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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet einer Modulierung und
Regulierung von Immunantworten von Vertebraten. Sie berichtet insbesondere über ein
neues von Milch isoliertes Polypeptid, welches lösliches, Toll-ähnliches
Rezeptor Regulator Proteinmolekül
(sTLRR) genannt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso
ein verzehrbares Produkt, Tierfutter und eine Creme oder Lotion,
welche das Polypeptid umfassen.
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Der
sterile fötale
Darm wird von in der Umgebung vorhandenen Mikroben unmittelbar nach
der Geburt jäh
kolonisiert. Die hauptsächlichen
bakteriellen Bestandteile bei einer frühen Kolonisierung sind Gram-negative,
Endotoxin (LPS) erzeugende Bakterien. Sie können zu einer Zahl von infektiösen und
entzündlichen
Zuständen
des Gastrointestinaltrakts des Neugeborenen beitragen. Es wurde
gezeigt, dass Neugeborene, denen Muttermilch verabreicht wurde,
eine geringere Anfälligkeit
gegenüber
Darminfektionen, entzündlichen
Zuständen
des Darms, geringere Anfälligkeit
gegenüber
Atemwegs-Infektionen und im späteren
Leben weniger allergische Erkrankungen aufweisen. Eine Zahl von
menschlichen Milch Bestandteilen von, unter anderem, immunkompetente
Zellen, einen passiven Immunschutz verleihenden Antikörpern, menschlichen
Milch Oligosacchariden, Lysozym, Lactoferrin, und anderen hervorgerufenen
Faktoren können
die schützende
Rolle erklären.
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Toll
Rezeptoren, welche eine Zell Signalübertragung in Drosophila mediieren,
wurden in einem vollständig
anderen Zusammenhang gesehen. Diese wichtige Familie von Transmembranmolekülen ist
in erster Linie in Morphogenese einbezogen, wobei allerdings im
späteren
Leben der erwachsenen Fliege seine Aktivierung eine defensive Antwort
bei Infektionen induziert.
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Die
Säuger
Homologe der Toll Rezeptor Familie wurden jüngst entdeckt (Medzhitov R.,
Janeway CA. Jr., Innate immunity: the virtues of a nonclonal system
of recognition, Cell 91 (1997) 295-298). Die Säuger Homologe werden aufgrund
der offenkundigen Beziehung Toll-ähnliche
Rezeptoren (TLR) genannt. TLR sind, wie Toll und Toll-ähnliche
Proteine in der Fliege, Transmembran-Zelloberflächen Proteine, welche sich
in die intrazelluläre
Domäne
erstrecken. Der extrazelluläre
Bereich (N-terminales Ende) umfasst im Allgemeinen multiple Leucin-reiche
Wiederholungen (LRR) und bei den bekannten menschlichen und Drosophila
Familienmitgliedern ein oberes Cys-reiches Modul, welches vermutlich
einen Abstandhalter von gegenüberliegenden
Membranen (juxtamembrane) darstellt. Die intrazellulären (C-terminale End) Domänen des
Säuger
TLR und Drosophila Toll Proteine sind zu dem der gut beschriebenen
Interleukin 1 und 18 Rezeptoren (IL-1R und IL-18R) ähnlich,
was ähnliche
Mechanismen und Teilnehmer einer nach gelagerten Signaltransduktion
zeigt. Bisher wurde eine Familie von ungefähr zehn Säuger TLR identifiziert.
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Umfangreiche
Forschung wurde zwischenzeitlich durchgeführt, um potentielle Liganden
zu finden, welche die TLR mediierte Signalübertragung von der extrazellulären Seite
aktivieren könnten
und um den intrazellulären
Signalübertragungsweg
des aktivierten Rezeptors zu bestimmen.
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Es
wurde klar, dass die TLR Familienmitglieder ein Teil des Säuger immanenten
Immunsystems sind, welches für
ein Erkennen und eine Antwort auf Bakterien und bakterielle Zellwand
Bestandteile verantwortlich ist.
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Die
WO 0075358 basiert auf der
Entdeckung von neuen TOLL Familienmitgliedern (TOLL Nukleinsäure Familienmitgliedern).
Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen TOLL Moleküle als Ziele
für ein Entwickeln
modulierender Agenzien von Nutzen sind. Daher werden Nukleotid und
Aminosäure
Sequenzen offenbart und beansprucht. Die
1 der
WO 0075358 zeigt die Nukleotidsequenz
des menschlichen TOLL Proteins ebenso wie damit kodierte Aminosäuresequenz.
Dieses TOLL Protein kann als Membranproteine vorliegen, welche als
Rezeptoren fungieren, und sie können
in Immun Signalübertragungsmechanismen
einbezogen sein.
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Die
WO 0024776 offenbart eine
neue molekulare Spezies TLR6, welche zu der Toll Familie gehört. TLR6
reguliert daher die Expression mehrerer Gene, welche bei einer Immunantwort
teilnehmen. Ebenso wird ein den Rezeptor kodierendes Gen angegeben.
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Flo
T. H. et al., Journal of Endotoxin Research, 6(2) (2000), 106 offenbart
den Nachweis löslichen TLR2
in menschlichen Sera. Es wird aufgeführt, dass TLR2 in einer löslichen
Form in Blut vorliegt. Darüber hinaus
wurde ein Elisa für
den Nachweis des Signalübermittlers
etabliert. Lösliches
CD14, welches in Kolostrum und Milch angereichert ist und B Zellwachstum
und Differenzierung induziert, wird von Filipp D. et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States, 98 (2),
26. Jan. (2001), 603-8) beschrieben. Das Membranprotein CD 14, welches
als ein Corezeptor für
bakterielle Lipopolysaccharide dient, löst die Induktion von entzündlichen
Antworten aus. Die Toll-ähnlichen
Rezeptoren TLR2 und TLR4 sind in die Endotoxin-mediierte zelluläre Aktivierung
von B Zellen durch lösliches
CD14 impliziert. LPS Signalübertragung
wird durch die Anwesenheit von TLR4 beeinflusst wohingegen TLR2
keine Wirkung aufweist. Xu Yingwu et al. berichtet in Nature (London),
Vol. 408, No. 6808 (2000), 111-15 über die Kristallstrukturen
der konservierten cytoplasmatischen Domänen (TIR Domänen) der
Toll-ähnlichen
Rezeptoren TLR1, TLR2 und eines TLR2 Mutanten. Ein Ausrichten bzw.
Alignment der jeweiligen TIR Domänen
zeigt an, dass die TIR Domänen
von TLR1 und TLR2 50% Aminosäure
Identität
teilen. Mantovani A. et al., Trends in Immunology, 22(6), 1 Jun.
(2001), 328-36 offenbart Köder-Rezeptoren,
wie beispielsweise Toll-ähnliche
Rezeptoren, die bestimmte entzündliche Cytokine
erkennen können
und schlägt
deren Verwendung zum Regulieren der Wirkung von primären entzündungsförderlichen
Cytokinen und Chemokinen vor. Darüber hinaus wird Regulierung,
Expression und Freisetzung von Köder-Rezeptoren
angegeben. Die
WO 99/20756 betrifft
die Identifizierung und Isolierung von drei DNA Sequenzen, die menschliche
Toll Homologe kodieren, von Plazentagewebe isoliert wurden und die
rekombinante Herstellung der jeweiligen Polypeptide in CHO Zellen,
Hefe oder E. coli. Die Deletion oder Substitution der Transmembrandomäne stellt
eine lösliche
Form der Proteine durch Verringern deren zellulärer oder Membranlipid Affinität bereit
und verbessert die Wasserlöslichkeit.
Labeta M. O. et al. offenbart in dem Journal of Experimental Medicine,
191(10), 15 May (2000), 1807-12 die Mengen an menschlichem löslichen
CD14 während
Schwangerschaft und nach der Geburt. Die Perspektiven eines Modifizierens
der antimikrobiellen Eigenschaften von Milch werden von Kolb A.
F., Biotechnology Advances, 19(4) 4 July (2001), 299-316 aufgeführt.
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Neben
der wissenschaftlichen Forschung wurde keine technisch verwertbare
Wirkung und kein anderes Fungieren als die/das der vorstehend aufgeführt beschriebenen
bis jetzt offenbart.
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Daher
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
eines Mittels zum Verabreichen einer aktiven Substanz an ein Individuum,
wodurch die Substanz die auslösenden
Wege regulieren wird, welche durch bakterielle Produkte wie durch
Bestandteile von TLRs, und insbesondere TLR-2 mediiert, induziert
werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher in einer ersten Ausführungsform
ein aus Milch erhältliches
Polypeptid mit einem durch SDS-PAGE-Analyse erfassten Molekulargewicht
von ungefähr
22, 25, 38, 40, 60, 70, 80 kDa bereit. Das Polypeptid weist ferner
eine Sequenzähnlichkeit
von mindestens 90% mit dem TLR-Rezeptor von einer von SEQ ID Nr.
1 oder 2 auf.
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In
einer zweiten Ausführungsform
ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Homolog der
oder verwandt mit der Toll-like bzw. ähnlichen Rezeptor (TLR)-Familie
ist.
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In
einer dritten Ausführungsform
ist das Polypeptid durch mit einem anti-TLR-Antikörper durchgeführte Immunpräzipitation
von Säugerfluiden
bzw. Flüssigkeiten,
wie Brustmilchserum, Plasma oder Darminhalt, erhältlich.
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In
einer vierten Ausführungsform
wird das vorliegende Polypeptid als ein Medikament verwendet.
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In
einer fünften
Ausführungsform
wird ein verzehrbares Produkt bereitgestellt, welches Beimengungen des
vorliegenden Polypeptids umfasst.
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In
einer sechsten Ausführungsform
wird eine Creme, Lotion oder Salbe bereitgestellt, welche Beimengungen
des vorliegenden Polypeptids umfassen.
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In
einer siebten Ausführungsform
wird das vorliegende Polypeptids als ein Bestandteil in einem funktionellen
Lebensmittel oder Kosmetikartikelrtikel verwendet.
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In
einer achten Ausführungsform
wird die Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments
für die
Prophylaxe, Verhinderung oder Behandlung einer mit entzündlichen
Zuständen
oder allergischen Reaktionen verbundenen Krankheit oder für die Modulation
immunologischer und/oder entzündlicher Prozesse
bereitgestellt.
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In
den Figuren,
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zeigt 1 eine
Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen unter reduzierenden
Bedingungen unter Verwendung eines 10% SDS Gels. STLRR Banden wurden
unter Verwendung des anti-TLR2 polyklonalen Antikörpers deutlich
gemacht (TLR2 Ab bzw. Ak, Spuren 1 und 2). Der anti-TLR2 Antikörper wurde
vor einem Blotten ebenso mit dem Peptid inkubiert, welches für ein Erzeugen
des Antikörpers
verwendet wurde (TLR2 Peptid, siehe Spuren 3 und 4). Ein anderer
Antikörper
wurde ebenso als Isotypenkontrolle (Spur 5) getestet (IgG).
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zeigt 2 eine
Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen, die wie
vorstehend dargelegt (entsprechend zum Schema der 1,
Spuren 1 und 2) von sTLRR an verschiedenen Tagen nach der Geburt
gesammelt wurden. Die Figur zeigt ebenso sCD 14 Konzentrationen,
welche parallel zu der sTLRR Analyse bestimmt wurden.
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zeigt 3 eine
Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen, die an verschieden
Tagen nach der Geburt gesammelt wurden. Ein anti-TLR2 polyklonaler
(Ziegen) Antikörper
(sc 8689, Santa Cruz, Ca, USA) wurde gegen ein Peptid mit 17 Aminosäuren erzeugt,
das den N-Terminus des menschlichen TLR2 Proteins abbildet bzw.
kartiert, und zum Immunoblotten verwendet. Die Fragmente des sTLRR
und deren Größen sind:
1 (80 kDa), 2 (70 kDA), 3 (60 kDA), 4 (40 kDA), 5 (25 kDA) und 6
(22 kDA) (Beispiel 7).
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung eines
molekularen Bestandteils von menschlicher Brustmilch, welcher eine
hohe Homologie mit der extrazellulären Domäne von TLRs Molekülen und
insbesondere mit TLR-2 zeigt. Dieser Milch Bestandteil stellt daher
ein natürlich
auftretendes, lösliches
Derivat des menschlichen TLR2 dar. Es ist insbesondere überraschend,
dass eine lösliche
Variante eines als Transmembranprotein bekannten Proteins in menschlicher
Milch gefunden wurde. Die vorliegende Erfindung beruht darüber hinaus
auf der Möglichkeit,
dass das lösliche
Toll-ähnliche
Rezeptor Regulatormolekül (anschließend sTLRR)
in Milch durch seine Wechselwirkungen mit putativen TLR2 Liganden,
d.h. Lipoproteine von Gram-positiven Bakterien, LPS und sCD 14.
Diese spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Immunantworten
von Säugern,
insbesondere von Immunantworten gegenüber in den Darmtrakten von Säugern vorliegenden
bakteriellen konservierten Molekülen.
Wir bezeichnen dieses Molekül
daher als Toll-ähnliches
Rezeptor Regulatormolekül
oder Toll-ähnlichen
Rezeptor.
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Polypeptids
besteht darin, dass es ein Werkzeug für ein Regulieren von entzündlichen
Reaktionen eines Säugers
gegenüber
einem Antigen bereitstellt.
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Ein
anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie
ein Polypeptid bereitstellt, welches bei einem Inhibieren, Herunterregulieren
oder Verhindern von entzündlichen
Reaktionen in einem Säuger wirksam
ist.
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Ein
noch weiter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass
sie ein Polypeptid bereitstellt, welches als Medikament oder Kosmetikartikel
geeignet ist.
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Ein
noch weiter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass
sie insbesondere für
eine Prophylaxe, Verhinderung oder Therapie von Magen-Darm Entzündungen
geeignet ist.
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Im
Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll der Begriff "umfassen" ein "einschließlich, unter
anderem" bedeuten.
Es ist nicht beabsichtigt, dass es als "bestehend aus ausschließlich" ausgelegt wird.
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Im
Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll der Begriff "ein Homolog von TLR" oder "ähnlich zu TLR" Proteine bedeuten,
welche durch Antikörper
erkannt werden, die an irgendein bekanntes TLR spezifisch binden.
Insbesondere Antikörper,
welche an einen Bereich in der Ektodomäne von irgendeinem bekannten TLR
binden. Da erwartet wird, dass neue Familienmitglieder von TLR in
Menschen ebenso wie in anderen Organismen gefunden werden, soll
die Definition ebenso Proteine einschließen, welche durch Antikörper erkannt werden,
die auf diese neuen TLR Proteine gerichtet sind.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Aktivität" nicht auf enzymatische Aktivität beschränkt ausgelegt
werden. Er soll jedoch ebenso die Funktion eines Bindens eines Liganden
oder einer Gruppe von Liganden betreffen, welche selbst aneinander
gebunden sein können.
Daher sind alle Funktionen, welche sTLRR erfüllen kann, in dem Begriff "Aktivität" umfasst.
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Der
Begriff "wirksam" betrifft den Zustand
eines Moleküls,
beispielsweise eines Peptids, in welchem es die Funktionen ausführt, welche
es für
gewöhnlich
unter in vivo Bedingungen ausführt.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "löslich" Polypeptide, welche in ihrer wirksamen
Form und unter den Umständen
ihrer natürlichen
Funktion löslich
sind. Sie sind daher bei einem pH löslich, welcher beispielsweise
dem pH von menschlicher Brustmilch entspricht.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "sTLRR", welcher eine Abkürzung von "löslichem Toll-like bzw. -ähnlichem
Rezeptor Regulatormolekül" darstellt, irgendein
erfindungsgemäßes Polypeptid
umfassen. Aus Gründen
der Wirtschaftlichkeit und des Platzes wird der Begriff sTLRR manchmal verwendet,
ebenso weil er als die am besten geeignete Bezeichnung angesehen
wird, welche seine Beziehung und/oder seine Befähigung von anti-TLR Antikörpern erkannt
zu werden widerspiegelt und da er löslich ist.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "lösliches Toll- ähnliches Rezeptor Regulatormolekül" (sTLRR) bedeuten,
dass das neue Polypeptid in irgendeiner Zell-freien Präparation
von biologischen Fluiden, einschließlich von menschlicher Milch
und Plasma aber nicht darauf beschränkt, nachgewiesen werden kann.
Irgendeine gereinigte oder halbreine Form dieses von den erwähnten Quellen
erhaltenen Polypeptids zeigt vorher die durch diese Erfindung dokumentierte
Aktivität.
STLRR kann beispielsweise in anderen Körperfluiden als Milch, wie
beispielsweise Blut, oder in Milch von anderen Säugern als Menschen, wie beispielsweise
von einer Ziege, einem Schaf und einer Kuh, gefunden werden.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Mutation" alle bekannten Arten
von Änderungen
in einer Nukleotidsequenz umfassen. Er ist nicht beabsichtig ausschließlich Punktmutationen
zu umfassen, sondern ebenso beispielsweise Deletion, Insertion,
Rasterverschiebung, Nonsense, Missense Mutationen.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Homologie" oder" Homolog", als Umfassen von
Homologen einer Aminosäuresequenz,
verstanden werden ein "Aufweisen
eines gemeinsamen evolutionären
Ursprungs" zu bedeuten.
Dies wird häufig
zusammen mit dem Begriff "Ähnlichkeit" verwendet, welcher
Vergleiche einer Sequenz mit einer anderen Sequenz betrifft und
welcher bei einer Homologiebestimmung behilflich sein kann. Modelle
für eine
Homologiebestimmung werden nachstehend gegeben.
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Der
Begriff "funktioneller
Nahrungsmittel Bestandteil" soll
eine Substanz betreffen, welche obschon bioaktiv kein Medikament
darstellt. Medikamente umfassen für gewöhnlich aktive Prinzipien, welche
für eine
Verwendung als ein Medikament von Regierungsautoritäten zugelassen
oder erlaubt werden müssen,
da ihr Verzehr unerwünschte
Nebenwirkungen aufweisen kann. Funktionelle Nahrungsmittel Bestandteile
widerspiegeln für
gewöhnlich
andererseits aktive Prinzipien jenseits eines strengen Zwecks als
Nahrungsmittel und von denen bekannt ist für einen Verbraucher hauptsächlich aufgrund
ihres natürlichen
Auftretens in einem Nahrungsmittel, wie beispielsweise Milch, nicht
schädlich
zu sein.
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Das
Polypeptid ist aus Milch erhältlich
und weist ein durch SDS-PAGE-Analyse erfasstes Molekulargewicht
von ungefähr
22, 25, 38, 40, 60, 70, 80 kDa auf und weist ferner eine Sequenzähnlichkeit
von mindestens 90% mit dem TLR-Rezeptor von einer von SEQ ID Nr.
1 oder 2 auf.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann eine Sequenzähnlichkeit
zu dem Polypeptid, wie durch irgendeine von SEQ ID Nr. 1 oder 2
identifiziert, von beispielsweise zumindest 95% und vorzugsweise
von zumindest 98% aufweisen.
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Diese
Molekulargewichte der Polypeptide betreffen jedoch glycosylierte
Peptide, welche das Gewicht beeinflussen. Beispielsweise würde der
erfindungsgemäße 80 kDa "Volllängen" extrazelluläre, lösliche Teil
von menschlichem TLR2 (sTLRR) ohne Glycosylierung nur 64,4 kDa aufweisen.
Es wird erwähnt,
dass menschliches sTLRR 4 mögliche
N-Glycosylierungs stellen (-Asn-Xaa-Ser/Thr-) und bovines bzw. vom
Rind stammendes drei davon aufweist (Mensch: Asn96, Asn181, Asn396,
Asn424; Rind: Asn94, Asn178, Asn422).
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
ist in einer weiteren Ausführungsform
ein Homolog von oder ähnlich
bzw. verwandt zu der Toll-ähnlichen
Rezeptor (TLR) Familie und ist in seiner wirksamen Form löslich.
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Daher
kann das erfindungsgemäße Polypeptid
durch seine Befähigung
mit TLR für
den gleichen Liganden oder der gleichen Gruppe von Liganden zu konkurrieren
gekennzeichnet sein.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist das erfindungsgemäße Polypeptid
durch Immunpräzipitation
von Säugerfluiden,
wie beispielsweise Brustmilch, Serum, Plasma oder Darmgehalt, erhältlich,
welche beispielsweise mit einem anti-TLR Antikörper durchgeführt wird.
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Das
erfindungsgemäße sTLRR
kann von menschlicher Milch, insbesondere während der frühen Stadien
der Stillzeit, erhalten werden. Offenkundig wechselwirkt das sTLRR
mit oder bindet an andere Proteine oder Moleküle, welche in Milch vorliegen
oder von äußeren Quellen
stammen. Die Größe des Polypeptids,
wie auf einem SDS Gel bestimmt, kann in Abhängigkeit von den daran gebundenen
Cofaktoren/Molekülen
variabel sein.
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Eine
mögliche
und einfache Technik zum Isolieren des Proteins besteht in der Affnitätschromatographie,
welche ebenso Immunochromatographie genannt wird. Dieses dem Fachmann
gut bekannte Verfahren verwertet das spezifische Binden eines Proteins
gegen einen spezifischen Antikörper.
Ein anti-TLR Antikörper (beispielsweise
ein anti-TLR2 Antikörper)
wird auf einer festen Matrix gehalten. Der Antikörper kann kovalent an die Matrix
gebunden sein, wobei er seinen variablen und spezifischen Teil aussetzt.
Die Matrix kann aus chemisch inerten Kügelchen bestehen, an welchen
der Antikörper
angebracht ist. Die an den Antikörper
gebundenen Kügelchen
werden auf eine Säule
geladen. Falls eine sTLRR (beispielsweise menschliche Milch oder
Serum) umfassende Flüssigkeit
durch die Säule
gespült
wird, wird das Polypeptid and den Antikörper gebunden und dadurch zurückgehalten
werden. Nach Waschen der sTLRR umfassenden Säule, kann es eluiert werden.
Die dadurch eluierte Proteinfraktion kann ferner auf einem SDS-Polyacrylamid
Gel getrennt und auf einen Nitrocellulose Filter durch eine weitere
Elektrophorese übertragen
werden. Lösliches
sTLRR kann schlussendlich gemäß eines
herkömmlichen
Western Blot Verfahrens sichtbar gemacht werden. Alternativ kann
es durch Zentrifugation oder Ultrafiltration konzentriert und in
dieser Form zu einem verzehrbaren Produkt in wirksamen Mengen hinzugegeben
werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann das erfindungsgemäße Polypeptid
durch einen gegen den extrazellulären Teil eines TLR gerichteten
Antikörpers
erkannt werden.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
ist daher nach Immunopräzipitation
durch SDS-PAGE,
Elektroblotten auf eine geeignete Membran und Proteinelution erhältlich.
Dem Fachmann sind diese Techniken gut bekannt.
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In
einer anderen Ausführungsform
weist das erfindungsgemäße Polypeptid,
falls mit einem TLR Polypeptid verglichen, höchste Sequenzähnlichkeit
und/oder Homologie zu der extrazellulären Domäne des TLR Polypeptids auf.
Das erfindungsgemäße Polypeptid
weist vorzugsweise höchste
Sequenzähnlichkeit
zu dem menschlichen TLR2 Molekül
auf.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
ist in noch einer anderen Ausführungsform
verwandt bzw. ähnlich zu
dem oder ein Homolog des menschlichen TLR2 Moleküls.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
ist in noch einer weiteren Ausführungsform
von menschlicher Brustmilch abgeleitet oder zu einer von Milch abgeleiteten
Variante identisch. Ein Weg zur Isolierung des Polypeptids von menschlicher
Brustmilch wird vorstehend offenbart.
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Bezüglich des
Antikörpers
gemäß einer
erfindungsgemäßen Ausführungsform
ist es klar, dass dem Fachmann die Herstellung eines monoklonalen
oder polyklonalen Antikörpers
gegen ein spezifisches Antigen oder Protein gut bekannt ist. Ist
das Protein einmal isoliert worden kann ein Antikörper gemäß herkömmlicher Techniken
hergestellt werden. Ein wirksamer, polyklonaler (Kaninchen) Antikörper kann
durch Immunisieren von Tieren mit einem künstlich erzeugten 20-mer Peptid,
Kartieren an dem N-Terminus von menschlichen TLR2 (anfangend mit
5 AA bzw. AS von dem N-Terminus) hergestellt werden. Derartige Antikörper zeigten
eine äußerst gute
Reaktivität
mit den löslichen
Formen von TLR2.
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Ein
im Handel erhältlicher
Antikörper,
welcher für
ein Nachweisen von sTLRR der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist,
ist der anti-TLR2 polyklonale (Kaninchen) Antikörper von IMG 410 (www.imgenex.com), welcher
durch die Biocarta Europe GmbH vertrieben wird, und welcher durch
Immunisieren mit einer Mischung von drei Peptiden hergestellt wurde,
die den Aminosäuren
180-196, 353-370 und 473-489 von menschlichem TLR2 entsprechen.
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Ein
weiterer Antikörper
ist der anti-TLR2 polyklonale (Ziegen) Antikörper TLR2 (N-17) Santa Cruz Biotech
(www.scbt.com) Kat.nr.: sc-8689, ein Antikörper, welcher gut bei Western
und Immunopräzipitationen funktioniert.
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Mögliche Variationen
des Nukleinsäuremoleküls, von
welchen beabsichtigt ist von dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül umfasst
zu sein, bestehen in Nukleinsäuremolekülen, die
unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung
hybridisieren.
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Das
erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann ferner
ein Expressionssystem umfassen, worin das Expressionssystem ein
Polypeptid erzeugen kann, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest 50%
Identität
zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid
aufweist.
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Zur
Expression eines biologisch aktiven sTLRR wird die sTLRR oder sein
funktionelles Äquivalent
kodierende Nukleotidsequenz in einen geeigneten Expressionsvektor
eingefügt,
d.h. einen Vektor, welcher die notwendigen Elemente für die Transkription
und Translation der eingefügten
kodierenden Sequenz aufweist.
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Dem
Fachmann gut bekannte Verfahren können verwendet werden, um Expressionsvektoren
zu konstruieren, welche eine sTLRR kodierende Sequenz und geeignete
Transkriptions- und Translations-Regler enthalten. Diese Verfahren
umfassen rekombinante in vitro Techniken, Synthesetechniken und
in vivo Rekombination oder genetische Rekombination. Derartige Techniken
werden beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning,
A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press beschrieben.
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Mehrere
Expressionsvektor-/Wirts-Systeme können verwendet werden, um eine
sTLRR kodierende Sequenz aufzunehmen und zu exprimieren. Diese umfassen,
sind allerdings nicht darauf begrenzt, Mikroorganismen, wie beispielsweise
Bakterien, welche mit einem rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid
oder Cosmid DNA Expressionsvektoren transformiert sind; mit Hefe
Expressionsvektoren transformierte Hefe; mit viralen Expressionsvektoren
infizierte Insekten Zellsysteme; und mit viralen Expressionsvektoren
infizierte pflanzliche Zellsysteme oder tierische Zellsysteme. Im
Grunde können
alle Expressionssysteme verwendet werden, welche Säuger-, bakterielle,
pflanzliche oder Pilz-Zellen einbeziehen.
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Überraschenderweise
wurde kein funktionelles mRNA Transkript des sTLRR in menschlichen
Brustepithelzellen gefunden, obgleich theoretisch versprechende
Transkripte gefunden wurden. Darüber
hinaus wurde überraschenderweise
gefunden, dass sich funktionelle (lösliche) Varianten von sTLRR
wesentlich in der Größe (37,
40, 60, 70, und 80 kDa) unterscheiden können. Diese Beobachtungen legen
nahe, dass sTLRR durch Prozessieren von Volllängem TLR2 erzeugt wird. Darüber hinaus
verdeutlicht die Tatsache, dass sTLRR mit gegen den extrazellulären Teil
von TLR2 gerichteten Antikörpern
wechselwirkt, dass erfindungsgemäßes sTLRR
dem extrazellulären
Teil von TLR oder einem kürzeren
Fragment davon entspricht.
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Seq.
ID Nr. 1 und 2 entsprechen dem prozessierten und löslichen
extrazellulären
Teil von menschlichem und bovinen TLR2.
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In
dem Teil der Sequenzliste der vorliegenden Beschreibung bezeichnet
Seq. ID Nr. 1 ein in menschlicher Milch auftretendes erfindungsgemäßes Polypeptid,
zusammen mit kürzeren
Fragmenten davon.
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In
dem Teil der Sequenzliste der vorliegenden Beschreibung bezeichnet
Seq. ID Nr. 2 ein erfindungsgemäßes Polypeptid,
welches das funktionelle Homologe von Seq. ID Nr. 1 in Bos taurus
ist. Das funktionelle Homologe von Seq. ID Nr. 2 kann für eine industrielle
Anwendung bedeutsamer sein, da es aus boviner Milch in beachtlichen
Mengen angereichert oder isoliert werden kann.
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Das
Protein selbst könnte
durch Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese einer sTLRR Aminosäuresequenz
hergestellt werden.
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Bezüglich einer
Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids
als ein Medikament, funktioneller Nahrungsmittelbestandteil oder
Kosmetikartikel, kann das Polypeptid für ein Verhindern oder Herunterregulieren
von entzündlichen
Zuständen
in einem Säuger
verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann darüber
hinaus bei der Vorbeugung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie
von entzündlichen
Zuständen
in einem Säuger
verwendet werden.
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Die
entzündlichen
Zustände
sind beispielsweise entzündliche
Zustande des Magen-Darm-Trakts
oder der Haut eines Säugers.
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Die
Verabreichungsform des Polypeptids ist unwesentlich. Das Polypeptid
kann beispielsweise einfach direkt verzehrt werden und oral nach
Isolierung und Konzentration, wie vorstehend aufgeführt. Dies
gilt insbesondere, falls entzündliche
Zustande des Magen-Darm-Trakts
direkt behandelt werden.
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Falls
das Polypeptid für
eine Behandlung von entzündlichen
Zuständen
der Haut verwendet wird, kann das sTLRR zu irgendeiner geeigneten
Lotion, Creme, Balsam und ähnlichem
hinzugegeben werden, welche für
ein Behandeln oder Verhindern von Reizungen oder Entzündungen
der Haut vorgesehen sind. Das sTLRR kann beispielsweise zu Öl in Wasser
oder Wasser in Öl
Emulsionen hinzugegeben werden. Vorzugsweise wird hochkonzentriertes
sTLRR nach Emulgieren der öligen
und wässrigen
Phase hinzugegeben. Es ist ebenso möglich sTLRR nach dem Homogenisierungsschritt
an dem Ende hinzu zugeben. Das konzentrierte sTLRR wird vorzugsweise
unter Rühren
bei ungefähr
35°C hinzugegeben.
In der
US 5,744,145 (Nestec
S. A.) werden eine Zahl von kosmetischen Zusammensetzungen offenbart,
zu denen sTLRR einfach hinzugegeben werden kann.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann ferner als ein dermatologisches Agens verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
kann in einem anderen Beispiel für
die Verhinderung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie von entzündlichen
Zuständen
der Schleimhaut (muscuous) Membranen oder Mukosi eines Säugers verwendet
werden.
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Darüber hinaus
kann das erfindungsgemäße Polypeptid
für die
Verhinderung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie von allergischen
Reaktionen in einem Säuger
verwendet werden. Bezüglich
des erfindungsgemäßen verzehrbaren
Produkts kann es sich dabei um ein Tierfutter handeln. Das verzehrbare
Produkt ist vorzugsweise für
den Menschen, mehr bevorzugt als Zusammensetzung für Kleinkinder,
vorgesehen. Es kann sich um eine Nahrungs- oder Kleinkind-Formulierung,
ein gekühltes
oder lagerstabiles Molkereiprodukt oder um Süßwaren handeln.
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Eine
Ernährungsformulierung
kann auf irgendeine geeignete Art hergestellt werden. Die Ernährungsformulierung
kann beispielsweise durch Zusammenmischen einer Molkereiprotein
Quelle, Kohlenhydrat Quelle und einer Fett Quelle in geeigneten
Verhältnissen
hergestellt werden. Emulgatoren können, sofern verwendet, in
die Mischung eingefügt
werden. Vitamine und Mineralien können an diesem Punkt hinzugegeben
werden, werden allerdings für
gewöhnlich
später
zum Vermeiden einer thermischen Zersetzung hinzugegeben. Irgendwelche
lipophilen Vitamine, Emulgatoren und ähnliches können vor einem Mischen in der
Fett Quelle gelöst
werden. Anschließend
kann Wasser, vorzugsweise einer Umkehrosmose unterzogenes Wasser,
hineingemischt werden, um eine flüssige Mischung zu bilden. Die
Temperatur des Wassers beträgt
geeigneterweise ungefähr
50°C bis
ungefähr
80°C, um
die Dispersion der Bestandteile zu unterstützen. Im Handel verfügbare Verflüssiger können zur
Bildung der flüssigen
Mischung verwendet werden. Die flüssige Mischung kann anschließend, beispielsweise
in zwei Stufen, homogenisiert werden.
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Gereinigtes
sTLRR kann in wirksamen Mengen zu der flüssigen Formulierung direkt
hinzugegeben werden. Der pH der Formulierung kann zwischen 4,5 und
7,5 liegen, was bedeutet, dass das Protein löslich ist. Naturgemäß kann der
erlaubte pH Bereich verschieden sein, falls die chemischen Eigenschaften
des sTLRR, beispielsweise durch Glycosylierung, oder durch Addition,
Deletion oder Ersetzen von Aminosäuren, geändert wurden.
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Eine
konzentrierte Lösung
eines sTLRR wird in einer Ausführungsform
zu einer flüssigen
(wiederhergestellten) Ernährungsformulierung
hinzugegeben, wobei die Ernährungsformulierung
irgendeinen erwünschten
Energiegehalt aufweist. Das sTLRR liegt vorzugsweise in einer Endkonzentration
von 50 ng pro ml bis 10 μg
pro ml, mehr bevorzugt 100 ng bis 1000 ng pro ml, vor. Die Konzentration
kann in der Ernährungsformulierung
ebenso von den Umständen
der Diät
abhängen
und insbesondere, ob die Ernährungsformulierung
eine vollständige
Diät ausmacht
oder nicht. Ebenso können
andere Umstände
die Endkonzentration von sTLRR in der Formulierung beeinflussen,
wie beispielsweise die Menge an verzehrter Formulierung, die Aktivität des sTLRR
oder der Zustand des Patienten. In der Regel sollte eine Tagesdosis
zwischen 10 μg
bis 20 mg Einheiten des Proteins, vorzugsweise 100 μg bis 1 mg
Einheiten in Abhängigkeit
von verschiedenen Zuständen
umfassen.
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Dem
Fachmann ist es klar, das die Funktionen des sTLRR Polypeptids durch
mehrere verschiedene Aminosäuresequenzen
erhalten werden können.
Demgemäß betrifft
eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform
Polypeptide, welche Änderungen
in Aminosäureresten
umfassen, die für
die Aktivität
unwesentlich sind. Derartige Proteine unterscheiden sich in der
Aminosäure
Sequenz von dem Polypeptid, wie erfindungsgemäß isoliert, und behalten dennoch
biologische Funktion oder Aktivität bei. Aminosäuren können beispielsweise
durch "nicht-essentielle" bzw. unwesentliche
Aminosäurereste
ersetzt werden. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest
ist ein Rest, welcher in der Wildtyp Sequenz des sTLRR ohne ein Ändern der
biologischen Funktion oder der strukturellen Faltungen geändert werden
kann, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest
für die
biologische Funktion erforderlich ist. Ähnliche Funktionen richten
sich häufig
nach Aminosäuren
mit ähnlichen
strukturellen oder chemischen Eigenschaften, wie beispielsweise
Ersetzen von Leucin mit Isoleucin. Eine Variante kann seltener „nicht-konservative" Änderungen, wie beispielsweise
Ersetzen von Glycin mit Tryptophan, aufweisen. Das Gleiche gilt
nicht nur für
einzelne Aminosäuren,
sondern für
gesamte Aminosäuresequenzen,
welche ohne Ändern
der biologischen Funktion des Proteins hinzugefügt oder weggelassen werden
können.
Daher können ähnliche
geringfügige
Variationen ebenso Aminosäure
Deletionen oder Insertionen oder beides umfassen. Eine kurze Aminosäuresequenz
in einem viel größeren Polypeptid
ist sehr häufig
für die
biologische Aktivität
oder Funktion eines Proteins grundlegend verantwortlich.
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Die
vorliegende Erfindung deckt daher ebenso Homologe von sTLRR.
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Die
Homologie oder Sequenzähnlichkeit
oder Sequenzidentität
von Proteinsequenzen kann nach im Stand der Technik gut bekannten
Techniken, beispielsweise durch Verwenden bekannter Software oder
Computerprogramme, beispielsweise dem BLAST (Basic Local Alignment
Sequence Tool) Programm basierend auf der Arbeit von D. Lipman und
Mitarbeiter (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meyers, E. W. & Lipman, D. J. „Basic
local alignment search tool.",
J. Mol. Biol., 215 (1990) 403-10 und Altschul, S. F., Madden, T.
L., Schäffer,
A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of
protein database search programs.", Nucleic acids Res. 25 (1997) 3389-3402),
einfach bestimmt warden.
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BLAST® (Basic
Local Alignment Search Tool) besteht in einem Satz von Programmen
zur Ähnlichkeitssuche,
welche entwickelt sind, um alle der verfügbaren Sequenzdatenbanken,
ohne Berücksichtigung
ob die Suche auf Protein oder DNA erfolgt, zu erforschen. Die BLAST
Programme wurden für
Geschwindigkeit mit minimalem Empfindlichkeitsverlust auf entfernte
Sequenzbeziehungen entwickelt. Die in einer BLAST Suche zugewiesenen
Werte weisen eine gut definierte statistische Interpretation auf,
was es einfacher macht wahres Passen von zufälligen Hintergrundtreffern
zu unterscheiden. BLAST verwendet einen heuristischen Algorithmus,
welcher lokal im Gegesatz zu globalen Ausrichtungen sucht und daher
Beziehungen unter Sequenzen nachweisen kann, welche nur isolierte
Bereiche einer Ähnlichkeit
teilen (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meyers, E. W. & Lipman, D. J. „Basic
local alignment search tool.",
J. Mol. Biol., 215 (1990) 403-10).
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BLAST
beruht auf einem modifizierten Algorithmus von Smith and Waterman
(Smith, T. F. & Waterman,
M. S. „Identification
of common molecular subsequences." J. Mol. Biol., 147 (1981) 195-197)
und Sellers (Sellers, P. H. "Pattern
recognition in genetic sequences by mismatch density.", Bull. Math. Boil.,
46 (1984) 501-14), um den besten Abschnitt einer Identität oder Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen zu finden. Falls ein Sequenz Ausrichtungsprogramm,
wie beispielsweise BLAST, verwendet wird, um den Grad einer Sequenzhomologie, Ähnlichkeit
oder Identität
zu bestimmen, kann die Grundeinstellung verwendet werden, oder eine geeignete
Wertematrix, wie beispielsweise BLOSUM oder PAM, welche ausgewählt werden
können,
um Identität, Ähnlichkeit
oder Homologie Werte zu optimieren.
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Um
künstlichen
Modifikationen der Aminosäuresequenz,
welche aus mehreren Gründen
eingefügt werden
können,
Rechnung zu tragen, umfasst die vorliegende Erfindung ebenso Sequenzen,
welche nicht homolog sind, sondern zumindest eine Sequenzähnlichkeit,
wie nachstehend definiert, oder die dreidimensionale Struktur oder
die Funktion des Proteins gemäß der vorliegenden
Erfindung teilen.
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In
einer Ausführungsform
umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid
eine Aminosäuresequenz,
welche zumindest ungefähr
95%, 98% oder mehr zu dem Protein mit Seq. ID. Nr. 1 oder 2 ähnlich ist.
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Das
wirksame lösliche
Polypeptid gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ebenso ein Dimer, Trimer, usw. sein. Es kann ein
homo- oder ein heterodimer, -trimer, -polymer sein. Die verschiedenen
Domänen
des wirksamen Polypeptids sind beispielsweise durch eine oder mehrere
Disulfidbrücken
kovalent verbunden. Insbesondere in extrazellulären Proteinen oder extrazellulären Domänen werden
Disulfidbindungen in verschiedenen Proteinen oder in den gleichen
Proteinen häufig
gefunden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Möglichkeit,
dass zwei identische oder verschiedene Polypeptidketten zum Bilden
eines Homo- oder eines Heterodimers oder Polymers miteinander verbunden
sind. Es ist ebenso möglich,
dass zwei sehr ähnliche
Domänen,
welche sich nur in eine begrenzten Zahl von Aminosäureresten
oder welche verschieden glycosyliert sind, ein Hetero- oder Homodimer
bilden. Die vorliegende Erfindung umfasst in all diesen Fällen Proteine
oder multi-Domänen
Proteine, welche zumindest eine Domäne mit den Eigenschaften gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen.
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Seine
Löslichkeit
unter physiologischen Bedingungen und zur gleichen Zeit seine Bedeutung
in immanenten Immunantworten macht sTLRR zu einem wertvollen Werkzeug
bei einer großen
Zahl von pathogenen oder nicht-pathogenen Zuständen. STLRR kann beispielsweise
für diagnostische
Zwecke verwendet werden, wobei seine Befähigung zum Binden an bakterielle
Epitope oder Antigene verwendet wird. Die Bedeutung von sTLRR ist
unter diesem Gesichtspunkt ähnlich
zu jener von Antikörpern.
Daher kann sTLRR insbesondere bei der Entwicklung neuer diagnostischer
Ziele oder therapeutischen Agenzien bei einem Regulieren einer Immun-
oder entzündlichen
Antwort von Nutzen sein. Wie beispielsweise Zustände, welche sich auf eine Fehlregulation
einer Immunantwort beziehen, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen,
entzündliche
Erkrankungen des Darms oder Allergie, einschließlich von Asthma.
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Beispiele
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Beispiel 1: Nachweis von löslichem
TLR2 in menschlicher Brustmilch
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Verfahren
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Menschliche
Milchproben, welche an verschieden Tagen nach der Geburt (0, 5,
6, 8) genommen wurden, wurden 1:150 mit Laemmli reduzierendem Probenpuffen
verdünnt,
auf 10% SDS-PAGE (MiniProtean II, BioRad) einer Elektrophorese unterzogen
und durch Western Blotten, wie vorstehend beschrieben (Durieux, J.
J., N. Vita, O. Popescu, F. Guette, J. Calzada-Wack, R. Munker,
R. E., Schmidt, J. Lupker, P. Ferrara, H. W. Zigler-Heitbrock und
M. O. Labeta, The two soluable forms of the lipopolysaccharide receptor,
CD 14: characterization and release by normal human monocytes. Eur.
J. Immunol. 24 (1994) 2006-12)
durch Verwenden eines TLR2 spezifischen Antikörpers (gereinigter Ziegen polyklonaler
Antikörper,
Santa Cruz) oder normalen Ziegen IgG (Santa Cruz) 1:2000 verdünnt (100
ng/ml) mit Phosphat gepufferter Salzlösung pH 7,4 (PBS) mit 2% (w/v)
BSA und 0,1% (v/v) Tween-20 supplementiert, analysiert. Der anti-TLR2
Antikörper
erkennt ein Peptid mit 17 Aminosäuren,
welches nahe dem N-Terminus des TLR2 Polypeptids kartiert. Ein Nachweis
wurde gemäß den Herstellerangaben
durch das verstärkte
Chemielumineszenz-Verfahren (ECL, Amersham) mit einem Meerrettich-Peroxidase
konjugierten anti-Ziegen Antikörper
(Santa Cruz), durchgeführt,
der 1:4000 mit PBS verdünnt
und mit 0,5% (w/v) BSA und 0,1% (v/) Tween –20 supplementiert ist. Um
die Spezifizität
der anti-TLR2 Western Blotte zu bestätigen, wurde der anti-TLR2
Antikörper
bei einigen Versuchen und vor einem Blotten mit 10-fach überschüssiger Konzentration
des Peptids (Santa Cruz) präinkubiert
(2h/Raumtemperatur), welches zum Erzeugen des anti-TLR2 Antikörpers verwendet
wurde.
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Die
Konzentration von löslichem
CD 14 (beschriebenes Ion) wurde darüber hinaus für jede Probe
bestimmt. (Menschliche Brustmilch wurde von gesunden Spendern nach
schriftlichem Einverständnis
gesammelt). Die Milch wurde innerhalb von 2 Stunden nach dem Sammeln
weiterverarbeitet. Das Zellpellet wurde nach Zentrifugation für eine andere
Analyse behalten und der Überstand
wurde bei –80°C bis zu
einem Testen von sCD14 durch ELISA (Immuno-Biological Laborstories)
eingefroren. Die untersuchten Proben zeigten eine sCD 14 Konzentration
im Bereich von zwischen 26 und 81 μg pro ml.
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Ergebnisse und Schlussfolgerung
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Das
Ergebnis der Western Blot Versuche ist in den 1 und 2 gezeigt,
worin zwei Banden von 38 und 40 kDa ersichtlich sind, wo der TLR2
Antikörper
verwendet wurde (Spuren 1 und 2 von 1).
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Das
neue Polypeptid wurde nicht nachgewiesen, falls die Membranen mit
dem anti-TLR2 Antikörper geblottet
wurden, der mit dem spezifischen 17-AS TLR2 Peptid präinkubiert
ist, das zum Erzeugen des Antikörpers
verwendet wurde (Spuren 3 und 4 von 1).
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Die
Expression von sTLRR war zu früheren
Zeitpunkten nach der Geburt höher
(Tag 0 bis Tag 5). Anzumerken ist, dass ebenso eine direkte Korrelation
zwischen der Expression von sTLRR und der Konzentration von Milch
sCD14 gefunden wurde (2). Die Vergleiche des Expressionsniveaus
zwischen sTLRR und sCD 14 in Milch legten ferner nahe, dass sTLRR
bei ungefähr
6-7-fach geringeren Niveaus als sCD 14 exprimiert wird.
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sTLRR
ist schlussendlich ein neues Polypeptid, das in menschlicher Brustmilch
auftritt und welches ein lösliches
Homolog von menschlichem TLR2 darstellt. Die Funktion von sTLRR
ist wahrscheinlich mit derjenigen von sCD14 verknüpft, was
sTLRR zu einem Kandidaten für
ein Regulieren von entzündlichen
Zuständen
macht. Darüber
hinaus kann es ein Molekül
zum Erhalten der Homeostase der Darmschleimhaut bei der andauernden
entzündungsförderlichen
Herausforderung durch Bakterien und bakterielle Produkte darstellen.
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Beispiel 2: Reinigung von sTLRR:
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Bedeutsame
Mengen von hoch gereinigtem sTLRR für weitere Studien können durch
Immunopräzipitation
gefolgt von SDS-PAGE, Elektroblotten auf PVDF Membranen und Proteinelution
erhalten werden.
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Verfahren
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Für gewöhnlich wird
1 ml menschliche Brustmilch (vorzugsweise Kolostrum, Tag 1 bis 5
nach der Geburt) 1:10 mit einem Verdünnungspuffer verdünnt, welcher
aus 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 besteht, der mit 0,5% (w/v)
NP-40 (BDH), 1 mM PMSF, 1 μg/ml
Leupeptin, 1 μg/ml
Pepstatin, 1 mM EDTA und 50 mM NaF (alle Protease Inhibitoren von
Sigma) supplementiert ist. Die verdünnte Probe wird durch Inkubation
(1 h, 4°C
mit Drehung bzw. Rotation) mit 30 μg gewöhnlichem Ziegen IgG (Santa
Cruz) vor geklärt,
gefolgt von zwei aufeinander folgenden Inkubationen mit 250 μl Protein
G-Sepharose (1:1 Schlämmung,
Sigma), wobei die letzte Inkubation Übernacht fortgesetzt wird.
Jede Runde einer Protein G-Sepharose Inkubation wird von einem Pelletieren
der Kügelchen
durch behutsame Zentrifugation (800 g, 2 min bei 4°C) gefolgt
und die Kügelchen werden
verworfen. Die vor geklärte
und verdünnte
Milchprobe wird mit 30 μg
polyklonalem (Ziegen) anti-TLR2 Antikörper (Santa Cruz) inkubiert
(1 h, 4°C
mit Drehung), gefolgt von 150 μl
Protein G-Sepharose. Folgend einer behutsamen Zentrifugation der
Sepharose Kügelchen
wird der Überstand
verworfen und das Pellet wird fünfmal
mit dem Verdünnungspuffer
gewaschen. Anschließend
werden die Kügelchen
in 100 μl
Laemmli reduzierendem Proben Puffer resuspendiert, gekocht (5 Min.),
und das eluierte Material wird auf ein 10% SDS-Polyacrylamid Gel
geladen. Das immunopräzipitierte
Molekül
wird nach der Elektrophorese auf eine PVDF Membran übertragen
und mit saurer Extraktion nach Standardprotokollen (J. Coligan et
al. eds., Current Protocols in Protein Science, J. Wiley & Sons; Kapitel
10, Abschnitt 10.7) extrahiert. Alternativ dazu wird das Protein
für eine
massenspektrometrische Analyse im Gel mit Trypsin (Sequenziergrad;
Promega) zur Vorbereitung der Analyse wie beschrieben (J. Coligan
et al. eds., Current Protocols in Protein Science, J. Wiley & Sons; Kapitel 16,
Anhang 14, Abschnitt 4) verdaut.
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Schlussfolgerung
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Das
neue Polypeptid sTLRR wird in einer isolierten Form erhalten. Die
Konzentration des Polypeptids in der Elution liegt ungefähr in dem
Bereich von 0,5 bis 3 μg,
vorzugsweise 1–2 μg pro ml.
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Beispiel 3: Co-Immunopräzipitation
von sTLRR und sCD14
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Verfahren und Ergebnisse
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Es
wurde getestet, ob sTLRR mit sCD 14 in menschlicher Milch wechselwirkt.
Eine starke 48 kDa Polypeptidbande wurde mit einem sCD 14 spezifischen
polyklonalen Antikörper
(Kaninchen) durch Westen Blot von Milchproben nachgewiesen, gefolgt
von einer Immunopräzipitation
mit einem anti-TLR2 Ziege polyklonalen Antikörper, aber nicht mit dem Kontroll
Ziegen IgG.
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Strippen
und erneutes Untersuchen der Membranen mit anti-TLR2 Antikörper bestätigte die
Anwesenheit des 38 und 40 kDa Polypeptids zusätzlich zu der 48 kDa sCD14
Bande. Diese 80 kDA Bande konnte nachgewiesen werden, falls die
Membran mit dem anti-TLR2 spezifischen Antikörper, aber nicht mit Kontroll
IgG, erneut untersucht wurde.
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Schlussfolgerung
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Es
gibt Anhaltspunkte, dass das neue Polypeptid (sTLRR) mit dem bereits
beschriebenen sCD 14 wechselwirkt oder daran bindet und einen 80
kDa Komplex bildet. Die Funktion des Komplexes muss mit den Funktionen
von sCD 14 eng verbunden sein, welche zuvor beschrieben wurden (Frey
EA, Miller DS, Gullstein Jahr T, Sundan A, Bazil V, Espevik T, Sinlay
BB, Wright SD, Soluble CD14 participates in the response of cells to
lipopolysaccharide; J. Exp. Med., 176 (1992) 1665-71).
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Beispiel 4: Expression von sTLRR und seine
Modifikation durch Säuger
Epithelzellen
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Dieser
Versuch zielt auf ein Identifizieren der Quelle des neuen sTLRR
Polypeptids.
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Verfahren und Ergebnisse
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Immunopräzipitation
gefolgt durch Western Blotten mit anti-TLR2 spezifischem Antikörper zeigte
eine Expression der 38 und 40 kDa TLRR Polypeptide ebenso wie die
80 kDa Bande in den Kulturüberständen und Gesamt-Lysaten
der Säuger
Epithelzelllinie MCF-7.
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Darüber hinaus
wurde getestet, um die Expression von sTLRR durch Verwenden verschiedener
Stimuli, einschließlich
von Östrogen
nachahmendem Phenolrot, synthetischem Lipopeptid, INF-γ/TNF-α, LPS und
PMA/Ionomycin, zu modifizieren. Phenolrot und INF-γ/TNF-α induzierten
eine bedeutsame Herrauf-Modulierung von beidem, den 38/40 kDa und
80 kDa Molekülen,
in dem Gesamt-Lysat ebenso wie in dem Kulturüberstand.
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Schlussfolgerung
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Das
neue Polypeptid (sTLRR) wirkt schlussendlich als ein immunmodulatorisches
Agens. Es reguliert insbesondere eine Immunantwort durch Inhibieren
der Induktion von entzündungsfördernden
Cytokinen herunter. Das neue Polypeptid weist daher ein Potential
für ein
Regulieren von mehreren Erkrankungen auf, welche mit Überreaktionen
des Immunsystems verbunden sind, wie beispielsweise Allergien, entzündliche
Erkrankungen des Darms, systemische chronische Entzündungen
und Autoimmun-Erkrankungen.
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Beispiel 5: Ernährungsformulierung, welche
sTLRR umfasst
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Um
eine entzündliche
immanente Immunantwort in dem Magen-Darm Trakt von Kindern herunter
zu regulieren, wurde eine Ernährungsformulierung
hergestellt, welche sTLRR in wirksamen Mengen umfasst.
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Lösliches
sTLRR wurde in angereicherter Form wie vorstehend beschrieben hergestellt
und zu Ernährungs-ausgewogenem
Produkt hinzu gegeben, welches ungefähr 15% Trockensubstanz in einer
derartigen Menge umfasst, dass die dadurch erhaltene Präparation
eine Menge von ungefähr
0,1 bis 100, vorzugsweise 0,5 bis 50 μg, des sTLRR pro g Trockensubstanz
umfasst. Die Trockensubstanz besteht aus 20% Protein, 45% Carbohydrat,
32,3% Fett und 2,7% Mineralien und Vitaminen gemäß den empfohlenen Werten. Die
Ernährungsformulierung
weist einen Energiegehalt von ungefähr 75 kcal/dl (315 kJ/dl) auf.
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Beispiel 6: Weitere Wirkungen des sTLRR
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Verfahren
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Um
die regulatorische Wirkung von sTLRR zu testen, wurden anti-TLR2
Antikörper
vor einer Zellstimulierung durch LPS hinzu gegeben, U373 Astrocytom
Zellen (ATCC) wurden mit E.coli LPS (100 ng/ml) wie bereits beschrieben
(Labeta MO, Vidal K, Rey Nores JA, Arias M, Vita N, Morgan BP, Guillemot
JC, Loyaux D, Ferrara P, Schmid D, Affolter M, Borysiewicz LK, Donnet-Hughes
A, Schiffrin EJ; Innate recognition of bacteria in human milk is
mediated by a milk-derived highly expressed pattern recognition
receptor, soluble CD 14; J. Exp. Med.; 191 (2000) 1807-12) in 2%
menschliche Brustmilch (1 bis 5 Tage nach der Geburt) enthaltendem Medium
aktiviert. Das Milch enthaltende Medium wurde vor einer Zellstimulierung
mit den anti-TLR2 Aks (10 Mikrogramm/ml) oder einer Isotypen-passenden
Kontrolle präinkubiert
(30 Min./Eis). Kulturüberstände wurden nach
24h Inkubation für
eine IL-6 Freisetzung durch ELISA getestet. Zellaliquots wurden
4h anschließend
einer Zellstimulierung genommen und auf CD54 (ICAM-1) Zelloberflächen Expression
durch Flusszytometrie getestet.
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Ergebnisse und Schlussfolgerung
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Die
Verwendung von anti-TLR2 bei der Präinkubation von Zellen erhöhte die
LPS induzierte Milch mediierte Expression von ICAM-1 (CD54) und
Sekretion von IL-6 durch die Zelllinien beträchtlich. Das Ausmaß der verstärkenden
Wirkung für
mehrere Versuche betrug durchschnittlich 100% für eine IL-6 Freisetzung und 100%
für CD54.
Die verstärkende
Wirkung wurde ebenso nachgewiesen falls gereinigtes sCD14 anstelle
von Milch verwendet wurde. Dies zeigt an, dass die sTLRR Molekül modulatorische
Aktivität
zumindest bei einigen Fällen,
falls mit dem sCD 14 Molekül
verglichen, stattfindet.
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Das
in Milch und ebenso in anderen Körperfluiden
vorliegende anti-TLR2 scheint ein wichtiges regulatorisches Molekül einer
bakteriellen Aktivierung von immanenten und anschließend adaptiven
Immunantworten darzustellen. Dies kann von entscheidender Bedeutung
bei der Kontrolle einer überhöhten entzündlichen Antwort
auf bakterielle Produkte in dem frühkindlichen Zeitraum sein,
falls der Wirt zum ersten Mal einem Überfluss von neuen bakteriellen
Antigenen und entzündungsförderlichen
Molekülen
begegnet.
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Beispiel 7: Verschiedene Fragmente von
aus menschlicher Milch isoliertem sTLRR
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Western
Blot Analyse von Milch Proben wurden 1:50 mit Laemmli reduzierendem
Probenpuffer verdünnt,
durch 10% SDS-PAGE getrennt, und mit anti-TLR2 polyklonalem (Ziegen)
Antikörper
(Sc 8689, Santa Cruz, Ca, USA) immunogeblottet, welcher gegen ein
Peptid von 17 Aminosäuren
erzeugt ist, der dem N-Terminus des menschlichen TLR2 Proteins kartiert.
Blots wurden durch Inkubation mit einem Esel anti-Ziegen IgG-Peroxidase
konjugiertem Ak visualisiert, gefolgt von verstärkter Chemolumineszenz (Amersham).
Für Einzelheiten
siehe Beispiel 1.
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Die
Ergebnisse werden in
3 gezeigt, worin verschiedene
Fraktionen von sTLRR, welche den Fragmenten von Seq. ID Nr. 1 entsprechen,
ersichtlich sind. Die Fragmente und ihre Größen sind: 1 (80 kDa), 2 (70
kDa), 3 (60 kDa), 4 (40 kDa), 5 (25 kDa) und 6 (22 kDa). Sequenzliste