JPH09508357A

JPH09508357A - 抗真菌方法及び材料

Info

Publication number: JPH09508357A
Application number: JP7519144A
Authority: JP
Inventors: ロジャー，ジー．リトル，; エドワードリン，; パトリック，ジェイ．スキャノン，; ルイス，エイチ．ランバート，
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1994-01-14
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1997-08-26
Also published as: EP0754049A1; ATE215379T1; AU703211B2; CN1112933C; WO1995019179A1; US5627153A; DE69526216D1; DE69526216T2; CA2181165C; CA2181165A1; MX9602570A; HK1014158A1; CN1140999A; EP0754049B1; AU1679795A

Abstract

(57)【要約】本発明は、真菌感染に罹患している被験者に殺菌性／透過性誘導（BPI）タンパク質産物を投与することを含む、真菌感染を治療するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】抗真菌方法及び材料本出願は、1994年1月14日出願の米国特許出願第08/183,222号の一部継続出願である、1994年3月11日出願の米国特許出願第08/209,762号の一部継続出願である、1994年7月11日出願の米国特許出願第08/273,540号の一部継続出願であり、これらの米国出願における開示は、参照することによりすべて本明細書に含まれる。発明の背景本発明は一般に、殺菌／浸透性増強タンパク質（BPI）産物の投与によって、真菌感染症を治療する方法に関する。 BPIは、微生物による侵入に対する防御に必須の血液細胞である哺乳動物の多形核白血球（PMNまたは好中球）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトB PIタンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー［Elsbachら、J.Biol.Chem.、2 54巻、11000頁(1979)］または大腸菌アフィニティークロマトグラフィー［Weiss ら、Blood、69巻、652頁(1987)］のいずれかと、酸抽出とを併用して、PMNから単離されている。このようにして得られたBPIを本明細書中、天然型BPIと称するが、これは、広範なグラム陰性細菌に対する強力な殺菌活性を有することが示されている。ヒトBPIの分子量はおよそ55,000ダルトン（55 kD）である。ヒトBPI タンパク質全体のアミノ酸配列、及び該タンパク質をコードするDNAの核酸配列は、Glayら、J.Biol.Chem.、264巻、9505頁(1989)の図１に報告されており、かかる文献を引用することにより、それら配列を本明細書に含むものとする。Gray らのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号：６９に示される。 BPIは、強い陽イオン性を有するタンパク質である。BPIのＮ末端半分は、高い実効電荷の原因となり、一方、分子のＣ末端半分は、-3の実効電荷を有する。［ Elsbach及びWeiss(1981)、前出］。約25 kDの分子量を有するBPIのタンパク質分解によるＮ末端断片は、疎水性領域と親水性領域とを交互に含み、両親媒性の特徴を有する。ヒトBPIのこのＮ末端断片は、天然に由来する55 kDのヒトBPIホロタンパク質の抗細菌効果を保有している。［Ooiら、J.Biol.Chem.、262巻、1489 1〜14894頁(1987)］。Ｎ末端部分とは対照的に、単離されたヒトBPIタンパク質のＣ末端領域は、グラム陰性生物に対してほんのわずかに検出可能な抗細菌活性を呈するに過ぎない。［Ooiら、J.Exp.Med.、174巻、649頁(1991)］。「rBPI₂₃ 」と称される、およそ23 kDのＮ末端BPI断片が、組換え法により製造されており、これもグラム陰性生物に対して抗細菌活性を保持するものである。Gazzano-Sa ntoroら、Infect.Immun.、60巻、4754〜4761頁(1992) BPIの殺菌効果は、例えばElsbach及びWeiss、Inflammation： Basic Principl es and Clinical Correlates、Gallinら編、30章、Raven Press，Ltd.(1992)におけるごとく、グラム陰性の種に特異性が高いとの報告がなされている。BPIは、酵母を包含する他の微生物や、さらに高等な真核細胞に対して、通常非毒性であると考えられている。Elsbach及びWeiss、(1992)、前出は、10^-8から10^-9Ｍ程度の低濃度で、BPIが広範囲のグラム陰性細菌に対して抗細菌活性を呈するものの、それより100から1,000倍高い濃度のBPIが、同時に調べたグラム陽性細菌種、酵母、及びさらに高等な真核細胞のすべてに対して、非毒性であったことを報告している。グラム陽性生物である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus、４つの株）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus ep idermidis）、スタフィロコッカス・ファエカリス（Streptococcus faecalis）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ミクロコッカス・リソデイクチカス（Micrococcus lysodeikticus）、及びリステリア・モノサイトゲンス（L isteria monocytogenes）に対して、pH7.0または5.5のいずれかで調べた場合、1 0^-6Ｍまたは160μg/mlの濃度で、BPIは毒性効果を有しないことが報告された。報告によれば、pH7.0または5.5において、BPIは10^-6Ｍにて真菌であるカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）及びカンジダ・パラシロシス（Candida pa rasilosis）に対する毒性効果を有さず、ヒト、ウサギ及びヒツジ赤血球細胞ならびに種々のヒト腫瘍細胞系に対して非毒性であった。やはりElsbach及びWeiss の、Advancesin Inflammation Research、G．Weissmann編、2巻、95〜113頁、Ra ven Press(1981)を参照されたい。このように報告された標的細胞の特異性は、リポ多糖（LPS）に対するBPIの強い誘引力の結果であると考えられていた。LPS は、グラム陰性生物の外膜（あるいはエンベロープ）に独特のものである。 BPIのグラム陰性細菌殺傷における正確な機構はいまだ完全には解明されていないが、まず、陽イオン性BPIタンパク質とLPS上の陰性に荷電した部位との間の静電気的相互作用及び疎水性相互作用を通して、細菌の表面にBPIが結合しなければならないと考えられている。LPSは、それが刺激する強い炎症応答（すなわち、回復不能の内毒性ショックを最終的には惹起こしうる宿主炎症細胞によるメディエータの放出）のゆえに、「内毒素」と称されている。BPIはリピドＡに結合するのであるが、これはLPSの最も毒性が強く最も生物学的活性を有する成分であると報告されている。感受性のグラム陰性細菌において、BPIの結合はLPS構造を崩壊させ、リン脂質及びペプチドグリカンを分解する細菌酵素の活性化を惹起こし、細胞外膜の透過性を変化せしめ、最終的には細胞死へと導く事象を開始させると考えられる。［ Elsbach及びWeiss(1992)、前出］。BPIは２段階にて作用すると考えられる。第一は、即b時的生育停止、外膜の透過性亢進（permeabilization）ならびにリン脂質及びペプチドグリカンを加水分解する細菌酵素の選択的な活性化によって特徴付けられる亜致死的段階である。この段階での細菌は、血清アルブミンを追加した培地中で生育させることにより救助できる［Mannionら、J.Clin.Invest.、8 5巻、853〜860頁(1990)］。第二段階は、血清アルブミンで回復しえない生長阻害により規定されるものであるが、細菌をさらに長い間BPIに曝した後に起こるものであり、細胞質内膜への明白な損傷を含む、広範囲の生理学的及び構造的変化により特徴付けられる。 BPIがLPSにまず結合して、正常時においてＭｇ⁺⁺及びＣａ⁺⁺の結合を通して外膜を安定化させる、LPSのKDO領域中の陰イオン性の基への結合におそらくは起因した、組織的な変化が惹起こされる。グラム陰性細菌の外膜へのBPIの付着によりアクチノマシンＤなどの疎水性物質への外膜の迅速な透過性亢進がなされる。 BPIの結合及びそれに続くグラム陰性細菌殺傷は、少なくとも部分的にLPS多糖の鎖長に依存するものであり、長いO-鎖を持っている「スムーズ」生物は、短いO- 鎖を持っている「ラフ」生物よりもBPIの殺菌効果に対して耐性である［Weissら、J.Clin.Invest.、65巻、619〜628頁(1980)］。このBPIの作用の第一段階であるグラム陰性外側エンベロープの透過性亢進は、BPIの解離に際しては可逆性であり、これは、二価陽イオンの存在及び新規LPSの合成を必要とするプロセスである［Weissら、 J.Immunol.、132巻、3109〜3115貞(1984)］。しかしながら、グラム陰性細菌の生育力喪失は、エンベロープの完全性を修復するプロセスによっては回復せず、従って殺菌作用は標的生物に誘導される付加的な障害により媒介されるのであり、それは細胞質膜に位置するかもしれないことが示唆される［Mannionら、J.Cli n.Invest.、86巻、631〜641頁(1990)］。この可能性を特に精査して、モルベースで、BPIは少なくともポリミキシンＢと同等に細胞質膜小胞機能を阻害することが示されている［In't Veldら、Infection and Immunity、56巻、1203〜1208 頁(1988)］ものの、正確な機構ならびに、このような小胞と無傷の生物の研究との関連は、いまだ解明されていない。真菌は有性生殖または無性生殖可能な真核細胞であり、二相性でありえ、一つの型は天然型であり、感染した宿主において異なる型をなす。真菌性の疾患は真菌症と称される。ある真菌症は地方病性、すなわちその真菌の天然の生息地である地球上の区域において感染がもたらされる。これらの地方病性の真菌症は、通常自己限定性であり、症候性は極微である。ある真菌症は、主に日和見的であって、臓器移植患者、化学療法を施されているガン患者、火傷患者、AIDS患者、または糖尿病ケトアシドーシスを持つ患者などの、免疫力が低下した（immuno-com promised）患者に発症する。多くの理由により、真菌の感染は主要な健康上の関心事となってきており、その理由には利用可能な抗真菌剤の数が限定されていること、古い抗真菌剤に耐性を有する種の発生率の増大、ならびに日和見真菌感染に対する危険性のある免疫力が低下した患者数の増加が包含される。全身性の真菌感染症の発生率は、1980 年代のあいだに、教育研究病院において600％、教育研究病院以外の病院において220％増大している。最も一般的な臨床分離菌は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）であり、これはすべての臨床分離菌の約19％を占める。ある研究では、病院でもたらされた感染による全死亡数のほぼ40％が真菌に起因している。［Sternberg、Science、266巻、1632 〜1634頁(1994)］。抗真菌剤には３つの主な群が包含される。主要群にはポリエン誘導体が含まれ、これにはアンフォテリシンＢならびに構造的に関連する化合物であるナイスタチン及びピマリシンが包含される。これらは真菌細胞膜の成分であるエルゴステロールに結合して、それにより膜を崩壊せしめる、適用範囲の広い抗真菌剤である。アンフォテリシンＢは通常、全身性の真菌症に対して有効であるが、発熱、腎障害、ならびに貧血、低血圧、頭痛、悪心、嘔吐及び静脈炎などの他の併発する副作用を包含する毒性作用により、その投与は限定される。類縁性のない抗真菌剤であるフルシトシン（5-フルオロシトシン）は、経口的に吸収される薬剤であるが、ある型のカンジダ症及びクリプトコッカス性髄膜炎（cryptococcal men ingitis）に対するアンフォテリシンＢ処置の佐剤としてしばしば使用される。その副作用には、白血球減少症及び血小板減少症を伴う骨髄抑制が包含される。抗真菌剤の第２の主要群には、エルゴステロールの合成の損傷を起こし、真菌の膜結合性酵素系（例えばシトクロムP450）の機能を破壊する代謝物の蓄積を導き、そして真菌の生長を阻害するアゾール誘導体が包含される。哺乳動物のP450 を有意に阻害すると、有意な薬剤の相互作用が惹起こされる。この群の抗真菌剤には、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、サルコナゾール、ターコナゾール、フルコナゾール及びイトラコナゾールが包含される。これらの薬品は、全身性の真菌症を治療するために投与することができる。経口投与されるイミダゾールであるケトコナゾールは、免疫力が低下していない患者における非髄膜性のブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症及びパラコクシジオイデス症を治療するために使用され、また、口腔及び食道のカンジダ症に対しても有用である。副作用には、まれに起こる薬剤誘導性肝炎があり、ケトコナゾールは、妊娠に禁忌でもある。イトラコナゾールは、ケトコナゾールよりは副作用が少ないようであり、前記と同様の症候ほとんどに対して用いられる。フルコナゾールもまた、ケトコナゾールよりも副作用が少なく、口腔及び食道のカンジダ症及びクリプトコッカス性髄膜炎に対して使用される。ミコナゾールは、コクシジウム症及び種々の他の真菌症において有効性を持つ腸管外用のイミダゾールであるが、高脂血症及び低ナトリウム血症を含む副作用を有する。抗真菌剤の第３の主要群には、皮膚の感染を治療するために通常使用されるアリルアミン−チオカーバメート類が包含される。この群には、トルナフテート（ tolnaftate）及びナフチフィン（naftifine）が包含される。他の抗真菌剤としては、局所的な処置に呼応しない皮膚、毛髪または爪の真菌感染のために経口的に投与される静真菌剤である、グリセオフルビンがある。大抵の地方病性真菌症は、呼吸経路によりもたらされ、症候性は極微であり、咳、発熱、頭痛、及び胸膜痛が認められるかもしれない。場合によっては、地方病性の真菌症は進行性の肺疾患または全身性の感染を惹起こすかもしれない。ヒストプラスマ（Histoplasma）により惹起こされるヒストプラスマ症は、米国において最も一般的な地方病性の呼吸器系真菌症であり、 4000万人を越える人々が感染している。かかる疾患は非伝染性であり、大抵は自己限定性であるが、慢性の肺感染及び播種性（disseminated）感染が生じる可能性がある。肺感染は滅多に治療を要しないが、播種性の感染は、アンフォテリシンＢを用いて治療されうる。コクシジオイデス（Coccidioides）によって惹起こされるコクシジオイデス症は、南西部において広く普及した非伝染性の呼吸器系真菌症である。これもやはり、通常は自己限定性であるものの、慢性の肺感染または播種性の感染を惹起こすかもしれない。治療のために、アンフォテリシンＢまたはミコナゾールが投与されうる。ブラストミセス（Blastomyces）によって惹起こされるブラストミセス症は、非伝染性、亜急性または慢性の地方病性真菌症であり、南東部において最も広く認められる。大抵の肺感染は、おそらくは自己限定性である。進行性の肺疾患または播種性の疾患を持つ患者、及び免疫力が低下した患者は、アンフォテリシンＢを用いて全身性の治療が行われるとよい。パラコクシジオイデス（Paracoccidioides）によって惹起こされるパラコクシジオイデス症は、非伝染性の呼吸器系真菌症であり、南米において最も一般的な全身性の真菌症である。これは急性且つ自己限定性でありえ、あるいは、進行性の肺疾患または肺外の播種を生じるかもしれない。播種性の疾患は、概して、治療を施さなければ命に関わるものである。スルホンアミド類が使用されうるが、成功率は低い。アンフォテリシンＢが応答の率は高いが、それでも再発が起こるかもしれない。クリプトコッカス症は、非伝染性で、しばしば日和見性の真菌症である。これは、しばしば髄膜炎を伴う、呼吸困難（involvement）または血行性の播種により特徴付けられる。主たる病因学的物質は、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（C．neoformans）である。大抵の肺感染はおそらく見落とされているが、クリプトコッカス性髄膜炎は、報告されている疾患のうち90％に相当し、劇的であり滅多に見落とされることはない。クリプトコッカス症は免疫力が低下した患者において特に問題であって、AIDS患者の７〜10％にクリプトコッカス性髄膜炎が発症している。髄膜炎の主な症候は頭痛であり、付随する所見には、精神的な変化、眼の症候、聴覚減退、悪心、嘔吐、及び急発作が包含される。治療しなければ、２年以内に80％の患者が死亡する。髄膜炎において、脳脊髄液沈渣のインディアインク調製物中にクリプトコッカスを観察することができ、脳脊髄液から培養できる。通常、治療にはフルコナゾールまたは、アンフォテリシンＢとフルシトシンの組合せが用いられるが、アンフォテリシンＢは血液−脳関門を通過しない。アスペルギルス症は、アスペルギルス（Aspergillus、コウジカビ）種によって惹起こされる多様な疾患プロセスを網羅する語である。アスペルギルス種は遍在性であり、その胞子は定常的に吸入されている。既知の300を越える種のうち、以下のわずか数種のみが通常ヒトに対して病原となる：アスペルギルス・フミガタス(A．fumigatus)、アスペルギルス・フラバス(A．flavus)、アスペルギルス・ニガー(A．niger)、アスペルギルス・ニドウランス(A．nidulans)、アスペルギルス・テレウス(A．terreus)、アスペルギルス・シドウィ(A．sydowi)、アスペルギルス・フラバタス(A．flavatus)、及びアスペルギルス・グラウカス(A ．glaucus)。アスペルギルス症の罹患率は上昇しており、特に慢性の呼吸器疾患を持つ患者または免疫力が低下した患者の間で問題になっている。免疫力が低下した患者の間において、アスペルギルス症は、最も一般的に日和見性の真菌症としてカンジダ症に次ぐものであり、この群の全身性真菌症の約15％に相当する。日和見性の肺アスペルギルス症は、広範な気管支びらん及び潰瘍形成、それに続く、血栓症、閉塞及び梗塞形成を伴う、肺血管の浸潤によりその特徴が示される。臨床的には、感染により壊死性の斑状気管支肺炎が現れ、時に出血性の肺梗塞を伴う。症例のうち40％で、他の部位への血行性の伝播がある。アスペルギルス症も稀少ではあるが、火傷創の悪化を圧倒的なものにし、療治のためにしばしば切断を施す必要がある。侵入性のアスペルギルス症は、一般に致命的であり、しかして果敢なる診断及び治療が必要である。血液、尿及び脳脊髄液の培養では滅多に陽性にならないが、塗沫標本及び生検において、真菌を認めることができる。治療のためにアンフォテリシンＢが投与可能である。ムコール症は、急性であり化膿性の日和見性真菌症で、免疫力が低下した患者に鼻脳、肺または播種性の疾患を起こし、火傷または開放創を持った患者に局所性または播種性の疾患を起こす。この感染は、接合菌類のクラスの真菌によって惹起こされ該真菌には、バシジオボラス（Basidiobolus）、コニジオボラス（Co nidiobolus）、リゾプス（Rhizopus、クモノスカビ）、ムコール（Mucor、ケカビ）、アブシジア（Absidia）、モーチエレラ（Mortierella）、クニンガメラ（ Cunninghamella、クスダマカビ）、及びサクセナエ（Saksenaea）が包含される。鼻脳ムコール症は、ムコール症の全症例のうち約半分に相当する。これは最も速やかなる致死性を持つ真菌性疾患のひとつであり、治療されない患者は２〜１０日以内で死に至る。初期の臨床的所見には、鼻詰まり、鼻からの血液分泌、顔面膨化及び顔面痛が挙げられる。次いで、感染は眼、頭蓋神経及び脳に伝藩する。肺のムコール症は鼻脳疾患とほぼ同様に一般的なものであり、アスペルギルス症と同様の壊死及び梗塞形成を惹起こす。真菌は事実上決して見出されず、あるいは血液、痰または脳脊髄液から培養もされない。播種性のムコール症は、肺または火傷創の感染を伴う。治療にはアンフォテリシンＢが用いられる。カンジダ症は、酵母であるカンジダの種による宿主における転移増殖または感染によって惹起こされる局所または全身性の多様なプロセスを称する概括的な用語である。カンジダ症は全世界において広く発生しており、皮膚、口腔及び他の粘膜の表面感染が一般的である。例えばガン治療に際して、正常な細菌性フローラを破壊する抗生物質、免疫抑制剤、及び骨髄に対して毒性を有する薬剤を高い投与量にて使用することに起因して、侵入性の全身性疾患が問題になってきている。カンジダの播種については、好中球減少が主たる危険因子である。カンジダ症はまた、AIDS患者、臓器移植患者、腸管外栄養を摂取している患者、ならびに放射線治療及び化学療法を行っているガン患者などといった免疫力が低下している個体のあいだにも見出される。カンジダ症は、世界中で最も一般的な日和見性の真菌症である。最も一般的な病原学的物質は、カンジダ・アルビカンスである。他の感染性を持つ種には、カンジダ・トロピカリス（C．tropicalis）、カンジダ・パラシロシス（C．parapsilosis）、カンジダ・ステラトイデア（C．stel latoidea）、カンジダ・クルセイ（C．krusei）、カンジダ・パラクルセイ（C． parakrusei）、カンジダ・ルシタナエ（C．lusitanae）、カンジダ・シュードトロピカリス（C．pseudotropicalis）、カンジダ・ギリエルモンディ（C．guilli ermondi）及びカンジダ・グラブラータ（C．glabrata）が包含される。カンジダ・アルビカンスは、普通に、ヒトの口腔、咽喉、胃腸管及び膣に見出される。アルビカンス以外の種は、よく皮膚にコロニー形成している。カンジダ種は、温度または宿主に依存せず、２つの型で存在する。通常のコロニー形成型は、特に組織侵入に際して偽菌糸体の形態に見せかけた酵母類である。偽菌糸体は、伸長した生物体の分岐鎖の中に酵母が連続的に出芽して生じる。カンジダ・アルビカンスは、酵母細胞の特定の宿主組織に対する接着を担うと考えられる、細胞壁マンノタンパク質を含んでいる。かかるマンノタンパク質のタンパク質部分よりもむしろマンナン部分が、マウスにおける脾臓及びリンパ節への真菌細胞の接着に寄与しているとの報告がなされている。［Kanbeら、Infec tion Immunity、61巻、2578〜2584頁(1993)］。カンジダ・アルビカンスは、フィブロネクチン、ラミニン、ならびにＩ型及び IV型コラーケンなどの細胞外マトリックス（ECM）タンパク質（これらはすべて、ヘパリン結合ドメインを含んでいる）にも強固に結合する。このことは、カンジダ・アルビカンスがヘパリン様表面分子を発現しているかもしれないことを示唆している。播種性のカンジダ症の病原論において、カンジダ・アルビカンスの ECMへの接着が重要であるかもしれない。ヘパリン、ヘパラン硫酸及びデキストラン硫酸グリコサミノグリカン（GAG）は、おそらくはGAGのECMタンパク質への結合が関与する機構によって、カンジダ・アルビカンスのECM及びECMタンパク質に対する接着を阻害し、しかしてこれらの選択的なリガンドをマスキングしていることが立証されている。［Klotzら、FEMS Microbiology Letters、78巻、205 〜208頁(1992)。］臨床的には、カンジダは、表在性の粘膜皮膚感染、慢性の粘膜皮膚カンジダ症、または全身性感染として現れる。表在性の粘膜皮膚感染は、皮膚または粘膜のいかなる領域にも生じうる。AIDS患者において一般に認められる口瘡は、舌、口腔、または他の中咽頭表面を覆う斑状または連続的な、クリーム色から灰色の偽膜により特徴付けられ、潰瘍または壊死を伴う可能性がある。喉頭が冒されると、嗄声が惹起こされる。時として、中咽頭の疾患が拡張して食道炎になる場合があり、胸骨後痛及び嚥下困難の症候を示すかもしれない。腸管のカンジダ症は、通常は非症候性であるものの、免疫力が低下した個体における血液原性の侵入の主因となる。間擦疹は、腋窩、そ径部、乳腺下の襞、及びその他の暖かく湿った領域を冒し、また、赤く侵出性の、または乾燥して鱗状の障害として現れるかもしれない。感染は他の領域で生じる可能性もあり、それら領域には、肛門周囲や生殖器の領域が含まれる。爪の感染である爪囲炎は、手または足が湿気に慢性的に曝されることに伴うことが多い。限定的なＴ−細胞免疫免疫不全を持ついくらかの患者は、慢性的な粘膜皮膚のカンジダ症を併発する。これらの患者は、皮膚、頭皮、爪及び粘膜の、頑固な表面性カンジダ感染に罹患する。全身性カンジダ症のほとんどの症例は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、及び増加傾向にあるカンジダ・グラバラータによって惹起こされる。カンジダの感染による臨床的な明示は、眼、腎臓及び皮膚に、主として現れる。眼では、単一または複数の、白い綿毛状の脈絡膜と網膜の障害が生じるかもしれない。これらの障害は、視覚消失の潜在的な原因である。腎臓が冒されると、瀰漫性膿瘍、毛細管壊死及び尿管の閉塞が発症する。感染によって、進行性の腎不全が惹起こされることがある。全身性のカンジダ感染はまた、赤変部分で取り囲まれた斑小結節性の皮膚障害としても現れ、これら障害は、ざ瘡に類似した外観を有するが潜在的致死性を呈する疾患の主な端緒となる。全身性のカンジダ症において他に明示されるものに、骨髄炎、関節炎、髄膜炎、及び脳、心臓、肝臓、脾臓及び甲状腺における膿瘍が包含される。肺が冒されることも一般的であるが、肺障害は、通常小さいので、胸部Ｘ線では認められない。最後に、カンジダ心内膜炎は、長期にわたる静脈内治療または心臓弁インプラントを受けている患者において、または静脈内薬剤の乱用者において発症する可能性がある。真菌による障害は、弁に現れ、大血管に梗塞を形成したり閉塞を起こしうる。表面感染は、10％の水酸化カリウムの存在下で、感染した障害の切屑またはスワブを顕微鏡で調べることによって診断される。カンジダ生物は、グラム染色でも見ることができる。心内膜炎は、血液培養または超音波心臓動態診断で肥厚した弁の障害を証明することによって診断される。全身性カンジダ症は、感染の通常部位での移しいコロニー形成の存在により、播種の発症が示唆されるものの、その立証はなされないので、診断が困難であるかもしれない。全身性カンジダ症の最も信頼のおける証拠は、組織侵入のバイオプシーによる立証、または脳脊髄液、肋膜もしくは腹膜液などの閉鎖系の体腔中の液体からの酵母の回収である。同様に、陽性の血液または尿または痰培養により、侵入性の疾患であるか、または、内在するデバイス、例えばカテーテルまたは静脈内ラインの周囲に単に局在するだけの疾患であるかが示されるかもしれない。粘膜皮膚の感染は、ナイスタチン、アンフォテリシンＢ、クロトリマゾール、ミコナゾール、ハロプロジンまたはゲンチアンバイオレットの局所用製剤で治療されうる。口腔咽頭または食道のカンジダ症は、ケトコナゾールまたはフルコナゾールなどの全身用薬剤を用いて治療することができる。慢性的な粘膜皮膚カンジダ症症候群は、アンフォテリシンＢまたはケトコナゾールなどの、局所または全身用治療薬に感応するかもしれないが、薬物投与が中断されると、しばしば再発する。膀胱炎は、アンフォテリシンＢを用いた膀胱洗浄、またはフルシトシンを経口投与しつつもしくはこの経口投与をせずに、短期間少量のアンフォテリシンＢを静脈内経路で投与することにより治療されうる。心内膜炎は、６から10週間アンフォテリシンＢ及びフルシトシンを併用して、弁の取替を行わなければ、本質的には治癒不能である。しかしながら、療法を用いても、心内膜炎の完全な治癒は必ずしも可能でない。全身性カンジダ症の死亡率は、約50％である。全身性カンジダ症は、フルコナゾール（静真菌剤）、またはアンフォテリシンＢ（殺真菌剤）を用いて治療することができるが、アンフォテリシンＢを全身に用いることは、その毒性により制限がある。双方の薬剤とも、シクロスポリンＡ（それ自体腎毒性を有する）と併用して用いる場合、実質的な副作用を有する。感染を制御するために、静脈内ラインまたはカテーテルなどの促進的（precipitating）因子を除去することも重要である。特に免疫力が低下していない患者において、全身性カンジダ症を治療するために、フルシトシン療法をアンフォテリシンＢ療法に追加することができる。しかしながら、免疫力が低下した患者では、これらの感染は問題を孕んでおり、有効な治療に抗するものである。かかる患者では、全身性カンジダ症の死亡率は90％を越える。さらに、慢性の粘膜皮膚カンジダ症及びカンジダ性心内膜炎は、治癒したと言明された後に疾患の証拠が示されることがしばしばある。当該技術分野において、新しい抗真菌方法及び材料に対する要求は現存し続けている。特に、全身性の真菌症のために有効な抗真菌療法は限られている。この要求に応じる産物及び方法には、理想的には、合成法または組換え法により大量に入手可能な、実質的に非毒性の化合物が包含されよう。理想的な化合物は、唯一の抗真菌剤として投与または適用した場合に種々の異なる真菌種に対して迅速な作用、ならびに広範なる殺真菌または静真菌活性を有するものであろう。理想的な化合物は、他の抗真菌剤との併用療法においても、特に、療法が有効であるために必要とされる抗真菌剤の量をこれらの活性が低減させ、かかる薬剤の効果を増強し、もしくは潜在的な毒性の応答及び治療における価格の高騰を限度あるものにする場合に、有用であろう。発明の要約本発明は、BPIタンパク質産物の治療的有効量を投与することとにより、真菌感染に罹患している被験者を治療する方法を提供する。本発明は、BPIタンパク質産物が殺真菌／静真菌作用を有するという、驚くべき発見に基づくものである。BPIタンパク質産物は、単独でまたは既知の抗真菌剤と組み合わせて投与するとよい。被験者に補助的な療法がなされる場合、BPIタンパク質産物の投与により有効な治療のために必要とされる抗真菌剤の量を減じることができ、しかして、潜在的な毒性応答及び／または治療に要する価格の高騰が限度あるものになる。BPIタンパク質産物の投与はまた、かかる薬剤の作用を増強し、かかる薬剤の作用を促進し、あるいは、このような薬剤に対する真菌の耐性を無効にするかもしれない。加えて、本発明は、真菌をBPIタンパク質産物に接触させることを含む、殺真菌または真菌生長阻害の方法を提供する。この方法は、in vivo、または液体及び表面の浄化のため、ならびに、補綴用の関節及び内在する侵入デバイスを包含する、外科用及び他の医療用装置及び埋込可能なデバイスを滅菌するための多岐にわたるin vitro用途などで、実施することができる。本発明のさらなる特徴には、真菌感染の治療のための医薬製造のためのBPIタンパク質産物の使用が包含される。医薬には、BPIタンパク質産物に加えて、抗真菌剤などの他の化学療法剤が含有されうる。当業者には、本発明の現在好ましい実施態様を記載した、以下の発明の詳細な説明を考慮すれば、本発明の多くの付加的な特徴や利点が明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、種々のBPIタンパク質産物のカンジダ・アルビカンスに対するブロスアッセイ試験の結果を示す。図２及び３は、カンジダ・アルビカンスによる攻撃、ならびにBPI由来ペプチドまたは緩衝液を用いた処置後のマウスにおける生存データをグラフにより表す。図４は、カンジダ・アルビカンスによる感染、ならびにrBPI₂₃またはタウマチンを用いた処置後のラットにおける呼吸数をグラフにより表す。図５は、カンジダ・アルビカンスによる感染、ならびにrBPI₂₃またはタウマチンを用いた処置後のラットにおける動脈の血圧をグラフにより表す。図６は、感染、ならびにrBPI₂₃またはタウマチンを用いた処置後のラットにおける、循環系でのカンジダ・アルビカンスのコロニー形成単位数をグラフにより表す。図７は、カンジダ・アルビカンスによる感染、ならびにrBPI₂₃またはタウマチンを用いた処置後のラットにおける動脈のpHをグラフにより表す。図８は、カンジダ・アルビカンスによる感染、ならびにrBPI₂₃またはタウマチンを用いた処置後のラットにおける動脈のＰＯ₂をグラフにより表す。発明の詳細な説明本発明は、真菌感染に罹患した被験者を治療するためにBPIタンパク質産物を投与することができるという驚くべき発見に関連し、かかる感染を治療する方法を提供するものである。予期せざることに、BPIタンパク質産物は、in vitro殺菌活性ならびに、真菌感染のin vivoモデルにおいて、例えば真菌による攻撃後の生存が向上することもしくは循環系でのコロニー形成単位が減少することなどによって判定して、双方で抗真菌活性を有することが立証された。アスペルギルスによって惹起こされる感染、クリプトコッカス性髄膜炎などのクリプトコッカスにより惹起こされる感染、ならびにカンジダ種によって惹起こされる粘膜皮膚及び全身性カンジダ症を包含する種々の真菌感染を、本発明によって治療することができる。 BPIタンパク質産物は全身に、あるいは局所に投与することができる。全身投与の経路には、経口、静脈内、筋肉もしくは皮下注射（長時間放出用のデポ剤に含有せしめられる）、眼内または眼球後部、鞘内、腹膜組織内（例えば腹腔組織内灌流による）、エアゾル化または霧状にした薬物を用いた経肺、または経皮経路が包含される。局所経路には、軟膏、眼用滴剤、耳用滴剤、または潅注液（例えば傷の潅注用）剤形での投与が包含される。 BPIタンパク質産物は、現在のところ有効であることが知られている他の抗真菌剤と併用して投与してもよい。この目的のために好ましい抗真菌剤は、アンフォテリシンＢ及びフルコナゾールである。抗真菌剤と共にBPIタンパク質産物を同時に投与することで、抗真菌剤の治療効果の向上が期待される。このような向上は、例えば複製などの真菌の生長を根絶または阻害するに要する抗真菌剤の濃度を低減することを通して起こるのかもしれない。いくらかの薬剤の使用は、全身性の毒性のためまたはひどく高価格となるために限度があるので、治療効果のために必要な抗真菌剤の濃度を下げることで毒性及び／または治療価格が低減され、しかして、その薬剤をより広範に用いることが許容される。BPIタンパク質産物と他の抗真菌剤とを同時に投与することで、いずれかの薬剤を単独で用いた場合に達成しうるよりも迅速または完全な殺真菌／静真菌効果が得られるかもしれない。BPIタンパク質産物の投与は、抗真菌剤に対する真菌の耐性を無効にするかもしれない。BPIタンパク質産物の投与はまた、静真菌剤を殺真菌剤に変換させるかもしれない。本発明により提供される利点は、現在のところ不治であると考えられている真菌感染、特にカンジダ感染を治療することができることにある。別の利点は、既知の抗真菌剤への後得した耐性を有する真菌を処置できることにある。例えばアンフォテリシンＢなどの望ましくない副作用を有する抗真菌剤と共にBPIを同時に投与することのさらなる利点は、有効な治療のために必要な抗真菌剤の量を減じうることにある。本発明は、さらには、例えば治療期間が短縮され、集中医療ユニットにおける滞在が短縮されまたは、病院全体での滞在が短縮されるために、患者の生活の質における恩典をも提供し、付随的に重大な院内（病院でもたらされる）感染の危険性を減じるものである。本明細書中における「同時投与」には、薬剤を一緒に、または互いに先にもしくは後で投与することが包含される。BPIタンパク質産物及び抗真菌剤は、異なる経路によって投与されてもよい。例えば、BPIタンパク質産物を静脈内投与し、一方抗真菌剤を筋肉、静脈内、皮下、経口または腹膜組織内に投与してもよい。あるいは、BPIタンパク質産物を腹腔組織内に投与し、一方抗真菌剤を腹腔組織内もしくは静脈内に投与したり、またはBPIタンパク質産物をエアゾルもしくは霧状の剤形にて投与し、一方抗真菌剤を例えば静脈内投与してもよい。BP Iタンパク質産物及び抗真菌剤を、双方とも静脈内投与してもよい。BPIタンパク質産物及び抗真菌剤は、同じ静脈内ラインを介して（間に水洗をした後）引き続き与えるか、または異なる静脈内ラインを介して与えてもよい。BPIタンパク質産物及び抗真菌剤は、双方の薬剤とも感染の部位において有効濃度に達することを許容するに充分なように与えられる限りにおいて、同時にまたは引き続き投与することができる。 BPIタンパク質産物及び抗生物質の同時投与によって、真菌感染のさらに効果的な治療が提供されると予測される。２つの薬剤の同時投与で、どちらかの薬剤を単独で投与した場合よりも、in vivoにおいて大きな治療効果が提供されるかもしれない。例えば、同時投与によって、同等の治療効果を達成しつつ、一方または双方の薬剤の投与量を低減させることができるかもしれない。あるいは、同時投与によって、いずれかの薬剤を単独で用いた場合に達成可能な効果よりも迅速または完全な殺真菌／静真菌効果が生み出されるかもしれない。治療上の有効性は、首尾良い臨床上の成果に基づくものであり、感染に関わる生物の100％を抗真菌剤または薬剤が死滅させることが必要なわけではない。成功は、宿主にとって利となるようにバランスを傾けるよう、真菌を阻害するに充分な、感染部位における抗真菌活性のレベルを達成することに依存している。宿主の防御が高度に効果的である場合には、必要な抗真菌作用は、低くてもよい。１の（常用）対数（指数10）にまで生物への負荷量を減じてでさえも、感染を制御するための宿主自身の防御が許容されるかもしれない。加えて、初期の殺真菌／静真菌作用を増加させることが、長期間の殺真菌／静真菌作用よりも重要でありうる。これらの初期の成果によって、宿主の防御機構を活性化する時間が与えられるので、かかる成果は重要であり、治療の成功に決定的な部分である。 BPIタンパク質産物は、補体、p15及びLBPを含む全血または血清、ならびに他の細胞及び免疫系の成分に存在する種々の宿主防御要素と相互作用すると考えられる。このような相互作用は、BPIタンパク質産物の活性の強化を生じさせるのかもしれない。これらの相互作用のために、BPIタンパク質産物はin vitroよりもin vivoでさらに大きな活性を発揮することが期待できる。しかして、in vitr o試験でin vivoにおける実用が予示はされるが、in vitroで活性がないことが必ずしもin vivoにおいて活性がないことを示唆するものではない。例えば、BPIは、旧来の培地を用いたアッセイにおけるよりも、全血または血漿アッセイで、グラム陰性細菌に対してより大きな殺菌効果を呈することが観察されている。［We issら、J.Clin.Invest．90巻、1122〜1130頁(1992)］。これは、旧来のin vitro 系が、in vivoにおけるBPIの機能を助長するかもしくは強化する血液成分を欠くためか、または、旧来の培地がBPIタンパク質産物の典型的な活性阻害剤であるマグネシウム及びカルシウムを生理学的濃度よりも多量に含有しているからかもしれない。さらに、宿主において、BPIタンパク質産物はグラム陰性細菌の転位を中庸化し、付随する菌体内毒素の放出を無効にするのに役立ち、抗真菌活性の in vitro試験によって認められないまたは予測されないさらなる臨床上の利益を提供する。 BPIタンパク質産物が、BPIタンパク質産物の抗真菌活性を包含するBPIタンパク質産物の活性を強化する他の産物と共に投与することも意図される。例えば、血清補体は、BPIタンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化し、BPIタンパク質産物と血清補体との組合せによって、相乗的な殺細菌／生長阻害効果が提供される。例えば、Ooiら、J.Biol.Chem.、265巻、15956頁(1990)、及びBPI殺細菌活性を強化する、天然に存在する15 kDタンパク質について述べられている、 Levyら、J.Biol.Chem.、268巻、6038〜6083頁( 1993)を参照されたい。また、1993年7月14日出願の米国特許出願第08/093,201号の一部継続出願である、1994年7月11日出願の米国特許出願第08/274,303号に対応する、1994年7月13日出願の共有で係属中であるPCT出願第US94/07834号も参照されたい。これらの出願は、すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものであり、リポ多糖結合タンパク質（LBP）及びLBPタンパク質産物を投与することによってBPIタンパク質産物の殺グラム陰性細菌活性を強化する方法が記載されているものである。CD-14免疫促進特性を欠くLBPタンパク質誘導体及び誘導体ハイブリッドが、1993年6月17日出願の米国特許出願第08/079,510号の一部継続出願である、1994年6月17日出願の、共有で係属中である米国特許出願第08/261,660号に対応する、1994年6月17日出願のPCT出願第US94/06931号に記載されており、これらの出願は、すべて引用することによってその開示が本明細書に含まれるものである。1995年1月13日出願の、Lambert、米国出願第号［代理人整理番号第27129/32424号］に記載されているように、ポロキサマー界面活性剤がBPIタンパク質産物の抗細菌活性を増強させることも観察されており、ポロキサマー界面活性剤は、抗真菌剤の活性をも増強するのかもしれない。本発明の理論に拘束されず、BPIタンパク質産物が種々の作用の態様を有するかもしれないと考えられる。BPIタンパク質産物はそのヘパリン結合能を通して、細胞外マトリックスへの真菌の結合を妨害するのかもしれない。例えば、カンジダのヘパリン様表面分子が、細胞外マトリックス及び宿主組織への酵母の接着を媒介すると考えられている。BPIタンパク質産物は、真菌の細胞質膜上への直接的な作用もしているかもしれない。加えて、BP Iはグラム陰性生物のLPSに構造的に類似している、または標的宿主組織への接着の原因である、真菌細胞壁マンノタンパク質に結合し、しかして宿主組織との真菌の相互作用が干渉されるかもしれない。真菌のマンナンへの結合は、BPIタンパク質産物の細胞質内膜への接近も促進するかもしれない。最後に、真菌感染は腸菌叢（flora）及び／またはLPSのストレス誘導性転位を惹起こすかもしれないので、BPIはグラム陰性細菌を殺傷し、LPSを中和することによって有益に作用するかもしれない。加えて、本発明は、真菌をBPIタンパク質産物に接触させることを含む、真菌の殺傷または生長阻害の方法を提供する。この方法は、in vivoまたは、食物の調製における用途、もしくは液体及び表面の浄化のため、もしくは、補綴用の関節を包含する、外科用及び他の医療用装置及び埋込可能なデバイスを滅菌するための用途など、種々のin vitro用途において、実施することができる。これらの方法は、しばしば感染の病巣である、静脈内ライン及びカテーテルなどの内在する侵入デバイスのin situ滅菌のためにも用いることができる。本発明のさらなる特徴には、真菌感染の治療用医薬の製造のためのBPIタンパク質産物の使用が包含される。医薬には、BPIタンパク質産物に加えて、抗真菌剤などの他の化学療法剤が含まれる。医薬は、製薬的に容認されうる希釈剤、佐剤または担体を随意に含むことができる。本明細書において用いられる「BPIタンパク質産物」なる語には、天然に及び組換えにより製造されたBPIタンパク質；天然、合成、及び組換えの、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド断片；ハイブリッド融合タンパク質及びダイマーを含む、BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド変異体またはその断片；システインで置換された類似体を含む、 BPIタンパク質の生物学的に活性を有するポリペプチド類似体またはその断片または変異体；ならびにBPI由来ペプチドが包含される。本発明に従って投与されるBPIタンパク質産物は、当該技術分野において知られているいかなる手段によって生産及び／または単離してもよい。引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである、米国特許第5,198,541号に、rBPI₅₀と称される組換えBPI ホロタンパク質及びBPIの組換え断片を含むBPIタンパク質をコードする組換え遺伝子、及びその発現のための方法が開示されている。共有であり係属中の米国特許出願第07/885,501号及びその一部継続出願である1993年5月19日出願の米国特許出願第08/072,063号及び対応する1993年5月19日出願のPCT出願第93/04752号は、すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものであるが、培養において遺伝的に形質転換した哺乳動物宿主細胞において発現し及び該細胞から分泌される組換えBPIタンパク質産物の新規精製方法を開示しており、また、安定で均質な製薬調剤に配合するのに好適な、大量の組換えBPI産物をどのように製造するかを開示している。 BPIの生物学的に活性を有する断片（BPI断片）には、その断片分子が、ホロタンパク質のアミノ末端アミノ酸、内部アミノ酸、及び／またはカルボキシ末端アミノ酸タンパク質産物を欠くことを除いては、天然のヒトBPIホロタンパク質と同じまたは類似のアミノ酸配列を有する、生物学的に活性を有する分子が包含される。このような断片の例に、Ooiら、J.Exp.Med.、174 巻、649貞(1991)に記載されるおよそ25 kDの天然ヒトBPIのＮ-末端断片及びGazz ano-Santoroら、Infect.Immun.60巻、4754〜4761頁(1992)に記載され、rBPI₂₃と称されている天然ヒトBPIの１位よりおよそ第193から199位までのＮ-末端アミノ酸をコードするDNAの組換え発現産物が包含されるが、これらに限定されるものではない。かかる出版物において、Grayら、前出の図１に示されると同様の、31 残基のシグナル配列及び成熟ヒトBPIのＮ-末端の最初の199アミノ酸を有する組換え発現産物（rBPI₂₃）をコードするDNA（第151位のバリンがＧＴＣでなくＧＴＧで特定され、第185位の残基がリジン（ＡＡＧで特定される）でなくグルタミン酸（ＧＡＧで特定される）であるという例外を含む）のソースとして、発現ベクターが用いられた。Grayら、前出の図１に示される配列（配列番号：１４５及び１４６）を有する組換えホロタンパク質（rBPI）も製造されている（rBPI₂₃について注解した例外、及び第417位の残基がバリン（ＧＴＴで特定される）でなくアラニン（ＧＣＴで特定される）であるという点は異なる）。他の例には、共有であり係属中の、1994年3月11日出願の米国特許出願第08/212,132号及び対応するPCT出願第号（引用することによりそれらの開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるごとき、BPI断片のダイマー型が包含される。好ましいダイマー産物には、モノマーが、BPIホロタンパク質のおよそ第1〜175 から、およそ第1〜199までのＮ-末端残基を有するアミノ末端BPI断片である、ダイマーBPIタンパク質産物が包含される。特に好ましいダイマー産物は、rBPI₄₂ ダイマーと名付けられた、Ｎ-末端残基第1から193までを有するBPI断片のダイマー型である。 BPIの生物学的に活性を有する変異体（BPI変異体）には、BPIホロタンパク質またはその生物学的に活性を有する断片及び他のポリペプチドの少なくとも一部を含む組換えハイブリッド融合タンパク質、ならびにBPI変異体のダイマー型が包含されるが、これらに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質及びダイマー型の例は、共有であり係属中の米国特許出願第07/885,501号（Theofanらによる）及びその一部継続出願である1 993年5月19日出願の米国特許出願第08/064,693号及び対応する1993年5月19日出願のPCT出願第US93/04754号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されており、アミノ末端端部でBPIタンパク質またはその生物学的活性を有する断片、及びカルボキシ末端端部で少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖の定常ドメインまたはその対立変異体を含む、ハイブリッド融合タンパク質を包含する。 BPIの生物学的に活性を有する類似体（BPI類似体）には、１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸に置換されているBPIタンパク質産物が包含されるが、これらに限定されない。例えば、共有であり係属中の1993年2月2日出願の米国特許出願第08/013,801号及び対応する1994年2月2日出願のPCT出願第US94/01235号（すべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に、システイン残基が異なるアミノ酸で置換されたBPI及びBPI断片のポリペプチド類似体が開示されている。この出願に記載された安定なBPIタンパク質産物は、BPIホロタンパク質のＮ-末端アミノ酸の第１アミノ酸からおよそ第193または199までのアミノ酸をコードするDNAの発現産物（但し、第132番目のシステイン残基がアラニンで置換されており、rBPI₂₁ΔcysまたはrBPI₂₁と名付けられている）である。他の例としては、例えば、共有であり係属中の1994年3月11日出願の米国特許出願第08/212,132号及び対応するPCT出願第号（引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）の、 BPI類似体のダイマー型が包含される。本発明の方法に有用な他のBPIタンパク質産物は、1994年9月15日出願の米国特許出願第08/306,473号に対応する、共有であり係属中の1994年9月15日出願のPCT 出願第US94/010427号、及び、1993年7月15日出願の米国特許出願第08/093,202号（これに対応する国際出願は、1994年3月11日出願のPCT出願第US94/02401号である）の一部継続出願である、1994年1月14日出願の米国特許出願第08/183,222号の一部継続出願である、1994年3月11日出願の米国特許出願第08/209,762号に対応する、1994年3月11日出願のPCT出願第US94/02465号（これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである）に記載されるものなどの、組換えまたは合成手段により生産されるBPI由来のまたはそれらBPIに基づくペプチド（BPI由来ペプチド）である。現在のところ好ましいBPIタンパク質産物には、組換えによって生産されたBPI のＮ-末端断片、特にrBPI₂₃またはrBPI₂₁などの、およそ21から25 kDのあいだの分子量を有するもの、もしくは、これらＮ-末端断片のダイマー型（例えばrBPI₄ ₂ ダイマー）が包含される。加うるに、好ましいBPIタンパク質産物には、rBPI₅₀ 及びBPI由来ペプチドが包含される。現在のところ好ましいBPI由来ペプチドには、約第142位から約第169位までのBPIタンパク質のアミノ酸配列、そのサブ配列ならびに、その配列またはそのサブ配列の変異配列を有するもので、BPI抗真菌生物学的活性を有するものが包含される。 BPIタンパク質産物の投与は、好ましくはBPIタンパク質産物及び製薬的に容認されうる希釈剤、佐剤または担体を含む、医薬組成物を用いて成し遂げられる。 BPIタンパク質産物は、既知の界面活性剤、他の化学療法剤または付加的な既知の抗真菌剤と併用してまたは併用せずに投与することができる。BPIタンパク質産物（例えば、rBPI₅₀、rBPI₂₃）を含有する安定な医薬組成物は、0.1重量％のポロキサマー188（Pluronic F-68、BASF Wyandotte、Parsippany、ニュージャージー州）及び0.002重量％のポリソルベート80（Tween 80、ICI Americans I nc.、Wilmington、デラウェア州）を含むクエン酸緩衝性生理食塩水（5または20 mMクエン酸塩、150 mM NaCl、pH 5.0）中に、1 mg/mlの濃度でBPIタンパク質産物を含むものである。BPIタンパク質産物（例えばrBPI₂₁）を含有する他の安定な医薬組成物は、5 mMクエン酸塩、150 mM NaCl、0.2％ポロキサマー188及び0.0 02％ポリソルベート80中に2 mg/mlの濃度でBPIタンパク質産物を含むものである。このような好ましい組合せが、1994年2月2日出願の米国特許出願第08/190,896 号及び1993年2月2日出願の米国特許出願第08/012,360号に対応する、共有で係属中の、1994年2月2日出願のPCT出願第US94/01239号に記載されており、これらはすべて引用することによりその開示が本明細書に含まれるものである。以下の例示的な実施例を考慮して、本発明の他の特徴及び利点が理解されるであろう。実施例１は、BPIタンパク質産物の調製及びin vitro抗真菌性試験を示し、実施例２は、カンジダで攻撃されたマウスの生存率に対するBPIタンパク質産物のin vivo効果を示し、実施例３は、多岐にわたる真菌種に対するBPIタンパク質産物の抗真菌効果の、追加のin vitro及びin vivo試験を示し、実施例４は、ラットにおけるBPIタンパク質産物のin vivo抗真菌効果を示し、実施例５は、さらなる抗真菌効果のin vivo試験を示す。実施例１ IN VITRO 抗真菌効果本実施例では、BPIタンパク質産物のin vitroスクリーニング、及び特に、BPI 由来ペプチドのブロスアッセイ及び／または放射拡散アッセイにおける抗真菌活性について示す。試験に供したBPI由来ペプチドはすべて、親出願の米国特許出願第08/209,762 号及び第08/183,222号に記載される方法に従って、調製した。手短に要約すると、ペプチドは、Applied Biosystems，Inc．Model 432ペプチド合成機を用いて、 Merrifield、J.Am.Chem.Soc.、85巻、2149頁(1963)及びMerrifieldら、Anal.Che m.、38巻、1905〜1914頁(1966)の方法に従って、固相ペプチド合成によって調製した。あるいは、ペプチドは、以下の実施例２に記載する方法によって合成してもよい。ペプチドのデザインは、部分的に、BPIホロタンパク質のＮＨ₂末端領域に存在する３つの機能性ドメインの発見に基づき、そのドメインとは、約第17位から約第45位までのBPIアミノ酸を含むドメインＩ（配列番号：１）、約第65位から約第99位までのBPIアミノ酸を含むドメインII（配列番号：６）、及び約第1 42位から約第169位までのBPIアミノ酸を含むドメインIII（配列番号：１２）である。ペプチドには、ドメイン配列及びそのドメイン配列のサブ配列ならびにその変異体が包含され、単一または複数のアミノ酸（典型的でないアミノ酸を含む）で置換されたかまたは置換されていない、直鎖状及び分岐鎖が組合わさったペプチドを包含し、それらのみならず、環状ペプチド及びドメイン間配列ペプチドが含まれる。以下の表１に、BPI配列より由来するまたはBPI配列に基づいたペプチドが示され、これらは接頭のXMPまたはBPIに伴うペプチド番号（例えば、XMP. 1またはBPI.1、XMP.2またはBPI.2）、配列番号：、BPIの中での参照位置に基づいたアミノ酸配列ならびにアミノ酸置換及び付加の標記によって識別される。さらに表１に示されるのは、それらペプチドのマススペクトル及びHPLCによる純度の評価である。各ブロスアッセイスクリーニング法において、CA-1と名付けたカンジダ・アルビカンス、SLU#1株（株が維持されていた、St.Louis University Hospital、St. Louis、ミズーリー州のG.Matuschak及びA.Lechnerの研究室から受領した）のコロニーを、5 mlのサブローデキストロースブロス（2％デキストロース、1％ネオペプトン）を含有するチューブに接種し、振盪しつつ37℃にて一晩インキュベートした。一晩培養した培養物を5 mlの新鮮なブロスにて1：50に希釈し、37℃にて３時間インキュベートした。生物をBeckman J-6M遠心機において3000 rpm（15 00× g）にて5分間遠心することによりペレットとし、そのペレットは5 mlのリン酸緩衝性生理食塩水（PBS）中に再懸濁して、570 nmにおける吸光度を測定した。1 OD単位は3 × 10⁷コロニー形成単位/mlに等しいという測定結果に基づいて、酵母細胞をサブローデキストロースブロス中、2 × 10⁶細胞/mlに希釈した。スクリーニングすべきBPI由来のペプチドまたはBPIに基づくペプチドは、元はダルベッコ−PBSにおいて構成されていたが、ブロス中100μg/mlに希釈し、そして、96ウェルの滅菌した、平底の発熱物質不含の組織培養プレート（Costar、Ca mbridge、マサチューセッツ州）のウェルの中へ連続的に２倍希釈していった。すべてのアッセイは、３重検定で実施した。2 × 10⁵の生物をウェル当たり100 μlにて添加して、プレートを37℃にて18時間振盪機でインキュベートし、そして各ウェルについての吸光度を、590 nmにて読み取った。本明細書に添付した図１に、５つのペプチド（XMP.13、XMP.138、XMP.139、XMP.142及びXMP.143）に対する用量曲線をグラフで示す。示した全ペプチドが、培養物の吸光度を約50μg/ mlを下回る用量において0.1を越えない数値にまで減じさせたが、XMP.138が、示したペプチドのうち低用量で最も良い結果を呈した。表１に、最小阻害濃度（MIC）（すなわち、590 nmにおける吸光度を0.1を越えない数値に減じさせるに要する最低濃度）によって、ブロスアッセイのデータを表す。放射拡散アッセイ法において、酵母CA-1培養物及びペプチド溶液を、前記のブロスアッセイ法におけると同様に調製した。3％サブローデキストロースブロス、1％アガロース（Pharmacia、Piscataway、ニュージャージー州）、0.02％Twee n 20、及び10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4を含む、10 mLの融解した下層アガロースをポリスチレンチューブに加え、酵母を添加するまで、56℃の水浴中に保持した。チューブをおよそ45℃にまで冷却し、酵母を添加して1 × 10⁶CFU/mlの最終濃度となるようにし、チューブを反転させることにより再度混合した。内容物を平坦な四角形のペトリ皿に注加し、平均に分布させた。アガロースは30秒経たないうちに固化し、約1 mmの均一の厚みを有していた。固まったアガロースに、真空装置が装着された滅菌した3 mmの穿孔器を用いて、一連のウェルを穿孔した。アッセイすべきペプチドは、およそ1 mg/mLの濃度から始めて、ダルベッコPBS （D-PBS）で連続的に２倍に希釈していった。各希釈液のうち5μLを、各々のウェルに加えて、プレートを37℃にて３時間インキュベートした。次いで、6％サブローデキストロースブロス、1％アガロース、及び10 mMリン酸ナトリウム、pH 7.4（およそ45℃）を含む、10 mLの融解したアガロース上層を加え、プレートを37℃にて一晩インキュベートした。この一晩にわたるインキュベーションに続き、希釈したクーマシー溶液をプレートに注加し、24時間染色させた。各ウェルを取り囲む生長阻害の清澄域を、カリパスを用いて測定した。実際の生長阻害面積（mm²）は、ウェルの面積を引くことで算出した。以下の表１に、3 0 mm²の生長阻害面積をなすために必要なペプチドのピコモル数（pmol）によって、調べたペプチドについての放射拡散アッセイの結果を表す。ペプチドXMP.221からXMP.281まで（配列番号：１６６から２２６）を調製し、前記のごとくに抗真菌活性について試験した。他の抗真菌剤に対して耐性であると考えられるカンジダの株：ポリエン耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ受託番号第38247号）、5-フルオロシトシン耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第44373号）、アゾール耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第62342号）及びケトコナゾール耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第64124号）へのBPIタンパク質産物の抗真菌活性を調べるために、さらなる実験を行なった。実施例２全身性のカンジダ感染を有するマウスにおける BPIタンパク質産物のIN VIVO 抗真菌効果本実施例では、カンジダ・アルビカンスを全身に感染させたマスの総死亡数または死亡率の軽減において、BPIタンパク質産物、特にBPI由来ペプチドのin viv o抗真菌効果を示す。実施例１に記載した放射拡散及びブロスアッセイで抗真菌活性についてスクリーニングしたBPI由来ペプチドを、実施例１に記載の通りに調製して、以下のごとく精製した。さらなる研究のために選択された殺真菌性ペプチドを、大容量で合成した。ペプチドは、Advanced Chemtech（ACT-Model 357 MPS）合成機での固相ペプチド合成を使用し、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）/1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）及び2-(1-Ｈ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウムヘキサ-フルオロフォスフェート（HBTU）/HOBt/ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）を使用する二重カップリング法を採用し、1-フルオレニルメチル-オキシカルボニル（Fmoc）保護ストラテジーを利用して製造した。固体支持体として、1％ジビニルベンゼン（DVB）架橋剤及び0.44 mmol/グラムの置換率を有する4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノメチル)-フェノキシ（Fmoc-Rinkアミド）リンカーと共にポリスチレン樹脂を使用した。用いたスケールは、開始時樹脂量で0.5グラムから5グラムの間であった。ペプチドは、40 × 10 mmのガードカートリッジ及び40 × 100 mmのPrep Pakカートリッジからなる、Delta Pak C-18、15 um、300 Aカートリッジカラムを装着したWaters Pre p LC 2000 Preparative Chromatography System（Water Corp.、Milford、マサチューセッツ州）を用いて、HPLCによって精製した。カラムは、25％の緩衝液Ｂで平衡化し、Ａはアセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸であり、そしてＢは80％アセトニトリル/0.065％トリフルオロ酢酸であった。ペプチドは緩衝液Ａ中に20mg/mL 以下に溶解し、そして8 mL/分の流速にて、LCポンプ操作を通して200〜800 mgをカラムに付した。結合した物質を、30分にわたって 8mL/分にて付される25〜35 ％の緩衝液Ｂの濃度勾配を用いて溶出した。（あるペプチドは、30分で23〜33％のＢの濃度勾配にて精製した）。溶出液は、Waters 490E Programmable Multiwa velength Detectorで、220及び280 nmにてモニターした。画分を集め、そして、 40℃に保持したZorbax C-8、150 × 1 mm、5 um、300 Aを装着したUltrafast Mi croprotein Analyzer（Michrom BioResources，Inc.、Pleasanton、カリフォルニア州）で、興味あるペプチドについてアッセイした。95％を越える純度の、興味あるペプチドを含有する画分を集めて、凍結乾燥処理により乾燥した。６〜８週齢の雄性DBA/2Jマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、メイン州）15匹の５つの群に、尾静脈への静脈注射により1.24 × 10⁵のカンジダ・アルビカンス（St.Louis University Medical Center、ミズーリー州からの、バッチ SLU-1）を接種した。このモデルでは、1 × 10⁵のカンジダ接種の結果、28日で8 0％致死量（LD₈₀）に至った。真菌で攻撃した直後に、尾静脈を介して10 mg/kg のXMP.36、5 mg/kgのXMP.97、10 mg/kgのXMP.102、1 mg/kgのアンフォテリシンＢ（Sigma、St.Louis、ミズーリー州）、または対照として0.1 mLのリン酸緩衝性生理食塩水（PBS）をマウスに静脈注射した。２日目及び４日目に同量のBPIタンパク質産物（例外として、XMP.36は第2回目に5 mg/kgの投与量にて与えた）を用いた処置を繰り返した。２８日目に試験を終了するまで、死亡率につき、１日２回マウスを監視した。図２に表す死亡率のデータで、２８日目までに、アンフォテリシンＢで処置したマウスの100％が生存し、XMP.97で処置したマウスの53％が生存し（対照に比較してp<0.05）、XMP.36で処置したマウスの33％が生存し、XMP.102で処置したマウスの27％が生存し、そしてPBSで処置したマウスの20％が生存することが示される。図２において、「×」の記号は、アンフォテリシンＢでの処置、白抜きの四角はXMP.97での処置、白抜きの円形はXMP.36での処置、白抜きの菱形はXMP.102 での処置、及び白抜きの三角は緩衝液での処置後の生存を表す。Lifetest Survi val Curve分析を用いて統計的有意性を評価した。［Lawless、Statistical Mode ls and Methods for Lifetime Data、John Wiley & Sons、New York(1982)。］生存における期間及びほぼ直線的な減衰はヒトの日和見性のカンジダ症に類似している。１５匹のマウス５群について、0.5 × 10⁵のカンジダ・アルビカンスによる真菌での攻撃に続き、０日、２日及び５日目に10 mg/kgのXMP.127、5 mg/kgのXMP. 13、5 mg/kgのXMP.37、1 mg/kgのアンフォテリシンＢ、または対照として0.1mL のPBSを用いて処置して、第２の実験を行なった。図３に表す死亡率のデータにより、２８日目までに、アンフォテリシンＢで処置したマウスの100％が生存し、XMP.127で処置したマウスの67％が生存し（対照に比較してp<0.05）、XMP.37 で処置したマウスの33％が生存し、XMP.13で処置したマウスの20％が生存し、そしてPBSで処置したマウスの33％が生存することが示される。図３において、「 ×」の記号はアンフォテリシンＢでの処置、白抜きの円形はXMP.127での処置、黒塗りの三角は緩衝液での処置、白抜きの四角はXMP.37での処置、白抜きの三角はXMP.13での処置後の生存を表す。これらの試験において、予期されるとおりアンフォテリシンＢには完全に保護能があった。抗真菌活性を有しない対照のペプチドであるXMP.102の効果は、PBS となんら異なることはなかった。このデータにより、全身をカンジダ・アルビカンスで攻撃したマウスへのBPI由来ペプチドXMP.97及びXMP.127の投与によって、予期せざることに、緩衝液で処置した対照に比較して死亡率の有意な低下が提供されることが立証される。他の抗真菌剤に対して耐性であると考えられるカンジダの株：ポリエン耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ受託番号第38247号）、5-フルオロシトシン耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第44373号）、アゾール耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第62342号）及びケトコナゾール耐性のカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣ第64124号）へのBPIタンパク質産物の抗真菌活性を確かめるために、さらなる実験を行なった。実施例３種々の真菌種に対するBPIタンパク質産物の IN VITRO 及びIN VIVOの効果 BPIタンパク質産物の抗真菌活性を、例えばブロスアッセイなどにおけるin vi tro、及びクリプトスポリジアム・パルバム（Cryptosporidium parvum）、クリプトコッカス・ネオフォーマンス及びヒストプラスマ・カプスラタム（capsulat um）を包含する種々の真菌種に対する動物モデルにおいてのin vivo評価を行なう。クリプトスポリジアム・パルバムに対する動物モデルには、重篤な複合免疫不全（SCID）マウスモデル及び初乳が剥奪されたSPF小豚モデルが含まれる。実施例４カンジダに感染した、好中球減少症ラットにおける BPIタンパク質産物のIN VIVO抗真菌効果本実施例は、抗真菌活性についてのBPIタンパク質産物のin vivo試験、特に、カンジダ・アルビカンスの臨床分離株の酵母相の懸濁液を大量且つ致死量、好中球減少症ラットに感染させた後の敗血性ショックの進行を包含する、感染の症候及びその続発症を鈍化または防止するうえでの、BPIタンパク質産物であるrBPI₂ ₃ の効力を示す。rBPI₂₃を用いたラットの処置（ｎ＝６のラット）を、類似の分子量及び電荷を有するが、rBPI₂₃の殺微生物効果を有しない対照タンパク質であるタウマチンによる処置（ｎ＝５のラット）と比較した。免疫力が低下した宿主動物におけるカンジダ生物を用いた圧倒的な感染の、初期実験のあいだ、感染後 24時間にわたる生存、全身の動脈圧、脈拍、呼吸数及びコア（core）体温、血液細胞数及び血液ガス、循環系のカンジダのコロニー形成単位（CFU）、ならびに肺、肝臓、心臓、及び腎臓の微少血管透過性及び組織病理学を包含する複数の指標について動物を監視した。圧倒的な感染によるかかる条件のもとで、BPIタンパク質を用いた処置は、生存にはほとんどまたは全く効果を有しないことが予測されるかもしれないが、感染の際に監視される他の指標に対して効果を有するかもしれないと考えられる。詳細には、以下の方法に従った。雄性Sprague-Dawleyラット（初期体重＝280 〜300 g、特に病原体は有しない、Harlan、Indianapolis、インディアナ州）を孤立させてケージに入れ、実験前及び実験中、食餌及び水を自由に摂取できるようにした。カンジダで感染する４日前に、100 mg/kgのシクロホスファミド（滅菌したリン酸緩衝性生理食塩水、pH 7.4中で結晶から再構成した、20 mg/ml 溶液を使用、Sigma、St.Louis、ミズーリー州）を腹腔内注射して、これらの動物に、４〜７日間継続する、絶対的好中球減少症を誘導した。感染の前日に、ケタミン：キシラジン（2：1、0.9 ml/kg、筋肉注射）で麻酔をかけて、左頚動脈及び右頚静脈に無菌的にカテーテル挿入した。カテーテル挿入の術後直ちに、動物に2.5 mgのアミカシン硫酸及び300 mgのペニシリンを静脈内投与した。 CA-1株のカンジダ・アルビカンス（CA）の培養は、28℃にてペニシリン／ストレプトマイシンを含有するサブローデキストロースアガー斜面に毎週移植することにより維持し、これらをサブローブロスに移し、48〜72時間振盪水浴中で37℃ にてインキュベートし、そして使用前の24時間、新鮮なサブローブロスに再懸濁した。注入用の酵母相CA（分生胞子芽（blasto-conidia））を、4℃にて10分間、400 × gで沈殿させ、生理食塩水で２度洗浄し、連続的な希釈及び血球計を用いて1 × 10⁹生物/mlになるように生理食塩水中に再懸濁し、そして、使用時まで4℃に保った。CA注入物中の内毒素レベルは、定量的色素産生リムラス変形細胞（Limulus amebocyte）溶解液アッセイ（Whittaker M．A．Bioproducts、Walk ersville、メリーランド州）によってアッセイしたところ、30 pg/ml以下であった。CA接種材料の生存度は、トリパンブルー排斥によって99％を上回ることが確認され、使用前の顕微鏡試験で、発芽は示されていなかった。1 × 10⁹/mlと算定されたCA接種材料について、サブローデキストロースアガー上に37℃にて24時間、線条播種した連続希釈によると、実際のコロニー形成単位（CFU）は5.7 ±0 .2 × 10⁸CFU/ml（平均±標準誤差）であると判定された。 CA感染前及び感染後に、動物をrBPI₂₃または対照タンパク質のタウマチンの2 mg/ml溶液（双方とも、150 mM NaCl、5 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.0）で処置した。CA注入開始の５分前に、rBPI₂₃またはタウマチンを6. 6 mg/kgの静脈内丸塊の形態にて投与した。次いでラットを、30分間にわたって生物の大量注入で感染させた。（Sage Pump、Cambridge、マサチューセッツ州）［12時間未満でLD₁₀₀に至る、1 ml中1 × 10⁹のCA］Ｔ＝０は、CA注入が完了した時間と考えた。感染後直ちに、6.6 mg/kg/時の継続的な静脈内注入にて、4時間にわたってラットにrBPI₂₃またはタウマチンを投与し、続いて次の４時間に1 ml/時で、生理食塩水を注入した。感染した動物に、Ｔ＝30分に追加の抗生物質（2.5 mgのアミカシン硫酸及び300 mgのペニシリン、静脈内）を与えた。６匹の白血球減少症の対照ラットは、生理食塩水で擬感染し、そしてrBPI₂₃処置もタウマチンン処置も施さなかった。血行動態及び生命兆候を、30分毎に記録した。動脈圧（mm Hg）及び脈拍数（拍動数／分）を、マルチチャンネルフィジオグラフ（MK-III-S；Narco Bio-Syst ems、Houston、テキサス州）に継続的に記録した。呼吸頻度（呼吸数／分）は、直接観察により評価し、直腸温度（℃）は、ミニプローブ（Diatek、San Diego 、カリフォルニア州）によって測定した。基線となる動脈血試料（1.5 ml）は、 30分の平衡化の後に採集し、追加の動脈血試料は、Ｔ＝1.5及び4.5時間にて（または、それより早く死亡例が生じれば、死亡時に）採取した。各血液試料の後に、同容積に測定した生理食塩水を、頚静脈カテーテルを介して与えた。これらの血液試料について、ミクロヘマトクリット、IL-1306機（Instrumentation Labor atory、Lexington、マサチューセッツ州）を用いた血液ガス、総白血球及び血小板計数（相顕微鏡法による）、分別白血球計数（Diff-Quik; Baxter、 Miami、フロリダ州）、ならびに定量的血液培養の２重検定分析を行った（結果を図６に示す）。痙攣または加速度的に重篤になる呼吸困難を呈したいずれの動物も、慈悲をもって屠殺し、その時点まで生存していたものとして計数した。死亡時に、微小血管の透過性の変化及び浮腫の指標である、湿潤／乾燥重量比（Ｗ／Ｄ）を70℃で一定の重量にまで乾燥することによって測定するために、気管支を結紮した後、右肺の頭葉を切除した。左肺は、20〜22 cm Ｈ₂Ｏの経肺膨満圧にてカコジル酸塩緩衝性グルタルアルデヒドを用いて30分間in situ固定し、続いて、脱水及びパラフィンへの埋設の前に5℃にて一晩、新鮮なグルタルアルデヒド中で2〜3 mm の中葉スライスを固定した。6μmの肺の連続切片を、慣例の組織病理学用のヘマトキシリン及びエオシン、酵母を同定するための過ヨウ素酸シッフ（PAS）、ならびに好中球顆粒を染色するためのクロロアセテートエステラーゼ（CAE）を用いて染色した。肝臓、心臓、及び腎臓を切除し、これらの器官からの標準化組織切片も、Ｗ／Ｄ測定のために単離し、または緩衝性ホルマリンに浸漬固定して肺について前記したと同様の工程を実施した。反復測定ANOVA及びNewman-Keuls試験を用いたポスト−ホック（post-hoc）比較によって分析した群内及び群間の変数に対する逐次変化と共に、平均±標準誤差としてデータを表している。統計的有意性は、P-値＜0.05に対して認定した。この初期実験において、1 × 10⁹CAの大量投与量に応答して、好中球減少症ラットは致死的な真菌原性感染に罹り、この感染で６時間以内にショックが進行し、この条件下ではrBPI₂₃を用いた処置によってショックが遅延されたり妨げられたりしなかった。多くの動物において致死性ショックが迅速に開始される結果、後になって試料を採取する時点でのn-値が小さくなってしまうことは、注意すべきである。この1 × 10⁹CAの投与量での生存に対する効果は立証されなかったが、これらのBPI₂₃処置ラットにおいて、タウマチンを与えた動物に比して、1.5及び4.5時間で循環系におけるCAの静脈内クリアランスが統計的に有意に増強されることが示された（p<0.05、図６の定量的血液培養の結果を参照されたい）。循環系におけるカンジダレベルの減少は、因数10でも治療上の成功において重要な因子となりうるので、このような抗真菌効果は特筆すべきであり、また極めて意義深い。この1 × 10⁹CA生物の投与量において、rBPI₂₃を用いた処置（対照のタンパク質に対して）が、CA感染に続く全身性低血圧及び呼吸困難を伴う頻呼吸の開始を一貫して遅延させることはなかった。タウマチン-及びrBPI₂₃-処置ラットの双方における真菌原性の循環系不全症に先がけて、顕著に急激に始まる徐脈及び低血圧が発症し、1 × 10⁹のCAで感染した動物は、安定な血行動態から15〜30分以内に死に至った。rBPI₂₃はこのようなカンジダ血症の動物で生存時間を延長させなかったが、対照タンパク質のみで処置した1 × 10⁹のCAで感染したラットにおいて4.5時間までに（または、それより早く死亡例が生じれば、死亡時に）認められた、重篤な頻呼吸（図４）及び低血圧（図５）を軽減した。しかして、rBPI₂₃ は、上記図６において示されるように循環している生物の静脈内クリアランスを劇的に増加させることにより、また図４及び５に示すようにCAで誘導された敗血症の際の心肺指標及び生命兆候の双方を安定化することによって、この圧倒的な CA感染のモデルにおける予測されなかった有益な効果を有していた。BPIタンパク質産物をより多くの量、もしくはより持続的に投与することで、このモデルでさらに優れた有益な効果が達成されることが予期される。また、関連する臨床上のCA感染の際に認められるごとき、より低レベルのCA感染では、BPIタンパク質産物がさらに優れた効果を提供することが予期される。タウマチン処置ラットにおける致死性カンジダ血症は、3〜6時間で死亡するまでの、有意なる動脈酸血症、低酸素血症、及び炭酸過剰症を伴う。rBPI₂₃を用いた処置で、カンジダ血漿のショックの際の動脈酸血症（図７）及び低酸素血症（図８）の双方が軽減された。試験したラットのすべてで、動脈ヘマトクリット、総白血球数、及び血小板数の、基線となる血液動態指標は、この動物モデルにおいてシクロホスファミドにより誘導されるわずかな、甚だしい、及び中庸の増加を各々反映していた。カンジダ血症のラットの間でヘマトクリットが高値であるのは、血漿の溢出に起因する血液濃縮を反映しており、この結果は対照のタンパク質であるタウマチンを与えたカンジダ血症の動物に対する結果と比較して、rB PI₂₃処置によってわずかに軽減されていた。動脈の総白血球数は、シクロフォスファミドを用いた前処置のゆえに基線において低値であるが、カンジダ血症のラットの間では白血球減少が徐々に始まり、そしてrBPI₂₃とタウマチン処置群との間に白血球数の有意差はなかった。最後に、すべての感染ラットが有意な動脈血小板減少症に罹り、これはカンジダ血症の動物の間で4.5時間までに（または、それより早く死亡例が生じれば、死亡時に）明瞭に現れ、いずれのCA感染群についても、タウマチンに比較して、rBPI₂₃を用いた処置が末梢の血小板損失の程度または動力学を変化させることはなかった。生理食塩水で擬感染させた好中球減少症の対照ラットに比較して、前記のごとく1 × 10⁹の生物を注射して対照のタンパク質（タウマチン）またはBPIタンパク質産物（rBPI₂₃）を用いて処置したカンジダ血症のラットは、肺の湿潤／乾燥重量比（Ｗ／Ｄ）が有意に高められていたが、肝Ｗ／Ｄ及び腎Ｗ／Ｄにおける増加程度はそれよりも少なかった。1 × 10⁹のCAにより感染して死亡するこれらの動物からの肺の組織学的実験によって、重篤な血管周囲及び気管支周囲の袖口様縁形成ならびにフィブリン沈着を伴う拡張性肺胞内破（flooding）で特徴付けられる出血起因性の肺浮腫の迅速な発症をrBPI₂₃が改変することはないことが明らかになった。発芽菌糸としての静脈内酵母凝集物から肺胞空間内に直接噴出しているカンジダ分生胞子芽が観察された。肝臓における組織学的変化もまた重篤であって、完全なグリコーゲンの枯渇及び門脈三分岐から漸進的な隔たりをもって、且つシヌソイドの星細胞により貧食されるが殺傷はされなかった発芽CAの近傍での帯性の空胞化を示す肝細胞が認められた。他の組織も発芽酵母を含んでいた（心臓及び腎臓で顕著）が、これらの器官の全体としての様相は、CAの菌糸の病巣塊（focal mass）を除けば著しいものではなかった。実施例５カンジダに感染した好中球減少症ラットにおける BPIタンパク質産物のIN VIVO抗真菌効果本実施例には、特にBPIタンパク質産物投与によってもたらされる循環系中のカンジダ・アルビカンスのコロニー形成単位の有意な低下を包含する、圧倒的なカンジダ感染（すなわち、実施例２に記載した1 × 10⁹CAの生物量）に対するBP Iタンパク質産物処置の有益な効果に鑑みた、追加のin vivo実験を示す。追加の実験は、実施例２に記載したカンジダ感染の好中球減少症ラットモデルを用いて行うが、より低量のCA生物を動物モデルに投与し、且つ／またはBPIタンパク質産物量を増加して投与し、同じかまたはより長期間、単独でまたは既知の抗真菌剤と併用して行なう。かかる実験は、不意のCA感染への典型的な応答により密接に近似するようデザインされたモデル系において、例えば死亡及び真菌原性ショックから保護することを含む、真菌感染治療におけるBPIタンパク質産物の効力を試験をするためにデザインされる。当業者であれば、本明細書における本発明の好ましい実施態様の前記記載を考慮して、本発明を実施する上での多くの修正や変更を想起することが予測される。よって、本発明の範囲は、添付の請求の範囲に登載される限定によってしか、限定を受けるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ｃ０７Ｋ 14/47 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 9282−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号０８／２７３，５４０ (32)優先日 1994年７月11日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スキャノン，パトリック，ジェイ. アメリカ合衆国 94117 カリフォルニアサンフランシスコエッジウッド 176 (72)発明者ランバート，ルイス，エイチ. アメリカ合衆国 94539 カリフォルニアフレモントオメガドライブ 45928

Claims

【特許請求の範囲】１．真菌感染に罹患している被験者に、治療的に有効量のBPIタンパク質産物を投与することを含む、真菌感染症の治療方法。２．前記BPIタンパク質産物が、BPIのＮ-末端断片またはそのダイマー型である請求の範囲第１項記載の方法。３．前記Ｎ-末端断片がおよそ21 kDから25 kDのあいだの分子量を有する、請求の範囲第３項記載の方法。４．前記BPIタンパク質産物が、BPIホロタンパク質、rBPI₂₃、またはrBPI₂₁である、請求の範囲第１項記載の方法。５．前記BPIタンパク質産物が、抗真菌活性を保有する、約第142位から約第16 9位までのBPIタンパク質のアミノ酸配列、そのサブ配列及びその配列の変異体またはそのサブ配列を有する、BPI由来ペプチドである請求の範囲第１項記載の方法。６．前記真菌感染が、カンジダ、アスペルギロシス、及びクリプトコッカス種よりなる群から選択される真菌種が関与するものである請求の範囲第１項記載の方法。７．前記真菌種がカンジダ・アルビカンスである請求の範囲第６項記載の方法。８．前記BPIタンパク質産物が、静脈内投与される請求の範囲第１項記載の方法。９．前記BPIタンパク質産物が、エアゾルとして投与される請求の範囲第１項記載の方法。１０．BPIではない抗真菌剤を投与する追加の工程を含む、請求の範囲第１項記載の方法。１１．真菌感染の治療用医薬の製造のための、BPIタンパク質産物の使用。１２．真菌感染の治療用医薬の製造のための、他の抗真菌剤と組み合わせたBPI タンパク質産物の使用。１３．真菌をBPIタンパク質産物に接触せしめる工程を含む、真菌の殺傷または複製阻害方法。１４．真菌種を抗真菌剤に接触せしめる工程をさらに含む、請求の範囲第１３項記載の方法。１５．BPIタンパク質産物が、XMP.97（配列番号：９２）及びXMP.127（配列番号：１２３）よりなる群から選択されるBPI由来ペプチドである、請求の範囲第５項記載の方法。