DE69034096T2

DE69034096T2 - Verwendung eines Bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins oder von biologisch aktiven Analogen davon zur Behandlung von mit Lipopolysaccharid assoziierten, durch gramnegative Bakterien hervorgerufenen Infektionen

Info

Publication number: DE69034096T2
Application number: DE69034096T
Authority: DE
Inventors: Marian N. Marra; Randal W. Scott
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1990-02-14
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2010-02-15
Also published as: EP0841064A1; EP0460058B1; ATE246933T1; US5089274A; AU647734B2; IL93360A; DE69032579D1; CA2048619C; WO1990009183A1; DE69032579T2; ES2205111T3; EP0460058A4; EP0841064B1; ATE169820T1; ES2122958T3; CA2048619A1; AU5170690A; KR0160133B1; EP1384485A1; EP0460058A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gram-negative Infektionen sind ein Hauptgrund für die Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit besonders bei stationär behandelten und abwehrgeschwächten Patienten. [Duma, R. J., Am. J. of Med. 78 (Ergänzungsband 6A) (1985), 154–164, und Kreger B. E., D. E. Craven und W. R. McCabe, Am. J. Med. 68 (1980), 344–355].
Obwohl verfügbare Antibiotika Infektionen effektiv eindämmen, tragen sie nicht zur Neutralisierung der pathophysiologischen Wirkungen in Verbindung mit dem Lipopolysaccharid (LPS) bei. LPS oder Endotoxin ist ein Hauptbestandteil der äußeren Membran von gram-negativen Bakterien und wird bei der Lyse der Organismen freigesetzt. [Ahenep, J.L., und K.A. Morgan, J. Infect. Dis. 150 (3) (1984), 380–388].
Das während der Antibiotikatherapie freigesetzte LPS ist ein wirksamer Stimulator der Entzündungsreaktion. Viele schädliche Wirkungen von LPS in vivo werden durch lösliche aus Entzündungszellen freigesetzte Mediatoren bewirkt. [Morrison D. C. und R. J. Ulevich, Am. J. Pathol. 93 (2) (1978), 527–617]. LPS induziert die Freisetzung von Mediatoren durch Entzündungszellen des Wirts, die schließlich zu einer disseminierten intravasalen Koagulation (DIC), einer akuten respiratorischen Insuffizienz (ARDS), einem Nierenversagen und einem irreversiblen Schock rühren.
Monocyten und neutrophile Granulocyten spielen eine Schlüsselrolle bei der Verteidigung des Wirts gegen bakterielle Infektionen und sind auch an der Pathologie von Endotoxämie beteiligt. Diese Zellen nehmen Mikroorganismen auf und töten diese intrazellulär und antworten auch auf LPS in vivo und in vitro durch Freisetzung löslicher Proteine mit mikrobiziden, proteolytischen, opsonischen, pyrogenen. Komplement-aktivierenden und gewebeschädigenden Wirkungen. Der Tumornekrosefaktor (TNF), ein durch LPS-stimulierte Monocyten freigesetztes Cytokin, ahmt einige der toxischen Wirkungen von LPS in vivo nach. Die Injektion von TNF in Tiere verursacht Fieber, Schock und Veränderungen im Glucose-Metabolismus. TNF ist auch ein wirksamer Stimulator von Neutrophilen.
Lösliches LPS bewirkt eine verringerte Chemotaxis bei Neutrophilen, erhöhte Adhäsionsfähigkeit, erhöhte Aktivität des Hexosemonophosphat-Nebenwegs und 0^-Radikalproduktion, Hochregulierung von Oberflächenrezeptoren für das Komplement und Freisetzung von Granulaproteinen in das umgebende Medium. [Morrison und Ulevich (1978)].
Sowohl spezifische als auch azurophile Kompartimente degranulieren als Antwort auf LPS. [Bannatyne, R.M., N.M. Harnett, K.Y. Lee und W.D. Rigger, J. Infect. Dis., 156 (4) (1977), 469–474]. Azurophile Proteine, die als Antwort auf LPS freigesetzt werden, können für den Wirt sowohl schädlich als auch vorteilhaft sein. Elastase von Neutrophilen bewirkt einen Abbau von für die Unterdrückung der Koagulationskaskade verantwortlichen Proteaseinhibitoren. Diese Ergebnisse bewirken in Koagulopathien wie disseminierte intravasale Koagulation, eine potentiell letale Konsequenz von Endotoxämie. Azurophile Granula enthalten auch bakterizide Moleküle, wie die Myeloperoxidase und den bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Faktor (BPI).
Kaninchen-BPI wurde zuerst im Jahre 1975 entdeckt. [Weiss, J., R.C. Franson, S. Becherdite, K. Schmeidler und P. Eisbach, J. Clin. Invest. 55 (1975), 33]. BPI wurde von menschlichen Neutrophilen im Jahre 1978 isoliert. [Weiss, J., P. Eisbach, I. Olsonund H. Odeberg, J. Biol. Chem. 253 (8) (1978), 2664–2672].
Im Jahre 1984 wurde ein 57 kD-Protein mit ähnlichen Eigenschaften aus menschlichen Neutrophilen isoliert. [Shafer, W.M., C.E. Martin und J.K. Spitznagel, Infect. Immun. 45 (1984), 29]. Dieses Protein ist mit BPI hinsichtlich der N-terminalen Sequenz, der Aminosäurezusammensetzung, dem Molekulargewicht und der Quelle identisch. Jedoch gelang den Autoren die Reproduktion des von Eisbach et al. und Weiss et al. verwendeten chromatographischen Isolationsverfahrens nicht.
Menschliches BPI ist ein 57 kD-Protein, das an die äußere Membran von dafür zugänglichen gram-negativen Bakterien bindet. [Weiss et al. (1978) und Marra et al., J. Immunology 144 (2) (1990), 662–666]. Die Tatsache, daß BPI ein Lipid A-bindendes Protein ist, wird nachgewiesen durch: (1) rauhe Bakterienstämme sind empfindlicher gegen bakterizide und die Permeabilität erhöhende Aktivitäten von BPI [Weiss, J., M. Hutzier und L. Kao, Infect. Immun. 51 (1986), 594]; (2) Mutationen im Lipid A bewirken eine verringerte Bindung und eine erhöhte Resistenz gegen eine bakterizide Aktivität sowohl von Polymyxin B als auch BPI [Far ley, M.M., W.M. Shafer und J.K. Spitznagel, Infect. Immun. 56 (1988), 1589]; (3) BPI konkurriert mit Polymyxin B um eine Bindung an S. typhimurium [Farley 1988]; (4) BPI zeigt eine Sequenzhomologie und Immunkreuzreaktivität mit einem anderen LPS-bindenden Protein, dem Lipopolysaccharid-Bindungsprotein (LBP). Es wurde gezeigt, daß LBP-LPS-Komplexe den oxidativen "Burst" bei Neutrophilen als Antwort auf formylierte Peptide stimulieren. Das Lipoprotein hoher Dichte (HDL), ein weiteres LPS-bindendes Protein, das im menschlichen Serum im Komplex mit LPS gefunden wird, zeigt keine stimulierende Wirkung auf Neutrophile. Die BPI-Bindung bricht die Struktur von LPS auf, verändert die mikrobielle Permeabilität auf kleine hydrophobe Moleküle und bewirkt den Zelltod (Weiss et al. (1978) und Weiss et al. J. Immunology, 132(6):3109–3115, 1984). BPI tötet Bakterien unter physiologischen Bedingungen des pH-Werts und der Ionenstärke in vitro, was anzeigt, daß es in vivo außerhalb der niedrigen pH-Umgebung des Phagolysosoms aktiv sein kann. Alle bakteriziden und die Permeabilität erhöhenden Aktivitäten von BPI sind im N-terminalen 25 kD-Fragment des Proteins vorhanden. [Ooi, C.E., J. Weiss, P. Eisbach, B. Frangione und B. Marrion, J. Biol. Chem. 262 (1987), 14891]. Vor der Erfindung war es jedoch selbstverständlich, daß die vorteilhaften Wirkungen von BPI auf seine bakteriziden Wirkungen begrenzt sind.
Trotz der Verbesserungen der antibiotischen Therapie bleibt die mit Endotoxämie in Verbindung stehende Krankheitshäufigkeit und Sterblichkeit hoch. Antibiotika allein können die toxischen Wirkungen von LPS nicht effektiv neutralisieren. Daher entsteht die Notwendigkeit für eine Zusatztherapie mit der direkten LPS-neutralisierenden Aktivität. In gegenwärtigen Verfahren zur Behandlung von Endotoxämie werden Antibiotika und eine Zusatztherapie verwendet. Die meisten verfügbaren Zusatztherapien behandeln Symptome von endotoxischem Schock, wie geringer Blutdruck und Fieber, inaktivieren jedoch nicht das Endotoxin. Andere Therapien hemmen die Entzündungsreaktionen der Wirte auf LPS. Wie nachstehend angegeben, gibt es für gegenwärtige Therapien erhebliche Einschränkungen aufgrund ihrer Toxizität, Immunogenität oder der nicht-reproduzierbaren Wirksamkeit zwischen Tiermodellen und der Erprobung am Menschen.
Polymyxin B ist ein basisches Polypeptid-Antibiotikum, von dem gezeigt wurde, daß es den am meisten toxischen und biologisch aktiven Bestandteil des Endotoxins Lipid A bindet und strukturell aufbricht. Es wurde gezeigt, daß Polymyxin B die LPS-Aktivierung der neutrophilen Granulafreisetzung in vitro hemmt und eine effektive Behandlung einer gram-negativen Sepsis in Menschen darstellt. Aufgrund seiner systemischen Toxizität wird dieses Arzneimittel jedoch nur begrenzt verwendet, außer als topischer Wirkstoff.
Es wurde gezeigt, daß die Kombinationstherapie unter Verwendung von Antibiotika und hohen Dosen von Methylprednisolonnatriumsuccinat (MPSS) den Tod in einem experimentellen Modell für gram-negative Sepsis unter Verwendung von Hunden verhindert. Eine weitere Untersuchung unter Verwendung von MPSS mit Antibiotika in einer Plazebo-kontrollierten klinischen Doppelblind-Multicenter-Untersuchung an 223 Patienten mit klinischen Anzeichen von systemischer Sepsis kommt zu dem Schluß, daß sich die Sterblichkeit zwischen den Behandlungs- und den Plazebo-Gruppen nicht signifikant unterschied. Ferner fanden die Forscher, daß die Resolution der sekundären Infektion innerhalb von 14 Tagen in der Plazebogruppe signifikant höher war.
Eine relativ neue Behandlungsform von Endotoxämie ist die passive Immunisierung mit Endotoxin-neutralisierenden Antikörpern. Es wurde gezeigt, daß hyperimmunes menschliches Immunglobulin gegen E. coli J5 die Sterblichkeit bei Patienten mit gram-negativer Bacterämie und Schock um 50% reduziert. Andere Gruppen haben vielversprechende Ergebnisse in Tiermodellen unter Verwendung von Mäuseantikörpern, Chimären und menschlichen monocionalen Antikörpern erreicht. Obwohl monocionale Antikörper gegenüber Hyperimmunseren Vorteile haben, z. B. gleichbleibendere Wirkstoffwirksamkeit und verringerte Übertragung von menschlichen Pathogenen, gibt es noch viele Probleme im Zusammenhang mit der Verabreichung von Immunglobulin zur Neutralisierung von LPS. Wirtantworten auf die Immunglobuline selbst können zu einer Hyperempfindlichkeit führen. Eine Gewebeschädigung nach der Komplementaktivierung und Ablagerung von Immunkomplexen ist ein weiteres Problem bei der Verwendung von anti-Endotoxin-Antikörper bei septischen Patienten einschließenden Therapien. Ferner sind Immunglobuline große Moleküle, besonders die sich zur Zeit in klinischer Erprobung befindlichen pentameren IgMs, die schnell durch das retikuloendotheliale System beseitigt werden, wodurch die Halbwertszeit des Wirkstoffs herabgesetzt wird.
Endotoxine erzeugen Antworten, die für den Wirt vorteilhaft sowie schädigend sind. Endotoxämie induziert die Produktion von LPS-bindenden Proteinen in der Leber und bewirkt die Freisetzung von mikrobiziden Proteinen aus Leukocyten. In den Untersuchungen der Anmelder über an der Wirtverteidigung beteiligte neutrophile Proteine wurde ermittelt, daß eines dieser Proteine, BPI, nicht nur ein wirksames mikrobizides Mittel in vitro ist, sondern auch die Fähigkeit von LPS zur Stimulierung von Neutrophilen stört. Genauer gesagt wurde gezeigt, daß BPI an lösliches LPS bindet und seine Fähigkeit zur Aktivierung von Neutrophilen neutralisiert. Dem zufolge stellt die Erfindung ein therapeutisches verfahren zur Behandlung von LPS-Toxizität bei gram-negativer Septikämie zur Verfügung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Lipopolysaccharid (LPS)-vermittelten Stimulierung von Zellen. Dies schließt das Inkontaktbringen der Zellen in Gegenwart einer zellstimulierenden Menge Lipopolysaccharid mit dem bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Protein (BPI) in einer eine Zellstimulation hemmenden Menge ein.
So kann die vorliegende Erfindung die Behandlung einer gram-negativen bakteriellen Infektion unterstützen. Zum Beispiel kann dies ein in Kontakt bringen der bakteriellen Infektion mit gereinigtem BPI oder biologisch aktivem Polypeptid-Analogon davon in einer Menge einschließen, die effektiv ist, um die LPS-vermittelte Stimulierung von Zellen zu inhibieren und dadurch die bakterielle Infektion zu behandeln.
Die Erfindung betrifft in einem Gesichtspunkt die Verwendung des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der pyrogenen Aktivität eines Endotoxins in einem Menschen.
Die Erfindung betrifft in einem anderen Gesichtspunkt die Verwendung des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Produktion des Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktors durch menschliche mononukleäre Zellen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Gesichtspunkt die Verwendung des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Endotoxin-vermittelten Stimulierung von Zellen in einem Menschen.
Auch durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird die Verwendung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Vorbeugung oder Inhibierung einer Erkrankung, die mit Endotoxin zusammenhängender Schock, mit Endotoxin zusammenhängende disseminierte intravaskuläre Koagulation, mit Endotoxin zusammenhängende Anemie, mit Endotoxin zusammenhängende Leukopenie, mit Endotoxin zusammenhängende Thrombozytopenie, mit Endotoxin zusammenhängendes adultes respiratorisches Streßsyndrom oder mit Endotoxin zusammenhängendes Nierenversagen ist, wobei die Erkrankung mit der Anwesenheit eines Endotoxins in einem Menschen assoziiert ist.
Weiterhin durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird die Verwendung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Endotoxämie, die mit der Anwesenheit von Endotoxin in einem Menschen assoziiert ist.
Weiterhin durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird die Verwendung von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Inhibierung von Endotoxämie, die mit der Anwesenheit von Endotoxin in einem Menschen, der gegenüber dieser Erkrankung empfindlich ist, assoziiert ist.
Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von gereinigtem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein zur Verfügung gestellt, das umfaßt:

(a) Erhalten einer ungereinigten Probe von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein;
(b) Auftrennen der ungereinigten Probe durch Umkehrphasen-HPLC;
(c) Sammeln jedes Peaks;
(d) Trocknen jedes Peaks in Anwesenheit von Niedrig-Endotoxin-BSA;
(e) Nochmaliges Trocknen jedes Peaks in Anwesenheit von Pyrogen-freier 0,1% Essigsäure; und
(f) Isolieren und Aufreinigen von gereinigtem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhendem Protein.

Hier beschrieben ist eine Zusammensetzung zur Behandlung einer Gram-negativen bakteriellen Infektion. Diese Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptid-Analogon davon in einer Menge, die effektiv ist, um die LPS-vermittelte Stimulierung von Zellen zu inhibieren und einen geeigneten Träger.
Auch beschrieben ist ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das an einem mit gram-negativem Endotoxin zusammenhängenden Schock leidet, der durch eine gram-negative Infektion verursacht wird, das Verabreichen an das Subjekt einer Menge an BPI umfaßt, die effektiv ist, um die gram-negative Infektion zu bekämpfen und das Subekt zu behandeln, um so den mit Endotoxin zusammenhängendem Schock zu lindern.
Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, das an einer eine disseminierte intravasale Koagulation einschließenden Störung leidet. Das Verfahren umfaßt Verabreichen an das Subjekt einer Menge an BPI die effektiv ist, um die Symptome der disseminierten intravasalen Koagulation zu lindern und so das Subjekt zu behandeln.
Ferner wird ein Verfahren zur Behandlung einer Person beschrieben, die an Endotoxämie leidet, die von einer gram-negativen Infektion bewirkt wird, das die Verabreichung an die Person einer Menge von BPI, die effektiv ist, um die gram-negative Infektion zu bekämpfen und die an Endotoxämie leidende Person zu behandeln.
Wie hier verwendet, meint Endotoxämie einen Zustand, bei dem das Blut giftige Produkte enthält, nämlich die von den Körperzellen produzierten oder die von Mikroorganismen, d. h. gram-negative Bakterien, stammenden Produkte.
Auch beschrieben ist ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Anämie leidet, die durch eine gram-negative bakterielle Infektion verursacht wird, die die Verabreichung einer zur Behandlung des Individuums wirksamen Menge von BPI an das Individuum umfaßt, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Anämie zu lindern.
Weiter beschrieben ist ein Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Leukopenie, die durch eine gram-negative bakterielle Infektion verursacht wird, leidet. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer zur Behandlung des Individuums wirksamen Menge von BPI an das Individuum, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Leukopenie zu lindern. Ferner ist ein Verfahren für die Behandlung eines Individuums beschrieben, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Thrombocytopenie leidet, die durch eine gram-negative bakterielle Infektion verursacht wurde, die die Verabrei chung einer zur Behandlung des Individuums wirksamen Menge von BPI an das Individuum umfaßt, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Thrombocytopenie zu lindern.
Auch ist ein Verfahren zur Hemmung eines Pyrogens beschrieben, wobei das Pyrogen mit einer Menge BPI in Kontakt gebracht wird, um das Pyrogen zu hemmen.
Ferner ist ein Verfahren zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen beschrieben, was das Inkontaktbringen der Zellen in Gegenwart einer Zell-stimulierenden Menge Lipopolysaccharid mit BPI in einer Menge, die die Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen bewirkt, umfaßt.
Auch beschrieben ist ein Verfahren zur Hemmung der LPS-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen beschrieben, was die Verwendung von BPI in einer Menge umfaßt, die die Hemmung der durch gram-negative Bakterien vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen bewirkt.
Darüber hinaus ist eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums beschrieben, das an einem an mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock leidet. Die Zusammensetzung umfaßt ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an einem mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger.
Weiter ist eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums beschrieben, das an einer disseminierten intravasalen Koagulation leidet. Die Zusammensetzung umfaßt ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an einer disseminierten intravasalen Koagulation leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger.
Es wird auch eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums beschrieben, das an Endotoxämie leidet, die gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an Endotoxämie leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfaßt.
Zusätzlich wird eine Zusammensetzung zur Behandlung eines an mit Endotoxin in Verbindung stehender Anämie leidenden Individuums beschrieben, die gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Anämie leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger umfaßt.
Zusätzlich wird eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Leukopenie leidet, beschrieben. Die Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Leukopenie leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger. Ferner wird eine Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums beschrieben, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Thrombocytopenie leidet. Die Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer zur Behandlung eines Individuums, das an mit Endotoxin in Verbindung stehender Thrombocytopenie leidet, wirksamen Menge und einen geeigneten Träger.
Wie hier verwendet, ist die mit Endotoxin in Verbindung stehende Leukopenie ein Zustand, dessen Manifestation eine Abnahme unter die normale Zahl von Leukocyten im peripheren Blut ist. Ferner ist die mit Endotoxin in Verbindung stehende Thrombocytopenie, wie hier verwendet, ein Zustand, dessen Manifestation eine Abnahme unter die normale Zahl von Thrombocyten ist.
Auch wird eine Zusammensetzung zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen beschrieben, die gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt. Ferner wird eine Zusammensetzung zur Hemmung der LPS-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen beschrieben, die gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung der LPS-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt.
Hier beschrieben ist eine Zusammensetzung zur Hemmung eines Pyrogens. Die Zusammensetzung umfaßt ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung eines Pyrogens wirksam ist.
Zusätzlich wird ein Verfahren zur Verhinderung eines Symptoms beschrieben, das mit einer gram-negativen bakteriellen Infektion in einer Person assoziiert ist, das die Verabreichung an die Person einer effektiven Menge von bakterizidem/die Permeabilität erhöhendem Protein umfaßt, um die gram-negative bakterielle Infektion zu verhindern und dadurch den Symptomen vorzubeugen.
Darüber hinaus wird auch ein Verfahren zur Verhinderung einer Störung beschrieben, die eine disseminierte intravasale Koagulation in einem Individuum beinhaltet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer die Symptome der disseminierten intravasalen Koagulation verhindernden und dadurch die Störung beseitigenden Menge des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins an das Individuum umfaßt.
Zuletzt wird ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von gereinigtem bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein beschrieben, das umfaßt: (a) Erhalten einer ungereinigten Probe von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein; und (b) Auftrennen der ungereinigten Probe durch Säulenchromatographie unter der Verwendung von depyrogenierten Lösungen, wodurch das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein isoliert und aufgereinigt wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1a: Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von CR1 auf frisch isolierten Neutrophilen wurde durch FACS-Analyse gemessen. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Dosen von E. coli 0111:B4-LPS stimuliert, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Da die durchschnittliche Fluoreszenzintensität zwischen Individuen variiert, werden die Daten als Prozent der beobachteten maximalen Antwort ausgedrückt. Die dargestellten Daten repräsentieren die durchschnittliche +/– Standardabweichung von drei Experimenten.
1b: 0111:B4-LPS (10 ng/ml) wurde mit verschiedenen Dosen von rohem Azurophilextrakt 30 Minuten bei 37°C vor dem Test auf eine Stimulierung von Neutrophilen vorinku biert. Die dargestellten Daten repräsentieren die durchschnittliche +/– Standardabweichung von doppelten Ausführungen eines repräsentativen Experiments. Die Werte werden als % Hemmung der Antwort auf LPS allein ausgedrückt.
2: Der rohe Azurophilextrakt wurde durch Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt. Jeder Peak wurde von Hand gesammelt und die Proteinkonzentrationen durch Aminosäureanalyse ermittelt. Ein Aliquot (1 /ug) jedes Peaks wurde in Gegenwart von Nieder-Endotoxin-BSA getrocknet und anschließend in Gegenwart von pyrogenfreier 0,1% Essigsäure erneut getrocknet. Die dargestellten Daten repräsentieren die durchschnittliche +/– Standardabweichung von doppelten Ausführungen eines repräsentativen Experiments.
3a: BPI, das durch Größenausschluß mit einer anschließenden Kationenaustausch-HPLC gereinigt wurde, wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, und die Fraktionen wurden auf eine LPS-hemmende Aktivität getestet.
3b: Die Daten zeigen das RPLC-Profil des 2X gereinigten Materials zusammen mit der hemmenden Aktivität und der SDS-PAGE-Analyse der Fraktionen 20, 21 und 22.
4: 0111:B4-LPS (10 ng/ml) wurde mit verschiedenen Dosen von (A) gereinigtem BPI und (B) Polymyxin B vorinkubiert und anschließend auf eine Neutrophile stimulierende Aktivität getestet. Die Ergebnisse von zwei Experimenten zeigen die Hemmung der Komplement-Rezeptor-Expression bei Neutrophilen mit der Standardabweichung für Probenduplikate.
5: (a) Eine Balkendarstellung, die die BPI-Expression auf der Oberfläche von mit FMLP, TNF und LPS stimulierten Neutrophilen erläutert, (b) Eine Balkendarstellung, die die maximale Hochregulierung von CR3 auf der Zelloberfläche von menschlichen Neutrophilen erläutert.
6: Eine Balkendarstellung, die zeigt, daß BPI und Polymyxin B mehr als 70% der Antwort von Neutrophilen auf LPS zum Zeitpunkt =0 hemmen.
7: Eine graphische Darstellung, die zeigt, daß BPI die LPS-Aktivität im LAL-Test hemmt.
8: Ein Chromatogramm, das ein durch Kationenaustausch-HPLC fraktioniertes azurophiles Granulaextrakt (Schritt 1) zeigt; die gepunktete Linie zeigt die LPS-hemmende Aktivität und die durchgezogene Linie die Proteinabsorption.
9: Ein Chromatogramm, das ein durch Kationenaustausch-HPLC fraktioniertes azurophiles Granulaextrakt (Schritt) zeigt; die gepunktete Linie zeigt die LPS-hemmende Aktivität und die durchgezogene Linie die Proteinabsorption.
10: Ein Chromatogramm, das ein durch Größenausschluß-HPLC fraktioniertes azurophiles Granulaextrakt (Schritt 3) zeigt; die gepunktete Linie zeigt die LPS-hemmende Aktivität und die durchgezogene Linie die Proteinabsorption.
11: Ein SDS-PAGE-Gel des azurophilen Granulaextrakts, des ausgefällten Extrakts und der Fraktionenpools der drei chromatographischen Schritte.
12: Analyse des gereinigten BPI durch Microbore-Umkehrphasen-HPLC, die einen einzelnen 97% des Gesamtproteins ausmachenden Hauptpeak identifiziert.
13: Eine Liniendarstellung, die die Hemmung der neutrophilen Antwort auf 10 ng/ml LPS durch BPI zeigt.
14: Eine Liniendarstellung, die zeigt, daß BPI direkt an LPS bindet.
15: Eine Liniendarstellung, die zeigt, daß die Bindung von BPI an immobilisiertes LPS durch Polymyxin B gehemmt wurde.
16: Eine Liniendarstellung, die zeigt, daß BPI in Gegenwart von Plasma an LPS bindet.
17: Eine Liniendarstellung, die zeigt, daß BPI in Gegenwart von Serum an LPS bindet.
18: Eine Balkendarstellung, die zeigt, daß BPI eine pyrogene Antwort auf LPS moduliert.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der Lipopolysaccharid (LPS)-vermittelten Stimulierung von Zellen verwendet werden. Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen der Zellen mit BPI in einer die Zellstimulation hemmenden Menge in Gegenwart einer zellstimulierenden Menge von Lipopolysaccharid.
Die die Zellstimulation hemmende Menge BPI variiert gemäß den vorhandenen Bedingungen. Die die Zellstimulierung hemmende Menge ist vorzugsweise 100 ng bis 100 mg, wobei die Menge von 10 ug bis 10 mg am meisten bevorzugt ist.
Neutrophile und Monocyten sind die Zellen mit der größten Bedeutung im Hinblick auf die Anwendung der vorliegenden Erfindung. Es werden jedoch andere Zellen, wie Endothelzellen, ebenfalls durch LPS beeinflußt und können in dieser Erfindung verwendet werden.
In der bevorzugten Ausführungsform wird gereinigtes BPI verwendet. BPI umfaßt ferner rekombinantes BPI und biologisch aktive Polypeptidanaloge davon. Ein geeignetes Analog von BPI umfaßt ein Polypeptid, das ein Molekulargewicht von etwa 25 kD aufweist und der N-terminalen Aminosäuresequenz von BPI entspricht.
Wie hier verwendet meint ein biologisch aktives Polypeptidanalog des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins ein Polypeptid, das im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz und biologische Aktivität wie natives oder natürlich vorkommendes bakterizides/die Permeabilität erhöhendes Protein aufweist.
Die Erfindung kann in einem Verfahren zur Behandlung einer gram-negative bakteriellen Infektion brauchbar sein. Dieses Verfahren umfaßt ein in Kontakt bringen der bakteriellen Infektion mit gereinigtem BPI oder einem biologisch aktiven Polypeptid-Analogon davon in einer effektiven Menge, um die LPS-vermittelte Stimulierung von Zellen zu inhibieren und dadurch die bakterielle Infektion zu behandeln.
Es ist dem Fachmann bewußt, daß eine gram-negative bakterielle Infektion eine gram-negative Sepsis einschließt, die häufigste tödliche nosokomiale Infektion. Allgemein ist eine gram-negative Sepsis ein ernsthafter toxischer fieberhafter Zustand, der durch eine Infektion mit pyrogenen Mikroorganismen verursacht wird, mit oder ohne Septikämie.
Die gram-negative bakterielle Infektion kann mit einem endotoxischen Schock oder einem entzündlichen Zustand assoziiert sein. Der entzündliche Zustand kann beispielsweise mit einer disseminierten intravasalen Koagulation (DIC), akuten respiratorischen Insuffizienz (ARDS) oder Nierenversagen in Verbindung stehen.
In Übereinstimmung mit der Erfindung ist die gram-negative bakterielle Infektion in einem Menschen vorhanden.
Hier beschrieben ist eine Zusammensetzung zur Behandlung einer gram-negativen bakteriellen Infektion. Diese Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder einem biologisch aktiven Polypeptid-Analogon davon in einer effektiven Menge, um die LPS-vermittelte Stimulierung von Zellen zu inhibieren und einen geeigneten Träger.
Bevorzugt wird das BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht. Ein pharmazeutisch verträglicher Träger umfaßt jeden beliebigen der pharmazeutischen Standardträger wie eine sterile Lösung, Tabletten, beschichtete Tabletten und Kapseln. Üblicherweise enthalten diese Träger Exzipienten, wie Stärke, Milch, Zucker, bestimmte Arten von Ton, Gelatme, Stensinsäure, Talk, Pflanzenfette oder -öle, Gummi, Glycole oder andere bekannte Exzipienten. Diese Träger können auch Geschmacksstoffe und Farbzusätze oder andere Bestandteile einschließen. Die diese Träger umfassenden Zusammensetzungen werden durch gut bekannte übliche Verfahren formuliert. Die Zusammensetzung jedoch, die BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge umfaßt, die zur Unterdrückung der die LPS vermittelte Stimulation von Neutrophilen oder Monocyten wirksam ist, ist bisher unbekannt.
In diesem Verfahren kann die Verabreichung der Zusammensetzung durch jedes beliebige der gut bekannten Verfahren, einschließlich, jedoch ohne Beschränkung darauf, einer oralen, intravenösen, intramuskulären und subcutanen Verabreichung durchgerührt werden.
Bei der Durchführung der Erfindung kann die in die Zusammensetzung eingeschlossene Menge an BPI oder einem biologisch aktiven Polypeptidanalog davon stark variieren. Verfahren zur Ermittlung der genauen Menge sind dem Fachmann gut bekannt und hängen unter anderem von der behandelten Person, dem spezifischen pharmazeutischen Träger und dem verwendeten Verabreichungsweg und der Häufigkeit ab, mit der die Zusammensetzung verabreicht werden soll.
Die vorliegende Erfindung kann ferner bei einem Verfahren zur Behandlung eines an einem mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock leidenden Individuums brauchbar sein, das die Verabreichung an das Individuum einer BPI-Menge umfaßt, die zur Behandlung der Person wirksam ist, um den mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock zu lindern. Endotoxine, wie hier verwendet, sind Substanzen, die Lipopolysaccharidkomplexe enthalten, die in den Zellwänden von Mikroorganismen, prinzipiell bei gram-negativen Bakterien, gefunden werden.
Ferner kann die Erfindung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Individuums, das an einer eine disseminierte intravasale Koagulation einschließenden Störung leidet, brauchbar sein. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Menge an BPI an das Individuum, die zur Linderung der Symptome der disseminierten intravasalen Koagulation wirksam ist und so die Person behandelt.
Wie hier verwendet, ist der Begriff disseminierte intravasale Koagulation eine komplexe Störung der Gerinnungsmechanismen, bei der die Koagulationsfaktoren mit einer erhöhten Geschwindigkeit mit allgemeiner Fibrinausfällung und Thrombose, Blutungen und weiterer Verminderung der Koagulationsfaktoren verbraucht werden. Ferner kann die disseminierte intravasale Koagulation akut oder chronisch sein.
Ferner kann die vorliegende Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung eines an Endotoxämie leidenden Individuums brauchbar sein, die durch eine gram-negative Infektion hervorgerufen wird, das die Verabreichung einer Menge an BPI, die zur Behandlung des an Endotoxämie leidenden Individuums wirksam ist, an das Individuum umfaßt und das Subjekt behandelt, das an Endotoxämie leidet.
Wie hier verwendet, meint Endotoxämie einen Zustand, bei dem das Blut giftige, entweder von Körperzellen produzierte oder von Mikroorganismen, d. h. gram-negative Bakterien, stammende Produkte, enthält.
Ferner kann die Erfindung in einem Verfahren zur Behandlung eines an mit Endotoxin in Verbindung stehender Anämie leidenden Individuums brauchbar sein, das die Verabreichung einer Menge an BPI, die zur Behandlung des Individuums wirksam ist, an das Individuum umfaßt, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Anämie zu lindern.
Die vorliegende Erfindung kann ferner in einem Verfahren zur Behandlung eines an mit Endotoxin in Verbindung stehender Leukopenie leidenden Individuums brauchbar sein. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Menge an BPI an das Individuum, die zur Behandlung des Individuums wirksam ist, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Leukopenie zu lindem. Ferner kann die Erfindung in einem Verfahren zw Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Thrombocytopenie leidenden Individuums brauchbar sein, das die Verabreichung einer Menge an BPI an das Individuum umfaßt, die zur Behandlung des Individuums wirksam ist, um die mit Endotoxin in Verbindung stehende Thrombocytopenie zu lindern.
Die Erfindung kann ferner in einem Verfahren zur Hemmung eines Pyrogens brauchbar sein, das das Inkontaktbringen des Pyrogens mit einer Menge an BPI zur Hemmung des Pyrogens umfaßt.
Wie hier verwendet, ist ein Pyrogen eine beliebige Fieber-erzeugende Substanz; exogene Pyrogene schließen bakterielle Endotoxine, besonders von gram-negativen Bakterien ein; ein endogenes Pyrogen ist ein thermolabiles Protein, das von Zellen wie mononukleären Leucocyten stammt und zur Erzeugung von Fieber auf Gehirnzentren wirkt.
Die Erfindung kann ferner in einem Verfahren zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen brauchbar sein, das das Inkontaktbringen der Zellen in Gegenwart einer zellstimulierenden Menge an Lipopolysaccharid mit BPI in einer Menge, die zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, umfaßt.
Die Erfindung kann ferner in einem Verfahren zur Hemmung der LPS-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen brauchbar sein, das die Verwendung von BPI in einer Menge, die zur Hemmung der LPS-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, umfaßt.
Die Menge an BPI, die zur Hemmung der Zellstimulierung wirksam ist, variiert gemäß den vorhandenen Bedingungen. Die Menge, die zur Hemmung der Zellstimulierung wirksam ist, ist vorzugsweise von 100 ng bis 100 mg, wobei die am meisten bevorzugte Menge von 10 ug bis 10 mg ist.
In den vorstehend beschriebenen Verfahren umfaßt das BPI rekombinantes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon. Ferner umfaßt das biologisch aktive Polypeptidanalog von BPI ein Polypeptid, das ein Molekulargewicht von etwa 25 kD aufweist und der N-terminalen Aminosäuresequenz von BPI entspricht.
Ferner kann die Erfindung durch Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines an einem mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock leidenden Individuums durchgeführt werden. Die Zusammensetzung umfaßt ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an einem mit Endotoxin in Verbindung stehenden Schock leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger.
Ferner kann die Erfindung unter Verwendung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer disseminierten intravasalen Koagulation leidenden Individuums durchgeführt werden. Die Zusammensetzung umfaßt ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an einer disseminierten intravasalen Koagulation leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger.
Die Erfindung kann durch eine Zusammensetzung zur Behandlung eines an Endotoxämie leidenden Individuums durchgerührt werden, die ein gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an Endotoxämie leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt.
Die Erfindung kann ferner durch Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Anämie leidenden Individuums durchgeführt werden, die gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Anämie leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt.
Ferner kann die Erfindung durch Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines Individuums, das an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Leukopenie leidet, durchgeführt werden. Die Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Leukopenie leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger. Eine weitere Wirkung kann durch eine Zusammensetzung zur Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Thrombocytopenie leidenden Individuums bereitgestellt werden. Die Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Behandlung eines an einer mit Endotoxin in Verbindung stehenden Thrombocytopenie leidenden Individuums wirksam ist, und einen geeigneten Träger.
Ferner kann die Erfindung durch eine Zusammensetzung zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen durchgeführt werden, die das gereinigte BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt. Darüber hinaus kann die Erfindung durch eine Zusammensetzung zur Hemmung der Bakterien-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen durchgeführt werden, die das gereinigte BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung der Bakterien-vermittelten Tumornekrosefaktorproduktion durch Zellen wirksam ist, und einen geeigneten Träger umfaßt.
Die Erfindung kann durch Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Hemmung eines Pyrogens durchgeführt werden. Die Zusammensetzung umfaßt gereinigtes BPI oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon in einer Menge, die zur Hemmung eines Pyrogens wirksam ist.
Ferner kann die Erfindung zur Vorsorge eines Zustands in Verbindung mit der Gegenwart eines Endotoxins in einem Individuum verwendet werden, die die Verabreichung einer Menge des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins, die zur Vorsorge des Zustandes wirksam ist, an ein Individuum umfaßt. In dem bisher beschriebenen Verfahren ist der Zustand ein beliebiger Zustand, der mit Endotoxin in Verbindung stehender Schock, Endotoxämie, mit Endotoxin in Verbindung stehende Anämie, mit Endotoxin in Verbindung stehende Leukopenie oder mit Endotoxin in Verbindung stehende Thrombocytopenie ist.
Ferner kann eine weitere Anwendung ein Verfahren zur Vorsorge einer Störung sein, an der eine disseminierte intravasale Koagulation in einem Individuum beteiligt ist, das die Verabreichung einer Menge des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins an das Individuum umfaßt, die zur Vorsorge der Symptome der disseminierten intravasalen Koagulation und damit zur Vorsorge der Störung wirksam ist.
Zuletzt wird hier ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von bakterizidem/die Permeabilität erhöhendem Protein beschrieben, das umfaßt: (a) Erhalten einer ungereinigten Probe von bakterizidem/permeabilitäts-erhöhendem Protein; und (b) Auftrennen der ungereinigten Probe durch Säulenchromatographie unter der Verwendung von depyrogenierten Lösungen, und Isolieren und Aufreinigen des bakteriziden/permeabilitäts-erhöhenden Protein. Darüber hinaus schließt in diesem Verfahren das bakterizide/permeabilitäts-erhöhende Protein ein natives bakterizides/die Permeabilität erhöhendes Protein oder ein biologisch aktives Polypeptidanalog davon ein. Ferner umfaßt das biologisch aktive Polypeptidanalog des bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Proteins ein Polypeptid, das ein Molekulargewicht von etwa 25 kD aufweist und der N-terminalen Aminosäuresequenz des bakteriziden die Permeabilität erhöhenden Proteins entspricht. Es wurde festgestellt, daß das biologische Aktivitätsniveau von BPI je nach dem für den Erhalt von BPI verwendeten Verfahren variiert. Es scheint, daß das depyrogenierte BPI, d. h. BPI, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung von depyrogenierten Lösungen isoliert und gewonnen wurde, ein viel höheres biologisches Aktivitätsniveau als Pyrogen enthaltendes BPI zeigt (Tabelle 5 und 4a).
Diese Erfindung wird in den nachstehenden Abschnitten Experimentelle Details und Ergebnisse erläutert.
Experimentelle Details
Beispiel 1
Materialien und Methoden
Reagenzien
Lipopolysaccharid von E. coli 0111:B4, S. typhimurium-Wildtyp, Glycolipid der S. typhimurium RE-Mutante, und Lipid A der S. typhimurium RE-Mutante und LPS von P. aeruginosa wurden von RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT, erworben; Fmet-Leu-Phe (FMLP) und Polymyxin B-Sulfat von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; Hank's balancierte Salzlösung ohne Calcium, Magnesium und Phenolrot (HBSS) von Hazelton Research Products, Denver, PA; Ficoll-Paque, Percoll und Macrodex von Pharmacia Inc., Piscataway, NJ; TNF und anti-TNF von Endogen, Boston, MA; Fluorescein konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG von TAGO Inc., Burlingame, CA: IgGI-Kontrollantikörper von Coulter Immunology, Hialeah, FL; Phycoerythrin (PE) konjugierter anti-CR3 (Leu-15) und IgG2a-Kontrolle von Becton Dickinson, Mountain View, CA, der monocionale anti-CR1-Antikörper Yz-1 war eine freundliche Spende von Dr. Rick Jack an der Harvard-University.
Isolierung und Extraktion von azurophilen Granula
Die Granulocyten wurden aus von lokalen Blutbanken erhaltenen Buffy-Coat Präparationen isoliert. Die Buffy-Coat-Präparationen wurden 3-4X in HBSS verdünnt und die Granulocyten von den mononucleären Zellen durch Zentrifugation durch 64% Percoll getrennt. Das Pellet wurde zu Diisopropylfluorophosphat (DFP) gegeben, gewaschen und in eiskaltem Lysepuffer (10 mM PIPES, pH 6,8, 100 mM KCl, 3 mM NaCl und 3,5 mM MgCl2) resuspendiert und durch Stickstoff-Kavitation (Pan Instrument Co., Moline, IL) aufgebrochen. Die azurophilen Granula wurden auf diskontinuierlichen Percoll-Gradienten, wie von Borregaard beschrieben, isoliert. [Borregaard, N., J. M. Heiple, E. R: Simons und R. A. Clark, J. Cell. Biol. 97 (1983), 52–61]. Die azurophilen Granula wurden gesammelt, und Percoll wurde durch Zentrifugation bei 180000 × g 2 Stunden entfernt. Die Granula wurden durch 4 Gefrier-Auftau-Zyklen mit einer anschließenden 1-minütigen Ultraschallbehandlung lysiert. Die lysierten Granula wurden in einem gleichen Volumen von 100 mM Glycin, pH 2, durch Behandlung mit dem Vortexgerät mit Unterbrechungen 1 Stunde bei Raumtemperatur lysiert. Der saure Extrakt wurde durch Zentrifugation bei 30000 × g 20 Minuten und bei 200000 × g 30 Minuten geklärt.
Isolation von Neutrophilen
Venenblut wurde gesunden freiwilligen Spendern entnommen, in saures Citratdextrose-Antikoagulans gegeben und unmittelbar anschließend auf Eis gegeben. Fünf Teile Blut wurden mit 1 Teil kaltem Macrodex vermischt und konnten 1,5 bis 2 Stunden bei 4°C absitzen.
Leucocyten-reiches Plasma wurde IX in kaltem HBSS gewaschen, anschließend in HBSS resuspendiert und über Ficoll-Paque geschichtet. Bei einer signifikanten Erythrocyten-Kontamination wurde das Granulocyten-Pellet einer hypotonischen Lyse unterzogen. Die Zellen wurden 2X in HBSS gewaschen und in HBSS + 2% autologem Plasma resuspendiert, um eine Granulocyten-Endkonzentration von 1 × 10⁶ ml im Inkubationsgemisch zu erhalten.
BPI-Reinigung
Etwa 2 mg Rohextrakt azurophiler Granula wurden nach Größe auf einer Biosil (TSK-250) (7,8 mm × 600 mm) Hochleistungs-Größenausschluß-Säule unter Verwendung von 50 mM Glycin und 100 mM NaCl-Puffer, pH 2,0, unter isokratischen Bedingungen bei einer Durchflußrate von 1 ml/min getrennt. Säulenfraktionen mit der größten LPS-hemmenden Aktivität enthielten einen großen Anteil des 54 kD-Spezies, wie durch SDS-PAGE gezeigt wurde. Diese TSK-Fraktionen wurden vereinigt, durch eine schwache Aquapore-Kationenaustauscher (WCX)-Säule (2,1 mm × 30 mm) unter Verwendung von 50 mM Citrat, pH 5,5, geleitet und in einem Gradienten von 0 bis 75% 50 mM Citrat und 1 M NaCl (Puffer B) 25 min und anschließend in einem Gradienten von 75 bis 100% Puffer B 5 min mit einer Durchflußrate von 200 ml/min eluiert. Material von 57 kD wurde aus dem Kationenaustauscher gewonnen und erschien als einzelne Bande bei der SDS-PAGE. In einigen Experimenten wurde BPI durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule weiter gereinigt, die 12 min in 0,1% CH₃CN plus 0,1% TFA und 30 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 200 ml/min beladen wurde (Rainin Instruments, Emeryville, CA).
Stimulation der Neutrophilen
Isolierte Neutrophile wurden bis zur Inkubation mit und ohne Stimuli 30 Minuten bei 37°C auf Eis gehalten. Nach der Inkubation wurden die Zellen in einem großen Volumen von kaltem PBS + 0,05% Na-Azid +2% autologem Plasma gewaschen. Die Pellets wurden in zwei Teile geteilt, eines mit 50 ul Kontroll-IgGl-Antikörper (20 ug/1 × 10⁶ Zellen), das andere mit 50 ul 20 ug/1 × 10⁶ Zellen anti-CR1 30 Minuten bei 0°C angefärbt. Nach der Inkubation wurden die Zellen 2X mit PBS + autologem Plasma gewaschen, anschließend mit Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC und in einigen Experimenten mit 20 ul IgG2a-Phycoerythrin (PE) in Kontrollvertiefungen und 20 ul Leu-15 PE in Testvertiefungen angefärbt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 0°C und 2 zusätzlichen Waschungen wurden die Zellen durch Durchfluß-Cytometrie auf einem Becton Dickinson FACStar-Durchflußcytometer (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. Die Stimulation der Neutrophilen wurde durch einen Vergleich der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität der Proben, die in HBSS +2% autologem Plasma allein (Kontrolle) inkubiert worden waren, mit der von mit LPS oder mit LPS, das 30 Minuten bei 37°C mit BPI oder Polymyxin B vorinkubiert worden war, inkubierten Proben beurteilt. Die Daten werden als % Stimulierung oder % Hemmung ausgedrückt und wurden unter Verwendung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (FI) auf einer logarithmischen Skala berechnet gemäß: % Stimulation = [(Experiment – Kontrolle)/(Maximum – Kontrolle)] × 100 und % Hemmung = 1-[(+ Inhibitor) – (Kontrolle)]/[(– Inhibitor – Kontrolle)] × 100
Aminosäureanalyse
Dampfphasenhydrolyse von BPI und die Aminosäurederivatisierung wurden unter Verwendung einer Pico-tag-Workstation (Waters, Milford MA) und eine chromatographische Analyse der Phenylthiocarbamylaminosäuren wurde mittels Applied Biosystems 130A MPLC unter Verwendung der vom Hersteller gelieferten Protokolle durchgeführt.
Sequenzanalyse
Die N-terminale Sequenz von BPI wurde durch automatischen Edman-Abbau unter Verwendung eines Applied Biosystems 477A-Pulsflüssigphasensequenziergeräts (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäureanalyse wurde online unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 120A-Flüssigchromatographen durchgeführt.
Ergebnisse
Menschliche Neutrophile können sowohl in vivo als auch in vitro durch Lipopolysaccharid stimuliert werden. Bei Aktivierung erhöht sich die Oberflächenexpression von Rezeptoren für C3b und C3bi (CR1 bzw. CR3). Unter Verwendung des fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräts (FACS) wurde die Fluoreszenzintensität von frisch isolierten menschlichen Neutrophilen nach einer Stimulierung mit steigenden Dosen von 0111:B4-LPS (1a) gemessen. Da die üblicherweise beobachtete maximale Stimulierung bei oder über 10 ng/ml war, wurde in Experimenten zum Testen auf eine Hemmung von 0111:B4-LPS 10 ng/ml als stimulatorische Dosis verwendet. Alle Experimente wurden in zweifacher Ausführung durchgerührt. In den meisten Experimenten sind die Daten nur für CR1 dargestellt, da kein Zustand beobachtet wurde, wo eine Stimulierung der Neutrophilen eine Hochregulierung nur von CR1 oder CR3 bewirkte (M. Marra et al., J. Immunol. 144 (2) (1990), 662–666).
Zur Ermittlung, ob Proteine, die in azurophilen Granula von Neutrophilen gerunden werden, mit der Antwort von Neutrophilen auf LPS wechselwirken, wurden saure Rohextrakte von azurophilen Granula mit LPS 30 Minuten bei 37°C vorinkubiert. Das Gemisch wurde anschließend auf seine Fähigkeit zur Stimulation von Neutrophilen getestet. Azurophiles Protein (1 ug/ml) konnte die Stimulation von 1 × 10⁶ polymorphnucleären Leucocyten (PMN)/ml durch 10 ng/ml LPS effektiv blockieren (1b). Diese Wirkung wurde unter Verwendung eines mit LPS vorinkubierten Glycin-Extraktionspuffers nicht beobachtet, noch gab es irgendeine Stimulierung von Neutrophilen unter Verwendung von Rohextrakt oder einer Glycinpufferkontrolle (Daten nicht dargestellt).
Zur weiteren Untersuchung, welches) der Proteine im Extrakt für eine hemmende Wirkung verantwortlich waren/war, wurden saure Rohextrakte durch Umkehrphasen-HPLC getrennt; jeder Peak wurde getrennt auf eine LPS-hemmende Aktivität getestet. Die Identität jedes der Peaks wurde zuvor unter Verwendung eines zweidimensionalen Reinigungsverfahrens ermittelt, das eine Microbore-Umkehrphasen-HPLC in der ersten Dimension nach SDS-PAGE, Elektroblotting und Mikrosequenzierung einschließt. Die azurophilen Proteine können in 10 diskrete Peaks aufgelöst werden, deren Identitäten in Tabelle 1 dargestellt sind. Die dargestellten Aminosäuresequenzen sind die ersten 15 Aminosäuren des N-Terminus.
Tabelle 1 Azurophilen Granula-abgeleitete Proteine
Die hemmende Aktivität von LPS von 1 ug jedes Peaks ist in 2 dargestellt. Wie dargestellt, hatte Peak 9 die höchste LPS-neutralisierende Aktivität. Die Hauptproteinspezies in diesem Peak war am N-Terminus mit dem zuvor beschriebenen bakteriziden/die Permeabilität erhöhenden Protein (BPI) identisch (Weiss, J., P. Eisbach, I. Olsson und H. Odeberg, J. Biol. Chem. 253 (8) (1978), 2664–2672). Es wurde gezeigt, daß BPI den größten Teil der gram-negativen bakteriziden Aktivität in den azurophilen Granulaproteinextrakten enthielt. Cathepsin G zeigte eine gewisse Hemmung von LPS, obwohl die Daten zwischen den Experimenten nicht so reproduzierbar wie für Peak 9 waren. Es wurde gezeigt, daß Cathepsin G an LPS in vitro bindet und gram-negative Organismen tötet, obwohl in einem geringeren Ausmaß als BPI. Weitere Proteine, die eine mikrobizide Aktivität gegen gram-negative Organismen aufwiesen, sind Elastase und die Defensive. Diese Proteine (1 ug/ml) hemmten jedoch nicht die stimulatorische Aktivität von LPS auf Neutrophile.
Die hemmende Aktivität von LPS von azurophilen Rohextrakten wurde weiter charakterisiert und unter Verwendung von Größenausschluß und Ionenaustausch mit einer anschließenden Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt. Die hemmende Aktivität von LPS wandert zusammen mit einer reinen 57 kD-Bande, die bei der SDS-PAGE beobachtet wurde (3b).
Da der in den RPLC-Trennungen verwendete Puffer [CH₃CN und 0,1% Trifluoressigsäure (TFA)] die LPS-hemmende Aktivität von BPI signifikant verringert (Daten nicht dargestellt) und da das aus einer Ionenaustauschchromatographie gereinigte Material von hoher Reinheit war, wie durch SDS-PAGE ermittelt wurde, wurde Größenausschluß/Ionenaustauschmaterial zur Erzeugung einer Dosis-Antwort-Kurve verwendet (4a). Daten von zwei Experimenten, die jeweils in zwei Ausführungsformen durchgerührt wurden, sind dargestellt. Dieses Größenausschluß/Ionenaustausch-gereinigte Material wurde als BPI durch N-terminale Se quenzanalyse bestätigt. Die Proteinkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse ermittelt. Wie in 4a dargestellt, sind etwa 90 ng/ml BPI zur maximalen Hemmung der Antwort von Neutrophilen auf 10 ng/ml 0111/B4-LPS erforderlich. Die Antwort von Neutrophilen auf das formulierte Peptid (10^–7 M FMLP) wurde durch BPI nicht gehemmt (Daten nicht dargestellt).
4b zeigt eine ähnliche Dosis-Antwort-Kurve für das Polypeptid-Antibiotikum Polymyxin B (PMB). Polymyxin B bindet an die Lipid A-Einheit von LPS und neutralisiert einige ihrer toxischen Wirkungen sowohl in vivo als auch in vitro. Es wurde gezeigt, daß Polymyxin B stöchiometrisch an LPS bindet (Morrison, D.C. und D.M. Jacobs, Immunochem. 13 (1976), 813–818). Die berechnete Menge an PMB, die zur Hemmung von 10 ng/ml glattem LPS erforderlich ist, ist etwa 0,67 nM. In den vorliegenden Experimenten waren 0,4 ng/ml oder 0,36 nM Polymyxin B erforderlich, um die Stimulierung von Neutrophilen unter Verwendung von 10 ng/ml LPS vollständig zu hemmen. 90 ng/ml oder 1,58 nM BPI waren zur 100%igen Hemmung von 10 ng/ml LPS erforderlich.
Daher war auf einer molaren Basis die Menge BPI, die zur Hemmung der LPS-Stimulierung von Neutrophilen in vitro erforderlich war, etwa 4X der für Polymyxin B erforderlichen Menge.
Zum Testen, ob BPI LPS von anderen gram-negativen Organismen hemmen kann, wurden LPS-Moleküle mit unterschiedlichen Polysaccharidkettenlängen und Lipid A im vorliegenden System gegen 90 ng/ml von 2X gereinigtem BPI untersucht. Die in Tabelle 2 dargestellten Daten zeigen, daß obwohl die stimulatorische Dosis zwischen diesen Molekülen variieren kann, LPS sowohl von glatten als auch rauhen Chemotypen sowie Lipid A durch BPI alle gehemmt werden.
Tabelle 2
Beispiel 2
I. Voruntersuchungen auf BPI von Neutrophilen
Wie zuvor diskutiert, ist das bakterizide/die Permeabilität erhöhende Protein (BPI) ein kationisches Protein mit einem Molekulargewicht von 50 bis 60 000, das zuerst aus Granula von menschlichen Neutrophilen durch Weiss et al. gereinigt wurde (Weiss, J., P. Eisbach, I. Olsson und H. Odegerg, J. Biol. Chem. 253 (1978), 2664). BPI verändert die Permeabilität der bakteriellen Zellmembran und hat eine bakterizide Aktivität spezifisch gegen gram-negative Organismen. Heute konzentriert sich die Literatur über BPI ausschließlich auf seine bakterizide Aktivität.
Es wird berichtet, daß BPI an LPS bindet und sowohl Antworten von Neutrophilen als auch Monocyten auf lösliches LPS in vitro hemmt. BPI hemmt ferner die LPS-Aktivität im Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test. Die vorliegende Forschung hat BPI als ein Leitmolekül zur Entwicklung von neuen Therapien gegen endotoxischen Schock identifiziert.
Als Antwort auf LPS regulieren menschliche Neutrophile die Zelloberflächenexpression der Komplementrezeptoren CR1 und CR3 hoch (1a und 5b). Zur Messung dieser neutrophilen Antwort auf LPS wurden frisch isolierte menschliche Neutrophile mit E. coli 011 LB4-LPS inkubiert (4a), und es wurde gezeigt, daß die maximale Hochregulierung von CR1 unter Verwendung von 10 ng/ml LPS beobachtet wird (4). Die Stimulation von Neutrophilen mit LPS wurde durch exogene anti-TNF-Antikörper nicht gehemmt, was den Schluß nahelegt, daß LPS direkt auf Neutrophile in diesem System wirkte.
BPI hemmt die Antwort von Neutrophilen auf LPS (4a). Die Hemmung der Hochregulierung von CR war bei einer Dosis von etwa 1,8 bis 3,6 nM (100 bis 200 ng/ml) BPI vollständig, im Vergleich zu 0,4 nM Polymyxin B, das zur Hemmung von 10 ng/ml glattem LPS (Molekulargewicht von etwa 15 000) erforderlich ist, das etwa 0,7 nM ist, was ungefähr mit dem beobachteten Wert von 0,4 nM übereinstimmt. Auf einer molaren Basis war die zur Hemmung von LPS erforderliche Menge an BPI etwa 5 fach größer als die für Polymyxin B erforderliche Menge.
BPI hemmt die LPS-vermittelte Stimulation von Neutrophilen, jedoch nicht die Stimulation durch FMLP oder TNF (Tabelle 3). Diese Daten zeigen, daß BPI LPS direkt hemmt und die Mechanismen von Neutrophilen, die an der Hochregulierung von CR beteiligt sind, nicht unterbricht.
Die Neutralisierung von LPS durch BPI erfolgte schnell. Selbst ohne Vorinkubation hemmten sowohl BPI (als auch Polymyxin B) mehr als 70% der Antwort von Neutrophilen auf LPS (6). Die maximale Hemmung wurde nach nur 5 Minuten Vorinkubation beobachtet.
BPI hemmt die durch LPS stimulierte Hochregulierung von CR von glatten und rauhen bakteriellen Stämmen sowie Lipid A (Tabelle 4). Aufgrund des breiten Spektrums der BPI-Aktivität gegen diese unterschiedlichen Formen von LPS, bei denen nur Lipid A und 2-Keto-3-desoxyoctonat geteilte Determinanten sind, ist es wahrscheinlich, daß die Hemmung von LPS durch BPI durch Lipid A bewirkt ist.
BPI hemmt weitere LPS-vermittelte Aktivitäten. Bei einer Konzentration von etwa 9 nM oder 500 ng/ml hemmte BPI signifikant die LPS-Aktivität im LAL-Test (7). Wenn LPS und BPI ohne Vorinkubation zusammengegeben wurden, wurde keine Hemmung beobachtet (Daten nicht dargestellt), was anzeigt, daß BPI auf LPS einwirkte und keine Wirkung auf das LAL-Testsystem hatte. BPI hemmt auch die LPS-vermittelte TNF-Produktion durch menschliche adhärente mononucleäre Zellen (Tabelle 5).
Tabelle 3 Wirkung von BPI auf eine Stimulation von Neutrophilen durch verschiedene Wirkstoffe Hemmung der Hochregulierung von CR bei Neutrophilen
Die Neutrophilen wurden mit E. coli 0111:B4-LPS, FMLP oder TNF, die in Gegenwart oder Abwesenheit von 2,7 nM BPI vorinkubiert wurden, inkubiert. Die Daten werden als prozentuale Hemmung der CR-Expression als Antwort auf jedes Stimulans, das mit Puffer allein vorinkubiert wurde, angegeben.
Tabelle 4 Hemmung der durch LPS und Lipid A induzierten Stimulation von Neutrophilen durch BPI Hemmung der Hochregulierung von CR bei Neutrophilen
Die Neutrophilen wurden mit LPS und Lipid A, die mit und ohne 2,7 nM gereinigtem BPI vorinkubiert wurden, stimuliert. Die Ergebnisse werden als prozentuale Hemmung der Fluoreszenzintensität, die bei jedem Typ von LPS allein beobachtet wurde, ausgedrückt.
Tabelle 5
Hemmung der LPS-induzierten TNF-Produktion menschlicher Monocyten durch BPI
Als Antwort auf LPS. das vorinkubiert wurde mit-, produziertes TNF (pg/ml)
BPI wurde zuerst durch Eisbach und Weiss im Jahre 1978 gereinigt. In den anfänglichen Untersuchungen der Anmelder wurde BPI aus azurophilen Granulaextrakten in einem einzelnen Schritt durch Umkehrphasen-HPLC isoliert. Die Ausbeute an BPI-Aktivität aus der Umkehrphase war gering, wahrscheinlich aufgrund der denaturierenden Bedingungen. Hier wird die Reinigung der LPS-hemmenden Aktivität unter Verwendung von nur nicht-denaturierenden Schritten beschrieben und gezeigt, daß der größte Teil der Aktivität von Neutrophilen zusammen mit BPI wandert. Verbesserungen bei der Reinigung führten zu einem Material mit sehr hoher spezifischer Aktivität, wie im nachstehenden Abschnitt dargestellt ist.
Die 8 bis 10 zeigen die drei chromatographischen Schritte, die gegenwärtig im Labor der Anmelder verwendet werden. Die Absorption wird durch die durchgezogene Linie und die LPS-hemmende Aktivität durch die gepunkteten Linien dargestellt. Tabelle 6 zeigt die Ausbeute an Aktivität und Protein und die spezifische Aktivität, wie sie in willkürlichen LPS-neutralisierenden Einheiten (NU) gemessen wurde. Eine neutralisierende Einheit ist die Menge an BPI, die 0,5 EU LPS um 50% im LAL-Test hemmt. Ein mit Coomassie angefärbtes SDS-PAGE-Gel dieser Pools ist in 11 dargestellt. Analyse des gereinigten BPI durch Mikrobore-Umkehrphasen-HPLC (12) identifizierte einen einzelnen Hauptpeak, der 97% des Gesamtproteins durch Integration ausmachte. Die tryptische Kartierung von BPI ermöglichte die Sequenzierung mehrerer Hauptfragmente, die die Identität des Proteins weiter bestätigten. Die in vollständiger Länge veröffentlichte Sequenz für BPI ist bekannt (P. W. Gray et al., J. Biol. Chem. 264 (16) (1989), 9505).
II. Reinigung von BPI unter streng pyrogenfreien Bedingungens
Materialien und Methoden
Reagenzien: USP-reines Spülwasser wurde von Travenol Laboratories Inc., Deerfield, IL; Pyrosart-Filter von Sartorius GmbH, Westdeutschland; CM Sepharose FF von Pharmacia, Upsala, Schweden; schwache Polyaspartamid-Kationenaustauscher-HPLC-Säule (100 × 4,6 mm) von der Nest Group, Southborough MA; Glycin und Bio-Sil G250-Größenausschluß-HPLC-Säule (600 × 7,5 mm) von BioRad Laboratories, Richmond, CA; Polyacrylamidelektrophoresegele von Novex, Encitas CA; Sequenzierungs- und Aminosäweanalysereagenzien und -puffer von Applied Biosystems Inc., Foster City, CA; Trifluoressigsäure, konstant kochende HCl, Aminosäure-Standardhydrolysat und BCA-Proteintestreagenzien von Peirce Chemical Co., Rockford, IL; Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test von Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD; Lipopolysaccharid von RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT; und HPLC-reines Acetonitril von J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, erhalten; alle anderen verwendeten Puffer und Salze hatten Analysenreinheit. 18 megohm reines Wasser wurde aus dem Lab Five-Ultrapure-Wassersystem von Technic, Seattle, WA, und 0,5 M NaOH zur Sanitation aus analysenreinen NaOH-Pellets und USP-Wasser hergestellt.
Granulaextrakte von Neutrophilen: wurden, wie beschrieben (U.S.-Seriennr. 199,206, am 26. Mai 1988 eingereicht) hergestellt, ausgenommen daß die Percoll-Trennung von azurophilen Granula weggelassen wurde. Stattdessen wurden Fraktionen aus ganzen Granula durch Zentrifugation des postnucleären Überstandes 20 Minuten bei 17 000 g erhalten. Das Granulapellet wurde anschließend in einem Volumen von 1 ml 50 mM Glycin, pH 2, für alle lysierten 4X10E8-Zellen suspendiert. Resuspendierte Granula wurden durch fünf Gefrier/Auftau-Zyklen auf Trockeneis/Ethanol mit anschließender heftiger Bewegung eine Stunde bei 4°C lysiert. Der lösliche Extrakt wurde durch Zentrifugation 30 Minuten bei 30000 g erhalten.
Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test: wurde, wie durch den Hersteller vorgesehen, durchgeführt. Wo erforderlich wurde der pH-Wert der Proben durch Zugabe von pyrogenfreiem 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,4, auf Neutralität eingestellt und der Salzgehalt auf < 150 mM durch Verdünnung mit USP-Wasser verringert.
LPS-Neutralisierungstest: wurde, wie zuvor beschrieben (M. Marra et al., J. Immunol. 144 (2) (1990), 662–666), durchgeführt.
Hochsalzfraktionierung von Granulaextrakten: 200 mg extrahiertes Protein wurden von verschiedenen Präparationen vereinigt und auf Eis gehalten, 1 Volumen von sterilem 5 M NaCl je 4 Volumina Extrakt wurde zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrimgation bei 20000 g 20 Minuten bei 4°C pelletiert. Dieser Überstand wurde für die CM-Sepharose-Chromatographie durch Verdünnen mit 4 Volumina USP-Spülwasser und Einstellen des pH-Werts mit ausreichend 1 M Tris, pH 7,4 zum Erhalt einer Endkonzentration von 50 mM hergestellt. Nur frische, sterile, pyrogenfreie Vorratssalze und Puffer wurden verwendet.
CM-Sepharose-Chromatographie: Eine XK-16-Säule (Pharmacia) wurde mit ausreichendem Harz gefüllt, um ein Bettvolumen von 5 ml zu erhalten. Die Säule wurde auf einem Gradienten-FPLC, der mit einer PI-Pumpe zum Auftragen der Proben ausgerüstet war, installiert. Vor der Verwendung wurden alle Oberflächen im Kontakt mit der mobilen Phase ausgiebig mit 0,5 M NaOH gewaschen. Die Säule wurde durch Waschen bei 0,2 ml/min mit 0,5 M NaOH 4 Std. sterilisiert. Die Säule wurde anschließend erneut äquilibriert und ein Leerlauf durchgerührt. Fraktionen des Leerlaufs und die Eluenten wurden durch einen LAL-Test auf eine Pyrogenität getestet. Der präparierte Extrakt wurde mit einer Durchflußrate von 400 ml/Std. aufgetragen. Nach dem Auftragen wurde die Säule mit 2 bis 3 Säulenvolumina Startpuffer gewa schen. Der Granulaextrakt wurde während des uftragens auf Eis gehalten. Die Säule wurde bei Raumtemperatur betrieben.
Schwache Kationenaustauscher-HPLC: wurde unter Verwendung einer ternären Eldex-Gradienten-Pumpe, die mit einem Rheodyne-Injektor und einem Gilson-Modell 111B U.V.-Detektor ausgerüstet war, durchgerührt. Benetzbare Oberflächen wurden mit 0,5 M NaOH gewaschen, wobei anschließend mit USP-Wasser ausgiebig gespült wurde, um alle Spuren der Base vor dem Installieren der Säule zu entfernen. Leerlauffraktionen und Eluenten wurden auf Pyrogenität, wie vorstehend beschrieben, getestet.
Gel-Permeations-HPLC: wurde mit den gleichen Vorsichtsmaßnahmen und Geräten, die für die schwache Kationen-Austauscher-HPLC angegeben wurden, durchgeführt.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese: 8 bis 16% Acrylamid-Gradientengele wurden von Novex erworben und gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgerührt.
Proteinsequenz-Ermittlung: Ein Applied Biosystems 477A-Pulsflüssigphasen-Sequenziergerät, das mit einem 120A PTH Aminosäureanalysegerät ausgerüstet war, wurde zum automatischen Edman-Abbau verwendet.
Microbore-Umkehrphasen-HPLC: Das Material zur Proteinsequenzierung wurde durch Entsalzung auf einer 30 × 2,1 mm-Aquapore-Butyl-Säule hergestellt. Der verwendete Gradient war 30 bis 100% B in 30 Minuten bei einer Durchflußrate von 200 ml/Minute. Der Detektor wurde auf eine Wellenlänge von 214 nm bei 2,0 Absorptionseinheiten Vollausschlag eingestellt (vgl. Insertion in X). Ein HP 3396A wurde zur Integration und zum Plotten der Daten verwendet.
Aminosäureanalyse: wurde auf dem vorstehend beschriebenen System unter Verwendung der PTC-Säule und den Puffern und Trennungsbedingungen, die von ABI bereitgestellt wurden, durchgeführt. Probenhydrolyse und PTC-Derivate wurden unter Verwendung einer Pico-Tag-Workstation von der Waters-Chromatographie-Abteilung von Millipore unter Verwendung der Hersteller-Protokolle hergestellt.
Proteintests: Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung der BCA-Verfahrensinstruktionen 23230 und 23225 von Peirce Chemical Co. ermittelt. Zur Minimierung der Pufferinterferenz wurden die Proben 10fach verdünnt und das Mikroreagenzprotokoll verwendet.
Ergebnisse
Von azurophilen Granula gereinigtes BPI wurde zuvor dargestellt, daß es die neutrophile Aktivierung durch LPS und LPS direkt im LAL-Test hemmt. Zur weiteren Definition der Rolle von BPI und zur Untersuchung der Gegenwart von anderen ähnlichen Molekülen sowohl in azurophilen als auch spezifischen Granula wurde die Reinigung der LPS hemmenden Aktivität von vollständigen Granula, die bei einem sauren pH-Wert extrahiert wurden, untersucht. Voruntersuchungen bestätigten die Gegenwart der LPS hemmenden Aktivität im Rohextrakt.
Zur Identifizierung der das Endotoxin neutralisierenden Aktivität wurde ihre Reinigung aus vollständigen Granula-Extrakten durchgeführt. Die Reinigung der LPS neutralisierenden Aktivität wurde durch die Beobachtung, daß hohe Konzentrationen von NaCl (IM) die reversible Ausfällung von etwa 90 Prozent des im Granulaextrakt vorhandenen Proteins bewirkten, wesentlich verbessert. Im wesentlichen verblieb die gesamte LPS hemmende Aktivität im löslichen Überstand. Die lösliche Fraktion wurde anschließend zur Reduktion der Ionenstärke verdünnt und durch CM-Sepharose-Kationenaustauschchromatographie weiter gereinigt und konzentriert. Ein breiter Aktivitätspeak eluierte, der anschließend weiter unter Verwendung einer Polyaspartamid-Hochleistungs-Kationenaustauschersäule gereinigt wurde. Ein etwas schärferer Aktivitätspeak wurde gewonnen; der zusammen mit einem Hauptprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 55 000 bei der SDS-PAGE zusammen mit mehreren Proteinen mit geringerem Molekulargewicht wanderte. Die Gel-Permeations-HPLC wurde als letzter Reinigungsschritt verwendet und ein Aktivitätspeak identifiziert, der mit einem einzelnen scharfen Proteinpeak eluierte. Das gereinigte Protein wanderte als zwei eng benachbarte Banden mit einem Molekulargewicht von 55000 bei der SDS-PAGE. 25% der das Endotoxin neutralisierenden Gesamtaktivität wurde mit einer 250fachen Reinigung gewonnen.
Das gereinigte Endotoxin neutralisierende Protein wurde einer Umkehrphasen-HPLC mit einer anschließenden Sequenzanalyse des N-Terminus durch automatischen Edman-Abbau unterzogen. Die in 6 dargestellte Sequenz wurde als bakterielles die Permeabilität erhöhendes Protein aufgrund der vollständigen Homologie über 39 Reste identifiziert. Ferner war die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Moleküls mit der von BPI praktisch identisch (Daten nicht dargestellt).
Zur Untersuchung, ob beide eng benachbarten Banden BPI waren, wurden die gereinigten Proteine einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung von BPI-spezifischen polyclonalen Kaninchen-Antiseren, die gegen ein synthetisches die Aminosäuren 1 bis 20 von BPI umfassendes Peptid erzeugt wurden, unterzogen. Beide Banden waren immunreaktiv. Die Unterschiede können durch die Glycosylierung entstehen.,
III. LPS-hemmende Aktivitäten von BPI in vitro
Die Reinigung von BPI unter streng pyrogenfreien Bedingungen, wie in Abschnitt II beschrieben, bewirkte eine effektivere BPI-Herstellung, wie durch die Dosis-Antwort-Kurve in 13 dargestellt ist.
Tabelle 6
Die Hemmung der LPS vermittelten Hochregulation von CR war bei 25 ng/ml BPI vollständig, was einer 4fachen Erhöhung der Aktivität im Vergleich mit dem in Abschnitt I verwendeten Material entspricht. Auf einer molaren Basis hemmte diese BPI-Präparation LPS in etwa stöchiometrischen Proportionen, die zu molaren hemmenden Konzentrationen von Po lymyxin B äquivalent sind. BPI hemmte ferner die LPS-vermittelte TNF-Produktion durch menschliche adhärente mononucleäre Zellen bei einer germgeren Konzentration im Anschluß an eine Reinigung unter pyrogenfreien Bedingungen (Tabellen 7 und 8).
BPI bindet an LPS (14). In diesen Experimenten wurden 4 ug LPS/Vertiefung an 96 Vertiefungen aufweisende Plastikplatten immobilisiert, anschließend mit verschiedenen Konzentrationen BPI inkubiert und mit polyclonalen anti-BPI-Antiseren entwickelt. Die BPI-Bindung an LPS wurde durch Polymyxin B (15) gehemmt, was die Spezifität der BPI-Bindung zeigt. BPI bindet sowohl in Gegenwart von Plasma (16) als auch Serum (17) an LPS, was die potentielle in vivo-Effizienz von BPI zeigt.
Tabelle 7
Hemmung der LPS-induzierten TNF-Produktion menschlicher Monocyten durch BPI
Als Antwort auf LPS. das vorinkubiert wurde mit-, produzierter TNF (pg/ml)
Die TNF-Produktion wurde durch ELISA getestet.
Tabelle 8
Hemmung der LPS-induzierten TNF-Produktion durch menschliche Monocyten
Als Antwort auf LPS. das vorinkubiert wurde mit-, produzierter TNF (pg/ml)
Beispiel 3
BPI/Endotoxin-Pyrogenität
Stadium 1A-Pyrogenität von Glycinpuffer:
305 ul Glycinpufferkontrolle (erhältlich von Redwood City) wurden auf 7 ml in PBS (Redwood City) verdünnt und in Polypropylenröhrchen (pyrogenfrei) vermischt. Das Röhrchen wurde mit Notizbuch-# 1990 markiert und in einem USP-Kaninchen-Pyrogentest unter Verwendung von drei Kaninchen in einer Dosis von 2 ml/Kaninchen (eigentliche Injektionsdosis waren 2,1 ml/Kaninchen) getestet.
Das Produkt war nicht-pyrogen; es produzierte eine Gesamttemperaturerhöhung bei allen drei Kaninchen von 0,4°C.
Stadium IB-Pyrogenität von 2 ug BPI:
304 ul BPI (Lot 78038, datiert mit 19.8.89) wurden auf 7 ml unter Verwendung von PBS (Redwood City) verdünnt und in Polypropylenröhrchen (pyrogenfrei) vermischt. Das Röhrchen wurde mit der Notizbuch-# 20170 markiert und in einem USP-Pyrogentest unter Verwendung von drei Kaninchen in einer Dosis von 2,0 ml/Kaninchen getestet.
Das Produkt war nicht-pyrogen, wie es durch eine Gesamttemperaturerhöhung von 0,2°C gezeigt wurde.
Stadium II-Pyrogenität von mit Endotoxin vorinkubiertem BPI:
Endotoxin von E. coli 055.B5 (Sigma Chemicals) wurde in PBS (Redwood City) auf 4096 EU/ml verdünnt. Diese Konzentration wurde durch den LAL-Test bestätigt. 304 ul BPI (Lot 78038, datiert mit 19.8.89) wurden auf 7 ml mit dem hier vorstehend beschriebenen PBS verdünnten Endotoxin (4096 EU/ml) unter Verwendung von Polypropylenröhrchen verdünnt. Das Röhrchen wurde durch Behandlung mit dem Vortexgerät zur effektiven Vermischung vermischt. Das BPI + Endotoxin und Endotoxin in PBS wurden bei 37°C in einem Wasserbad 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation bei 37°C zeigen das BPI + Endotoxin eine Endotoxinkonzentration von 122 EU/ml. Das in PBS verdünnte Endotoxin zeigte keine Veränderung des Endpunkts von 4096 EU/ml.
Das BPI + Endotoxin und Endotoxin in PBS wurden in dem USP-Pyrogentest unter Verwendung von drei Kaninchen getestet und bei einer Gesamttemperaturerhöhung von 4,6°C bzw. 7,5°C als pyrogen ermittelt.
Stadium II (Wiederholung):
Für eine Verbesserung der Ergebnisse bei den Manipulationen der Endotoxinpräparation wurde von E. coli 055:B5 von Sigma zu den offiziellen FDA-Referenzen gewechselt.
Ein Gefäß von EC-5 wurde erneut mit PBS (Redwood City) auf 2 ml rehydriert, um eine Konzentration von 5 000 EU/ml zu erhalten. Sie wurde gemäß der Etikettenvorgabe von 10 000 EU/ml durch den LAL-Test verifiziert.
Die BPI + Endotoxin-Probe wurde durch Zugabe von 38 ul PBI (Lot 78038) zu 7,3 ml PBS plus 320 (JL\ 5000 EU/ml EC-5-Endotoxin hergestellt. Die Präparation wurde in einem Polypropylenröhrchen (pyrogenbefreit) gut vermischt. Eine 8,0 ml-Probe des EC-5-Endotoxins wurde in PBS (Redwood City) mit der gleichen Konzentration ohne Zugabe von BPI hergestellt. Beide Proben wurden bei 37°C 30 Minuten in einem Wasserbad inkubiert.
Die beiden Proben wurden auf eine Endotoxinaktivität unter Verwendung des LAL-Tests getestet. Das BPI + Endotoxin waren negativ. Die Endotoxinprobe war beim Zielpunkt von 200 EU/ml positiv (18).
Beide Proben wurden in dem USP-Pyrogen-Test unter Verwendung von drei Kaninchen mit einer Dosis von 2,0 ml/Kaninchen getestet.
Das BPI + Endotoxin waren nicht-pyrogen und bewirkten eine Gesamttemperaturerhöhung von 1,1°C. Das EC-5-Endotoxin in PBS war pyrogen und bewirkte eine Gesamttemperaturerhöhung von 3,9°C.

Claims

Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der pyrogenen Aktivität eines Endotoxins in einem Menschen.
Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Lipopolysaccharid-vermittelten Tumornekrosefaktor-Produktion durch menschliche mononukleare Zellen in einem Menschen.
Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von der Endotoxin-vermittelten Stimulierung von Zellen in einem Menschen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Zellen Neutrophile oder Endothel- oder mononukleare Zellen sind.
Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung, Vorbeugung oder Inhibierung einer Erkrankung, die mit Endotoxin zusammenhängender Schock, mit Endotoxin zusammenhängende disseminierte intravaskuläre Koagulation, mit Endotoxin zusammenhängende Anemie, mit Endotoxin zusammenhängende Leukopenie, mit Endotoxin zusammenhängende Thrombozytopenie, mit Endotoxin zusammenhängendes adultes respiratorisches Streßsyndrom oder mit Endotoxin zusammenhängendes Nierenversagen ist, wobei die Erkrankung mit der Anwesenheit eines Endotoxins in einem Menschen assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Erkrankung mit Endotoxin zusammenhängender Schock ist.
Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Endotoxämie, die mit der Anwesenheit von Endotoxin in einem Menschen assoziiert ist.
Verwendung von bakterizidem/die Permeabilität-erhöhendem Protein (BPI) zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung oder Inhibierung von Endotoxämie, die mit der Anwesenheit von Endotoxin in einem Menschen, der gegenüber dieser Erkrankung empfindlich ist, assoziiert ist.
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Menge von BPI, die verabreicht wird, von 100 ng bis 100 mg beträgt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Menge von BPI, die verabreicht wird, von 10 μg bis 10 mg beträgt.
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das "BPI" nicht nur natives oder rekombinantes BPI einschließt, sondern auch ein biologisch aktives Polypeptid-Analogon von BPI, das ein Molekulargewicht von ungefähr 25 kD aufweist und die folgende N-terminale Sequenz von BPI besitzt: VNPGVVVRISQKGLD.
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur oralen, intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der voranstehenden Ansprüche bei der Behandlung einer Gram-negativen bakteriellen Infektion.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Gram-negative bakterielle Infektion Gram-negative bakterielle Sepsis und/oder Septikämie einschließt.
Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von gereinigtem bakteriziden/die Permeabilität-erhöhenden Protein, das umfaßt: (a) Erhalten einer ungereinigten Probe von bakterizidem die Permeabilität-erhöhendem Protein; (b) Auftrennen der ungereinigten Probe durch Umkehrphasen-HPLC; (c) Sammeln jedes Peaks; (d) Trocknen jedes Peaks in Anwesenheit von Niedrig-Endotoxin-BSA; (e) Nochmaliges Trocknen jedes Peaks in Anwesenheit von Pyrogen-freier 0,1% Essigsäure; und (f) Isolieren und Aufreinigen von gereinigtem bakteriziden/die Permeabilität-erhöhendem Protein.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das "BPI" nicht nur natives oder rekombinantes BPI einschließt, sondern auch ein biologisch aktives Polypeptid-Analogon von BPI, das ein Molekulargewicht von ungefähr 25 kD aufweist und die folgende N-terminale Sequenz von BPI besitzt: VNPGVVVRISQKGLD.