DE60219808T2

DE60219808T2 - Ein löslicher toll-ähnlicher rezeptor

Info

Publication number: DE60219808T2
Application number: DE60219808T
Authority: DE
Inventors: Eduardo Schiffrin; Michael Affolter; Mario O. Cardiff LABETA
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2001-09-17
Filing date: 2002-09-13
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-09-14
Also published as: EP1430133A2; EP1293566A1; DE60219808D1; US20050124538A1; WO2003025015A3; JP4354812B2; ES2286292T3; EP1430133B1; PT1430133E; AU2002338714B2; ATE360694T1; WO2003025015A2; JP2005511020A; US7230078B2; DK1430133T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet einer Modulierung und Regulierung von Immunantworten von Vertebraten. Sie berichtet insbesondere über ein neues von Milch isoliertes Polypeptid, welches lösliches, Toll-ähnliches Rezeptor Regulator Proteinmolekül (sTLRR) genannt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein verzehrbares Produkt, Tierfutter und eine Creme oder Lotion, welche das Polypeptid umfassen.
Der sterile fötale Darm wird von in der Umgebung vorhandenen Mikroben unmittelbar nach der Geburt jäh kolonisiert. Die hauptsächlichen bakteriellen Bestandteile bei einer frühen Kolonisierung sind Gram-negative, Endotoxin (LPS) erzeugende Bakterien. Sie können zu einer Zahl von infektiösen und entzündlichen Zuständen des Gastrointestinaltrakts des Neugeborenen beitragen. Es wurde gezeigt, dass Neugeborene, denen Muttermilch verabreicht wurde, eine geringere Anfälligkeit gegenüber Darminfektionen, entzündlichen Zuständen des Darms, geringere Anfälligkeit gegenüber Atemwegs-Infektionen und im späteren Leben weniger allergische Erkrankungen aufweisen. Eine Zahl von menschlichen Milch Bestandteilen von, unter anderem, immunkompetente Zellen, einen passiven Immunschutz verleihenden Antikörpern, menschlichen Milch Oligosacchariden, Lysozym, Lactoferrin, und anderen hervorgerufenen Faktoren können die schützende Rolle erklären.
Toll Rezeptoren, welche eine Zell Signalübertragung in Drosophila mediieren, wurden in einem vollständig anderen Zusammenhang gesehen. Diese wichtige Familie von Transmembranmolekülen ist in erster Linie in Morphogenese einbezogen, wobei allerdings im späteren Leben der erwachsenen Fliege seine Aktivierung eine defensive Antwort bei Infektionen induziert.
Die Säuger Homologe der Toll Rezeptor Familie wurden jüngst entdeckt (Medzhitov R., Janeway CA. Jr., Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition, Cell 91 (1997) 295-298). Die Säuger Homologe werden aufgrund der offenkundigen Beziehung Toll-ähnliche Rezeptoren (TLR) genannt. TLR sind, wie Toll und Toll-ähnliche Proteine in der Fliege, Transmembran-Zelloberflächen Proteine, welche sich in die intrazelluläre Domäne erstrecken. Der extrazelluläre Bereich (N-terminales Ende) umfasst im Allgemeinen multiple Leucin-reiche Wiederholungen (LRR) und bei den bekannten menschlichen und Drosophila Familienmitgliedern ein oberes Cys-reiches Modul, welches vermutlich einen Abstandhalter von gegenüberliegenden Membranen (juxtamembrane) darstellt. Die intrazellulären (C-terminale End) Domänen des Säuger TLR und Drosophila Toll Proteine sind zu dem der gut beschriebenen Interleukin 1 und 18 Rezeptoren (IL-1R und IL-18R) ähnlich, was ähnliche Mechanismen und Teilnehmer einer nach gelagerten Signaltransduktion zeigt. Bisher wurde eine Familie von ungefähr zehn Säuger TLR identifiziert.
Umfangreiche Forschung wurde zwischenzeitlich durchgeführt, um potentielle Liganden zu finden, welche die TLR mediierte Signalübertragung von der extrazellulären Seite aktivieren könnten und um den intrazellulären Signalübertragungsweg des aktivierten Rezeptors zu bestimmen.
Es wurde klar, dass die TLR Familienmitglieder ein Teil des Säuger immanenten Immunsystems sind, welches für ein Erkennen und eine Antwort auf Bakterien und bakterielle Zellwand Bestandteile verantwortlich ist.
Die WO 0075358 basiert auf der Entdeckung von neuen TOLL Familienmitgliedern (TOLL Nukleinsäure Familienmitgliedern). Es wird angenommen, dass die erfindungsgemäßen TOLL Moleküle als Ziele für ein Entwickeln modulierender Agenzien von Nutzen sind. Daher werden Nukleotid und Aminosäure Sequenzen offenbart und beansprucht. Die 1 der WO 0075358 zeigt die Nukleotidsequenz des menschlichen TOLL Proteins ebenso wie damit kodierte Aminosäuresequenz. Dieses TOLL Protein kann als Membranproteine vorliegen, welche als Rezeptoren fungieren, und sie können in Immun Signalübertragungsmechanismen einbezogen sein.
Die WO 0024776 offenbart eine neue molekulare Spezies TLR6, welche zu der Toll Familie gehört. TLR6 reguliert daher die Expression mehrerer Gene, welche bei einer Immunantwort teilnehmen. Ebenso wird ein den Rezeptor kodierendes Gen angegeben.
Flo T. H. et al., Journal of Endotoxin Research, 6(2) (2000), 106 offenbart den Nachweis löslichen TLR2 in menschlichen Sera. Es wird aufgeführt, dass TLR2 in einer löslichen Form in Blut vorliegt. Darüber hinaus wurde ein Elisa für den Nachweis des Signalübermittlers etabliert. Lösliches CD14, welches in Kolostrum und Milch angereichert ist und B Zellwachstum und Differenzierung induziert, wird von Filipp D. et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States, 98 (2), 26. Jan. (2001), 603-8) beschrieben. Das Membranprotein CD 14, welches als ein Corezeptor für bakterielle Lipopolysaccharide dient, löst die Induktion von entzündlichen Antworten aus. Die Toll-ähnlichen Rezeptoren TLR2 und TLR4 sind in die Endotoxin-mediierte zelluläre Aktivierung von B Zellen durch lösliches CD14 impliziert. LPS Signalübertragung wird durch die Anwesenheit von TLR4 beeinflusst wohingegen TLR2 keine Wirkung aufweist. Xu Yingwu et al. berichtet in Nature (London), Vol. 408, No. 6808 (2000), 111-15 über die Kristallstrukturen der konservierten cytoplasmatischen Domänen (TIR Domänen) der Toll-ähnlichen Rezeptoren TLR1, TLR2 und eines TLR2 Mutanten. Ein Ausrichten bzw. Alignment der jeweiligen TIR Domänen zeigt an, dass die TIR Domänen von TLR1 und TLR2 50% Aminosäure Identität teilen. Mantovani A. et al., Trends in Immunology, 22(6), 1 Jun. (2001), 328-36 offenbart Köder-Rezeptoren, wie beispielsweise Toll-ähnliche Rezeptoren, die bestimmte entzündliche Cytokine erkennen können und schlägt deren Verwendung zum Regulieren der Wirkung von primären entzündungsförderlichen Cytokinen und Chemokinen vor. Darüber hinaus wird Regulierung, Expression und Freisetzung von Köder-Rezeptoren angegeben. Die WO 99/20756 betrifft die Identifizierung und Isolierung von drei DNA Sequenzen, die menschliche Toll Homologe kodieren, von Plazentagewebe isoliert wurden und die rekombinante Herstellung der jeweiligen Polypeptide in CHO Zellen, Hefe oder E. coli. Die Deletion oder Substitution der Transmembrandomäne stellt eine lösliche Form der Proteine durch Verringern deren zellulärer oder Membranlipid Affinität bereit und verbessert die Wasserlöslichkeit. Labeta M. O. et al. offenbart in dem Journal of Experimental Medicine, 191(10), 15 May (2000), 1807-12 die Mengen an menschlichem löslichen CD14 während Schwangerschaft und nach der Geburt. Die Perspektiven eines Modifizierens der antimikrobiellen Eigenschaften von Milch werden von Kolb A. F., Biotechnology Advances, 19(4) 4 July (2001), 299-316 aufgeführt.
Neben der wissenschaftlichen Forschung wurde keine technisch verwertbare Wirkung und kein anderes Fungieren als die/das der vorstehend aufgeführt beschriebenen bis jetzt offenbart.
Daher besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Mittels zum Verabreichen einer aktiven Substanz an ein Individuum, wodurch die Substanz die auslösenden Wege regulieren wird, welche durch bakterielle Produkte wie durch Bestandteile von TLRs, und insbesondere TLR-2 mediiert, induziert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher in einer ersten Ausführungsform ein aus Milch erhältliches Polypeptid mit einem durch SDS-PAGE-Analyse erfassten Molekulargewicht von ungefähr 22, 25, 38, 40, 60, 70, 80 kDa bereit. Das Polypeptid weist ferner eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 90% mit dem TLR-Rezeptor von einer von SEQ ID Nr. 1 oder 2 auf.
In einer zweiten Ausführungsform ist das Polypeptid dadurch gekennzeichnet, dass es ein Homolog der oder verwandt mit der Toll-like bzw. ähnlichen Rezeptor (TLR)-Familie ist.
In einer dritten Ausführungsform ist das Polypeptid durch mit einem anti-TLR-Antikörper durchgeführte Immunpräzipitation von Säugerfluiden bzw. Flüssigkeiten, wie Brustmilchserum, Plasma oder Darminhalt, erhältlich.
In einer vierten Ausführungsform wird das vorliegende Polypeptid als ein Medikament verwendet.
In einer fünften Ausführungsform wird ein verzehrbares Produkt bereitgestellt, welches Beimengungen des vorliegenden Polypeptids umfasst.
In einer sechsten Ausführungsform wird eine Creme, Lotion oder Salbe bereitgestellt, welche Beimengungen des vorliegenden Polypeptids umfassen.
In einer siebten Ausführungsform wird das vorliegende Polypeptids als ein Bestandteil in einem funktionellen Lebensmittel oder Kosmetikartikelrtikel verwendet.
In einer achten Ausführungsform wird die Verwendung eines Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe, Verhinderung oder Behandlung einer mit entzündlichen Zuständen oder allergischen Reaktionen verbundenen Krankheit oder für die Modulation immunologischer und/oder entzündlicher Prozesse bereitgestellt.
In den Figuren,
zeigt 1 eine Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung eines 10% SDS Gels. STLRR Banden wurden unter Verwendung des anti-TLR2 polyklonalen Antikörpers deutlich gemacht (TLR2 Ab bzw. Ak, Spuren 1 und 2). Der anti-TLR2 Antikörper wurde vor einem Blotten ebenso mit dem Peptid inkubiert, welches für ein Erzeugen des Antikörpers verwendet wurde (TLR2 Peptid, siehe Spuren 3 und 4). Ein anderer Antikörper wurde ebenso als Isotypenkontrolle (Spur 5) getestet (IgG).
zeigt 2 eine Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen, die wie vorstehend dargelegt (entsprechend zum Schema der 1, Spuren 1 und 2) von sTLRR an verschiedenen Tagen nach der Geburt gesammelt wurden. Die Figur zeigt ebenso sCD 14 Konzentrationen, welche parallel zu der sTLRR Analyse bestimmt wurden.
zeigt 3 eine Western Blot Analyse von menschlichen Milch Fraktionen, die an verschieden Tagen nach der Geburt gesammelt wurden. Ein anti-TLR2 polyklonaler (Ziegen) Antikörper (sc 8689, Santa Cruz, Ca, USA) wurde gegen ein Peptid mit 17 Aminosäuren erzeugt, das den N-Terminus des menschlichen TLR2 Proteins abbildet bzw. kartiert, und zum Immunoblotten verwendet. Die Fragmente des sTLRR und deren Größen sind: 1 (80 kDa), 2 (70 kDA), 3 (60 kDA), 4 (40 kDA), 5 (25 kDA) und 6 (22 kDA) (Beispiel 7).
Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung eines molekularen Bestandteils von menschlicher Brustmilch, welcher eine hohe Homologie mit der extrazellulären Domäne von TLRs Molekülen und insbesondere mit TLR-2 zeigt. Dieser Milch Bestandteil stellt daher ein natürlich auftretendes, lösliches Derivat des menschlichen TLR2 dar. Es ist insbesondere überraschend, dass eine lösliche Variante eines als Transmembranprotein bekannten Proteins in menschlicher Milch gefunden wurde. Die vorliegende Erfindung beruht darüber hinaus auf der Möglichkeit, dass das lösliche Toll-ähnliche Rezeptor Regulatormolekül (anschließend sTLRR) in Milch durch seine Wechselwirkungen mit putativen TLR2 Liganden, d.h. Lipoproteine von Gram-positiven Bakterien, LPS und sCD 14. Diese spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Immunantworten von Säugern, insbesondere von Immunantworten gegenüber in den Darmtrakten von Säugern vorliegenden bakteriellen konservierten Molekülen. Wir bezeichnen dieses Molekül daher als Toll-ähnliches Rezeptor Regulatormolekül oder Toll-ähnlichen Rezeptor.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Polypeptids besteht darin, dass es ein Werkzeug für ein Regulieren von entzündlichen Reaktionen eines Säugers gegenüber einem Antigen bereitstellt.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie ein Polypeptid bereitstellt, welches bei einem Inhibieren, Herunterregulieren oder Verhindern von entzündlichen Reaktionen in einem Säuger wirksam ist.
Ein noch weiter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie ein Polypeptid bereitstellt, welches als Medikament oder Kosmetikartikel geeignet ist.
Ein noch weiter Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie insbesondere für eine Prophylaxe, Verhinderung oder Therapie von Magen-Darm Entzündungen geeignet ist.
Im Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll der Begriff "umfassen" ein "einschließlich, unter anderem" bedeuten. Es ist nicht beabsichtigt, dass es als "bestehend aus ausschließlich" ausgelegt wird.
Im Zusammenhang mit dieser Beschreibung soll der Begriff "ein Homolog von TLR" oder "ähnlich zu TLR" Proteine bedeuten, welche durch Antikörper erkannt werden, die an irgendein bekanntes TLR spezifisch binden. Insbesondere Antikörper, welche an einen Bereich in der Ektodomäne von irgendeinem bekannten TLR binden. Da erwartet wird, dass neue Familienmitglieder von TLR in Menschen ebenso wie in anderen Organismen gefunden werden, soll die Definition ebenso Proteine einschließen, welche durch Antikörper erkannt werden, die auf diese neuen TLR Proteine gerichtet sind.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Aktivität" nicht auf enzymatische Aktivität beschränkt ausgelegt werden. Er soll jedoch ebenso die Funktion eines Bindens eines Liganden oder einer Gruppe von Liganden betreffen, welche selbst aneinander gebunden sein können. Daher sind alle Funktionen, welche sTLRR erfüllen kann, in dem Begriff "Aktivität" umfasst.
Der Begriff "wirksam" betrifft den Zustand eines Moleküls, beispielsweise eines Peptids, in welchem es die Funktionen ausführt, welche es für gewöhnlich unter in vivo Bedingungen ausführt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "löslich" Polypeptide, welche in ihrer wirksamen Form und unter den Umständen ihrer natürlichen Funktion löslich sind. Sie sind daher bei einem pH löslich, welcher beispielsweise dem pH von menschlicher Brustmilch entspricht.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "sTLRR", welcher eine Abkürzung von "löslichem Toll-like bzw. -ähnlichem Rezeptor Regulatormolekül" darstellt, irgendein erfindungsgemäßes Polypeptid umfassen. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und des Platzes wird der Begriff sTLRR manchmal verwendet, ebenso weil er als die am besten geeignete Bezeichnung angesehen wird, welche seine Beziehung und/oder seine Befähigung von anti-TLR Antikörpern erkannt zu werden widerspiegelt und da er löslich ist.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "lösliches Toll- ähnliches Rezeptor Regulatormolekül" (sTLRR) bedeuten, dass das neue Polypeptid in irgendeiner Zell-freien Präparation von biologischen Fluiden, einschließlich von menschlicher Milch und Plasma aber nicht darauf beschränkt, nachgewiesen werden kann. Irgendeine gereinigte oder halbreine Form dieses von den erwähnten Quellen erhaltenen Polypeptids zeigt vorher die durch diese Erfindung dokumentierte Aktivität. STLRR kann beispielsweise in anderen Körperfluiden als Milch, wie beispielsweise Blut, oder in Milch von anderen Säugern als Menschen, wie beispielsweise von einer Ziege, einem Schaf und einer Kuh, gefunden werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Mutation" alle bekannten Arten von Änderungen in einer Nukleotidsequenz umfassen. Er ist nicht beabsichtig ausschließlich Punktmutationen zu umfassen, sondern ebenso beispielsweise Deletion, Insertion, Rasterverschiebung, Nonsense, Missense Mutationen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Homologie" oder" Homolog", als Umfassen von Homologen einer Aminosäuresequenz, verstanden werden ein "Aufweisen eines gemeinsamen evolutionären Ursprungs" zu bedeuten. Dies wird häufig zusammen mit dem Begriff "Ähnlichkeit" verwendet, welcher Vergleiche einer Sequenz mit einer anderen Sequenz betrifft und welcher bei einer Homologiebestimmung behilflich sein kann. Modelle für eine Homologiebestimmung werden nachstehend gegeben.
Der Begriff "funktioneller Nahrungsmittel Bestandteil" soll eine Substanz betreffen, welche obschon bioaktiv kein Medikament darstellt. Medikamente umfassen für gewöhnlich aktive Prinzipien, welche für eine Verwendung als ein Medikament von Regierungsautoritäten zugelassen oder erlaubt werden müssen, da ihr Verzehr unerwünschte Nebenwirkungen aufweisen kann. Funktionelle Nahrungsmittel Bestandteile widerspiegeln für gewöhnlich andererseits aktive Prinzipien jenseits eines strengen Zwecks als Nahrungsmittel und von denen bekannt ist für einen Verbraucher hauptsächlich aufgrund ihres natürlichen Auftretens in einem Nahrungsmittel, wie beispielsweise Milch, nicht schädlich zu sein.
Das Polypeptid ist aus Milch erhältlich und weist ein durch SDS-PAGE-Analyse erfasstes Molekulargewicht von ungefähr 22, 25, 38, 40, 60, 70, 80 kDa auf und weist ferner eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 90% mit dem TLR-Rezeptor von einer von SEQ ID Nr. 1 oder 2 auf.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann eine Sequenzähnlichkeit zu dem Polypeptid, wie durch irgendeine von SEQ ID Nr. 1 oder 2 identifiziert, von beispielsweise zumindest 95% und vorzugsweise von zumindest 98% aufweisen.
Diese Molekulargewichte der Polypeptide betreffen jedoch glycosylierte Peptide, welche das Gewicht beeinflussen. Beispielsweise würde der erfindungsgemäße 80 kDa "Volllängen" extrazelluläre, lösliche Teil von menschlichem TLR2 (sTLRR) ohne Glycosylierung nur 64,4 kDa aufweisen. Es wird erwähnt, dass menschliches sTLRR 4 mögliche N-Glycosylierungs stellen (-Asn-Xaa-Ser/Thr-) und bovines bzw. vom Rind stammendes drei davon aufweist (Mensch: Asn96, Asn181, Asn396, Asn424; Rind: Asn94, Asn178, Asn422).
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist in einer weiteren Ausführungsform ein Homolog von oder ähnlich bzw. verwandt zu der Toll-ähnlichen Rezeptor (TLR) Familie und ist in seiner wirksamen Form löslich.
Daher kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch seine Befähigung mit TLR für den gleichen Liganden oder der gleichen Gruppe von Liganden zu konkurrieren gekennzeichnet sein.
In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polypeptid durch Immunpräzipitation von Säugerfluiden, wie beispielsweise Brustmilch, Serum, Plasma oder Darmgehalt, erhältlich, welche beispielsweise mit einem anti-TLR Antikörper durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße sTLRR kann von menschlicher Milch, insbesondere während der frühen Stadien der Stillzeit, erhalten werden. Offenkundig wechselwirkt das sTLRR mit oder bindet an andere Proteine oder Moleküle, welche in Milch vorliegen oder von äußeren Quellen stammen. Die Größe des Polypeptids, wie auf einem SDS Gel bestimmt, kann in Abhängigkeit von den daran gebundenen Cofaktoren/Molekülen variabel sein.
Eine mögliche und einfache Technik zum Isolieren des Proteins besteht in der Affnitätschromatographie, welche ebenso Immunochromatographie genannt wird. Dieses dem Fachmann gut bekannte Verfahren verwertet das spezifische Binden eines Proteins gegen einen spezifischen Antikörper. Ein anti-TLR Antikörper (beispielsweise ein anti-TLR2 Antikörper) wird auf einer festen Matrix gehalten. Der Antikörper kann kovalent an die Matrix gebunden sein, wobei er seinen variablen und spezifischen Teil aussetzt. Die Matrix kann aus chemisch inerten Kügelchen bestehen, an welchen der Antikörper angebracht ist. Die an den Antikörper gebundenen Kügelchen werden auf eine Säule geladen. Falls eine sTLRR (beispielsweise menschliche Milch oder Serum) umfassende Flüssigkeit durch die Säule gespült wird, wird das Polypeptid and den Antikörper gebunden und dadurch zurückgehalten werden. Nach Waschen der sTLRR umfassenden Säule, kann es eluiert werden. Die dadurch eluierte Proteinfraktion kann ferner auf einem SDS-Polyacrylamid Gel getrennt und auf einen Nitrocellulose Filter durch eine weitere Elektrophorese übertragen werden. Lösliches sTLRR kann schlussendlich gemäß eines herkömmlichen Western Blot Verfahrens sichtbar gemacht werden. Alternativ kann es durch Zentrifugation oder Ultrafiltration konzentriert und in dieser Form zu einem verzehrbaren Produkt in wirksamen Mengen hinzugegeben werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Polypeptid durch einen gegen den extrazellulären Teil eines TLR gerichteten Antikörpers erkannt werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist daher nach Immunopräzipitation durch SDS-PAGE, Elektroblotten auf eine geeignete Membran und Proteinelution erhältlich. Dem Fachmann sind diese Techniken gut bekannt.
In einer anderen Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Polypeptid, falls mit einem TLR Polypeptid verglichen, höchste Sequenzähnlichkeit und/oder Homologie zu der extrazellulären Domäne des TLR Polypeptids auf. Das erfindungsgemäße Polypeptid weist vorzugsweise höchste Sequenzähnlichkeit zu dem menschlichen TLR2 Molekül auf.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist in noch einer anderen Ausführungsform verwandt bzw. ähnlich zu dem oder ein Homolog des menschlichen TLR2 Moleküls.
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist in noch einer weiteren Ausführungsform von menschlicher Brustmilch abgeleitet oder zu einer von Milch abgeleiteten Variante identisch. Ein Weg zur Isolierung des Polypeptids von menschlicher Brustmilch wird vorstehend offenbart.
Bezüglich des Antikörpers gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist es klar, dass dem Fachmann die Herstellung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörpers gegen ein spezifisches Antigen oder Protein gut bekannt ist. Ist das Protein einmal isoliert worden kann ein Antikörper gemäß herkömmlicher Techniken hergestellt werden. Ein wirksamer, polyklonaler (Kaninchen) Antikörper kann durch Immunisieren von Tieren mit einem künstlich erzeugten 20-mer Peptid, Kartieren an dem N-Terminus von menschlichen TLR2 (anfangend mit 5 AA bzw. AS von dem N-Terminus) hergestellt werden. Derartige Antikörper zeigten eine äußerst gute Reaktivität mit den löslichen Formen von TLR2.
Ein im Handel erhältlicher Antikörper, welcher für ein Nachweisen von sTLRR der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, ist der anti-TLR2 polyklonale (Kaninchen) Antikörper von IMG 410 (www.imgenex.com), welcher durch die Biocarta Europe GmbH vertrieben wird, und welcher durch Immunisieren mit einer Mischung von drei Peptiden hergestellt wurde, die den Aminosäuren 180-196, 353-370 und 473-489 von menschlichem TLR2 entsprechen.
Ein weiterer Antikörper ist der anti-TLR2 polyklonale (Ziegen) Antikörper TLR2 (N-17) Santa Cruz Biotech (www.scbt.com) Kat.nr.: sc-8689, ein Antikörper, welcher gut bei Western und Immunopräzipitationen funktioniert.
Mögliche Variationen des Nukleinsäuremoleküls, von welchen beabsichtigt ist von dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül umfasst zu sein, bestehen in Nukleinsäuremolekülen, die unter stringenten Bedingungen an die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung hybridisieren.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann ferner ein Expressionssystem umfassen, worin das Expressionssystem ein Polypeptid erzeugen kann, welches eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest 50% Identität zu dem erfindungsgemäßen Polypeptid aufweist.
Zur Expression eines biologisch aktiven sTLRR wird die sTLRR oder sein funktionelles Äquivalent kodierende Nukleotidsequenz in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, d.h. einen Vektor, welcher die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingefügten kodierenden Sequenz aufweist.
Dem Fachmann gut bekannte Verfahren können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche eine sTLRR kodierende Sequenz und geeignete Transkriptions- und Translations-Regler enthalten. Diese Verfahren umfassen rekombinante in vitro Techniken, Synthesetechniken und in vivo Rekombination oder genetische Rekombination. Derartige Techniken werden beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Press beschrieben.
Mehrere Expressionsvektor-/Wirts-Systeme können verwendet werden, um eine sTLRR kodierende Sequenz aufzunehmen und zu exprimieren. Diese umfassen, sind allerdings nicht darauf begrenzt, Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, welche mit einem rekombinanten Bakteriophagen, Plasmid oder Cosmid DNA Expressionsvektoren transformiert sind; mit Hefe Expressionsvektoren transformierte Hefe; mit viralen Expressionsvektoren infizierte Insekten Zellsysteme; und mit viralen Expressionsvektoren infizierte pflanzliche Zellsysteme oder tierische Zellsysteme. Im Grunde können alle Expressionssysteme verwendet werden, welche Säuger-, bakterielle, pflanzliche oder Pilz-Zellen einbeziehen.
Überraschenderweise wurde kein funktionelles mRNA Transkript des sTLRR in menschlichen Brustepithelzellen gefunden, obgleich theoretisch versprechende Transkripte gefunden wurden. Darüber hinaus wurde überraschenderweise gefunden, dass sich funktionelle (lösliche) Varianten von sTLRR wesentlich in der Größe (37, 40, 60, 70, und 80 kDa) unterscheiden können. Diese Beobachtungen legen nahe, dass sTLRR durch Prozessieren von Volllängem TLR2 erzeugt wird. Darüber hinaus verdeutlicht die Tatsache, dass sTLRR mit gegen den extrazellulären Teil von TLR2 gerichteten Antikörpern wechselwirkt, dass erfindungsgemäßes sTLRR dem extrazellulären Teil von TLR oder einem kürzeren Fragment davon entspricht.
Seq. ID Nr. 1 und 2 entsprechen dem prozessierten und löslichen extrazellulären Teil von menschlichem und bovinen TLR2.
In dem Teil der Sequenzliste der vorliegenden Beschreibung bezeichnet Seq. ID Nr. 1 ein in menschlicher Milch auftretendes erfindungsgemäßes Polypeptid, zusammen mit kürzeren Fragmenten davon.
In dem Teil der Sequenzliste der vorliegenden Beschreibung bezeichnet Seq. ID Nr. 2 ein erfindungsgemäßes Polypeptid, welches das funktionelle Homologe von Seq. ID Nr. 1 in Bos taurus ist. Das funktionelle Homologe von Seq. ID Nr. 2 kann für eine industrielle Anwendung bedeutsamer sein, da es aus boviner Milch in beachtlichen Mengen angereichert oder isoliert werden kann.
Das Protein selbst könnte durch Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese einer sTLRR Aminosäuresequenz hergestellt werden.
Bezüglich einer Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids als ein Medikament, funktioneller Nahrungsmittelbestandteil oder Kosmetikartikel, kann das Polypeptid für ein Verhindern oder Herunterregulieren von entzündlichen Zuständen in einem Säuger verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann darüber hinaus bei der Vorbeugung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie von entzündlichen Zuständen in einem Säuger verwendet werden.
Die entzündlichen Zustände sind beispielsweise entzündliche Zustande des Magen-Darm-Trakts oder der Haut eines Säugers.
Die Verabreichungsform des Polypeptids ist unwesentlich. Das Polypeptid kann beispielsweise einfach direkt verzehrt werden und oral nach Isolierung und Konzentration, wie vorstehend aufgeführt. Dies gilt insbesondere, falls entzündliche Zustande des Magen-Darm-Trakts direkt behandelt werden.
Falls das Polypeptid für eine Behandlung von entzündlichen Zuständen der Haut verwendet wird, kann das sTLRR zu irgendeiner geeigneten Lotion, Creme, Balsam und ähnlichem hinzugegeben werden, welche für ein Behandeln oder Verhindern von Reizungen oder Entzündungen der Haut vorgesehen sind. Das sTLRR kann beispielsweise zu Öl in Wasser oder Wasser in Öl Emulsionen hinzugegeben werden. Vorzugsweise wird hochkonzentriertes sTLRR nach Emulgieren der öligen und wässrigen Phase hinzugegeben. Es ist ebenso möglich sTLRR nach dem Homogenisierungsschritt an dem Ende hinzu zugeben. Das konzentrierte sTLRR wird vorzugsweise unter Rühren bei ungefähr 35°C hinzugegeben. In der US 5,744,145 (Nestec S. A.) werden eine Zahl von kosmetischen Zusammensetzungen offenbart, zu denen sTLRR einfach hinzugegeben werden kann.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann ferner als ein dermatologisches Agens verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Polypeptid kann in einem anderen Beispiel für die Verhinderung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie von entzündlichen Zuständen der Schleimhaut (muscuous) Membranen oder Mukosi eines Säugers verwendet werden.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Polypeptid für die Verhinderung, Prophylaxe, Behandlung oder Therapie von allergischen Reaktionen in einem Säuger verwendet werden. Bezüglich des erfindungsgemäßen verzehrbaren Produkts kann es sich dabei um ein Tierfutter handeln. Das verzehrbare Produkt ist vorzugsweise für den Menschen, mehr bevorzugt als Zusammensetzung für Kleinkinder, vorgesehen. Es kann sich um eine Nahrungs- oder Kleinkind-Formulierung, ein gekühltes oder lagerstabiles Molkereiprodukt oder um Süßwaren handeln.
Eine Ernährungsformulierung kann auf irgendeine geeignete Art hergestellt werden. Die Ernährungsformulierung kann beispielsweise durch Zusammenmischen einer Molkereiprotein Quelle, Kohlenhydrat Quelle und einer Fett Quelle in geeigneten Verhältnissen hergestellt werden. Emulgatoren können, sofern verwendet, in die Mischung eingefügt werden. Vitamine und Mineralien können an diesem Punkt hinzugegeben werden, werden allerdings für gewöhnlich später zum Vermeiden einer thermischen Zersetzung hinzugegeben. Irgendwelche lipophilen Vitamine, Emulgatoren und ähnliches können vor einem Mischen in der Fett Quelle gelöst werden. Anschließend kann Wasser, vorzugsweise einer Umkehrosmose unterzogenes Wasser, hineingemischt werden, um eine flüssige Mischung zu bilden. Die Temperatur des Wassers beträgt geeigneterweise ungefähr 50°C bis ungefähr 80°C, um die Dispersion der Bestandteile zu unterstützen. Im Handel verfügbare Verflüssiger können zur Bildung der flüssigen Mischung verwendet werden. Die flüssige Mischung kann anschließend, beispielsweise in zwei Stufen, homogenisiert werden.
Gereinigtes sTLRR kann in wirksamen Mengen zu der flüssigen Formulierung direkt hinzugegeben werden. Der pH der Formulierung kann zwischen 4,5 und 7,5 liegen, was bedeutet, dass das Protein löslich ist. Naturgemäß kann der erlaubte pH Bereich verschieden sein, falls die chemischen Eigenschaften des sTLRR, beispielsweise durch Glycosylierung, oder durch Addition, Deletion oder Ersetzen von Aminosäuren, geändert wurden.
Eine konzentrierte Lösung eines sTLRR wird in einer Ausführungsform zu einer flüssigen (wiederhergestellten) Ernährungsformulierung hinzugegeben, wobei die Ernährungsformulierung irgendeinen erwünschten Energiegehalt aufweist. Das sTLRR liegt vorzugsweise in einer Endkonzentration von 50 ng pro ml bis 10 μg pro ml, mehr bevorzugt 100 ng bis 1000 ng pro ml, vor. Die Konzentration kann in der Ernährungsformulierung ebenso von den Umständen der Diät abhängen und insbesondere, ob die Ernährungsformulierung eine vollständige Diät ausmacht oder nicht. Ebenso können andere Umstände die Endkonzentration von sTLRR in der Formulierung beeinflussen, wie beispielsweise die Menge an verzehrter Formulierung, die Aktivität des sTLRR oder der Zustand des Patienten. In der Regel sollte eine Tagesdosis zwischen 10 μg bis 20 mg Einheiten des Proteins, vorzugsweise 100 μg bis 1 mg Einheiten in Abhängigkeit von verschiedenen Zuständen umfassen.
Dem Fachmann ist es klar, das die Funktionen des sTLRR Polypeptids durch mehrere verschiedene Aminosäuresequenzen erhalten werden können. Demgemäß betrifft eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform Polypeptide, welche Änderungen in Aminosäureresten umfassen, die für die Aktivität unwesentlich sind. Derartige Proteine unterscheiden sich in der Aminosäure Sequenz von dem Polypeptid, wie erfindungsgemäß isoliert, und behalten dennoch biologische Funktion oder Aktivität bei. Aminosäuren können beispielsweise durch "nicht-essentielle" bzw. unwesentliche Aminosäurereste ersetzt werden. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, welcher in der Wildtyp Sequenz des sTLRR ohne ein Ändern der biologischen Funktion oder der strukturellen Faltungen geändert werden kann, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die biologische Funktion erforderlich ist. Ähnliche Funktionen richten sich häufig nach Aminosäuren mit ähnlichen strukturellen oder chemischen Eigenschaften, wie beispielsweise Ersetzen von Leucin mit Isoleucin. Eine Variante kann seltener „nicht-konservative" Änderungen, wie beispielsweise Ersetzen von Glycin mit Tryptophan, aufweisen. Das Gleiche gilt nicht nur für einzelne Aminosäuren, sondern für gesamte Aminosäuresequenzen, welche ohne Ändern der biologischen Funktion des Proteins hinzugefügt oder weggelassen werden können. Daher können ähnliche geringfügige Variationen ebenso Aminosäure Deletionen oder Insertionen oder beides umfassen. Eine kurze Aminosäuresequenz in einem viel größeren Polypeptid ist sehr häufig für die biologische Aktivität oder Funktion eines Proteins grundlegend verantwortlich.
Die vorliegende Erfindung deckt daher ebenso Homologe von sTLRR.
Die Homologie oder Sequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität von Proteinsequenzen kann nach im Stand der Technik gut bekannten Techniken, beispielsweise durch Verwenden bekannter Software oder Computerprogramme, beispielsweise dem BLAST (Basic Local Alignment Sequence Tool) Programm basierend auf der Arbeit von D. Lipman und Mitarbeiter (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meyers, E. W. & Lipman, D. J. „Basic local alignment search tool.", J. Mol. Biol., 215 (1990) 403-10 und Altschul, S. F., Madden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D. J. „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.", Nucleic acids Res. 25 (1997) 3389-3402), einfach bestimmt warden.
BLAST^® (Basic Local Alignment Search Tool) besteht in einem Satz von Programmen zur Ähnlichkeitssuche, welche entwickelt sind, um alle der verfügbaren Sequenzdatenbanken, ohne Berücksichtigung ob die Suche auf Protein oder DNA erfolgt, zu erforschen. Die BLAST Programme wurden für Geschwindigkeit mit minimalem Empfindlichkeitsverlust auf entfernte Sequenzbeziehungen entwickelt. Die in einer BLAST Suche zugewiesenen Werte weisen eine gut definierte statistische Interpretation auf, was es einfacher macht wahres Passen von zufälligen Hintergrundtreffern zu unterscheiden. BLAST verwendet einen heuristischen Algorithmus, welcher lokal im Gegesatz zu globalen Ausrichtungen sucht und daher Beziehungen unter Sequenzen nachweisen kann, welche nur isolierte Bereiche einer Ähnlichkeit teilen (Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Meyers, E. W. & Lipman, D. J. „Basic local alignment search tool.", J. Mol. Biol., 215 (1990) 403-10).
BLAST beruht auf einem modifizierten Algorithmus von Smith and Waterman (Smith, T. F. & Waterman, M. S. „Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol., 147 (1981) 195-197) und Sellers (Sellers, P. H. "Pattern recognition in genetic sequences by mismatch density.", Bull. Math. Boil., 46 (1984) 501-14), um den besten Abschnitt einer Identität oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen zu finden. Falls ein Sequenz Ausrichtungsprogramm, wie beispielsweise BLAST, verwendet wird, um den Grad einer Sequenzhomologie, Ähnlichkeit oder Identität zu bestimmen, kann die Grundeinstellung verwendet werden, oder eine geeignete Wertematrix, wie beispielsweise BLOSUM oder PAM, welche ausgewählt werden können, um Identität, Ähnlichkeit oder Homologie Werte zu optimieren.
Um künstlichen Modifikationen der Aminosäuresequenz, welche aus mehreren Gründen eingefügt werden können, Rechnung zu tragen, umfasst die vorliegende Erfindung ebenso Sequenzen, welche nicht homolog sind, sondern zumindest eine Sequenzähnlichkeit, wie nachstehend definiert, oder die dreidimensionale Struktur oder die Funktion des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung teilen.
In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Polypeptid eine Aminosäuresequenz, welche zumindest ungefähr 95%, 98% oder mehr zu dem Protein mit Seq. ID. Nr. 1 oder 2 ähnlich ist.
Das wirksame lösliche Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann ebenso ein Dimer, Trimer, usw. sein. Es kann ein homo- oder ein heterodimer, -trimer, -polymer sein. Die verschiedenen Domänen des wirksamen Polypeptids sind beispielsweise durch eine oder mehrere Disulfidbrücken kovalent verbunden. Insbesondere in extrazellulären Proteinen oder extrazellulären Domänen werden Disulfidbindungen in verschiedenen Proteinen oder in den gleichen Proteinen häufig gefunden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Möglichkeit, dass zwei identische oder verschiedene Polypeptidketten zum Bilden eines Homo- oder eines Heterodimers oder Polymers miteinander verbunden sind. Es ist ebenso möglich, dass zwei sehr ähnliche Domänen, welche sich nur in eine begrenzten Zahl von Aminosäureresten oder welche verschieden glycosyliert sind, ein Hetero- oder Homodimer bilden. Die vorliegende Erfindung umfasst in all diesen Fällen Proteine oder multi-Domänen Proteine, welche zumindest eine Domäne mit den Eigenschaften gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
Seine Löslichkeit unter physiologischen Bedingungen und zur gleichen Zeit seine Bedeutung in immanenten Immunantworten macht sTLRR zu einem wertvollen Werkzeug bei einer großen Zahl von pathogenen oder nicht-pathogenen Zuständen. STLRR kann beispielsweise für diagnostische Zwecke verwendet werden, wobei seine Befähigung zum Binden an bakterielle Epitope oder Antigene verwendet wird. Die Bedeutung von sTLRR ist unter diesem Gesichtspunkt ähnlich zu jener von Antikörpern. Daher kann sTLRR insbesondere bei der Entwicklung neuer diagnostischer Ziele oder therapeutischen Agenzien bei einem Regulieren einer Immun- oder entzündlichen Antwort von Nutzen sein. Wie beispielsweise Zustände, welche sich auf eine Fehlregulation einer Immunantwort beziehen, wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen, entzündliche Erkrankungen des Darms oder Allergie, einschließlich von Asthma.
Beispiele
Beispiel 1: Nachweis von löslichem TLR2 in menschlicher Brustmilch
Verfahren
Menschliche Milchproben, welche an verschieden Tagen nach der Geburt (0, 5, 6, 8) genommen wurden, wurden 1:150 mit Laemmli reduzierendem Probenpuffen verdünnt, auf 10% SDS-PAGE (MiniProtean II, BioRad) einer Elektrophorese unterzogen und durch Western Blotten, wie vorstehend beschrieben (Durieux, J. J., N. Vita, O. Popescu, F. Guette, J. Calzada-Wack, R. Munker, R. E., Schmidt, J. Lupker, P. Ferrara, H. W. Zigler-Heitbrock und M. O. Labeta, The two soluable forms of the lipopolysaccharide receptor, CD 14: characterization and release by normal human monocytes. Eur. J. Immunol. 24 (1994) 2006-12) durch Verwenden eines TLR2 spezifischen Antikörpers (gereinigter Ziegen polyklonaler Antikörper, Santa Cruz) oder normalen Ziegen IgG (Santa Cruz) 1:2000 verdünnt (100 ng/ml) mit Phosphat gepufferter Salzlösung pH 7,4 (PBS) mit 2% (w/v) BSA und 0,1% (v/v) Tween-20 supplementiert, analysiert. Der anti-TLR2 Antikörper erkennt ein Peptid mit 17 Aminosäuren, welches nahe dem N-Terminus des TLR2 Polypeptids kartiert. Ein Nachweis wurde gemäß den Herstellerangaben durch das verstärkte Chemielumineszenz-Verfahren (ECL, Amersham) mit einem Meerrettich-Peroxidase konjugierten anti-Ziegen Antikörper (Santa Cruz), durchgeführt, der 1:4000 mit PBS verdünnt und mit 0,5% (w/v) BSA und 0,1% (v/) Tween –20 supplementiert ist. Um die Spezifizität der anti-TLR2 Western Blotte zu bestätigen, wurde der anti-TLR2 Antikörper bei einigen Versuchen und vor einem Blotten mit 10-fach überschüssiger Konzentration des Peptids (Santa Cruz) präinkubiert (2h/Raumtemperatur), welches zum Erzeugen des anti-TLR2 Antikörpers verwendet wurde.
Die Konzentration von löslichem CD 14 (beschriebenes Ion) wurde darüber hinaus für jede Probe bestimmt. (Menschliche Brustmilch wurde von gesunden Spendern nach schriftlichem Einverständnis gesammelt). Die Milch wurde innerhalb von 2 Stunden nach dem Sammeln weiterverarbeitet. Das Zellpellet wurde nach Zentrifugation für eine andere Analyse behalten und der Überstand wurde bei –80°C bis zu einem Testen von sCD14 durch ELISA (Immuno-Biological Laborstories) eingefroren. Die untersuchten Proben zeigten eine sCD 14 Konzentration im Bereich von zwischen 26 und 81 μg pro ml.
Ergebnisse und Schlussfolgerung
Das Ergebnis der Western Blot Versuche ist in den 1 und 2 gezeigt, worin zwei Banden von 38 und 40 kDa ersichtlich sind, wo der TLR2 Antikörper verwendet wurde (Spuren 1 und 2 von 1).
Das neue Polypeptid wurde nicht nachgewiesen, falls die Membranen mit dem anti-TLR2 Antikörper geblottet wurden, der mit dem spezifischen 17-AS TLR2 Peptid präinkubiert ist, das zum Erzeugen des Antikörpers verwendet wurde (Spuren 3 und 4 von 1).
Die Expression von sTLRR war zu früheren Zeitpunkten nach der Geburt höher (Tag 0 bis Tag 5). Anzumerken ist, dass ebenso eine direkte Korrelation zwischen der Expression von sTLRR und der Konzentration von Milch sCD14 gefunden wurde (2). Die Vergleiche des Expressionsniveaus zwischen sTLRR und sCD 14 in Milch legten ferner nahe, dass sTLRR bei ungefähr 6-7-fach geringeren Niveaus als sCD 14 exprimiert wird.
sTLRR ist schlussendlich ein neues Polypeptid, das in menschlicher Brustmilch auftritt und welches ein lösliches Homolog von menschlichem TLR2 darstellt. Die Funktion von sTLRR ist wahrscheinlich mit derjenigen von sCD14 verknüpft, was sTLRR zu einem Kandidaten für ein Regulieren von entzündlichen Zuständen macht. Darüber hinaus kann es ein Molekül zum Erhalten der Homeostase der Darmschleimhaut bei der andauernden entzündungsförderlichen Herausforderung durch Bakterien und bakterielle Produkte darstellen.
Beispiel 2: Reinigung von sTLRR:
Bedeutsame Mengen von hoch gereinigtem sTLRR für weitere Studien können durch Immunopräzipitation gefolgt von SDS-PAGE, Elektroblotten auf PVDF Membranen und Proteinelution erhalten werden.
Verfahren
Für gewöhnlich wird 1 ml menschliche Brustmilch (vorzugsweise Kolostrum, Tag 1 bis 5 nach der Geburt) 1:10 mit einem Verdünnungspuffer verdünnt, welcher aus 50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 besteht, der mit 0,5% (w/v) NP-40 (BDH), 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 1 mM EDTA und 50 mM NaF (alle Protease Inhibitoren von Sigma) supplementiert ist. Die verdünnte Probe wird durch Inkubation (1 h, 4°C mit Drehung bzw. Rotation) mit 30 μg gewöhnlichem Ziegen IgG (Santa Cruz) vor geklärt, gefolgt von zwei aufeinander folgenden Inkubationen mit 250 μl Protein G-Sepharose (1:1 Schlämmung, Sigma), wobei die letzte Inkubation Übernacht fortgesetzt wird. Jede Runde einer Protein G-Sepharose Inkubation wird von einem Pelletieren der Kügelchen durch behutsame Zentrifugation (800 g, 2 min bei 4°C) gefolgt und die Kügelchen werden verworfen. Die vor geklärte und verdünnte Milchprobe wird mit 30 μg polyklonalem (Ziegen) anti-TLR2 Antikörper (Santa Cruz) inkubiert (1 h, 4°C mit Drehung), gefolgt von 150 μl Protein G-Sepharose. Folgend einer behutsamen Zentrifugation der Sepharose Kügelchen wird der Überstand verworfen und das Pellet wird fünfmal mit dem Verdünnungspuffer gewaschen. Anschließend werden die Kügelchen in 100 μl Laemmli reduzierendem Proben Puffer resuspendiert, gekocht (5 Min.), und das eluierte Material wird auf ein 10% SDS-Polyacrylamid Gel geladen. Das immunopräzipitierte Molekül wird nach der Elektrophorese auf eine PVDF Membran übertragen und mit saurer Extraktion nach Standardprotokollen (J. Coligan et al. eds., Current Protocols in Protein Science, J. Wiley & Sons; Kapitel 10, Abschnitt 10.7) extrahiert. Alternativ dazu wird das Protein für eine massenspektrometrische Analyse im Gel mit Trypsin (Sequenziergrad; Promega) zur Vorbereitung der Analyse wie beschrieben (J. Coligan et al. eds., Current Protocols in Protein Science, J. Wiley & Sons; Kapitel 16, Anhang 14, Abschnitt 4) verdaut.
Schlussfolgerung
Das neue Polypeptid sTLRR wird in einer isolierten Form erhalten. Die Konzentration des Polypeptids in der Elution liegt ungefähr in dem Bereich von 0,5 bis 3 μg, vorzugsweise 1–2 μg pro ml.
Beispiel 3: Co-Immunopräzipitation von sTLRR und sCD14
Verfahren und Ergebnisse
Es wurde getestet, ob sTLRR mit sCD 14 in menschlicher Milch wechselwirkt. Eine starke 48 kDa Polypeptidbande wurde mit einem sCD 14 spezifischen polyklonalen Antikörper (Kaninchen) durch Westen Blot von Milchproben nachgewiesen, gefolgt von einer Immunopräzipitation mit einem anti-TLR2 Ziege polyklonalen Antikörper, aber nicht mit dem Kontroll Ziegen IgG.
Strippen und erneutes Untersuchen der Membranen mit anti-TLR2 Antikörper bestätigte die Anwesenheit des 38 und 40 kDa Polypeptids zusätzlich zu der 48 kDa sCD14 Bande. Diese 80 kDA Bande konnte nachgewiesen werden, falls die Membran mit dem anti-TLR2 spezifischen Antikörper, aber nicht mit Kontroll IgG, erneut untersucht wurde.
Schlussfolgerung
Es gibt Anhaltspunkte, dass das neue Polypeptid (sTLRR) mit dem bereits beschriebenen sCD 14 wechselwirkt oder daran bindet und einen 80 kDa Komplex bildet. Die Funktion des Komplexes muss mit den Funktionen von sCD 14 eng verbunden sein, welche zuvor beschrieben wurden (Frey EA, Miller DS, Gullstein Jahr T, Sundan A, Bazil V, Espevik T, Sinlay BB, Wright SD, Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide; J. Exp. Med., 176 (1992) 1665-71).
Beispiel 4: Expression von sTLRR und seine Modifikation durch Säuger Epithelzellen
Dieser Versuch zielt auf ein Identifizieren der Quelle des neuen sTLRR Polypeptids.
Verfahren und Ergebnisse
Immunopräzipitation gefolgt durch Western Blotten mit anti-TLR2 spezifischem Antikörper zeigte eine Expression der 38 und 40 kDa TLRR Polypeptide ebenso wie die 80 kDa Bande in den Kulturüberständen und Gesamt-Lysaten der Säuger Epithelzelllinie MCF-7.
Darüber hinaus wurde getestet, um die Expression von sTLRR durch Verwenden verschiedener Stimuli, einschließlich von Östrogen nachahmendem Phenolrot, synthetischem Lipopeptid, INF-γ/TNF-α, LPS und PMA/Ionomycin, zu modifizieren. Phenolrot und INF-γ/TNF-α induzierten eine bedeutsame Herrauf-Modulierung von beidem, den 38/40 kDa und 80 kDa Molekülen, in dem Gesamt-Lysat ebenso wie in dem Kulturüberstand.
Schlussfolgerung
Das neue Polypeptid (sTLRR) wirkt schlussendlich als ein immunmodulatorisches Agens. Es reguliert insbesondere eine Immunantwort durch Inhibieren der Induktion von entzündungsfördernden Cytokinen herunter. Das neue Polypeptid weist daher ein Potential für ein Regulieren von mehreren Erkrankungen auf, welche mit Überreaktionen des Immunsystems verbunden sind, wie beispielsweise Allergien, entzündliche Erkrankungen des Darms, systemische chronische Entzündungen und Autoimmun-Erkrankungen.
Beispiel 5: Ernährungsformulierung, welche sTLRR umfasst
Um eine entzündliche immanente Immunantwort in dem Magen-Darm Trakt von Kindern herunter zu regulieren, wurde eine Ernährungsformulierung hergestellt, welche sTLRR in wirksamen Mengen umfasst.
Lösliches sTLRR wurde in angereicherter Form wie vorstehend beschrieben hergestellt und zu Ernährungs-ausgewogenem Produkt hinzu gegeben, welches ungefähr 15% Trockensubstanz in einer derartigen Menge umfasst, dass die dadurch erhaltene Präparation eine Menge von ungefähr 0,1 bis 100, vorzugsweise 0,5 bis 50 μg, des sTLRR pro g Trockensubstanz umfasst. Die Trockensubstanz besteht aus 20% Protein, 45% Carbohydrat, 32,3% Fett und 2,7% Mineralien und Vitaminen gemäß den empfohlenen Werten. Die Ernährungsformulierung weist einen Energiegehalt von ungefähr 75 kcal/dl (315 kJ/dl) auf.
Beispiel 6: Weitere Wirkungen des sTLRR
Verfahren
Um die regulatorische Wirkung von sTLRR zu testen, wurden anti-TLR2 Antikörper vor einer Zellstimulierung durch LPS hinzu gegeben, U373 Astrocytom Zellen (ATCC) wurden mit E.coli LPS (100 ng/ml) wie bereits beschrieben (Labeta MO, Vidal K, Rey Nores JA, Arias M, Vita N, Morgan BP, Guillemot JC, Loyaux D, Ferrara P, Schmid D, Affolter M, Borysiewicz LK, Donnet-Hughes A, Schiffrin EJ; Innate recognition of bacteria in human milk is mediated by a milk-derived highly expressed pattern recognition receptor, soluble CD 14; J. Exp. Med.; 191 (2000) 1807-12) in 2% menschliche Brustmilch (1 bis 5 Tage nach der Geburt) enthaltendem Medium aktiviert. Das Milch enthaltende Medium wurde vor einer Zellstimulierung mit den anti-TLR2 Aks (10 Mikrogramm/ml) oder einer Isotypen-passenden Kontrolle präinkubiert (30 Min./Eis). Kulturüberstände wurden nach 24h Inkubation für eine IL-6 Freisetzung durch ELISA getestet. Zellaliquots wurden 4h anschließend einer Zellstimulierung genommen und auf CD54 (ICAM-1) Zelloberflächen Expression durch Flusszytometrie getestet.
Ergebnisse und Schlussfolgerung
Die Verwendung von anti-TLR2 bei der Präinkubation von Zellen erhöhte die LPS induzierte Milch mediierte Expression von ICAM-1 (CD54) und Sekretion von IL-6 durch die Zelllinien beträchtlich. Das Ausmaß der verstärkenden Wirkung für mehrere Versuche betrug durchschnittlich 100% für eine IL-6 Freisetzung und 100% für CD54. Die verstärkende Wirkung wurde ebenso nachgewiesen falls gereinigtes sCD14 anstelle von Milch verwendet wurde. Dies zeigt an, dass die sTLRR Molekül modulatorische Aktivität zumindest bei einigen Fällen, falls mit dem sCD 14 Molekül verglichen, stattfindet.
Das in Milch und ebenso in anderen Körperfluiden vorliegende anti-TLR2 scheint ein wichtiges regulatorisches Molekül einer bakteriellen Aktivierung von immanenten und anschließend adaptiven Immunantworten darzustellen. Dies kann von entscheidender Bedeutung bei der Kontrolle einer überhöhten entzündlichen Antwort auf bakterielle Produkte in dem frühkindlichen Zeitraum sein, falls der Wirt zum ersten Mal einem Überfluss von neuen bakteriellen Antigenen und entzündungsförderlichen Molekülen begegnet.
Beispiel 7: Verschiedene Fragmente von aus menschlicher Milch isoliertem sTLRR
Western Blot Analyse von Milch Proben wurden 1:50 mit Laemmli reduzierendem Probenpuffer verdünnt, durch 10% SDS-PAGE getrennt, und mit anti-TLR2 polyklonalem (Ziegen) Antikörper (Sc 8689, Santa Cruz, Ca, USA) immunogeblottet, welcher gegen ein Peptid von 17 Aminosäuren erzeugt ist, der dem N-Terminus des menschlichen TLR2 Proteins kartiert. Blots wurden durch Inkubation mit einem Esel anti-Ziegen IgG-Peroxidase konjugiertem Ak visualisiert, gefolgt von verstärkter Chemolumineszenz (Amersham). Für Einzelheiten siehe Beispiel 1.
Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt, worin verschiedene Fraktionen von sTLRR, welche den Fragmenten von Seq. ID Nr. 1 entsprechen, ersichtlich sind. Die Fragmente und ihre Größen sind: 1 (80 kDa), 2 (70 kDa), 3 (60 kDa), 4 (40 kDa), 5 (25 kDa) und 6 (22 kDa). Sequenzliste

Claims

Lösliches, aus Milch erhältliches Polypeptid mit einem durch SDS-PAGE-Analyse erfassten Molekulargewicht von ungefähr 22, 25, 38, 40, 60, 70, 80 kDa, und welches ferner eine Sequenzähnlichkeit von mindestens 90% mit dem TLR-Rezeptor von einer von SEQ ID Nr. 1 oder 2 aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Homolog der oder verwandt mit der Toll-like Rezeptor (TLR)-Familie ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 2, das durch mit einem anti-TLR-Antikörper durchgeführter Immunpräzipitation von Säugerfluiden, wie Brustmilchserum, Plasma oder Darminhalt, erhältlich ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Verwendung als ein Medikament.
Verzehrbares Produkt, welches Beimengungen des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
Creme, Lotion oder Salbe, welche Beimengungen des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als ein Bestandteil in einem funktionellen Lebensmittel oder Kosmetikartikel.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Medikaments für die Prophylaxe, Verhinderung oder Behandlung einer mit entzündlichen Zuständen oder allergischen Reaktionen verbundenen Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 8 für die Modulation immunologischer und/oder entzündlicher Prozesse.