DE10240866A1

DE10240866A1 - Immunmodulierendes Peptid aus S. aureus Enterotoxin B

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Publication number: DE10240866A1
Application number: DE10240866A
Authority: DE
Inventors: Karsten Prof. Dr. Neuber
Original assignee: AGELAB PHARMA GmbH
Current assignee: AGELAB PHARMA GmbH
Priority date: 2002-09-04
Filing date: 2002-09-04
Publication date: 2004-03-18

Abstract

Die Erfindung betrifft insbesondere Peptide, die spezifisch IgE-Antikörper zu binden vermögen und die beispielsweise aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) erhältlich sind. Ihre immunmodulatorischen Eigenschaften unterscheiden sich erheblich von denen des bakteriellen SEB. Die erfindungsgemäßen Peptide induzieren im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften sind die Peptide für die Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch einen erhöhten Serum-IgE-Spiegel und/oder eine vermehrte Produktion von Interferon-gamma charakterisiert sind, sowie für die Therapie von Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht von Th1- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind, wie z. B. Atopisches Ekzem, Lupus erythematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Psoriasis, rheumatoide Arthritis.

Description

Die Erfindung betrifft. insbesondere Peptide, die spezifisch IgE-Antikörper zu binden vermögen und die beispielsweise aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) erhältlich sind. Ihre:immunmodulatorischen Eigenschaften unterscheiden sich erheblich von denen des bakteriellen SEB. Die erfindungsgemäßen Peptide induzieren im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen. Aufgrund ihrer Eigenschaften sind die Peptide für die Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch einen erhöhte Serum-IgE-Spiegel und/oder eine vermehrte Produktion von Interferon-gamma charakterisiert sind, sowie für die Therapie von Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht von Th1- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind, wie z.B. Atopisches Ekzem, Lupus ery thematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Psoriasis,.rheumatoide Arthritis.
Staphylococcus aureus ist ein weit verbreiteter pathogener Mikroorganismus, der eine Vielzahl von schweren Infektionskrankheiten auslösen kann. S. aureus produziert Enterotoxine (Enterotoxin A, B, C, D, E und TSST-1) und Endotoxine (Koagulase, Staphylokinase, Lipase, Hyaluronidase, DNAse). Aufgrund der Entwicklung multipler Resistenzen gegenüber verschiedenen Antibiotika hat S. aureus in den letzten Jahren eine große Bedeutung als Erreger von Krankenhausinfektionen erlangt.
Die von S. aureus produzierten Enterotoxine (SE) können beim Menschen u.a. Lebensmittelvergiftungen und einen septischen Schock auslösen [Marrack, P. & Kappler, J. (1990), Science 248, 705].
Es handelt sich um mittelgroße Proteine (20-30 kD), die sich hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen sehr ähnlich sind. So beträgt die Übereinstimmung zwischen Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA) und Staphylokokken-Enterotoxin E (SEE) über 90 [Marrack, P. & Kappler, J. (1990), Science 248, 705].
Das Interesse an den immunologischen Eigenschaften dieser Toxine stieg beträchtlich, nachdem entdeckt wurde, daß sie bereits in Konzentrationen von 10^–13 M – 10^–16 M zu den stärksten Induktoren einer Lymphozytenproliferation zählen und sich diese Proliferation auf die T-Zellen beschränkt [Fleischer, B. & Schrezenmeier, H. (1988), J. Exp. Med. 167, 1697].
Die Aufklärung der genauen Stimulationsmechansimen begann mit der Beobachtung, daß SEs hochgereinigte T-Zellen nicht stimulieren, sondern daß die toxininduzierte Proliferation von der Anwesenheit akzessorischer Zellen, Monozyten oder B-Lymphozyten, abhängig ist.
Im Gegensatz zu gewöhnlichen Antigenen werden die Enterotoxine jedoch nicht prozessiert und in der Antigen-Bindungsstelle des MHC-II-Moleküls präsentiert, sondern sie kreuzvernetzen den MHC-II-Komplex auf Monozyten oder B-Zellen mit dem T-Zell-Rezeptor [Herrmann, T. et al. (1992), Eur. J. Immunol. 22, 1935].
Die Bindungsaffinität der Enterotoxine zu verschiedenen MHC-II-Proteinen des Menschen ist unterschiedlich. Die meisten SEs binden bevorzugt an HLA-DR, weniger stark an DQ und praktisch überhaupt nicht an DP [Fleischer, B. (1991), Immun. Infekt. 19, 8]. Der Grund für die massive, im Gegensatz zu Lektinen wie Concanavalin A jedoch limitierte T-Zell-Stimulation ist die spezifische Bindung der SEs an die Außenseite der v_β-Kette des T-Zell-Rezeptors (TZR). Die anderen Komponenten des T-Zell-Rezeptors, die sog. V_β-, J- oder D-Segmente, sind keine Bindungsstellen für SEs. Da nur T-Lymphozyten mit einer bestimmten V_β-Kette des TZR durch bestimmte SEs stimuliert werden, bezeichnet man die Toxine als Antigene und nicht als Mitogene.
Da jedoch die Zahl der zirkulierenden T-Zellen, die durch ein bestimmtes Toxin stimuliert werden können, deutlich größer ist als die Zahl der T-Lymphozyten, die für ein konventionelles Antigen spezifisch sind, werden SEs als „Superantigene" bezeichnet [Marrack, P. & Kappler, J. (1990), Science 248, 705].
Je nach Häufigkeit der V_β-Populationen können in vivo 5 – 30% des zirkulierenden T-Zell-Repertoires durch bakterielle Superantigene stimuliert werden [Choi, Y. (1990), J. Exp. Med. 172, 981]. Diese T-Zell-Stimulation induziert eine Fülle komplexer pathophysiologischer Mechanismen, die zur Zeit noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Im Tiermodell, aber auch beim Menschen, führt die Intoxikation mit Superantigenen zu sy stemischen Reaktionen, die von Fieber bis zum kardiovaskulären Schock reichen können [Fleischer, B. (1991), Immun. Infekt. 19, 8]. Tabelle 1 zeigt die durch Enterotoxine von S. aureus induzierten immunologischen Reaktionen. Diese Reaktionen werden wahrscheinlich durch komplexe immunologische Vorgänge ausgelöst. Die Bindung der Toxine an den MHC-II-Komplex und den TZR führt zur Proliferation, Freisetzung von Zytokinen und anderen Mediatoren und zur Antikörperproduktion (Tabelle 1). Ausserdem wird das "cutaneous lymphocyte-associated antigen" (CLA), das die Rezirkulation von T-Zellen in die Haut steuert, verstärkt exprimiert [Zollner, T.M. (1996), Immunol. Leiters 49, 111] .
Tabelle 1:
Nach dieser hyperreaktiven Phase gehen die Superantigenstimulierten T-Zellen in einen anergischen Zustand über, so daß es zu einer massiven Immunsuppression kommen kann. Andererseits können autoreaktive, aber anerge T-Zellen aktiviert werden, die dann Autoimmunkrankheiten auslösen. Bei der multiplen Sklerose [Hafler, D.A. (1988), J. Exp. Med. 167, 1313] und der rheumatoiden Arthritis [Palliard, x. (1991), Science 253, 325] wurde bereits eine oligoklonale Selektion bestimmter V_β-Ketten nachgewiesen, die auf einen Superantigen-vermittelten Pathomechanismus dieser Erkrankungen hindeutet.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß SEB die IgE-Synthese und die Produktion von Interleukin-4 bei Patienten mit atopischem Ekzem verstärkt [Neuber, K, (1993), Hautarzt 44, 135; Ring, J. et al. (1992), Allergy 47, 265; Neuber, K. et al. (1995), Int. Arch. Allergy Immunol. 107, 179]. Ausserdem konnte eine ekzemauslösende Wirkung für SEB im Epikutantest nachgewiesen werden [Hofer, M.F. (1999) , J. Invest. Dermatol. 112, 171] .
Das atopische Ekzem gehört wie die allergische Rhinokonjunktivitis und das allergische Asthma bronchiale zu den Erkrankungen, bei denen eine pathologisch verstärkte IgE-Synthese auftritt. Diese Erkrankungen sind bisher nur symptomatisch zu behandeln, d.h. die Unterdrückung der IgE-Synthese erfolgt unspezifisch durch die Suppression der an der Synthese beteiligten T-Lymphozyten. Die am häufigsten systemisch eingesetzten Medikamente sind dabei Cortison oder Cyclosporin A. Diese Substanzen bewirken häufig sehr schwere systemische Nebenwirkungen (Hautatrophie, Diabetes, Hypertonie, Nieren- und Hepatotoxizität u.a.). Durch eine spezifische Modulation der überhöhten IgE-Synthese würden sich derart schwere Nebenwirkungen vermeiden lassen. Das gleiche gilt auch für Erkrankungen, die mit einer vermehrten Interferon-gamma-Synthese der Lymphozyten einhergeht. Ein gutes Beispiel für einen solchen Zustand stellt die Psoriasis vulgaris dar. Bei dieser Erkrankung pro duzieren T-Zellen vermehrt Interferon-gamma und induzieren dadurch die Hyperproliferation der Epidermis. Zur Therapie der Psoriasis werden ebenfalls Immunsuppressiva wie Cortison oder Cyclosporin A zur Therapie verwendet. Die selektive Hemmung der Zytokinproduktion würde in diesem Fall ebenfalls die Nebenwirkungsrate deutlich verringern.
Bei einer Reihe von Erkrankungen ist ursächlich eine pathologische Th1- oder eine abgeschwächte Th2-Reaktion nachgewiesen worden oder wird diskutiert (vergleiche auch Tabelle 2). Tierexperimentelle Befunde lassen vermuten, dass bei diesen Erkrankungen eine Umstimmung der Immunantwort in Richtung Th2 protektiv wirkt. Zu nennen sind hier organspezifische Autoimmunkrankheiten wie Multiple Sklerose [Shevach, E.M. et al. (1999), Springer Semin. Immunopathol. 21, 249-262; Leonard, J.P. et al. (1997), Crit. Rev. Immunol. 17, 545-553], autoimmune Uveitis [Singh, V.K. et al. (1999), Immunol. Res. 20, 147-161; Sun, B. et al. (1999), Int. Immunol. 11, 1307-1312; Egwuagu, C.E. et al. (1999), J. Immunol. 162, 510-517], Insulinpflichtiger Diabetes mellitus [Rabinovitch, A. et al. (1998), Biochem. Pharmacol. 55, 1139-1149], rheumatoide Arthritis [Muller, B. et al. (1998), Springer Semin. Immunopathol. 20, 181-196], Behcet's Syndrom [Frassanito, M.A. et al. (1999), Arthritis Rheum. 42, 1967-1974] weiterhin die Helicobacter pylori-Infektion (die Ursache u.a. von Magenulcus und atrophischer Gastritis) [Smythies, L.E. et al. (2000), J. Immunol. 165, 1022-1029; Fox, J.G. et al. (2000), Nat. Med. 6, 536-542; Mattapallil, J.J. et al. (2000), Gastroenterology 118, 307-315], entzündliche Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und andere [Romagnani, P. et al. (1997), Curr. Opin. Immunol. 9, 793-799; MacDonald, T.T. (1999), Curr. Top. Microbiol. Immunol. 236, 113-135], die akute Organtransplantat-Abstoßungsreaktion [Morelli, A.E. et al. (2000), Transplantation 69, 2647-2657] und spontane rekurrente Aborte [Jenkins, C. et al. (2000), Fertil. Steril. 73, 1206-1208].
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines neuen Wirkstoffs, der sich zur Behandlung von Erkrankungen eignet, die durch einen erhöhten IgE-Spiegel und/oder eine verstärkte Interferon-gamma-Produktion charakterisiert sind und der die im Stand der Technik bekannten Nachteile nicht aufweist. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, Wirkstoffe bereitszustellen, die sich zur Therapie von Erkrankungen eignen, die durch ein Ungleichgewicht des Verhältnisses von Th1- und Th2-Immunantwort charakterisiert sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, daß sich aus dem natürlich vorkommenden S. aureus Enterotoxin B (SEB) Peptide isolieren lassen, die die oben genannten Aufgaben lösen.
Insbesondere läßt sich ein Peptid isolieren, welches in der Lage ist, spezifisch IgE-Antikörper zu binden. Dabei unterscheiden sich seine immunmodulatorischen Eigenschaften überraschenderweise erheblich von denen des bakteriellen SEB. Das erfindungsgemäße Peptid, dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:10 dargestellt ist, induziert im Gegensatz zu SEB überraschenderweise keine Proliferation von T-Zellen und hemmt aber andererseits die Interferon-gamma-Synthese stimulierter T-Lymphozyten. Aufgrund seiner Eigenschaften ist das Peptid für die Therapie von Erkrankungen geeignet, die durch erhöhte Serum-IgE-Spiegel und/oder vermehrte Produktion von Interferongamma charakterisiert sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Erkrankungen um die allergische Rhinokonjunktivitis, das allergische Asthma bronchiale sowie die Psoriasis vulgaris.
Neben dem erfindungsgemäßen Peptid wurden weitere erfindungsgemäße Peptide hergestellt, die dieselben oder im wesentlichen dieselben biologischen und/oder immunologischen Eigenschaften aufweisen. Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften, d.h. Bindung von IgE-Antikörpern und Hemmung der Interferon-gamma- Synthese ohne Induktion der T-Zell-Proliferation, sind die erfindungsgemäßen Peptide besonders zur Behandlung von Erkrankungen geeignet, die mit einer erhöhten IgE-Synthese und vermehrter Interferon-gamma-Synthese einhergehen, wie es zum Beispiel beim atopischen Ekzem (Neurodermitis) der Fall ist. Dieser Zustand ist bei der chronischen Verlaufsform des atopischen Ekzems beschrieben worden. Dabei finden sich vermehrt Interferon-gamma-produzierende T-Lymphozyten in der Haut und erhöhte Serum-IgE-Werte. Die therapeutische Wirkung der Peptide könnte entweder direkt durch eine inaktivierende Bindung an das IgE erfolgen oder aber indirekt durch die Modulierung der Zytokinproduktion der T-Lymphozyten. In diesem Zusammenhang kommt auch die Hemmung weiterer Zytokine wie IL-4 und IL-13 in Betracht, von denen bekannt ist, daß sie die IgE-Synthese stimulieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polypeptid, das die N-terminale Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:15 aufweist und durch Trypsin-Spaltung von S. aureus Enterotoxin B als 12 kD-Spaltfragment erhältlich ist.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid (im folgenden als Peptid P1 bezeichnet), das die in SEQ 2D NO:10 angegebene Aminosäuresequenz aufweist und das in vitro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Homologe und Derivate der vorgenannten Polypeptide, die an IgE binden. Bei den homologen Polypeptiden handelt es sich um solche Substanzen, die sich aber von den vorgenannten Aminosäuresequenzen, insbesondere von der Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, infolge des Austauschs einer oder mehrerer Aminosäuren oder durch Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren unterscheiden, wobei sie eine Sequenzhomologie von etwa 50 bis 99 %, vorzugsweise von mindestens etwa 75 % aufweisen. Eine Sequenzhomolo gie von mindestens 85 % ist besonders bevorzugt. Unter einem Derivat werden erfindungsgemäß solche Polypeptide verstanden, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren der vorgenannten Sequenzen, insbesondere der Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, durch ein Stereoisomer (d.h. Austausch von einer oder mehreren L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren) oder eine entsprechende, modifizierte Aminosäure ausgetauscht sind. Unter modifizierten Aminosäuren werden solche Aminosäuren verstanden, deren Seitenketten im Vergleich zu natürlich vorkommenden Aminosäuren chemisch verändert sind, beispielsweise durch Glykosylierung, Phosphorylierung, Methylierung usw. Derartige Modifikationen sind dem Fachmann wohlbekannt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Homologen und Derivate, die IgE binden, die selben oder im wesentlichen die selben Eigenschaften auf wie das vorgenannte Peptid gemäß SEQ 2D NO:10, d.h. sie hemmen in vitro die Synthese von Interferon-gamma stimulierter T-Lymphozyten und/oder sie induzieren nicht die Proliferation von T-Lymphozyten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das Homologe (im folgenden als Peptid P2 bezeichnet) die in SEQ ID NO:11 angegebene Aminosäuresequenz auf.
Die Erfindung schließt auch Polypeptide mit einer Länge von mehr als 9 Aminosäuren ein, die die in SEQ 2D NO:10 oder 11 angegebene Aminosäuresequenz enthalten und in vitro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmen.
Ferner betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das eine für ein vorgenanntes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz enthält. Vorzugsweise weist es die in SEQ ID NO:9 angegebene Nukleinsäuresequenz auf. Das Nukleinsäuremolekül kann verwendet werden, um die Sequenz in einen Expressionsvektor einzuklonieren und das erfindungsgemäße Peptid rekombinant herzustellen. Diese Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Peptide, insbesondere P1 und P2, in der Lage sind, das Verhältnis zwischen Th1- und Th2-Zellen und damit auch das Verhältnis der entsprechenden Zytokine zu beeinflussen.
Tabelle 2:
Aufgrund der immunologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Proteine und Polypeptide eignen sich diese in besonderem Maße zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Th1- oder Th2-Immunantwort durch Verstärkung der Th2- bzw. Senkung der Th1-Antwort und umgekehrt, insbesondere zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer (überwiegenden) Th2- oder Th1-Immunantwort einhergehen. Vorzugsweise handelt es sich bei diesen Erkrankungen um Erkrankungen aus der Gruppe bestehend aus Multipler Sklerose, autoimmuner Uveitis, Diabetes mellitus, rheumatoider Arthritis, Behcet's Syndrom, Helicobacter pylori-Infektion, entzündlichen Darmerkrankungen (insbesondere Morbus Crohn), akuter Organtransplantat-Abstossungsreaktion und spontanen rekurrenten Aborten.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 aufweist oder enthält, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation und zur Hemmung der Zytokinproduktion von Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten. Eingeschlossen ist ferner die Verwendung eines solchen Polypeptids zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen (wie z.B. Interferon-gamma) und/oder einem erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen. Bei den Ekrankungen handelt es sich insbesondere um Atopisches Ekzem (insbesondere in der chronischen Verlaufsform), Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis allergica, Psoriasis, Rheumatoide Arthritis oder Multiple Sklerose. Weitere Erkrankungen sind in Tabelle 2 genannt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Zytokin um Interferon-gamma, Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13).
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung eines oben beschriebenen Polypeptids ein, das eine zu SEQ ID NO: 10 homologe oder davon abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist. Hin sichtlich der homologen oder davon abgeleiteten Sequenzen wird auf die obige Definion der „Homologen" und „Derivate" Bezug genommen, wobei insbesondere solche IgE-bindenden Polypeptide eingeschlossen sind, die die Proliferation von T-Lymphozyten nicht induzieren und/oder in vitro die Synthese von Interferon-gamma durch stimulierte T-Lymphozyten hemmen. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist das verwendete Polypeptid die Sequenz gemäß SEQ ID NO:11 auf. Soweit die Erfindung die Verwendung von Polypeptiden betrifft, die die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10 oder SEQ ID NO:11 oder dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenzen mit den selben oder im wesentlichen den selben biologischen oder immunologischen Eigenschaften als Teil einer längeren Aminosäuresequenz enthalten, sind Polypeptide mit einer Länge von bis zu 30 Aminosäuren, insbesondere mit einer Länge von bis zu 15 Aminosäuren, bevorzugt.
Aufgrund seiner besonderen biologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Polypeptide zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in Lymphozyten, insbesondere in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
Die erfindungsgemäßen Peptide modulieren sowohl die stimulierte als auch die spontane Zytokinproduktion von TH1- und TH2-Lymphozytensubpopulationen. Für die Richtung der Peptidinduzierten Effekte scheint der endogene Aktivierungsstatus der Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Bei Patienten mit atopischem Ekzem wird eine Hemmung der endogen gesteigerten Synthese aller Zytokine durch das erfindungsgemäße Peptid P1 beobachtet. Mittlerweile ist bekannt, daß nicht nur die TH2-Zytokine bei diesen Patienten erhöht sind, sondern daß gerade bei der chronisch-stationären Verlaufsform eine gesteigerte IFNγ-Produktion beobachtet wird. Besonders das erfindungsgemäße Peptid P1 ist in der Lage, nicht nur die TH2-Zytokinsynthese der Lymphozyten dieser Patienten zu hemmen, sondern auch die IFNγ-Produktion, was von erheblicher therapeutischer Relevanz ist, z.B. durch Abschwächung der Symptome bis zur Heilung.
Bei Psoriatikern ist die Induktion einer massiv gesteigerten IL-10-Ausschüttung durch die erfindungsgemäßen Peptide von besonderem Interesse. Es gibt verschiedene Hinweise, daß IL-10 das klinische Erscheinungsbild der Psoriasis günstig beeinflußen kann. Der gezielte Effekt der erfindungsgemäßen Peptide auf die IL-10-Produktion der Lymphozyten von Psoriatikern ist hier in der Interaktion mit den Effekten auf die anderen Zytokine von besonderer therapeutischer Bedeutung, z.B. durch Abschwächung der Symptome bis zur Heilung.
Die differenzierten Effekte der erfindungsgemäßen Peptide auf die spontane bzw. endogene Zytokinsynthese bei verschiedenen pathologischen Aktivierungszuständen des Immunsystems zeigen, daß die Peptide immunmodulatorische Wirkung auch gegenüber anderen durch Veränderungen des TH1-/TH2-Gleichgewichts bedingte Erkrankungen (Tabelle 2) zeigen.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein oder mehrere erfindungsgemäße Polypeptide und gegebenenfalls ferner einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
Das aus SEB isolierte Peptid ist dadurch erhältlich, daß man Enterotoxin B aus S. aureus mit Trypsin verdaut und man anschließend das 12 kD-Fragment aus dem Reaktionsansatz isoliert. Alternativ sind selbstverständlich auch gentechnische Methoden der Herstellung möglich, indem man die in SEQ ID NO:9 gezeigte Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor einbringt, man diesen in geeignete Wirtszellen einführt, man die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Proteinex pression geeignet sind und man das exprimierte Polypeptid isoliert, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen, einem Sequenzprotokoll und Figuren veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1: Immunoblot zum Nachweis spezifischer IgE-Antikörper gegen SEB
Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-PAGE) wurde nach der Methode von Lughtenberg et al. [Lughtenberg, B. (1975), FEBS Lett. 58, 254] durchgeführt. Es wurden 12,5 Polyacrylamid-Trenngele verwendet. Zur Bestimmung der Molekulargewichte wurden Standardproteingemische (Fa. Biorad, MW-Standard, 203 kD – 7,5 kD) parallel aufgetrennt. Die Färbung der Proteine erfolgte mit Coomassie-Blue G-250. Im Sammelgel standen 10 Taschen zur Probenaufnahme bereit, wobei die eingesetzte Proteinmenge zwischen 10 und 100 μg lag. Die aufzutrennende Proteinlösung (20 μl) wurde mit 20 μl Probenpuffer gemischt, in die Sammelgeltaschen gefüllt und anschließend mit Elektrodenpuffer überschichtet. Die Elektrophorese wurde in Elektrodenpuffer und bei einem konstanten Stromfluß von 20 mA durchgeführt. Wenn die Bromphenolblau-Bande das Ende des Trenngels erreicht hatte (Laufzeit bis zu 2 h), wurde die Elektrophorese beendet. Die zu untersuchenden Proteingemische wurden gelelektophoretisch (SDS-PAGE) aufgetrennt und im Western-Blot-Verfahren auf Nitrozellulose (Porengröße 0,45 μm) transferiert. Der Transfer erfolgte unter Kühlung in einer Elektro-Blot-Kammer (BioRad, München) unmittelbar nach der Gelelektrophorese für 18-20 h bei einer konstanten Stromstärke von 0,2-0,3 A.
Die Nitrozellulose-Blots wurden mit humanem Serum für 4 h auf einem Schwenktisch bei RT inkubiert (Dianova, Hamburg). Anschließend wurden die Blots fünfmal gewaschen und dann erneut für 4 h bei RT mit einem sekundären Antikörper gegen humanes IgE (anti-human-IgE-Antikörper, Fa. Serva, Heidelberg) inkubiert und die Bindung durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht.
Das Ergebnis des Immunoblots ist in 1 dargestellt. Mit Hilfe des Immunoblots konnten in Seren von Patienten mit atopischem Ekzem spezifische IgE-Antikörper gegen SEB nachgewiesen werden.
In den Immunoblots wurden Peroxidase-markierte Antikörper verwendet. Es ist darauf hinzuweisen, daß das in 1 dargestellte Ergebnis des Blots (in eingescannter Form) nicht den tatsächlichen, mit bloßem Auge erkennbaren Farbabstufungen entspricht. Die als Schatten zu erkennenden Banden sind auf dem Originalblot so schwach gegenüber den mit Atopikerseren inkubierten Banden, daß sie als unspezifische Reaktionen gewertet werden müssen.
Beispiel 2: Spaltung von SEB mit Trypsin
SEB (100 μg/100 μl) wurde mit 10 μl Trypsin (4 mg/ml Aqua dest.) über 18 h bei 37° C enzymatisch verdaut. Die Lösung wurde anschließend auf SDS-Gele aufgetragen und die entsprechenden Spaltprodukte getrennt. Die Bedingungen für die Gelelektrophorese entsprachen den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen. Die Spaltprodukte wurden im Immunoblot mit Seren der in Beispiel 1 genannten Patienten mit atopischem Ekzem inkubiert. Als Kontrolle diente Serum von gesunden Kontrollpersonen. Das Ergebnis des Trypsinverdaus ist in 2 dargestellt.
Nach Trypsinspaltung fand sich ein ca. 12 kD großes Spaltprodukt mit dem das IgE aus dem Serum der Patienten mit atopischem Ekzem eine im Immunoblot nachweisbare Bindung einging (2). Der Nachweis erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem anti-human-IgE-Antikörper (Fa. Serva, Heidelberg).
Beispiel 3: Sequenzierung des IgE-bindenden Spaltproduktes
Das als IgE-bindend identifizierte Spaltprodukt mit einem Molekulargewicht von ca. 12 kD wurde aus dem Gel eluiert und anschließend maschinell nach der Methode von P. Edman [Edman, P. (1950), Acta Chem. Scand. 4, 283] sequenziert, wobei die N-terminale Sequenz KVTAQELDYL ermittelt wurde. Die Sequenzanalyse ergab somit eine Sequenz, die an Position 181 (vom N-terminalen Ende) des SEB-Moleküls beginnt. 3 zeigt das Ergebnis der Sequenzanalyse.
Beispiel 4: Synthese kurzer Peptide
Ausgehend von der ansequenzierten Sequenz des 12 kD-Spaltproduktes wurden mehrere Peptide mit überlappenden Sequenzen vor und nach dem ansequenzierten Bereich hergestellt:

(a) H N G N Q L D K Y R S I T V R V F E (SEQ 2D NO: 1)
(b) V R V F E D G K N L L S F D V Q T N K (SEQ ID NO: 2)
(c) V Q T N K K K V T A Q E L D Y L T R H (SEQ ID NO: 3)
(d) Y L T R H Y L V K N K K L Y E F N N S (SEQ ID NO: 4)
(e) E F N N S P Y E T G Y 2 K F I E N E N (SEQ ID NO: 5)
(f) I E N E N S F W Y D M M P A P G D K F D (SEQ 2D NO: 6)
(g) G D K F D Q S K Y L M M Y N D N K M V D (SEQ ID NO: 7)
(h) N K M V D S K D V K I E V Y L T T K K K (SEQ ID NO: 8)

[Anmerkung: die verwendete "SEQ ID NO:" entspricht der Sequenzkennzahl <400> gemäß WIPO-Standard ST.25.]
Die Peptide mit den Sequenzen (a) bis (h) wurden dann wie in Beispiel 2 beschrieben getestet. Das Peptid (c) zeigte neben dem 12 kD-Spaltprodukt als einziges eine IgE-Bindung.
Die sequenzierte Aminosäuresequenz des Peptids (c) wurde mit Hilfe einer Datenbank (SwissProt) auf mögliche Homologien mit anderen bekannten Molekülen verglichen. Dabei stellte sich heraus, daß zwischen der IgE-bindenden Sequenz dieses Peptids und einer Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne des humanen niedrig-affinen IgE-Rezeptors (CD23) eine Homologie von 89 % besteht (vgl. 4). Mit Hilfe des Smith-Waterman-Algorithmus konnte die Homologie zwischen SEB und CD23 als signifikant (p = 0.03) errechnet werden.
Daraufhin wurden zwei weitere Peptide synthetisiert, die die Seguenz QELDYLTRH (P1; SEQ ID NO:10) und QEEDFLTLH (P2; SEQ ID NO:11; entsprechend dem homologen Sequenzabschnitt aus dem CD23-Molekül) aufwiesen.
Diese beiden Peptide wurden dann in den weiteren Experimenten zur Stimulation der Lymphozyten eingesetzt (vgl. Beispiele 6 und 7).
Beispiel 5: Dotblot zum Nachweis der Bindung von Serum-IgE an die Peptide
Mit Hilfe eines Dotblots konnte gezeigt werden, daß die beiden erfindungsgemäßen Peptide IgE-Antikörper aus dem Serum von Patienten mit atopischem Ekzem binden können. Dazu wurden die Seren von 5 verschiedenen Patienten mit atopischem Ekzem zunächst über Protein G-Säulen vorgereinigt (1 ml, Pharmacia).
Die Seren wurden über 0,8 μm-Spritzenvorsätze vorfiltriert. Anschließend wurde die Säule mit 10 ml Bindungspuffer (20 mM PBS, pH 7,0) „drop to drop" gekoppelt und bei einer Durchflußrate von 1 ml/min gewaschen. Dann wurde jeweils 1 ml Serum filtriert und das Filtrat aufgefangen, sobald es eine leicht gelbliche Farbe angenommen hatte. Es wurde mit 5 ml PBS gewaschen und das Restfiltrat solange gesammelt, bis es klar wurde. Das filtrierte Serum wurde 1:2 in 20 mM PBS verdünnt.
Für die Durchführung des Dotblots wurden jeweils 20 μg der Peptide P1 und P2 sowie 1 μg SEB auf eine Membran gegeben und über Nacht getrocknet. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch / PBS Tween blockiert. Dann wurden die Seren und eine Positivkontrolle (Sheep anti-SEB-IgG, 10 μl/ml, SERVA) eingesetzt und für 1 h bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Membranen dreimal gewaschen. Zum Nachweis der Serum-IgE-Antikörper wurde Biotin-markiertes Anti-human-IgE (Pharmingen) in einer Konzentration von 4 μg/5 ml für 1 h bei RT inkubiert und die Membran anschließend dreimal gewaschen. Nach einer weiteren Inkubation für 1 h bei RT mit dem Streptavidin-markierten zweitem Antikörper und dreimaligen Waschen wurde die Farbreaktion mit BCIP und NBT als Substrat ausgelöst. Die Ergebnisse des Dotblots sind in 5 dargestellt. Es zeigt sich, daß beide erfindungsgemäßen Peptide mit den Seren 4, 5 und 6 eine schwache, aber eindeutig nachweisbare IgE-Bindung zeigen. Alle Seren zeigten eine IgE-Bindung an SEB.
Beispiel 6: Immunmodulatorische Eigenschaften der Peptide
Periphere Blutlymphozyten (PBMC) von gesunden freiwilligen Spendern wurden über einen Ficollgradienten isoliert und in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640-Medium + 10% FCS (Fötales Kälberserum) kultiviert. Als Stimuli wurden SEB (1 μg/10⁶ Zellen) und das Peptid (5 μg/10⁶ Zellen) verwendet.
Die Proliferation der Zellen und die intrazelluläre Produktion von Interferon-gamma und Interleukin-4 wurde durchflußzytometrisch nach 2 Tagen Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ gemessen. Nachdem die peripheren Blutlymphozyten über eine Ficoll-Paque-Gradientenzentrifugation isoliert wurden, wurde die Zellzahl auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden in konischen 15 ml-Polypropylengefäßen aufgenommen und dann im Brutschrank für 2 Tage inkubiert. Für die Proliferation wurden die PBMC in den letzten 5 h der Inkubationszeit mit 60 μM Bromodeoxyuridin (BrdU) inkubiert. Für die Messung der intrazellulären Zytokine wurde für die letzten 5 h Brefeldin A (BFA, 20 μl/1 ml PBMC) hinzugegeben. Dann wurden 20 mM EDTA (100 μl/1 ml PBMC) hinzugegeben und danach 10 ml kaltes PBS. Nach Zentrifugation wurden 3 ml „FACS Lysing Solution" (BD Bioscience, Heidelberg) zu den Zellen gegeben und nach einem Waschschritt die „FACS Permeabilisierungslösung" (BD Bioscience, Heidelberg). Anschließend wurden zum Zellpellet Anti-BrdU-FITC-Antikörper mit DNase (Proliferation) oder anti-Zytokin-Antikörper (intrazelluläre Zytokinbestimmung) hinzugegeben und für 30 min inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit 200 μl 1% Paraformaldehyd fixiert. Die Fluoreszenz wurde am Durchflußzytometer (FACScan, BD Bioscience) gemessen und ausgewertet.
Die Proliferation wurde durch den Einbau von BrdU in Lymphozyten am Durchflußzytometer bestimmt. Die Inkubation der Lymphozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen der erfindungsgemäßen Peptide P1 und P2 zeigte keine signifikanten Effekte der Peptide auf die Proliferation (6A). Die SEB-induzierte Proliferation wurde weder durch die Peptide alleine (6A) noch die Kostimulation mit SEB + Peptid P1 (6B) wesentlich modifiziert. Lediglich in hohen Konzentrationen zeigte sich eine Hemmung der SEB-induzierten Lymphozytenproliferation (6B).
Im nächsten Schritt wurde die intrazelluläre IFNγ- (7) und IL-4-Produktion nach Stimulation mit SEB und den erfindungsgemäßen Peptiden P1 und P2 untersucht (7). Dabei zeigte sich, daß P1 stärker als P2 die Produktion von IFNγ, einem Zytokin, das eine Vielzahl von immunologischen Funktionen vermittelt, dosisabhängig supprimiert (7A), und daß IL-4 (7B) dosisabhängig stimuliert wird. Die in diesen Experimenten untersuchten Lymphozyten stammten von gesunden Probanden. Dementsprechend wurde das Verhältnis zwischen IFNγ und Il-4 durch die Peptide dosisabhängig zu Gunsten der IL-4-produzierenden TH2-Lymphozyten verändert (7C).
Beispiel 7: Effekt der Peptide auf die sekretorische Zytokinproduktion
Periphere Blutlymphozyten von gesunden freiwilligen Spendern wurden über einen Ficollgradienten isoliert und in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640-Medium + 10% FCS (Fötales Kälberserum) aufgenommen. Die Zellen wurden in 24-Loch-Platten ausgebracht und mit den beiden Peptiden (200 μg/10⁶ Zellen) für 2 Tage im Brutschrank (37°C, 5 % CO₂) inkubiert. Danach wurden die Überstände gesammelt und zunächst bei –20°C eingefroren. Die humanen TH1-Zytokine IL-2, IFNγ und TNFα sowie die TH2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 wurden im Zellkulturüberstand mit dem „Cytometric Bead Array (CBA)" der Firma B&D (Heidelberg) gemessen. Der Test wurde exakt nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
In einer ersten Serie von Experimenten wurden die Effekte der erfindungsgemäßen Peptide P1 und P2 auf die spontane Zytokinsekretion peripherer Blutlymphozyten gesunder Probanden (n=3) untersucht. 8 zeigt die Effekte auf die TH1-Zytokine (IL-2, IFNγ, TNFα) und auf die TH2-Zytokine (IL-4, IL-5, IL-10).
Es zeigte sich, daß P1 vor allem die spontane Produktion der TH1-Zytokine IL-2 und IFNγ hemmt, während P2 stärker TNFα inhibiert. Peptid 2 induziert bei gesunden Probanden die Synthese von TH2-Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10), während P1 auch die Synthese von IL-4 und IL-5 vollständig hemmt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß P1 und P2 das Verhältnis von TH1- und TH2-Zytokinen beeinflußen.
Deshalb wurde im nächsten Schritt dasselbe Experiment mit peripheren Blutlymphozyten von Patienten mit einem schweren atopischen Ekzem (TH2 > TH1). bzw. einer schweren Psoriasis vulgaris (TH1 > TH2) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in den 9 und 10 dargestellt.
Es zeigte sich, daß bei Patienten mit atopischem Ekzem bzw. mit Psoriasis vulgaris z.T. gegenläufige Effekte auf die bereits endogen veränderte spontane Zytokinsekretion auftreten. Bei Patienten mit atopischem Ekzem (9) war die spontane Produktion aller Zytokine, d.h. sowohl der TH1- als auch der TH2-Zytokine deutlich erhöht. P1 hemmt bei diesen Patienten die erhöhte Zytokinproduktion aller TH-Populationen, besonders aber auch hier die IFNγ-Synthese, die bei chronischem atopischem Ekzem erhöht ist.
Bei den Patienten mit Psoriasis vulgaris zeigte sich eine massive Stimulation der IL-10- und der IL-5-Synthese durch P1 (10).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid mit der in SEQ ID NO:10 angegebenen Aminosäuresequenz.
Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die N-terminale Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:15 aufweist und durch Trypsin-Spaltung von S. aureus Enterotoxin B als 12 kD-Spaltfragment erhältlich ist.
Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Homologes oder ein Derivat des Polypeptids nach Anspruch 1 oder 2 ist, das an IgE bindet.
Polypeptid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Derivat ein oder mehrere L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ausgetauscht sind.
Polypeptid nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Proliferation von T-Lymphozyten nicht induziert.
Polypeptid nach den Ansprüchen 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in vitro die Synthese von Interferongamma stimulierter T-Lymphozyten hemmt.
Polypeptid nach den Ansprüchen 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in vitro sowohl die stimulierte als auch die spontane Zytokinproduktion von Th1- und Th2-Lymphozytensubpopulationen moduliert.
Polypeptid nach den Ansprüchen 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO:11 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet, daß es eine für ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 8 kodierende Nukleinsäuresequenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO:9 angegebene Nukleinsäuresequenz aufweist.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Immunmodulation.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Zytokinproduktion von Lymphozyten.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung der Zytokinproduktion von Lymphozyten.
Verwendung nach Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Lymphozyten T-Lymphozyten sind.
Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interferon-gamma, Interleukin-4 (IL-4), In terleukin-5 (IL-5), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13) ist.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen und/oder einem erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer verstärkten Produktion von Zytokinen und/oder einem. erhöhten Spiegel von IgE-Antikörpern einhergehen.
Verwendung nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interferon-gamma, Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-10 (IL-10), Interleukin-12 (IL-12) und/oder Interleukin-13 (IL-13) ist.
Verwendung nach Anspruch 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung Atopisches Ekzem, Asthma bronchiale, Rhinokonjunktivitis allergica, Psoriasis, Rheumatoide Arthritis öder Multiple Sklerose ist.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Th1- oder Th2-Immunantwort.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induktion oder Verstärkung einer Th1- oder Th2-Immunantwort
Verwendung nach den Ansprüchen 21 und 22 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Th1- oder Th2-Immunantwort einhergehen.
Verwendung nach den Ansprüchen 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung Psoriasis vulgaris, autoimmune Uveitis, Allergisches Kontaktekzem, Behcet's Syndrom, Diabetes mellitus, Hashimoto Thyreoiditis, Heliobacter pylori-Infektion, Lupus erythematodes, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Organtransplantat-Abstoßungsreaktion, Psoriasis arthropathica, Rheumatoide Arthritis und spontane, rekurrente Aborte.
Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn ist.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur in vitro-Hemmung der Interferon-gamma-Produktion in humanen, periphären T-Lymphozyten des Blutes.
Verwendung eines Polypeptids, das die Sequenz gemäß SEQ ID NO:10, eine dazu homologe oder davon abgeleitete Sequenz enthält, wobei das Polypeptid an IgE bindet, zur in vitro-Modulation der stimulierten und der spontanen Zytokinproduktion von Th1- und Th2-Lymphozytensubpopulationen.
Verwendung eines Polypeptids nach den Ansprüchen 1 bis 8 zur in vitro-Modulation der stimulierten und der spontanen Zytokinproduktion von Th1- und Th2-Lymphozytensubpopulationen.
Verwendung nach den Ansprüchen 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid ein Polypeptid mit einer von SEQ ID NO:10 abgeleiteten Sequenz ist, bei der ein oder mehrere L-Aminosäuren durch D-Aminosäuren ausgetauscht sind.
Pharmazeutische. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polypeptid nach den Ansprüchen 1 bis 8 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in SEQ ID NO:9 gezeigte Nukleinsäuresequenz in einen Expressionsvektor einbringt, man diesen in geeignete Wirtszellen einführt, man die Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die zur Proteinexpression geeignet sind und man das exprimierte Polypeptid, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, isoliert.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Enterotoxin B aus S. aureus mit Trypsin verdaut und man anschließend das 12 kD-Fragment aus dem Reaktionsansatz isoliert.