.S.A.；Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Research 12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(see Ausubel et al.,1999 ibid–Chapter 18)、FASTA(Atschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,403-410)和GENEWORKS比较工具套件。适当地，默认设置用于任何缺口罚分或计算所需的其他此类值。

适当地，表位是蛋白质表位。

适当地，抗原是蛋白质抗原。

适当地，抗原选自由以下组成的组：疟疾抗原、乙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒抗原或巨细胞病毒抗原或戊型肝炎病毒抗原或甲型肝炎病毒抗原或EB病毒抗原。

更适当地，抗原选自由以下组成的组：疟疾抗原、乙型肝炎病毒抗原和丙型肝炎病毒抗原。

·适当地，抗原/表位不是HGXPRT。适当地，排除HGXPRT。

·适当地，抗原/表位不是IL-12。适当地，排除IL-12。

数据库发布(release)

存储在数据库中的序列可能会随时间而变化。适当地，依赖于当前版本的序列数据库。或者，依赖于申请日的有效发布。

如技术人员所知，登录号可以是版本/日期的登录号。当前数据库条目的可引用登录号与上述相同，但省略小数点和任何后续数字。

GenBank是NIH基因序列数据库，是所有可公开获得的DNA序列的注释集合(National Center for Biotechnology Information,U.S.National Library ofMedicine 8600Rockville Pike,Bethesda MD,20894 USA；Nucleic Acids Research,2013Jan；41(D1):D36-42)并且提供的登录号与此有关，除非另有说明。适当地，所参考的GenBank数据库发布是2015年12月15日,NCBI-GenBank Release 211.0。

UniProt(Universal Protein Resource，通用蛋白质资源)是蛋白质信息的综合目录(‘UniProt:a hub for protein information’Nucleic Acids Res.43:D204-D212(2015).)。为避免疑义，依赖于UniProt Release 2015_11。

更详细地，依赖于UniProt联盟欧洲生物信息学研究所(EBI)、SIB瑞士生物信息学和蛋白质信息资源研究所(PIR)的UniProt Knowledgebase(UniProtKB)Release 2015_12(2015年12月9日)。

PlasmoDB(http://PlasmoDB.org)是恶性疟原虫基因组测序联盟的官方数据库。该资源包含最近完成的恶性疟原虫基因组序列和注释，以及其他疟原虫测序项目中出现的草案序列和注释。参见Nucleic Acids Res.2003 Jan 1；31(1):212–215；和PlasmoDB:afunctional genomic database for malaria parasites.Nucleic Acids Res.2008 Oct31.Aurrecoechea C,et al.。

PlasmoDB有时在本文中称为“PlamoDB”。

适当地，依赖于2016年3月31日的PlasmoDB发布28。

肝炎

有五种已知的人类肝炎病毒：甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎。甲型肝炎和戊型肝炎是不太严重的疾病，死亡率低。然而，这些肝炎病毒中的任何一种都可能在弱势患者中更严重，例如免疫功能低下的患者或孕妇。因此，适当地，抗原可以是甲型肝炎抗原或戊型肝炎抗原。

丁型肝炎通常仅与乙型肝炎一起作为共病毒(共感染)感染患者。因此，在一个实施方案中，抗原可以是丁型肝炎抗原。

乙型肝炎和丙型肝炎是人类的严重疾病。如果它们发展成慢性感染，当肝硬化和/或肝癌可能发展时，这些尤其危险。因此，最适当地，本发明的抗原是乙型肝炎抗原或丙型肝炎抗原。在一个实施方案中，提供了包含来自乙型肝炎抗原的表位和来自丙型肝炎抗原的表位的组合物。这具有提供单一组合物(或单组组合物)的优点，用于在单组施用中针对乙型肝炎和丙型肝炎病毒免疫。

乙型肝炎是人类健康中普遍存在的问题。例如，估计多达10％的东亚人口患有乙型肝炎。乙型肝炎是一种人类病毒，其基因组约为3.5Kb。示例性乙型肝炎病毒基因组的序列如登录号AB775201.1(GenBank，DNA环状基因组)。

丙型肝炎是人类肝病的另一个原因。丙型肝炎也是一种广泛存在的病毒，其基因组大约为9.6-12.3Kb。示例性丙型肝炎病毒基因组的序列如登录号D11168.1(GenBank，RNA线性基因组)。

肝脏抗原

鉴定肝脏病原体中的肝脏阶段抗原是现有技术中公认的方法。例如，肝阶段抗原可以通过生物信息学预测，或寄生肝细胞的RNA分析，或详细的文献检索以及可能的抗原呈递的体外测试来确定。或者，可以纯化来自感染细胞(例如，用spz感染的肝细胞)的MHC I类肽复合物，并且使用质谱分析，可以确定具有免疫显性表位的相关抗原。确定了主要候选物可以克隆到病毒载体和免疫原性中，以及无菌保护受攻击小鼠的能力。

适当地，表位是CD8 T细胞表位。由于常规的遗传变异，CD8 T细胞表位在群体中的个体之间的氨基酸序列可能不同。适当地，表位是HLA-A2表位。HLA-A2是最常见的人类MHC类型，这具有优点。因此，在HLA-A2背景下识别的表位可以覆盖多达50％的通常人群。

施用方案

本发明的关键特征是第一和第二或后续免疫接种是通过不同途径进行的。适当地，第一和第二或进一步的免疫接种是通过不同的途径。适当地，第一和第二或进一步的免疫接种是通过异种的途径。

适当地，第一施用包含腺病毒载体。

适当地，第二施用包括腺病毒载体或痘病毒载体如MVA，最适当地是痘病毒载体。

适当地，第一施用是肌内施用。

适当地，第二或进一步的施用是皮下施用。

最适当地，第二或进一步的施用是静脉内施用。

应该注意的是，现有技术中没有任何地方教导了相同抗原或表位的组合物的不同施用途径。在解决粘膜表面时，可能存在一种可能的例外，偶尔气溶胶或鼻内应用可用于常规初免(例如肌内注射初免)之后的增强。在任何情况下，本发明不包括其中第二或进一步的施用是通过气溶胶或鼻内应用的任何方案。适当地，第二或进一步的施用不是气溶胶施用。适当地，第二或进一步的施用不是鼻内施用。

本发明的一个关键特征是异种的施用途径用于第一和第二或进一步的施用。

在一个实施方案中，可给予超过一剂的第一施用(另外的第一施用)，条件是其后通过异种的途径(IV或SC)进行第二或进一步的施用。这在本文中进行讨论(参见“初免-加强-靶向”)。

剂量

除非另有说明，否则剂量用于成年人；必要时，熟练的操作者可以使用本文的指导来改变剂量。适当地，由医生确定给药。

适当地，对于基于蛋白质或肽的抗原，施用约1微克至100微克的抗原，但是如果需要可以给予多达5mg。

适当地，当使用病毒载体时，给予每施用10⁶至10¹²个腺病毒载体的病毒颗粒的病毒载体剂量，更通常为10⁸至10¹¹个腺病毒载体的病毒颗粒。当使用MVA载体时，每MVA载体施用使用10⁶至10⁹个噬斑形成单位(pfu)，更通常每施用使用10⁷至10⁸个pfu的病毒颗粒。

剂量可根据施用途径而变化。在这方面，每施用的近似剂量显示在下表中。

时机

适当地，不同时给予第一和第二或进一步的施用。

适当地，分开给予第一和第二或进一步的施用。

适当地，顺序给予第一和第二或进一步的施用。

适当地，第二或进一步的施用的时间与先前免疫应答的峰值一致。

第二或进一步的施用可以在第一或先前的施用后一天至几年的时间内给予，适当地在第一或先前的施用后约2周给予。

第二或进一步的施用的合适时间是：第一或之前的施用后1天、1周、10天、2周、3周或3年，最适合的是2周。

适当地，在先前(例如前面最近的)的施用后约2天至12周给予任何进一步的施用，最合适地在先前(例如前面最近的)的施用后2周给予。

更适当地，第一或之前的施用后约2周给予第二或进一步的施用，最合适地在第一或之前的施用后2周给予。

更适当地，第一施用后约2周给予第二施用，最合适地在第一施用后2周给予。

载体

已经观察到施用于受试者的腺病毒可以具有肝脏的趋向性。然而，本发明人首次公开了可以产生高水平的细胞介导的免疫(CMI)应答并在肝脏中定位。有利地，通过本文公开的组合物和施用方案实现该效果。

适当地，腺病毒载体是基于人或基于猴腺病毒的载体，最适当的是基于人腺病毒的载体。适当地，腺病毒载体是Ad5、ChAdOx1、ChAd3或ChAd63；更适当地，腺病毒载体是Ad5或ChAdOx1；最适当地，腺病毒载体是Ad5。这些和其他载体在本领域中是公知的并且已被广泛发表，包括相关的序列存储。在需要任何进一步指导的情况下，例如可以参考GenBank登录号AC_000008使用Ad5载体。

在一个实施方案中，腺病毒载体不是ChAd63。

·这样的载体描述于现有技术中，例如：

·ChAd63 GenBank:CS479279.1(例如参见WO2006133911)或GenBank:JB344651.1(例如参见EP2570423)

·ChAd3 GenBank:JB344647.1(例如参见EP2570423)

·ChAdOx1描述于Dicks MDJ,Spencer AJ,Edwards NJ,Wadell G,Bojang K,etal.(2012)A Novel Chimpanzee Adenovirus Vector with Low Human Seroprevalence:Improved Systems for Vector Derivation and Comparative Immunogenicity.PLoSONE 7(7):e40385和WO2012/172277中。此外，含有GFP的ChAdOx1保藏于ECACC:包含含有AdChOX1的克隆基因组(pBACe3.6 AdChOx1(E4改良)TIPeGFP,细胞系名称"AdChOx1(E4改良)TIPeGFP")的细菌人工染色体(BAC)的大肠杆菌菌株SW1029(DH10B的衍生物)的实例由Isis Innovation Limited于2012年5月24日在布达佩斯条约下保藏于EuropeanCollection of Cell Cultures(ECACC)at the Health Protection Agency CultureCollections,Health Protection Agency,Porton Down,Salisbury SP4 0JG,UnitedKingdom，编号为临时登录号12052403。Isis Innovation Limited是本专利/申请的所有权人/申请人之前的名称。

腺病毒载体是本领域已知的。具体而言，腺病毒载体已被用于抗肿瘤方法。但是，抗肿瘤方法已经具体寻求避免肝脏中的任何免疫应答。例如，涉及腺病毒载体的一个现有技术方法已知为溶瘤病毒疗法。该方法涉及试图使病毒进入肿瘤以裂解该肿瘤的细胞。这些方法已经倾向于使用痘苗病毒、疱疹病毒和有时基于腺病毒的方法。虽然可以针对以这种方式施用的病毒产生免疫应答，但该应答针对病毒本身。相比之下，本发明涉及使用病毒载体递送针对其产生应答的抗原。在现有技术方法中，非常不希望具有针对病毒的免疫应答，因为那些免疫应答可能在这些病毒实施其治疗效果(例如帮助裂解肿瘤细胞)之前很好地消除它们。因此，本发明中病毒载体的使用在现有技术应用如溶瘤病毒疗法中使用病毒载体的方法上是不同的。

适当地，痘病毒载体是禽痘病毒载体、正痘病毒载体，NYVAC载体或MVA载体。最适当地，痘病毒载体是改良安卡拉病毒(MVA)。这些和其他载体在本领域中是公知的并且已被广泛发表，包括相关的序列存储。如果需要任何进一步的指导，我们参考GenBank登录号：AY603355.1。

例如，用于本发明的特别优选的MVA载体如该登录号，Acambis 3000菌株在非必需基因F7L中插入6bp(Cottingham et al.,(2008,PLosOne))。

基因治疗的现有技术方法甚至涉及将病毒直接施用于肝动脉，通常是以大剂量(例如本发明中教导的剂量的1000倍)。在这些方法中，病毒通常用于递送基因，例如被认为从被靶向的细胞“缺失”的基因，例如递送鸟氨酸转羧酶。再一次，这种基因治疗方法的目的是避免使用这些病毒载体产生的可能的免疫应答。实际上，存在临床试验的实例，其中受试者不幸遭受致命的副作用，这可能是由于施用的基因治疗载体引起的免疫应答。

从上面应该显而易见的是，本发明人采用的方法与基于腺病毒的载体在溶瘤病毒治疗/基因治疗应用中的现有技术用途完全不相容。在现有技术方法中，免疫应答是主动不想要的，因此这些现有技术方法将永远不会涉及如本发明所教导的施用第一剂量来“初免”免疫应答。

在现有技术中已知纯化子孢子然后将它们静脉内施用(I.V.)。例如，Sanaria的方法是纯化子孢子然后给它们I.V.施用于受试者。该方法涉及相同组合物(子孢子)多次施用，例如对同一受试者施用5次。此外，施用非常大剂量的纯化子孢子，这与本发明施用的有利的低水平抗原形成对比。最重要的是，在Sanaria的方法中没有教导或暗示任何异种的施用途径。因此，Sanaria的方法与本发明之间存在重要差异，本发明包括使用病毒载体，并且还包括使用异种的施用途径进行第一和第二或进一步的施用。

·适当地，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体和痘病毒载体。更适当地，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体和痘病毒载体。最适当地，病毒载体是腺病毒载体。

比较数据

应注意，异种的施用途径对本发明至关重要。虽然I.V.途径对于第二或进一步的施用是优选，本发明不包括仅通过I.V.途径的多施用。实际上，并不知晓增强免疫I.V.施用的使用对于诱导免疫应答而言是有用的途径。许多研究人员会一直努力避免这种途径。已知I.V.途径不是诱导免疫应答的最佳方式。实际上，发明人提出他们自己的数据，表明给出使用本文详述的病毒载体的第一和第二I.V.施用不会产生本发明的有益效果。本发明的有益效果是使用异种的施用途径实现的。与之形成鲜明对比的是，如形成了本专利申请的一部分的实施例和数据中所证明的，使用根据本发明的异种施用方案，例如肌内(IM)的第一施用然后静脉内(IV)的第二或进一步的施用产生令人惊讶的优异结果。

此外，并不知晓在肌内初免免疫后使用SC途径用于加强免疫在本领域中是有用的。尽管皮下(S.C.)是公认的免疫途径，但使用它作为特别好的靶向具有细胞免疫力的肝脏的途径是新颖的。

适当地，根据本发明的第一施用不是通过I.V.途径给予的。适当地，第一施用是通过除I.V.之外的途径给予的。适当地，第一施用是通过除I.V.之外的肠胃外途径给予的。适当地，I.V.施用不用于第一施用。

包括第一I.V.施用和第二I.V.施用的一对施用不形成本发明的一部分，因为这不代表异种途径的施用(因为在这种情况下，两施用都是I.V.施用)。本发明的关键部分是施用途径是异种的的(即不同的)。

本发明提供的关键优点是使用通过I.V.或S.C.途径、最适当地I.V.途径的第二或进一步的施用产生肝脏应答。

本发明提供的关键优点是使用与第一施用不同的途径的第二或进一步的施用，适当地，所述第二或进一步的施用通过I.V.或S.C.途径、最适当地I.V.途径，产生高水平保护(无菌功效)。

适当地，病毒载体是基于腺病毒的载体或基于痘病毒的载体。

适当地，基于腺病毒的载体选自由以下组成的组：hAd5、ChAd63、ChAd3和ChAdOx1，更适当地，选自由以下组成的组：hAd5和ChAdOx1，最适当地，基于腺病毒的载体包括ChAdOx1。适当地，基于痘病毒的载体包括改良安卡拉病毒(MVA)。

可以在本发明中使用腺相关病毒(AAV)衍生的载体。通过使用基于AAV的载体可以实现的一个可能的优点是它们可以口服施用并且可以靶向肝脏。

·为了选择正确的AAV血清型，应选择这些血清型作为对肝细胞具有最高亲和力的那些。测试它们对肝细胞的亲和力是常规和标准的，本领域技术人员将能够在没有进一步帮助或说明的情况下进行。如果需要进一步的指导，我们参考书籍章节“AAV介导的肝脏定向基因治疗”(Methods Mol Biol.2011；807:141-57)，其描述了对肝细胞具有更高亲和力因此最适合肝脏基因诱导的AAV8和AAV9。因此，适当地，AAV载体是AAV8或AAV9载体。这些载体是本领域已知的，例如AAV8是GenBank:HV550988.1(例如参见EP2345731)。本领域的观点是AAV不具有很强的免疫原性，并且用于基因转移领域，其中认为其不具有很强的免疫原性的优点；参见例如对腺病毒和腺相关病毒的免疫应答的综述，其中记载了对腺病毒的应答是如何强烈的AAV特征性地诱导对转基因的弱应答(如果有的话)(Gene Ther.2003Jun；10(11):955-63)。因此，本发明人教导AAV载体可用于本发明是令人惊讶的。

疾病

适当地，本发明用于靶向肝脏疾病的受试者的任何疾病。适当地，疾病或病症具有肝脏阶段。适当地，疾病或病症选自疟疾、乙型肝炎和丙型肝炎。

适当地，疾病是慢性HBV感染。

适当地，受试者是哺乳动物，最适当的是灵长类动物，最适当的是人。

适当地，第一施用通过I.M.、S.C.、I.D.、口服或气溶胶途径；更适当地通过I.M.、SC、ID或气溶胶途径；更适当地通过I.M.、S.C.或I.D.途径，最适当地通过I.M.途径。

适当地，第二或进一步的施用通过I.V.、S.C.或口服途径，更适当地通过I.V.或S.C.途径；最适当地通过I.V.途径。

适当地，第一和第二或进一步的施用是通过不同的途径。更详细地，适当地，第一施用是通过第一途径，第二施用是通过第二途径，其中第一途径和第二途径是不同的。

适当地，在第一和第二施用中施用的抗原和/或表位是相同的。

适当地，用于第一施用和第二施用的载体可以是相同的或可以是不同的；适当地，载体是不同的。因此，适当地，第一施用包括第一载体，第二施用包括第二载体，其中第一载体和第二载体是不同的。

当施用为口服施用时，载体适当地不是基于腺病毒也不是基于痘病毒的载体。作为解释，并不知晓腺病毒和痘病毒对于口服施用是最佳有效的。适当地，当施用为口服施用时，载体适当地是基于腺相关病毒(AAV)的载体。

当载体是颗粒载体如PLGA或其他纳米颗粒的形式时，蛋白质或病毒载体可以包被在所述颗粒上或可以包埋在所述颗粒内，或两者都有。或者，可以包封病毒载体以便帮助递送至肝脏，例如PLGA腺病毒构建体。

适当地，载体不是基于VSVG的载体。

第一载体和第二载体可以是相同的。适当地，第一载体和第二载体是不同的。

在一个特别优选的实施方案中，使用腺病毒载体肌内提供第一施用(初免)；使用基于痘病毒的载体例如MVA肌内提供另外的第一施用(增强免疫)；使用基于腺病毒的载体静脉内施用提供第二或进一步的异种的施用(靶向)。这种三管齐下的方法可称为“初免-增强免疫-靶向”。适当地，第一和另外的第一施用之间间隔几周；适当地，另外的第一和第二或进一步的施用之间间隔约1天至三个月，适当地约2周，最适当地为2周。

肝脏中的免疫应答

适当地，免疫应答是细胞介导的免疫应答(CMI)。

适当地，免疫应答是T细胞介导的应答，适当地，CD8+ T细胞介导的应答。

适当地，免疫应答在肝脏中，适当地，产生于或靶向肝脏，最适当地靶向肝脏。

适当地，免疫应答是保护性的。

本文所用的短语“保护性免疫应答”是指该组合物能够在本发明施用于其的宿主生物(例如人或非人哺乳动物)中产生保护性应答。适当地，保护性免疫应答保护免受由肝脏病原体引起的后续感染或疾病，例如恶性疟原虫或肝炎病毒或本文提及的其他肝脏病原体。保护性免疫应答可通过减少(例如)恶性疟原虫或肝炎病毒的复制，或通过影响(例如)恶性疟原虫或肝炎病毒的作用模式来减少或降低感染水平以减少疾病。

本发明的重要之处在于免疫应答是在肝脏中的。这通常通过取肝脏样品，分离该样品中的细胞，分离淋巴细胞，并确定施用的抗原/表位特异性淋巴细胞的数量来进行测试。对抗原/表位特异的淋巴细胞数在10⁶个总抗原/表位特异性T细胞范围内被认为表明已经产生了应答(在小鼠肝脏免疫学的背景下)，更适当地对于所有肝脏CD8 T细胞在15-20％的范围内(在小鼠肝脏免疫学的背景下)。替代的检测方法可以通过组织学定量。

当考虑人类受试者时，可以为此目的适当地进行肝脏活组织检查。

适当地，淋巴细胞是T细胞。

适当地，T细胞是CD8⁺ T细胞。

适当地，T细胞是T_RM。

不希望受理论束缚，发明人的见解包括观察到组织驻留T细胞(T_RM)介导这些令人惊讶和有利的效果。T_RM是一类公认的T细胞，它是组织驻留的，即它们被定位并保留在某些位置中，例如器官，例如肝脏。

T_RM表达的标记物在世界范围内达成一致。T_RM包含驻留在多种外周组织中的非再循环细胞群，例如皮肤、肺脏、粘膜表面、肾脏和肝脏[49,50]。在肝脏驻留的背景下的T_RM被认为是表达以下标记的抗原特异性T细胞：CXCR6、CD69、CD127^lo、CD62L^-、IFNg⁺。这些通常通过用特异性地检测标记物的存在或不存在的适当的抗体对细胞表面进行免疫染色来评估。在肝脏驻留的背景下也可以考虑的其他标记是以下两种转录标记物的下调：Eomes^loKLF2^lo。

实现疟疾保护的“金标准”测试通过让人类受试者被蚊子叮咬，并在疟疾病原体的冲击下测试免疫接种的功效。这种类型的研究在该领域中进行，具有知情同意并且在测试期间对任何被感染的个体进行治疗。

该专利申请中呈现的数据包括从小鼠模型获得的大量数据。值得注意的是，所呈现的数据之间存在大量差异。例如，已经使用本发明的方法在小鼠中测试了几种不同的抗原，包括抗原如卵清蛋白以及来自引起疾病的目标病原体的的抗原。此外，还测试了来自不同疾病(包括疟疾和肝炎如乙型肝炎)的抗原，为本文件中的数据提供了进一步的多样性。因此，本申请表明，本领域技术人员从这些详细且稳健的数据中理解本发明可以在人类中进行。

适当地，施用过程给予受试者。适当地，该过程包括第一施用和第二施用。第一施用有时称为“初免”。第二施用有时称为“靶向”。当然，接受施用的受试者可能先前已经遇到如本文所述向其施用一种或多种抗原。出于本公开的目的，如果受试者对第一(“初免”)施用向其施用的抗原具有任何或不存在的预先存在的免疫力或反应，这是无关紧要。受试者可能是未经历组合物中的抗原，或者可能对这些抗原具有预先存在的暴露和/或应答。重要的是，如本文所述施用于受试者的过程中的第一和第二施用是通过不同的给药途径给予的。这种不同对于本发明提供的靶向益处非常重要。

组合物

适当地，组合物是药物组合物。

适当地，组合物是抗原性组合物。

适当地，组合物是免疫原性组合物。

适当地，组合物是疫苗组合物。

适当地，该组合物配制用于哺乳动物，适当地用于灵长类动物，适当地用于人类。

适当地，组合物的配制考虑到其施用途径。适当地，配制组合物以适用于特定的施用途径。适当地，配制组合物以适用于由操作人员或医师选择的施用途径。

佐剂

根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，例如药物组合物，其包含本文根据本发明的免疫原性组合物或疫苗和药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体可包含盐水、水或缓冲液。药学上可接受的载体可包含一种或多种相容的固体或液体稀释剂或包封物质，其适于施用于哺乳动物(例如人)的身体。药学上可接受的载体可以是液体，溶液，悬浮液，凝胶，软膏，洗剂，粉末或其组合。药学上可接受的载体可以是药学上可接受的水性载体。

组合物(例如药物组合物、免疫原性组合物或疫苗)可进一步包含佐剂。佐剂可包含油乳液。佐剂可选自包含以下的组中的任一种：PEI；明矾；AS01或AS02(GlaxoSmithKline)；无机化合物，如氢氧化铝，磷酸铝，磷酸氢钙，或铍；矿物油，如石蜡油；乳液，如MF59；细菌产品，如杀死的细菌百日咳博德特氏菌或牛分枝杆菌；类毒素；非细菌有机物，如角鲨烯或硫柳汞；皂苷佐剂基质M(Isconova/Novavax)或其他ISCOM佐剂；洗涤剂，如QuilA；细胞因子，如IL-1，IL-2或IL-12；弗氏完全佐剂；和弗氏不完全佐剂；Toll样受体激动剂如CpG或单磷酰脂质A，或据报道增强诱导的免疫应答的其他佐剂，或其组合。该组合物还可包含稳定剂，包括本领域已知的热稳定剂，例如海藻糖。

进一步的应用

在广义方面，本发明涉及使用多途径疫苗接种策略产生组织局部保护性免疫。

还广泛公开了一种用于诱导高水平循环T细胞并随后将它们靶向相关组织例如肝脏的新方法。所提出的策略包括在已知位点进行初始初免(第一次)疫苗接种以诱导高水平循环的Ag特异性CD8⁺ T细胞，可以是但不限于肌内、皮下或皮内免疫。初始剂量之后进行第二或进一步的施用，以通过在需要驻留群体的位点提供疫苗抗原来靶向所选位点。这可能包括但不限于初始初免次优或细胞性T细胞定位至关重要的位点。其实例包括但不限于肺脏、肠、生殖道和皮肤的粘膜表面，以及实体瘤，内部器官例如脾脏和肝脏，以及淋巴系统。该方法可用于各种传染性和非传染性疾病的预防性和治疗性疫苗接种，例如但不限于由以下引起的疾病：疟原虫物种，乙型肝炎和丙型肝炎，CMV，EBV，流感，单纯疱疹病毒，人乳头瘤病毒，衣原体，淋球菌，结核分枝杆菌和恶性癌症和肿瘤，如前列腺癌，肺癌，结肠直肠癌，肾癌和皮肤癌。因此，该策略将被称为“初免-靶向”免疫。

还广泛公开了一种新方法，其使用在非粘膜位点的初始初免免疫来成功地扩大循环T细胞应答，然后通过进一步的静脉内或粘膜免疫将这些T细胞靶向目标组织。先前已经尝试使用粘膜特异性趋化因子进行了靶向女性生殖道，以在所谓的“初免-拉(prime-pull)”免疫中定位Ag特异性T细胞或减毒病原体。但是在该方法中，将细胞因子和/或趋化因子局部施用于粘膜以吸引T细胞。相比之下，我们使用加强剂量的疫苗将T细胞靶向目标组织，例如肝脏或粘膜表面。

因此，我们描述了一种新的异种途径的疫苗策略，旨在产生大量循环的Ag特异性T细胞，并随后将这些T细胞靶向目标组织。这种初免-靶向方法已被证明在肝脏阶段疟疾的背景下非常有效，在T细胞初免是次优的和/或需要特定位置的高频率T细胞的多种组织中，也可获得其他感染性和非感染性病理的类似结果。这种新方案在预防和治疗方面都是相关的。

在广义方面，本发明涉及针对肝脏阶段疟疾感染或肝脏阶段微生物病原体或肝癌的免疫方法，其包括肌内接种疫苗接着静脉内或皮下接种，适当地静脉内接种。

还公开了一种药物产品，其包含适于递送如本文所定义的组合物的分配装置。还公开了这种装置与本文定义的组合物的组合。适当地，公开了包含(适当地与两种这样的组合物组合的)两种这样的装置的试剂盒。

在受试者中引发保护性免疫应答的方法，其中通过两种不同途径向所述受试者施用如本文所述的两种组合物。

在受试者中诱导免疫应答的方法，其中通过两种不同途径向所述受试者施用如本文所述的两种组合物。

在受试者中诱导T_RM的方法，其中通过两种不同途径向所述受试者施用如本文所述的两种组合物。

诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一组合物和另外的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物和另外的第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+ T细胞表位，

其中通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、口服或气雾剂途径施用所述第一组合物和另外的第一组合物，和通过静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)或口服途径施用所述第二组合物，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

本发明还涉及试剂盒，其包含如上定义的第一组合物和另外的第一组合物和第二组合物。

适当地，所述第一组合物和所述另外的第一组合物的施用之间的时间为1至12周，合适地为3周。

适当地，施用所述另外的第一组合物和所述第二组合物之间的时间是第一组合物反应的峰值时间，适当地是两周。

适当地，所述第一组合物包含编码所述表位的腺病毒载体。

适当地，所述另外的第一组合物包含编码所述表位的MVA载体。

适当地，所述第二组合物包含编码所述表位的腺病毒载体。

适当地，所述第一组合物是通过肌内途径(i.m.)施用的。

适当地，所述另外的第一组合物是通过肌内途径(i.m.)施用的。

适当地，所述第二组合物是通过静脉内途径(i.v.)或皮下(s.c)途径、适当地通过静脉内途径(i.v.)施用的。

本发明可用于诱导短期保护(功效)，例如用于旅行者或军事人员。

本发明可用于提供更持久的保护，例如用于免疫疟疾流行地区的居民。

还公开了初免疫苗可以是能够诱导循环T细胞应答的任何疫苗，并且可以通过肌内或皮内或皮下或口服途径但不是通过静脉内途径施用。第二次疫苗接种通过静脉内或皮下给药，适当地静脉内给药，用于靶向肝脏，但也可以口服或以导致肝脏积累Ag的任何方式给予。第二次疫苗接种可以使用表达相同抗原的病毒载体(例如重组腺病毒或重组MVA)或颗粒载体(例如：PLGA-蛋白质NP)。疫苗接种方案可以同时或分开(例如：间隔两周)给予。颗粒制剂不限于PLGA-OVA，还可包括不同的聚合物、制剂、佐剂和蛋白质包封方法。免疫的初免位点处于高免疫原性位点，例如但不限于肌内、亚切(sub-cut)或id。初免疫苗和第二次疫苗接种通过不同途径施用。

针对传染性肝脏疾病的免疫方法，例如但不限于：疟疾，乙型肝炎和丙型肝炎，CMV(巨细胞病毒)和EBV(EB病毒)；以与上述相似的方式施用表达相关免疫原性抗原或颗粒的病毒载体构建体；针对呼吸道传染病的免疫方法，如流感，RSV(呼吸道合胞病毒)鼻病毒，结核分枝杆菌，肺炎球菌，葡萄球菌。在高免疫原性位点(例如肌内)施用表达免疫原性抗原的病毒载体构建体。Ag特异性T细胞的第二次靶向通过病毒载体或通过鼻内或气雾剂施用的颗粒施用来进行。可以设想初免-靶向免疫的类似应用在皮肤、胃肠和泌尿生殖道疾病以及使用病毒载体的淋巴器官和脾脏的背景下是相关的。初免-靶向免疫策略也可利用在病毒载体中表达或包封在颗粒中的肿瘤相关抗原作为针对实体瘤的治疗和预防策略；包括在高免疫原性位点(例如i.m.)的初免疫苗接种，并随后通过肿瘤内施用或施用于目标组织靶向对肿瘤块的免疫应答。一个例子但不限于表达前列腺相关抗原的腺病毒可以i.m.施用，随后在实体前列腺肿瘤块中接种表达相同肿瘤相关抗原的溶瘤或非溶瘤病毒载体。

我们证明，初免和靶向免疫增强了肝脏驻留的记忆CD8+ T细胞和对肝脏阶段疟疾的保护作用。

重要的是第二组合物(第二施用/靶向施用)中的表位与第一组合物(第一施用)中的表位相同，以便第二施用靶向第一施用诱导/扩增的T细胞。原则上，第一组合物的所有表位应存在于第二组合物中。换句话说，第二组合物应包含第一组合物的所有表位。然而，在一个实施方案中，可能需要在第一制剂具有一个表位(例如TRAP)，第二制剂中具有相同表位以及另外的表位(例如TRAP-LSA1)。在该实施方案中，第二组合物包含第一组合物的所有表位，并且还包含至少一个另外的表位。因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据前述权利要求中任一项的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物中的至少一个表位是不同的，其中所述至少一个不同的表位是由所述第二组合物包含的另外的表位。

·进一步的优点

·本发明的一个优点是可以在第一和第二或进一步的组合物中使用相同的载体。发明人认为本领域的观点是，相同的载体不能在短时间尺度中使用，例如本文所教导的那样。

在所附独立和从属权利要求中阐述了进一步的特定和优选方面。从属权利要求的特征可以适当地与独立权利要求的特征组合，并且可以与权利要求中明确阐述的组合之外的组合组合。

在设备特征被描述为可操作以提供功能的情况下，应当理解，这包括提供该功能的设备特征或者适于或配置为提供该功能的设备特征。

附图简要说明

现在将参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：

图1显示优选靶向肝脏的PLGA纳米颗粒的静脉内施用。(a)用PLGA-APC-OVA Np以i.v.或i.m.(参见图例)免疫接种C57BL/6小鼠(n＝3)。一周后，收获肝脏、脾脏、肺脏、肌肉和dLN，并在流式细胞仪上检测APC-OVA的存在。(b)来自施用后一周接种PLGA-罗丹明Nps的C57BL/6小鼠的肝切片的代表性免疫荧光染色，定量总Np与库普弗细胞的关联(F4.80⁺),(n＝4)。(c)实验计划：用Ad5-OVA i.m.(右肢)或i.v.25μg的PLGA-OAV(Np iv初免)初免小鼠。两周后，小鼠接受了i.v.施用25μg的PLGA-OVA(Np iv)、未包封的OVA蛋白(OVA iv)或接受i.m.施用25μg的PLGA-OVA(Np im,左肢)。三周后，收获组织用于细胞计数分析，或者，用spz攻击小鼠以确定保护作用。

图2显示了在转基因伯氏疟原虫攻击模型中保护靶向小鼠的初免和靶标方法。(A)用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.或用PLGA-OVA(25μg蛋白)(Np初免)初免C57BL/6小鼠(n＝4-6)。两周后，小鼠接受i.m.(Np im)或iv(Np iv)25μgOVA蛋白(OVA iv)、25μg PLGA-OAV，或没有接受任何后续免疫接种(Ad)。施用后三周，收获肝脏、dLN和脾脏组织并测定Ag特异性CD8⁺ T细胞的总细胞计数，其通过Pen⁺染色测定。(B)五聚体门控策略：针对活的、大小和单重群体门控淋巴细胞，并且后续针对CD8⁺ T细胞门控。显示了Pen⁺CD8⁺ T细胞的频率。(C)定量总CD8⁺细胞的Pen⁺CD8⁺ T细胞的频率。(D)用SIINFEKL肽离体刺激后总CD8⁺细胞的IFNγ⁺CD8⁺ T细胞的频率。(E)用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，两周后小鼠接受i.m.(□)或i.v.(■)PLGA-OVA(25μg蛋白)或没有接受PLGA-OVA(▲)。另一个未接种疫苗的组作为感染对照(ο)。三周后，用1000转基因OVA::Hep17伯氏疟原虫spz.攻击所有小鼠。使用薄血涂片评估寄生虫血症，并通过线性回归计算至1％寄生虫血症的时间。(E)使用OVA::Hsp70伯氏疟原虫spz进行先前描述的实验。显示中位数值。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.001(***)；p<0.005(**)；p<0.05(*)；没有统计学意义(ns)。使用对数秩Mantel-Cox检验进行存活曲线分析。p<0.001(***)。

图3显示Ag特异性CD8⁺ T细胞稳定地维持在肝脏组织中，表达组织驻留的标记物。用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，然后初免后两周接受PLGA-OVA Npi.v.(Ad+Np)。或者，用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，后续在10天后用i.m.MVA-OVA(1x10⁶pfu)接着PLGA-OVA Np i.v.的i.v.施用进行增强免疫(Ad-MVA+Np)。(A)图表表示在疫苗接种后相关时间从小鼠肝脏分离的OVA TCR⁺(Vα₂/Vβ₅)CD8⁺ T细胞的总数。x轴的起点对应于最终的病毒载体免疫，垂直的虚线表示Np注射的时间。用双向ANOVA和post-hoc Bonferroni's检验分析数据以进行组间比较，p<0.005(**)表示观察到的显著性水平。(B)在接种疫苗后第50天通过流式细胞术测定肝脏和脾脏中Pen⁺CD8⁺ T细胞的总细胞计数。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.005(**)；p<0.05(*)；没有统计学意义(ns)。(C)在各种疫苗接种策略后第50天，肝脏(灰色)和脾脏(白色)中的总Pen⁺CD8⁺ T细胞的Trm(CXCR6⁺CD69⁺Pen⁺CD8⁺)T细胞的频率。使用双向ANOVA分析数据，并使用Bonferroni's事后检验校正多重比较。p<0.001(***)。(D)在各种疫苗接种策略后第50天，肝脏中总的Pen⁺CD8⁺ T细胞的Teff(黑色,CD62L^-CD127^-)、Tem(灰色,CD62L-CD127⁺)和Tcm(白色,CD62L⁺CD127⁺)Pen⁺CD8⁺ T细胞的频率。使用双向ANOVA分析数据，并使用Bonferroni's事后检验校正多重比较。p<0.001(***)；p<0.005(**)；p<0.05(*)。(E)针对CXCR6和CD69T细胞表达以及CD127和CD62L(总Pen⁺CD8⁺ T细胞的记忆表型标记物)，门控策略比较在第50天肝脏中的Ad和Ad+Np疫苗接种方案。在象限中，显示了每个细胞群的频率。

图4显示肝脏Ag特异性CD8⁺ T细胞的表征。(A)上：用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝5)(Ad)，然后初免两周后接受或没有接受PLGA-OVA Np i.v.(Ad+Np)。最后一次疫苗接种后三周，随后i.p.注射BrdU，24小时或6小时后收获肝脏和脾脏。使用Pen⁺染色计数Ag特异性CD8⁺ T细胞，并通过流式细胞术测定BrdU⁺细胞。结果表示为总Pen⁺CD8⁺T细胞的％。显示中位数值。使用双向ANOVA分析数据，并使用Bonferroni's事后检验校正多重比较。p<0.05(*)；没有统计学意义(ns)。(B)实验示意：用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免Ly5.1⁺小鼠，然后初免后两周接受PLGA-OVA Np i.v.(Ad+Np)。随后在三周后收获脾脏和肝脏组织，负选择CD8⁺ T细胞，并分别用APC或CFSE染色。通过流式细胞术测定Pen⁺细胞的频率，并将细胞以1:1的比例重新转移至未经实验的Ly5.2宿主。然后在过继转移后一周收获受体肝脏和脾脏。(C)受体小鼠的肝脏或脾脏中的总淋巴细胞的CFSE⁺或APC⁺Pen⁺CD8⁺ T细胞的频率。显示中位数值。使用Mann–Whitney分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.05(*)。(D)显示CFSE或APC细胞的频率的肝脏:脾脏比例，或各个器官中的CFSE:APC的比例。显示中位数值。使用Mann–Whitney检验分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.005(**)。

图5显示了作为靶向剂的病毒载体在转基因伯氏疟原虫攻击模型中保护小鼠。

(A)用Ad5(1x109iu)和表达萤火虫萤光素酶的MVA(1x106pfu)病毒载体i.v.免疫接种BALB/c小鼠(n＝5)。随后在第1、3、8、15、30、50和73天获得生物发光成像。重叠图像指示不同组中生物发光信号的位置。(B)不同疫苗接种方案的感兴趣区域(ROI)总通量(p/s)的定量随时间的变化。虚线表示检测限。显示了四分位数范围的中位数。(C)如先前所述用Ad5-OVA(1x108iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝5-6)。两周后，小鼠接受Ad5-OVA i.v.(1x109iu；Ad),MVA-OVA i.v.(1x106pfu；MVA)或PLGA-OVA i.v.(1x109iu；Np iv)。三周后，收获肝脏和脾脏组织用于细胞计数分析，并测定Pen+CD8+T细胞的总细胞计数。显示中位数值。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.05(**)。(D)如先前所述用Ad5-OVA(1x108iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)。两周后，小鼠接受Ad5-OVA i.m.(1x109iu；□)、MVA-OVA i.m.(1x106pfu；▲)、Ad5-OVA i.v.(1x109iu；)或MVA-OVA i.v.(1x106pfu；▲)。未接种疫苗的组作为感染对照(ο)。在疫苗接种后3周，用1000个在Hep17启动子下表达OVA的转基因伯氏疟原虫spz攻击小鼠。(E)类似的实验设置，包括另一组已经i.v.接受PLGA-OVA的小鼠，其代替第二剂载体()。接种疫苗后8周对小鼠进行攻击，使用薄血涂片评估寄生虫血症，并通过线性回归计算至1％寄生虫血症的时间。使用对数秩Mantel-Cox检验进行存活曲线分析。p<0.001(***)；p<0.005(**)。(参见实施例)

图6显示(参见实施例)

图7显示图

图8显示图表

图9显示图表

图10显示条形图

图11显示图。dLN中Tet+CD8+ T细胞的总数。

图12显示图

图13显示条形图

图14显示图和图表

图15显示(参见实施例)

图16显示图表

图17显示照片a(上)、b(下)。图a和b中的小鼠已经接受1:10⁸iu AdHu5 iv；2:10⁹iuAdHu5 s.c.；3:5x10⁹iu AdHu5 s.c.。所有组中，在给药后1天对小鼠进行成像。

图18显示了在各种两剂量免疫方案后测量的肝脏T细胞应答的条形图，每个剂量之间的间隔为2周：从左到右，如下：1)Ad im-Ad iv；2)Ad im-Ad im；3)Ad im-Ad sc；4)Adiv-Ad iv；5)Ad sc-Ad sc。第一剂量在所有组中均为10⁸iu的Ad5-Ova；第二剂量在所有组中均为10⁹iu的Ad5-Ova。在第二剂量后3周显示C57/BL/6小鼠中肝脏细胞和脾细胞的流式细胞术和五聚体(Pent+)分析。

图19(补充图1)显示了靶向Np剂量的免疫方案时间的优化。用HAdV5-OVA(1x108iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，然后在初免的当天(W0)、初免后一周(W1)或者初免后两周(W2)接受PLGA-OVA Np i.v.,或者它们不接受颗粒(仅Ad)。在接受最终免疫后三周，收获肝脏，并用SIINFEKL肽离体刺激后使用Pen+染色和细胞内IFNγ染色计数Ag特异性CD8+ T细胞。结果表示为细胞总数(A、B)。还使用针对TCR vα2/β5的OVA肽特异性可变链产生的抗体对肝脏中的抗原特异性CD4+ T细胞进行染色，显示为总数(C)。显示的线代表每组的中值，使用Dunn's事后检验，使用针对多重比较校正的单向ANOVA进行分析。p<0.05(*)；p<0.005(**)；没有统计学意义(ns)。

图20(补充图2)显示肝脏T细胞募集依赖于施用的PLGA-OVA剂量。用HAdV5-OVA(1x108iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝4-5)，并且两周后在有或者没有含Np的佐剂(adj)的情况下给予10μg(10μg)或者25μg(25μg)PLGA-OVA Np i.v.。三周后收获肝脏(A、B)和脾脏(C、D)。使用SIINFEKL特异性Pen+评估抗原特异性CD8+ T细胞，结果表示为每个器官的CD8+T细胞总数(A、C)或总CD8+ T细胞的百分比(B、D)。对于每个组，用线显示中位数。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.005(**)；p<0.05(*)；没有统计学意义(ns)。

图21(补充图3)显示肝脏T细胞募集依赖于施用的HAdV5剂量。用HAdV5-OVA i.m.以不同剂量1x104iu、1x10⁶iu和1x10⁸iu初免C57BL/6小鼠(n＝6)。两周后，将PLGA-OVA Npi.v.(25μg)给予所有组。三周后收获肝脏(A、B)和脾脏(C、D)。使用SIINFEKL特异性Pen+评估抗原特异性CD8+ T细胞，结果表示为每个器官的CD8+ T细胞总数(A、C)或总CD8+ T细胞的百分比(B、D)。对于每个组，用线显示中位数。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.005(**)；p<0.05(*)；没有统计学意义(ns)。

图22(补充图4)显示了在转基因伯氏疟原虫攻击模型中仅使用相关抗原保护小鼠的初免和靶标方法。用HAdV5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，两周后小鼠接受i.v.PLGA-OVA(·)或PLGA-BSA(□)(25μg蛋白)。另一个未接种疫苗的组作为感染对照(ο)。三周后，用在Hep17启动子控制下表达OVA的1000转基因伯氏疟原虫spz攻击所有小鼠。使用薄血涂片评估寄生虫血症，并通过线性回归计算至1％寄生虫血症的时间。使用对数秩Mantel-Cox检验进行存活曲线分析。p<0.001(***)。

图23(补充图5)显示了使用病毒载体作为靶向剂的初免和靶向方法。(A-B)如先前所述用Ad5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝5-6)。两周后，小鼠接受Ad5-OVA i.v.(1x10⁹iu；Ad),MVA-OVA i.v.(1x10⁶pfu；MVA)或PLGA-OVA i.v.(1x10⁹iu；Np iv)。三周后，收获肝脏和脾脏组织进行流式细胞术分析，并测定Pen⁺CD8⁺ T细胞、IFNγ⁺CD8⁺和(B)CXCR6⁺CD69⁺Pen+CD8T细胞的频率。显示中位数值。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.05(**)。(C)用Ad5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，两周后小鼠接受Ad5-OVA(■)或MVA-OVA(▲)i.v.。作为对照，小鼠接受Ad-METRAP(AdHu5)(□)或MVA-METRAP(▲)或者初免并在后来接受Ad-METRAP(AdHu5)()的iv免疫接种。另一个未接种疫苗的组作为感染对照(ο)。三周后，用在Hep17启动子控制下表达OVA的1000转基因伯氏疟原虫spz攻击所有小鼠。使用薄血涂片评估寄生虫血症，并通过线性回归计算至1％寄生虫血症的时间。使用对数秩Mantel-Cox检验进行存活曲线分析。p<0.001(***)。(D)类似地，用Ad5-OVA(1x10⁸iu)i.m.初免C57BL/6小鼠(n＝6)，两周后小鼠接受不同剂量的Ad5-OVA：1x10⁴iu(▲)、1x10⁶iu(■)或1x10⁸iu(·)。三周后，用在Hep17启动子控制下表达OVA的1000转基因伯氏疟原虫spz攻击所有小鼠，并且如上所述评估寄生虫血症。

图24(补充图6)显示了使用病毒载体的初免和靶方法在肝脏中产生大量HBsAgCD8⁺ T细胞。用Ad5-HBsAg(1x10⁸iu)im或者用经i.v.途径施用的10,000辐照的spz(iSpz)初免Balb/c小鼠(n＝5)。两周后，小鼠接受Ad5-HBsAgi.m.或i.v.或者备选地MVA-HBsAg i.m.或i.v.。三周后，收获肝脏或脾脏组织进行流式细胞术分析，并在离体IPQSLDSWWTSL肽刺激后测定总IFNγ⁺CD8⁺ T细胞计数或IFNγ⁺CD8⁺ T细胞的频率。显示中位数值。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.005(**)；p<0.05(*)。

图25(补充图7)显示了使用病毒载体的初免和靶方法在肝脏和脾脏中产生比辐照子孢子更多的Ag特异性CD8⁺ T细胞。用Ad5-OVA(1x10⁸iu)im或者用经i.v.途径施用的10,000辐照的spz(iSpz)初免C57BL/6小鼠(n＝6)。两周后，小鼠接受Ad5-OVA i.v.(iSpz Ad或Ad Ad)。或者，小鼠接受10,000辐照的spz(iSpz)作为第二剂量(iSpz iSpz或Ad iSpz)。三周后，收获肝脏和脾脏组织用于流式细胞术分析，并测定离体SIINFEKL刺激后Pen⁺CD8⁺ T细胞的总细胞计数和IFNg+产量。显示中位数值。使用单向ANOVA分析数据，并使用Dunn's事后检验校正多重比较。p<0.0001(****)；p<0.001(***)；p<0.05(*)。

·图26显示图表。

·图27显示了具有Oxford ChAd载体ChAdOx1和我们的临床抗原LS2的初免-靶向数据。

实施例

尽管这里已经参考附图详细公开了本发明的示例性实施方案，但是应该理解，本发明不限于所述精确的实施方案，并且本领域技术人员可以在其中实现各种改变和修改，而不脱离由所附权利要求及其等同物限定的本发明的范围。

实施例1

在接种疫苗小鼠的T细胞分布的研究中，发明人发现，存在于免疫小鼠肝脏中的相对新描述的CD8+驻留记忆T细胞群的水平与针对子孢子攻击的保护非常相关。可以定义CD8+ T细胞的阈值水平，其与完全保护相关。肝脏中如此大量的驻留记忆T细胞可以通过利用病毒载体(或加载抗原的PLGA纳米颗粒)的静脉内施用的特定疫苗接种方法诱导。该疫苗接种方案包括通过标准肌内途径给予初始剂量的腺病毒，然后是静脉内加强给药。重组腺病毒或重组MVA载体的静脉内加强给药显示导致肝脏中的抗原表达延长，表明需要肝脏疟疾抗原表达以将抗原特异性循环CD8+ T细胞归巢或“靶向”至肝脏。

用编码卵清蛋白的载体然后用表达卵清蛋白的转基因伯氏疟原虫子孢子攻击，初次证明这种“初免-靶向”免疫方案诱导80％无菌保护。

静脉内加强的最佳时间点为2周，其高水平保护持续数月。

因此，本发明涉及易于制造的亚单位疫苗，其可在人体中提供两个给药的高水平功效。

ME-TRAP ChAd和MVA载体已经在英国和非洲的临床试验中进行了广泛测试——但是从未使用如本发明中的异种的第二施用或进一步的施用(例如静脉内加强给药)。

我们期望这种方法是安全的，因为已经在人类中安全地测试了静脉内更高剂量的重组腺病毒和牛痘载体的治疗应用。

本发明为人类具有高水平功效的第一疟疾疫苗提供了异常好的前景。

使用可用的ChAd和MVA疟疾肝脏阶段载体例如ChAdOx1，在Iia阶段子孢子攻击试验设计中，评估这种针对疟疾的初免-靶向疫苗接种方法的安全性、免疫原性和功效将，其中我们有相当多的经验。首先在小鼠中进行毒理学研究，然后对静脉内剂量的ChAd和MVA载体进行初始I期安全性测试(参见下文，第1和2组)。接下来是不同的疫苗接种方案，测试在肌内ChAd初免后使用静脉内或皮下(最适当地为静脉内)加强给药ChAd或MVA第3和第4组)；在完全异种的ChAd-MVA方案(第5组)或无初免剂量(第6组)后静脉内或皮下(最适当地为静脉内)给予ChAd。

该试验允许对这种非常令人兴奋的人类疟疾疫苗接种方法进行快速临床评估。

重要的是，相同的初免-靶向方法适用于其他疫苗接种目标，如乙型肝炎和丙型肝炎免疫接种。

临床试验组

在第3-6组中的ChAd剂量：5x 10¹⁰vp；在第6组中的MVA剂量：2x 10⁸pfu。

CHMI:受控的人类疟疾感染(5次传染性蚊虫叮咬)

·临床试验简介：

·分组是

·DNA(im)-MVA(iv)

·AdHu5(im)-MVA(iv)

·MVA(im)-MVA(iv)

·无初免-MVA(iv)

·全部测试了抗疟疾攻击的功效。

·第1组：第0周肌内50ug DNA-TIP，在第2周iv施用10^6pfu MVA-TIP，在第5周1000伯氏疟原虫子孢子攻击

·第2组：第0周肌内10^8iu AdHu5-TIP，在第2周iv施用10^6pfu MVA-TIP，在第5周1000伯氏疟原虫子孢子攻击

·第3组：第0周肌内注射10^6pfu MVA-TIP，在第2周iv施用10^6pfu MVA-TIP，在第5周1000伯氏疟原虫子孢子攻击

·第4组：在第2周iv施用10^6pfu MVA-TIP，在第5周1000伯氏疟原虫子孢子攻击

·第5组：在第5周1000伯氏疟原虫子孢子攻击(传染对照)

·将用50ug的DNA-TIP、10^8iu AdHu5-TIP或10^6pfu MVA-TIP均肌内施用于BALB/c小鼠，而有一组将不接受初免接种。两周后，所有小鼠将接受用10^6pfu MVA-TIP静脉内施用的靶向疫苗接种，并且3周后接着用1000伯氏疟原虫子孢子攻击，其中监测所有小鼠的血液阶段疟疾的发展。一组未接种疫苗的小鼠将作为疟疾感染对照。TIP是包含来自称为Pb9的伯氏疟原虫环子孢子蛋白的免疫显性肽的表位串。在攻击之前，在用Pb9肽离体刺激细胞后，通过细胞内细胞因子染色在小鼠血液中测量对Pb9表位的免疫应答。

实施例2：肝脏阶段疟疾模型

为了示例初免-靶向方法，使用了伯氏疟原虫肝期疟疾模型。在该模型中，已知保护需要肝脏中高水平的CD8⁺ T淋巴细胞杀死感染的肝细胞(Reyes-Sandoval,A.,et al.,CD8+ T effector memory cells protect against liver-stage malaria.Journal ofimmunology,2011.187(3):p.1347-57)。

使用小鼠疟疾模型证明了初免-靶向方法。伯氏疟原虫是恶性疟原虫感染的肝脏阶段的常见动物模型，具有非常独特的具有初始的红细胞前期的生命周期。重要的是，肝脏阶段疟疾是无症状的，持续时间短(在伯氏疟原虫的情形下只有两天)，并且由于寄生虫的Ag螯合、寄生虫液泡膜(PV)的建立以及少量感染的肝细胞而Ag呈递有限。

可能由于肝脏作为器官的大尺寸和缺乏显著的危险信号，在子孢子(spz)感染时需要异常大量的巡逻效应CD8⁺ T细胞，以识别和杀死(直接或间接)感染的肝细胞。在肝脏阶段疟疾的情形下，保护性肝脏驻留记忆CD8⁺ T细胞被描述为表达CXCR6、CD69和CD103(Tse,S.W.,et al.,Unique transcriptional profile of liver-resident memory CD8+T cells induced by immunization with malaria sporozoites.Genes and immunity,2013.14(5):p.302-9)。最后，值得注意的是，除了对循环CD8⁺ T细胞的这种异乎寻常的高要求之外，由于已知肝脏环境中的CD8⁺ T细胞引发不是最理想的通常会产生功能失调或耗尽的免疫应答的事实，而使肝脏阶段疟疾进一步复杂化。由于这些原因，使用传统疫苗接种策略保护肝脏阶段疟疾尤其具有挑战性。然而，肝脏中非常高水平的CD8⁺ T细胞已被证明具有保护作用，因此使伯氏疟原虫成为初免-靶向接种疫苗方法的合适候选者。

这里描述的策略由两部分组成：第一(初免)给药，由i.m.给予Ad载体组成，已知产生大量循环T细胞，然后是第二(靶向)给药，静脉内(i.v.)给予以靶向CD8⁺ T细胞到肝脏。使用加载聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-蛋白质的纳米颗粒(NP)或使用表达目标抗原的病毒载体实现靶向肝脏。通过产生驻留在肝脏中的长寿抗原特异性CD8⁺ T细胞，这种新的疫苗接种方法在临床相关的疟疾疫苗开发中提供了大幅进展，相对于目前的异种病毒载体初免-加强疫苗策略，大大提高了功效。

最后，这种方法不仅限于疟疾可以应用于各种传染性和非传染性疾病，包括治疗性应用。为此，使用乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作为抗原，评估和验证了该系统。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的肝脏慢性感染，其并发症包括肝硬化和肝癌。在这项研究中，初免-靶向方法能够在肝脏中诱导一定水平的抗原特异性T细胞，这与之前的伯氏疟原虫模型中观察到的相当。

总之，这些实验表明，可以利用其他抗原(来自感染性病原体或肿瘤相关的)以及靶向其他位点，从而扩大可应用初免-靶向策略的疾病谱。总之，这扩展了异种的初免-加强免疫策略，以包括将T细胞免疫应答定位于目标组织。

载体和纳米粒子设计：

对于该专利，使用在人腺病毒5(HAd5)载体中表达的模型抗原OVA。此外，除了表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的HAd5之外，还使用了表达以下疟疾抗原的黑猩猩腺病毒ChAdOx1：PfLSA1和PfLSAP2。除非另有说明，否则所有抗原在长CMV启动子下用前导tPA序列表达，并插入E1/E3缺失构建体的E1基因座(使病毒不具有复制能力)。接种疫苗的剂量基于感染单位(iu)。

还使用表达相似抗原的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)病毒载体。简而言之，使用表达模型抗原OVA和tdTomato的MVA，以及表达ME-TRAP、PfLSA1、PfTRAP和HBsAg的MVA载体。

使用油包水包油型双重乳液制备聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-蛋白质NP。简言之，将蛋白质、特别是OVA悬浮于水中，然后使用超声处理将其用PLGA(Resomer，RG 502H)在二氯甲烷中乳化。然后将该初级乳液加入到较大体积的1％PVA中并超声处理以获得纳米液滴。通过在减压下快速除去溶剂使颗粒沉淀。使用动态光散射测定粒径为300-400nm。确定蛋白质加载效率为起始蛋白质的20-30％。

免疫原性和疫苗接种

对至少6周龄的雌性C57BL/6J、BALB/c或CD-1(ICR)给予1x10⁸iu腺病毒i.m.免疫接种进入胫骨肌(50μl体积，用PBS稀释)。两周后通过静脉内施用给予第二次“靶向”疫苗接种(100μl体积，在PBS中稀释)。除非另有说明，否则在最后一次接种后三周收获组织。

简而言之，用ACK处理小鼠脾细胞，然后用1μg/ml CD8⁺免疫显性表位SIINFEKL和/或CD4⁺表位ISQAVHAAHAEINEAGR和1μg/ml Golgi-Plug(BD)在37℃刺激6小时。类似地，通过机械破坏组织提取肝脏淋巴细胞，然后在33％等渗Percoll梯度上进行细胞分离，并进行ACK处理。然后如上所述刺激细胞。刺激后，在4℃在黑暗中用各种不同的表面标记物(活/死、CD4、CD8、CXCR6、抗SIINFEKL四聚体(Tet⁺)、CD69和CD103)标记淋巴细胞。用含有4％甲醛的中性缓冲福尔马林溶液固定细胞，然后针对稀释到Perm-Wash缓冲液中的细胞内标记物(IFNγ)进行染色。然后在BD CantorLSRII流式细胞仪上获得样品，并通过基于活/死门控的门控细胞鉴定抗原特异性细胞，随后是大小、单峰和CD4⁺和CD8⁺的表达。然后测定Tet⁺或IFNγ⁺细胞，并使用FlowJo(Treestar)和Prism v6.0(Graphpad)分析数据。

静脉内子孢子伯氏疟原虫攻击

在饲喂后第21天解剖感染了伯氏疟原虫的A.stephensi蚊子并从唾液腺分离子孢子。除非另有说明，否则最后一次接种后三周通过i.v.尾静脉注射给予1000spz。从感染后第3天开始每天获得薄血膜，并用Giemsa染色血液阶段寄生虫的存在。监测小鼠的阳性血膜并在1％的人终点处死或维持15天，并且如果没有寄生虫则认为是无菌保护的。使用基于三个连续血膜的线性回归模型计算到1％寄生虫血症的时间。

在该工作中，使用以下先前描述的转基因伯氏疟原虫spz:OVA::Hep17_hep17、OVA::mCherry_hsp70、PfLSA1@UIS4和PfTRAP@UIS4(Lin,J.W.,et al.,The subcellular locationof ovalbumin in Plasmodium berghei blood stages influences the magnitude ofT-cell responses.Infection and immunity,2014.82(11):p.4654-65；Longley,R.J.,etal.,Comparative assessment of vaccine vectors encoding ten malaria antigensidentifies two protective liver-stage candidates.Scientific reports,2015.5:p.11820)。

实施例3：在初免-靶向方案中静脉内施用PLGA-OVA增加肝脏Ag特异性CD8⁺ T细胞应答

为了在肌内初免后靶向Ag特异性CD8⁺ T细胞对肝脏的应答，首先研究了PLGA NP作为靶向剂，因为它们之前已被描述为易于保留在肝脏中。制备PLGA-APC-OVA NP并随后i.v.施用，施用后7天测定其生物分布。使用流式细胞术分析荧光信号，测定i.v.注射后大多数PLGA-APC-OVA在一周后位于肝脏中(图7)。确定PLGA NP主要递送至肝脏后，用HAd5-OVA(1x10⁸iu)在右肢中i.m.初免C57BL/6小鼠。两周后，在Ad免疫应答的高峰期，小鼠通过尾静脉接种疫苗，i.v.施用25μg的PLGA-OVA、仅25μg OVA蛋白，或者根本不接种疫苗。包括对照组小鼠，其经i.m.疫苗接种在左肢中接受25μg的PLGA-OVA。此外，还包括另一个对照组，其仅接受i.v.免疫接种。在最后一次接种后三周，获得肝脏、脾脏和引流性腘淋巴结(dLN)并进行流式细胞术。在i.v.PLGA-OVA施用后在肝脏中观察到四聚体结合(Tet⁺)Ag特异性CD8 T细胞的增加10倍，而在其它组(图8A-C)或如脾脏的全身组织(图9A-C)中均没有增加。使用CD69⁺和CXCR6⁺作为肝驻留的标记物，显示Tet⁺ T细胞表达肝归巢的标记物(图10)。最后，在PLGA-OVA i.m.施用后的dLN中可以观察到类似的增加，这强调了初免-靶向方法可用于将Ag特异性细胞靶向各种组织(图11A-B)。

实施例4：靶向的Ag特异性T细胞在两种表达伯氏疟原虫的转基因OVA的攻击模型中是保护性的

当i.v.施用PLGA-OVA NP后显示肝脏定位存在的Ag特异性CD8⁺ T细胞增加10倍(图8C)。使用伯氏疟原虫转基因spz攻击模型确定该策略赋予的保护水平，其中最后一次疫苗接种后三周i.v.注射1000spz。转基因伯氏疟原虫系OVA::Hep17_hep17表达与之前表明诱导特别强的T细胞应答的PVM膜上的EXP₁/HEP₁₇(输出蛋白1，肝细胞红细胞蛋白17kDa)融合的模型抗原OVA[18]。用HAd5-OVA i.m.初免小鼠，两周后通过i.v.、i.m.施用或作为对照不施用PLGA-OVA NP。PLGA-OVA NP i.v.的施用得到小鼠的100％的无菌保护(图12A)。相比之下，与未经实验组(group)相比，其他接种组仅显示到1％寄生虫血症的少量时间延迟，未观察到无菌保护(图12A)。为了进一步测试该疫苗方案，用OVA::mCherry_hsp70伯氏疟原虫OVA转基因spz系(其在热休克蛋白70(HSP₇₀)的强启动子下在寄生虫细胞质中表达OVA)攻击小鼠(Lin,J.W.,et al.,The subcellular location of ovalbumin in Plasmodiumberghei blood stages influences the magnitude of T-cell responses.Infectionand immunity,2014.82(11):p.4654-65)。由于OVA的细胞内定位，该寄生虫诱导较低水平的T细胞应答。同样，即使在这种更严格的模型中，仅iv施用的PLGA-OVA NP作为靶向给药也能够无菌保护受攻击的小鼠(图12B)。总之，这些数据表明，针对肝脏的初免-靶向策略可以导致保护免受伯氏疟原虫肝脏阶段疟疾挑战。

实施例5：静脉内施用病毒载体

在成功地用PLGA NP靶向Ag特异性CD8⁺ T细胞对肝脏的应答之后，研究了使用病毒载体作为替代靶向工具。用HAd5-OVA(1x10⁸iu)在右肢i.m.初免C57BL/6小鼠。两周后，用HAd5-OVA(1x10⁹iu)或MVA-OVA(1x10⁶pfu)经尾静脉i.v.注射接种小鼠。最后一次接种后三周，获得肝脏和脾脏；并且进行流式细胞术以确定Ag特异性T细胞的数量。令人惊讶的是，与PLGA-OVA类似，Ad和MVA病毒载体均能够在i.v.施用后显著增加肝脏中Tet⁺Ag特异性CD8 T细胞的数量(图13)。

实施例6：静脉内施用病毒载体在伯氏疟原虫转基因OVA攻击模型中是保护性的

在初免后两周i.v.施用Ad或MVA毒载体，与PLGA-OVA NP类似显示出高水平的Ag特异性肝脏驻留CD8⁺ T细胞，使用伯氏疟原虫攻击模型OVA::Hep17_hep17评估了这些病毒载体的保护能力。用HAd5-OVA i.m.初免所有小鼠，两周后作为对照经经i.v.或i.m.途径施用表达OVA的第二次靶向病毒载体。任一载体的i.m施用仅导致至1％寄生虫血症延迟1.5天，未观察到无菌保护。所有小鼠都患上了疟疾。但是，Ad或MVA病毒载体的i.v.施用诱导83.3％的动物的无菌保护，其中使用i.v.Ad和i.v.MVA之间没有显著差异(图14A)。因此，与使用非静脉内途径相比，使用病毒载体进行T细胞靶向可大大提高整体疫苗效力。

为了确定保护是否随时间减弱，建立了类似的实验，比较T细胞肝靶向与Ad、MVA或PLGA-OVA NP方案。然后，最终i.v.接种后两个月用伯氏疟原虫OVA::Hep17_hep17攻击小鼠。所有三种靶向策略在接种疫苗后两个月保持保护水平，其中PLGA-OVA NP达到100％无菌保护，两种病毒载体均保持83％无菌保护(图14B)。肝Ag特异性CD8⁺ T细胞的寿命在动力学研究中得到进一步证实，其中在PLGA-OVA NP施用后Ag特异性CD8⁺ T细胞维持在稳定水平(图14C)，在最后一次疫苗接种后第50天的最终时间点发现与先前实验处于相同的范围内(图14D)。

实施例8：使用HBsAg作为模型用其他疾病模型验证系统

由于初免-靶向策略成功地在肝脏中产生高水平的Ag特异性CD8⁺ T细胞，因此使用HBsAg作为模型抗原进一步测试该系统。跟之前一样，用HAd5-HBsAg(1x10⁸iu)i.m.初免BALB/c小鼠，两周后给予用HAd5(1x10⁸iu)病毒载体或MVA(1x10⁶pfu)的靶向i.v.免疫。如先前所见，初免-靶向方法显著增加肝脏中Ag特异性CD8⁺ T细胞的存在(图16A-B)，用非疟疾抗原验证了该模型。该发现表明针对肝炎病毒抗原的T细胞可以靶向肝脏，从而提供改善肝炎病毒感染的预防和特别是免疫疗法的机会。

在该方案的背景下，肌内疫苗接种仅仅是诱导循环T细胞的机制。因此，在存在由微生物病原体或癌细胞诱导的循环T细胞应答的情况下，很可能使用加强免疫靶向免疫。通过施用PLGA颗粒或病毒载体，可以将这些循环T细胞靶向肝脏或选定的粘膜表面，就像通过免疫诱导循环T细胞一样。

实施例9：在肝脏中诱导T_RM

我们在此描述了必须专门开发一种新型疫苗接种策略，以便在感染时诱导肝脏中存在高水平的长寿命组织驻留(T_RM)T细胞，从而可能绕过对大量循环T细胞的需要[17]。当存在时，T_RM已被证明通过调节先天免疫系统和适应性免疫系统来加速对再感染的保护[18,19]。在肝脏阶段性疟疾的背景下，已经描述了肝脏T_RM需要CXCR6进行维持，并且已经提出它们在组织中的持久性与完全寄生虫免疫后的疟疾保护相关联[20-22]。

我们描述了旨在诱导高水平的循环T细胞并随后增加表达驻留标记物的肝脏CD8⁺T细胞的新的疫苗接种策略。这种初免和靶向方法需要两种免疫：初免给药，由i.m.给予Ad载体组成，已知产生大量循环T细胞，然后是二次疫苗接种，静脉内(i.v.)给予以靶向CD8⁺T细胞到肝脏。使用聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-加载蛋白质的纳米颗粒(NP)或使用表达目标抗原的病毒载体实现靶向CD8⁺ T细胞至肝脏。通过产生驻留在肝脏中的长寿命Ag特异性CD8⁺ T细胞，该新的疫苗接种方法在临床相关疟疾疫苗接种策略所观察到的功效方面具有显著进步。

结果

用静脉内施用PLGA-OVA Np的初免和靶向方案增加导致无菌保护的肝Ag特异性CD8⁺ T细胞应答

颗粒物被描述为保留在肝脏中，这一过程主要依赖于Np大小[23]。因此，研究了载有蛋白质的PLGA Np作为将Ag特异性CD8+ T细胞靶向肝脏的药剂。产生的PLGA-APC-OVA Np的大小约为350-400nm(补充表1)，并且在i.v.或i.m.施用后7天，通过流式细胞术和免疫荧光测定它们的生物分布。尾静脉i.v.注射后，发现与脾脏或肺组织相比PLGA-APC-OVA Np主要集中在肝脏中(图1a)，主要被库普弗细胞吞噬和内化(图1b，补充视频1)。这被发现是依赖于i.m.施用途径，导致它们定位于近端肌肉或引流淋巴结(dLN)。

产生的PLGA-APC-OVA Np的大小约为350-400nm。通过精确称量冻干产物并用0.1MNaOH和1％SDS水解聚合物来计算平均蛋白质负载量。使用BCA测定法定量释放的蛋白质，显示Np的平均加载量。使用zetasizer使用动态光散射测量PLGA Np的大小。(n＝15个批次的PLGA Np)。

使用Zeiter-sizer测量平均粒径。(n＝15):

i.v.或i.m.施用后7天，通过流式细胞术和组织学测定它们的生物分布。尾静脉i.v.注射后，发现与脾脏或肺组织相比PLGA-APC-OVA Np主要集中在肝脏中(图1A)，主要被库普弗细胞吞噬(图1B)。这被发现是依赖于途径，i.m.施用导致它们定位于近端肌肉或引流淋巴结(dLN)。

在证实了i.v.施用Np导致肝脏定位之后，研究了它们将循环的Ag特异性效应CD8⁺T细胞靶向至器官的能力。用表达卵清蛋白的人腺病毒5(Ad5-OVA)在右肢i.m.初免C57BL/6小鼠。两周后大约是Ad5免疫应答(先前测定的[24])的峰值，小鼠接受i.v.施用的PLGA-OVANp或未包封的OVA蛋白(图1C)。另一组小鼠接受i.m.(左肢)施用的Np。靶向后三周，从肝脏、脾脏和腘dLN提取的细胞通过流式细胞术进行分析(图2A)。在i.v.PLGA-OVA施用后在肝脏中观察到SIINFEKL-五聚体(Pen⁺)Ag特异性CD8⁺ T细胞的频率和总数增加10倍，在该时间点在任何其它接种疫苗组中没有观察到任何增加(图2B、C)。与Pen⁺染色一致的是，相比于所有其它组，在PLGA-OVA Np接种的小鼠中在离体SIINFEKL肽刺激之后观察到肝脏IFNγ⁺CD8⁺T细胞更高的百分比(图2D)。在PLGA-OVA i.m.施用后的dLN中也能够观察到Pen⁺ CD8⁺ T细胞总数的类似增加，这表示局部靶向(图2A)。重要的是，Np施用没有全身性加强循环CD8⁺ T细胞数，因为所有的组在循环脾脏Ag特异性CD8⁺ T细胞方面均没有观察到差异(图2A)。优化了Np施用的时机，其中在i.m.初免后两周观察到最高的Ag特异性T细胞募集，并且观察到应答的幅度是剂量依赖性的(补充图1、2)。含有MPLA和R837的佐剂PLGA Np，显示增加T细胞应答[25],对增加肝脏Ag特异性CD8⁺ T细胞仅有轻微影响，这种趋势仅在较低抗原剂量下观察到。根据文献，在肝脏中引发的Ag特异性CD8⁺ T细胞显示出更高频率的耗尽的标记物PD-1的表达(补充图3)。

使用伯氏疟原虫转基因spz攻击模型确定该策略赋予的保护水平，其中最后一次疫苗接种后三周i.v.注射1000spz。转基因寄生虫系OVA::Hep17_hep17表达与寄生泡液膜(PVM)中的EXP₁/HEP₁₇(输出蛋白1，肝细胞红细胞蛋白17kDa)融合的模型抗原OVA[25]。与没有无菌保护相反，Np i.v.的施用导致小鼠中100％无菌保护，并且在所有其他组中仅观察到1％寄生虫血症的小的非显著时间延迟。在更严格的模型中，用OVA::mCherryhs_p70伯氏疟原虫转基因spz(其在热休克蛋白70(HSP₇₀)的强启动子下在寄生虫细胞质中表达OVA)攻击小鼠[25]。由于OVA的细胞内定位，此寄生虫先前已显示诱导较低水平的T细胞应答。再次，只有i.v.施用Np能够100％无菌保护受攻击的小鼠(图2F)。重要的是，给予无关的包封蛋白(PLGA-BSA Np)作为靶向剂量不会给予任何保护(补充图3)；这表明该免疫方案赋予的对肝脏-阶段疟疾的保护是抗原特异性的。

靶向肝脏的Ag特异性CD8⁺ T细胞表达组织驻留的标记物并且不是瞬时群体

为了确定肝脏中Ag特异性CD8⁺ T细胞的寿命，用标准的初免和靶向方案接种小鼠，并在许多不同的时间点获得从组织分离的淋巴细胞，并通过流式细胞术分析。通过用抗OVA TCR抗体(TCR Vα₂/Vβ₅)染色来确定肝脏中Ag特异性CD8⁺ T细胞的数量(图3A，上图)[26]。或者，用异种的病毒载体初免-加强方案(Ad-MVA)接种的小鼠接受i.v.Np的靶向疫苗接种，以确定通过已知诱导比仅用Ad疫苗接种更多数量的CD8⁺ T细胞的初始方案，肝脏中Ag特异性CD8⁺ T细胞的数量是否可以进一步增加。对于这种疫苗接种方案，在MVA应答的峰值[27],i.v.施用Np(图3A，下图)。两种疫苗接种方案均诱导相对稳定的肝脏Ag特异性CD8⁺T细胞群，其中Pen⁺CD8⁺ T细胞总数增加7-9倍直至疫苗接种后至少50天。显示通过i.v.Np靶向疫苗接种诱导的Ag特异性CD8⁺ T细胞数量的增加是肝脏特异性的，因为在相同时间点脾脏中没有观察到差异(图3B)。

肝脏Ag特异性CD8⁺ T细胞的进一步表型表征显示，Np施用显著诱导表达肝脏组织驻留和组织维持的常见标记物CXCR6和CD69的Ag特异性细胞的更高频率(图3C，E)[17]。此外，用于分化为T效应物(T_EFF)、T效应记忆细胞(T_EM)和T-中枢记忆细胞(T_CM)群体的CD62L和CD127染色显示，大部分肝脏Ag特异性细胞具有下调的CD127表达(图3D，E)，该表型先前描述与T_RM细胞相关[28]。发现通过腹膜内BrdU施用评估的Ag特异性CD8⁺ T细胞的增殖略高于对照小鼠，尽管没有统计学意义(图4A)。为了确定肝脏T_RM是否能够在没有抗原的情况下回到其居留组织，在初免和靶向疫苗接种后从Ly5.2⁺动物收获脾脏和肝脏组织，富集细胞制剂的CD8⁺ T细胞，然后用APC(用于脾脏)或CFSE(用于肝脏)标记细胞内染料。将来自肝脏或脾脏的Pen⁺CD8⁺ T细胞以1:1的比例混合并注射到未经实验的受体宿主中(在L5.1⁺背景上)，七天后收获脾脏和肝脏(图4B)。虽然以1:1的比例注射，但在肝脏中，与脾脏来源的细胞相比，观察到更高频率的肝脏来源的CD8⁺ T细胞，相反，在脾脏中，与肝脏来源的CD8⁺ T细胞相比，观察到更高频率的脾脏来源的CD8⁺ T细胞(图4C)。当比较已经重新定位回任一器官的肝脏来源或脾脏来源的细胞的频率时，肝脏来源的T细胞显示优先回归肝脏，导致肝脏中肝脏来源细胞的比例高于脾脏(图4D右图)，肝脏中的细胞比例较高的是肝脏来源的(图4D左图)。相比之下，脾脏来源的细胞不优选归巢，因为在两个器官之间存在相等的细胞分布(图4D)。总之，数据表明，就其表型(CD69⁺CXCR6⁺CD127-)和再注射时优先定位肝脏中而言，初免-靶向疫苗接种方案诱导高频率的肝脏T_RM细胞。

病毒载体静脉内给药可用作替代靶向方法

已经确定高肝脏抗原递送显著增强了表达驻留标记物的CD8⁺ T细胞的频率，评估了临床测试的腺病毒和MVA载体作为肝脏抗原递送方法的能力。已知这些非复制型病毒载体可稳定表达蛋白质，每种载体均显示出独特的动力学特征[29]。重要的是，在i.m.和i.v.施用途径之后，它们在人体中都表现出良好的安全性[29-31]。在小鼠中通过i.v.施用含有荧光素酶(Luc)盒的人Ad5和MVA病毒载体，随时间进行生物发光成像(图5A)。对感兴趣区域(ROI)光子通量强度的定量显示，人和猿Ad病毒载体均为高度肝脏向性，具有强而稳定的荧光素酶表达(图5B)。MVA还在i.v.施用后很快显示出一些具有低荧光素酶表达的肝脏向性，随着时间的推移短暂地驻留在脾脏。

研究了i.m.Ad5初免接着Ad5或MVA i.v.靶向施用的免疫原性。靶向i.v.注射Ad5和MVA均能够在肝脏中产生大量的Ag特异性CD8⁺ T细胞，与通过Np i.v.在肝脏中获得的相当。Ag特异性细胞的增加不限于肝脏，因为在脾脏中观察到更高数量的Ag特异性CD8⁺ T细胞(图5C，补充图5A)。相应地，观察到高频率的IFNγ⁺CD8⁺ T细胞，以及组织驻留的标记物(补充图5A、B)。更重要的是，这些载体增强Ag特异性细胞到肝脏的能力并不局限于模型抗原，因为可以类似的方式使用Ad和MVA病毒载体在肝脏中诱导大量的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)CD8⁺ T细胞(补充图6)。

为了确定是否i.v.施用病毒载体导致增强的保护作用，在最终疫苗接种后三周用OVA::Hep17_hep17伯氏疟原虫spz攻击初免-靶向接种的小鼠(图5D)。通过i.m.途径施用Ad5或MVA产生了至1％寄生虫血症的时间延迟，i.v.施用病毒载体均显著增强保护，导致80％的无菌功效。发现保护是剂量依赖性的，更高的靶向剂量导致至1％寄生虫血症的时间延迟增加和更高的无菌保护(补充图5D)。由初免-靶向方案介导的功效显示为抗原特异性的，因为用表达不同抗原的相同方案接种不会产生任何程度的无菌功效(补充图5C)。至关重要的是，保护水平并未随着时间的推移而显著下降。在最后一次接种后8周，用Ad5、MVA或Np攻击了用初免和靶向方法接种的小鼠(图5E)。用Np i.v.靶向接种疫苗在所有动物中赋予无菌保护，而两种病毒载体均表现出80％的无菌保护，未受保护的动物在至1％寄生虫血症的时间方面具有显著的延迟。相比之下，i.m施用Ad5或MVA病毒载体仅显示出至1％寄生虫血症的时间的小延迟。重要的是，与单独用经照射的spz接种相比，当i.v.给予的Ad用于靶向通过i.v.施用经照射的spz的接种诱导的CD8⁺ T细胞(替代的临床疫苗接种方案)，诱导了肝脏中Ag特异性细胞数量的显著增加。然而，Ag特异性细胞的最高频率是通过Ad5i.m.和Ad5i.v.的初免-靶向接种诱导的(补充图7)。总之，数据表明，用Ad5或MVA接种的初免-靶向疫苗接种导致T_RM表型的Ag特异性肝细胞显著增加，并增强对肝脏阶段疟疾的保护。

结论

为了开发涉及CD8⁺ T细胞介导的保护的红细胞前期疫苗策略，开发了一种初免和靶向方法。在这里，我们证明，用PLGA蛋白负载Np将高抗原递送到肝脏，导致高频率的Ag特异性CD8⁺ T细胞仅位于肝脏。重要的是，i.v.施用PLGA-OVA Np接着用Ad5i.m.疫苗接种导致Ag特异性CD8⁺ T细胞增加10倍。发现Ag特异性CD8⁺ T细胞随时间相对稳定，并表达肝组织驻留和维持的标记物(特别是CXCR6和CD69)[22]。除了PLGA-OVA Np，还研究了i.v.病毒载体作为靶向剂。用Tg伯氏疟原虫OVA寄生虫的spz攻击之后，C57BL/6小鼠(难以通过红细胞前期疫苗保护的小鼠品系)在接种疫苗后两个月内显示出100％无菌保护。类似地，i.v.施用Ad5或MVA载体在接种疫苗后两个月无菌保护80％的C57BL/6小鼠。

肝脏阶段疟疾对疫苗开发提出了若干挑战。首先，需要特别大量的巡逻效应CD8⁺T细胞识别和杀死肝脏中非常少的感染肝细胞，肝脏是一种特别大的血管化器官[24,35,36]。这一需要是由于寄生虫的Ag螯合和细胞内寄生虫液泡(PVM，寄生虫在其中隐藏和复制)的建立导致的Ag呈递受限[37-40]。因此，在子孢子(spz)感染的短窗口中(在小鼠中大约两天，在人中大约七天)，通过目前的疫苗接种很少诱导和维持产生保护所必需的Ag特异性T细胞的水平[41]。此外，这由于肝脏是一种其中特别难以引起稳健的免疫应答的器官而进一步复杂化，由于次优的CD8⁺ T细胞初免(通常由肝窦内皮细胞(LSEC)引起)，导致产生功能障碍性或耗尽表型的T细胞[42-44]。

这种初免和靶向方法首先通过在外周组织中初免得到CD8⁺ T细胞并随后用能够成功递送大量抗原的试剂(Np或病毒载体)将它们靶向肝组织，来规避这些挑战中的一些。过去，通过血液或脾脏应答测量，旨在诱导高水平全身免疫的常规病毒载体疫苗策略未能产生在肝脏中随时间维持的保护性应答[11]。在若干工作中已经描述了高频率的肝Ag特异性CD8⁺ T细胞的重要性[22,45]，迄今为止仅通过整个寄生虫接种(例如经照射的子孢子)诱导[20,46]。然而，我们在此证明，Np和病毒载体是优良的靶向剂，临床测试的猴腺病毒为疟疾提供了特别可转变的(translatable)选择。由于只有一种病毒载体需要制造而且加强给药的免疫原没有变化，因此，i.m.接着i.v.疫苗接种方案不仅可以显著提高疫苗的疗效，还可以大大简化疫苗的生产。

通过利用各种病毒载体和Np，这种初免和靶向方法应该提供特别灵活的疫苗平台，用于多种疾病环境。首先，施用病毒载体或载有蛋白质的Np可用于在所选组织中产生局部细胞免疫应答，例如粘膜(例如气雾剂)、皮内或肿瘤内施用。其次，通过病毒载体工程，可以选择不同的抗原并在各种不同的组织中强烈表达，为乙型肝炎和丙型肝炎、CMV和EBV等疾病提供了潜在的疫苗和免疫治疗平台。虽然已经使用非抗原特异性趋化因子募集或UV灭活细菌描述了生殖道粘膜归巢方法，但是初免-靶向免疫提供了基于抗原递送的策略，其导致内部器官中显著的T细胞定位[47,48]。总之，初免-靶向方法能够显著改善目前基于抗原的肝脏阶段疟疾免疫策略，并提供新的高度灵活的疫苗接种策略。

实施例10用于肝脏靶向的皮下施用途径

为了调查除静脉内施用以外的途径是否可用于后期或靶向免疫。用表达荧光素酶的Ad5免疫小鼠，并通过生物发光成像评估肝脏中转基因表达的水平。如所预期的，(图17)在静脉内施用Ad5施用后1天显示肝脏靶向(图17a、17b)。令人惊讶的是，用皮下Ad5给药观察到显著的肝脏靶向，表明该途径可用于初免-靶向免疫策略中的靶向免疫。

为了评估这种可能性，用编码Ova的Ad5用以下一系列途径免疫进一步的小鼠：研究的C57/BL6小鼠组的剂量间隔为两周。

发现(图18)，在第3)组中肝干扰素γ阳性CD8T细胞显著高，其中i.m.初免给药后sc施用Ad5载体。实际上，该实验中的应答与使用i.v.靶向免疫的第1)组一样强。因此，这些数据强烈支持使用s.c.施用进行靶向免疫可以用作i.v.途径的替代方案的观点。

实施例11：皮下和腹膜内途径均有效

我们证明了皮下比im更好。特别地，我们显示皮下以及腹膜内途径在改善的功效方面超过了i.m.增强免疫，即当用作第二组合物(靶向组合物)时。

图26表示组间的统计学显著性。

这是很好的支持证据。

值得注意的是，i.p.免疫是小鼠的标准途径，但通常不用于人类。

图26显示了皮下或腹膜内施用腺病毒的靶向免疫产生了比肌内靶向免疫更大的保护作用。用10⁸iu的Ad5-OVA初免C57BL/6小鼠，两周后用10⁹iu的Ad5-OVA静脉内施用(黑色圆圈)、腹膜内(空方块)、皮下施用(黑色三角形)或肌内(实心方块)进行靶向。靶向接种疫苗之后三周，用1000个伯氏疟原虫OVA(hep17)子孢子攻击小鼠，并监测血液阶段疟疾的发展，未接种疫苗的小鼠用作感染对照(灰色方块)。用对数秩Mantel-Cox检验分析数据，并且星号表示Bonferroni校正后组之间的显著差异，证明与对照小鼠相比，用Ad肌内靶向实现了疟疾发展的小延迟。与肌内靶向组相比，用皮下腺病毒靶向接种显著改善了保护作用，而腹膜内施用腺病毒相对于腺病毒皮下组进一步改善了保护作用。

进一步的实施例

参考实施例1，首次证明该“初免-靶向”免疫方案用编码卵清蛋白的载体然后用表达卵清蛋白的转基因伯氏疟原虫子孢子攻击诱导了80％无菌保护。

然后我们发现表达恶性疟原虫ME-TRAP插入物的ChAd和MVA载体疫苗已经在临床上进行了广泛评估，在静脉内加强时也提供100％的效力，而通过其他途径施用的加强剂仅实现30％或更低的效力(取决于小鼠品系)。

然后，我们扩展了这种方法，以显示针对转基因寄生虫攻击的两种其他红细胞前期疟疾抗原的100％功效。非常有趣的是，在小鼠中用肌内腺病毒初免-静脉内腺病毒加强疫苗方案也可以观察到100％的功效，因此不需要异种的载体(即MVA)。

实施例7：其他临床相关的疟疾抗原也可以实现无菌保护

然后研究临床相关的肝脏阶段疟疾抗原。重要的是，PfLSA1和PfTRAP分别在BALB/c和CD1小鼠中进行了研究。用1x10⁸iu的ChAd63-PfLSA1i.m.免疫BALB/c小鼠，两周后，以1x10⁹iu的剂量i.v.给予相同的载体。选择Ad作为靶向疫苗，因为如果仅需要制造和使用一种载体(即单独的Ad)而不是两种(Ad加MVA)，将简化现场的疫苗接种方案。类似地，用含有抗原盒PfTRAP的相同方案免疫CD1小鼠。

如前所述，接受主初免-靶向策略的100％小鼠受到保护(图15A和15B)。图15显示2个图表。经典的异种的肌内初免-加强策略Ad-MVA在MVA加强后3周攻击时在PfLSA1接种的小鼠中未显示无菌保护。然而，观察到至1％寄生虫血症的显著延迟。用异种的初免-加强策略的PfTRAP接种的CD1小鼠显示出40％的无菌保护，远低于用初免-靶向方案观察到的100％。

总之，这些实验表明在临床相关的疟疾疫苗开发方面取得了实质性进展，大大改善了目前的初免-加强病毒载体疫苗策略。

病毒载体静脉内给药可用作替代靶向方法

已经确定高肝脏抗原递送显著增强了表达驻留标记物的CD8⁺ T细胞的频率，评估了临床测试的腺病毒和MVA载体作为肝脏抗原递送方法的能力。已知这些非复制型病毒载体可稳定表达蛋白质，每种载体均显示出独特的动力学特征[29]。重要的是，在i.m.和i.v.施用途径之后，它们在人体中都表现出良好的安全性[29-31]。在小鼠中通过i.v.施用含有荧光素酶(Luc)盒的人Ad5、黑猩猩腺病毒(ChAd63)和MVA病毒载体，随时间进行生物发光成像(图5F)。感兴趣区域(ROI)光子通量强度的定量显示，人和猿Ad病毒载体均为高度肝脏向性，具有强而稳定的荧光素酶表达(图5G)。MVA还在i.v.施用后很快显示出一些具有低荧光素酶表达的肝脏向性，随着时间的推移短暂地驻留在脾脏。

图5F和G显示了作为靶向剂的病毒载体在转基因伯氏疟原虫攻击模型中保护小鼠的照片和图。(图5F)用表达萤火虫萤光素酶的ChAd36(1x109iu)病毒载体i.v.免疫接种BALB/c小鼠(n＝5)。随后在第1、3、8、15、30、50和73天获得生物发光成像。重叠图像指示不同组中生物发光信号的位置。(图5G)不同疫苗接种方案的感兴趣区域(ROI)总通量(p/s)随时间变化的定量。虚线表示检测限。显示了四分位数范围的中位数。

临床相关的疟疾抗原可以实现无菌保护

为了研究初免和靶向策略对临床相关抗原和病毒载体的保护能力，用在黑猩猩腺病毒血清型63(ChAd63)病毒载体中表达的恶性疟原虫肝脏阶段疟疾抗原接种小鼠，并用野生型(WT)伯氏疟原虫或表达相关的恶性疟原虫蛋白的转基因(Tg)伯氏疟原虫攻击[32,33]。ME-TRAP含有来自环子孢子(CS)蛋白质Pb9的免疫显性H-2Kd限制性伯氏疟原虫表位，其中通过用表达Pb9的载体接种或转移Pb9特异性细胞所提供的保护是CD8⁺ T细胞数量依赖性的[34]。最近已显示肝脏阶段抗原1(PfLSA1)、肝脏阶段相关蛋白2(PfLSAP2)和TRAP(PfTRAP)主要通过诱导CD8⁺ T细胞应答介导保护[32]。用ChAd63构建体i.m.免疫小鼠，两周后，i.v.施用相同的载体。最后一次接种后三周，用1000个WT或Tg伯氏疟原虫spz攻击小鼠并监测血液阶段疟疾的发展。与先前的数据一致，接种初免和靶向方案对所有测试的抗原均实施100％无菌保护(图6A-D)，而接种标准初免-加强策略仅诱导至1％寄生虫血症的时间的小延迟(图6A-d)。重要的是，用PGLA-Pb9或ChAd.ME-TRAP靶向显示出相同的保护水平。通过肌内施用的经典异种初免-加强方案观察到的改善保护水平的能力表明，这种显著改善的载体疫苗接种方法值得临床评估。

图6显示4个图表。更详细地，初免和靶向方法保护小鼠免受表达临床相关抗原的伯氏疟原虫：

(A-C)Bal b/c小鼠和(D)CD1(n＝5-6)用ChAd63(1X10⁸iu)im初免，后者或表达(A)ME-TRAP、(B)PfLSA1、(C)PfLSAP2或者(D)PfTRAP。两周后，作为常规增强免疫施用MVA i.m.(1X10⁶pfu)(Δ)，或者表达同源抗原的ChAd63i.v.(1X10⁹iu)(■)。在ME-TRAP的情形下(A)，还有一组小鼠接受了含有免疫显性表位Pb9的PLGA颗粒(●)。还有一个未免疫接种的组作为所有组中的感染对照(○)。3周后用转基因有对应抗原的1000伯氏疟原虫spz攻击小鼠。利用血液薄涂片评价寄生虫血症以及通过线性回归计算的至1％寄生虫血症的时间。利用对数秩Mantel-Cox检验进行存活曲线分析。p<0.005(*)；p<0.005(**)。Mantel-Cox进行存活曲线分析。

·实施例8：静脉内施用ChAdOx1LS2和MVA LS2的保护效力

参见图27。

A)用10⁸iu ChAdOx1LS2im免疫BALB/c小鼠，接着两周后用10⁶pfu的MVA LS2im，再过两周后小鼠接受10⁷pfu MVA LS2，静脉内(iv)或肌内(im)。在最后一次接种后3周，用表达PfLSA1和PfLSAP2的1000个双嵌合伯氏疟原虫寄生虫攻击小鼠并监测血液阶段寄生虫血症。未接种疫苗的小鼠作为感染对照。图表表示通过每日寄生虫生长的线性回归计算的至1％寄生虫血症的时间。

B)用10⁸iu ChAdOx1LS2im免疫远交CD-1小鼠，接着两周后用10⁶pfu的MVA LS2im，再过两周后小鼠接受10⁹iu ChAdOx1LS2，静脉内(iv)或肌内(im)。在最后一次接种后3周，用1000个表达PfLSA1和PfLSAP2的双嵌合伯氏疟原虫寄生虫攻击小鼠并监测血液阶段寄生虫血症。未接种疫苗的小鼠作为感染对照。图表表示通过每日寄生虫生长的线性回归计算的至1％寄生虫血症的时间。

这些数据与图6有关，其中小鼠用伯氏疟原虫和临床相关抗原攻击。

LS2是我们的临床构建体，其含有2个肝脏阶段抗原(LSA-1和LSAP-2)，以及分子佐剂，在这个例子中是shark恒定链的跨膜结构域。

LSA-1和LSAP2的序列如上表描述部分标题“抗原”下的表中所示。

Shark不变链具有登录号AEX34752.1和/或如PCT/GB2014/053596(例如公布为WO2015/082922)中所述。

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上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文中。

Claims

1.试剂盒，其至少包含第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+T细胞表位，

用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或气雾剂途径施用所述第一组合物和通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径施用所述第二组合物来诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

2.诱导哺乳动物受试者的肝脏中的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用第一组合物和第二组合物，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+T细胞表位，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

3.根据权利要求1的试剂盒在治疗或预防肝脏疾病中的用途。

4.根据权利要求1的试剂盒、根据权利要求2的方法或根据权利要求3的用途，其中在施用所述第一组合物之后约2周施用所述第二组合物。

5.根据权利要求1或权利要求4的试剂盒、根据权利要求2的方法或根据权利要求3的用途，其中静脉内或皮下、优选静脉内施用所述第二组合物。

6.根据权利要求1、权利要求4或权利要求5的试剂盒、根据权利要求2的方法或根据权利要求3的用途，其中肌内施用所述第一组合物。

7.根据权利要求1的试剂盒、根据权利要求2的方法或根据权利要求3的用途，其中肌内施用所述第一组合物并且静脉内施用所述第二组合物。

8.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

9.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第二组合物包含粒子-或颗粒-结合表位，或编码所述表位的病毒载体，所述病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体或痘病毒载体。

10.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一组合物包含编码所述表位的腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的痘病毒载体。

11.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一组合物包含编码所述表位的猴或人腺病毒载体，并且所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体。

12.根据权利要求1-9中任一项的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物的病毒载体是相同的。

13.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中免疫应答是CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应答。

14.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物的至少一个表位来自相同的肝脏疾病抗原。

15.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物中的至少一个表位是相同的。

16.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物是不同的。

17.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一和第二组合物是相同的。

18.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述肝脏疾病抗原是来自或衍生自引起人、牲畜或伴侣动物的肝脏疾病的传染性病原体。

19.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述表位是由来自人的肝脏肿瘤抗原的人HLA I类分子限制的CD8+T细胞表位或肝癌新抗原表位。

20.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述表位在每侧侧接有其天然侧翼序列的至少7个氨基酸。

21.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第一组合物不包含质粒DNA。

22.根据前述任一项权利要求的试剂盒、方法或用途，其中所述第二组合物包含编码所述表位的改良安卡拉病毒(MVA)痘病毒载体，并且其中所述第二组合物包含所述载体的至少2×10⁶个噬斑形成单位。

23.根据权利要求1至22中任一项的试剂盒、方法或用途，其中所述抗原选自由以下组成的组：疟疾抗原、恶性疟原虫(P.falciparum)抗原、间日疟原虫(Plasmodium vivax)抗原、诺氏疟原虫(P.knowlesi)抗原和伯氏疟原虫(P.berghei)抗原。

24.根据权利要求1至22中任一项的试剂盒、方法或用途，其中所述抗原选自肝炎病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原和戊型肝炎病毒抗原。

25.施用如权利要求1至24任一项定义的组合物的装置，所述装置包含至少一个剂量的所述组合物。

26.试剂盒，其包含第一容器和第二容器，所述容器各自含有包含肝脏疾病抗原的至少一种表位的组合物，

其中所述表位是CD8+T细胞表位，用于诱导受试者中的免疫应答，其中所述第一容器和所述第二容器用于通过不同途径向所述受试者施用所述组合物。

27.根据权利要求1、4至24或26中任一项的试剂盒在诱导受试者中的免疫应答中的用途，其中将所述试剂盒的组合物施用于所述受试者。

28.制备根据权利要求1、4至24或26中任一项的试剂盒的方法，该方法包括选择肝脏疾病抗原的至少一种表位，将所述表位与药学上可接受的载体一起混合，并配制适用于通过肌内(i.m.)、皮下(s.c.)、皮内(i.d.)或气雾剂途径、优选肌内(i.m.)途径施用的第一组合物，并配制适用于通过静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、优选静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)途径、最优选静脉内(i.v.)途径施用的第二组合物，

29.治疗肝脏疾病的方法，所述方法包括将如权利要求1至26中任一项定义的第一组合物和第二组合物施用于所述受试者，所述第一和第二组合物各自包含肝脏疾病抗原的至少一个表位，其中所述表位是CD8+T细胞表位，

其特征在于，所述第一和第二组合物通过不同途径施用。

30.根据权利要求1、4至24或26中任一项的试剂盒，其用于治疗肝脏疾病。

31.根据权利要求1、4至24或26中任一项的试剂盒在治疗肝脏疾病中的用途。