DE60216788T2

DE60216788T2 - Den calciumeinstrom hemmender faktor und verfahren zu dessen isolierung

Info

Publication number: DE60216788T2
Application number: DE60216788T
Authority: DE
Inventors: Stephen E. Virginia Beach BUESCHER
Original assignee: Eastern Virginia Medical School
Current assignee: Eastern Virginia Medical School
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2002-09-11
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2022-09-12
Also published as: WO2003022870A1; EP1434790A4; ES2278943T3; EP1434790B1; JP2005509601A; US20050054566A1; JP4537704B2; US20090011998A1; EP1434790A1; CA2472102A1; DK1434790T3; US20110045590A1; MXPA04002387A; DE60216788D1; ATE348105T1

Description

Hintergrund
Polymorphonucleare Leukozyten oder Granulocyten sind eine umfassende Klasse von weißen Blutzellen, einschließlich Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen, welche im Knochenmark produziert werden und den Körper gegen infizierende Organismen oder Fremdsubstanzen verteidigen, und Neutrophile sind die überwiegenden zellularen Komponenten von akuten Entzündungen. Migration von Neutrophilen in die befallenen Bereiche ist charakteristisch für eine entzündliche Reaktion. Von Neutrophilen wurde auch gezeigt, dass sie eine Rolle bei Entzündungserkrankungen spielen, und es wurde vorgeschlagen die Rolle der Neutrophilen bei bestimmten Erkrankungen durch „unpassende" neutrophile Aktivierung und nachfolgende Unterdrückung zu erklären. Zum Beispiel wurde unpassende Aktivierung, Deaktivierung und mögliche autooxidative Zerstörung als ein Mechanismus bei neutrophilen lokomotorischen Defekten bei Traumata in Erwägung gezogen. Unpassende neutrophile Aktivierung wurde auch mit venösen Erkrankungen in Verbindung gebracht.
Wenn polymorphonucleare Leukozyten („PMN") währen einer immunologischen Reaktion mit einem Agonisten stimuliert werden, zeigen die PMN einen vorübergehenden Anstieg an intrazellularem Spiegel an freiem Kalzium, welcher der Freisetzung von Kalzium aus internen Lagern wie jenen innerhalb des endoplasmatischen Retikulums zugeordnet wird. Zum Beispiel zeigen Neutrophile, nachdem sie einem Entzündungsreiz, einem Sekretationsauslöser, oder einem aktivierenden Agonisten ausgesetzt wurden, einen Anstieg des Spiegels an freiem Kalzium. Dieser Anstieg an intrazellularem freiem Kalzium ist wichtig für die nachfolgende Aktivität des PMN bei der immunologischen Reaktion. Derzeitige Modelle zeigen an, dass nach diesem vorübergehenden Anstieg des intrazellularen Spiegels an freiem Kalzium die Neutrophilen danach zur Homeostase zurückkehren und die intrazellularen Spiegel an freiem Kalzium auf den normalen Stand durch einen Vorgang zurückkehren, der die Ca⁺⁺ Rückeinlagerung in intrazellulare Lager, Ca⁺⁺ Einfluss von außerhalb der Zelle und Ca⁺⁺ Ausfluss in das externe Milieu involviert.
Von menschlicher Milch wurde gezeigt, dass sie antiinflammatorische Wirkung sowohl bei Menschen als auch in Tiermodellen enthält (z.B. im durch Chemikalien induzierten Colitismodell in Ratten und in einem subcutanen Luftbeutel-Inflammationsmodell). Frühere Studien haben gezeigt, dass viele pro-inflammatorische Funktionen der Neutrophilen vermindert werden, wenn sie sie Vormilch und/oder Humanmilch ausgesetzt werden. Zum Beispiel können Komponenten der Humanmilch die Expression von DC11b erhöhen, die Expression von L- Selektin vermindern und aktivierte Neutrophile produzieren. Intrazellulare Spiegel an freiem Kalzium in Neutrophilen stehen mit der neutrophilen Aktivität in Zusammenhang und das intrazellulare Ca⁺⁺ Gleichgewicht ist kritisch für vielfach normale neutrophile Funktionen.
Studien haben gezeigt, dass die Inhibierung von Ca⁺⁺ Einstrom (entweder durch einen Ca⁺⁺ Kanalblocker oder durch Suspendierung von Neutrophilen in einem Ca⁺⁺ freien Puffer) viele inflammatorischen neutrophilen Funktionen nach physiologischer Stimulation vermindern kann, z.B. Inhibierung der Funktion humaner Neutrophilen durch Tolfenaminsäure bringt die Inhibierung des Ca⁺⁺ Einstroms mit sich. Von N-Acetylsphingosin (C₂-Ceramid) wurde berichtet, dass es die Bildung von neutrophilem Superoxid und Kalzium-Einstrom inhibiert. Von Arzneimitteln, die Kalziumkanäle blockieren ist bekannt, dass sie einen Einfluss auf die mikrobioziden Funktionen von menschlichen Neutrophilen aufweisen und von Kalziumkanalblocker wurde berichtet, dass sie die polymorphonucleare und monocytbakterizidale und fungizidale Aktivität beeinflussen. Selektive Unterdrückung der PMN Funktion wurde unter Verwendung cytotoxischer Wirkstoffe, die zur Unterdrückung der PMN Produktion im Knochenmark fähig sind, erprobt, um zu versuchen, die durch Verletzung von Geweben verursachte Entzündung zu minimieren. Die Markunterdrückung war jedoch nicht PMN-spezifisch und hat zu unterdrückter Produktion anderer Blutbestandteile mit den anhaftenden Nebeneffekten geführt. Corticosteroide Behandlung wurde eingesetzt, um PMN Funktion zu unterdrücken, aber solche Behandlungen haben ebenfalls eine Anzahl unerwünschter Nebeneffekte. Von selektiver Unterdrückung von PMN Funktion in vivo wurde berichtet, dass sie experimentell durch die Verwendung von monoklonalen, gegen PMN Integrine gerichteten Antikörpern erreicht wurde. Diese letztgenannte Arbeit schlägt vor, dass die Unterdrückung von PMN Funktion Anwendung in der Prävention/Minimierung von Myocardinfarktausdehnung und der Verbesserung von Ischämie/Reperfusion Schädigungen finden kann.
Es wurde bereits berichtet, dass menschliche Milch PMN durch Verminderung der Kalziumlager, zumindest teilweise, durch Inhibierung des Einstromes von extrazellularem Kalzium zu PMN in der Folge einer Agonisten Stimulation inhibiert. Vom Aussetzen menschlicher Milch wird auch berichtet, das intrazellulare Ca⁺⁺ Gleichgewicht zu ändern, zellulare Aktivierung zu verursachen und Funktion von polymorphonuclearen Leukozyten zu unterdrücken. Jüngere Arbeiten haben berichtet, dass die Fähigkeit menschlicher Milch den Einstrom von extrazellularem Kalzium zu PMN zu inhibieren, ein Effekt sein kann, der signifikante Spezifität besitzt. Von Aussetzen menschlicher Milch wurde berichtet, dass kein inhibitorischer Effekt auf den extrazellularen Kalziumeinstrom auf glatte oder gestreift Murkelzellen von Kaninchen, auf unreife menschliche Myeloidzellen oder unreife Rattenintstinalzellen auftritt.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Inhibierungsfaktor für extrazellulares Kalzium und auf ein Verfahren für seine Reinigung aus menschlicher Milch. Menschliche Milch hat weitreichende antiinflammatorischen Eigenschaften und von menschlicher Milch wurde gezeigt, dass sie zellulare Entzündungsvermittler wie PMN oder Neutrophile inhibiert. Die Aktivität von PMN und Neutrophilen wurde mit den Spiegeln intrazellularen freien Kalziums in Beziehung gesetzt. Menschliche Milch kann die Wirkung von PMN oder Neutrophilen durch Inhibierung des Kalziumeinstroms in die Zellen von externen Quellen unterdrücken, wenn die PMN oder Neutrophilen zu Homeostase zurückkehren, nachdem sie mit einem Agonisten stimuliert wurden. Andere Studien haben vorgeschlagen, dass menschliche Milch auch Ca⁺⁺ Resequestration in intrazellulare Lager und Ca⁺⁺ Ausstrom in das externe Milieu modifizieren kann. Da das intrazellulare Kalziumgleichgewicht anscheinend für vielfache normale PMN Funktionen kritisch ist, kann die Verminderung von intrazellularen Kalziumlagern einen Weg zur Erzielung von anti-inflammatorischen Wirkungen durch weitgehende Unterdrückung der PMN Funktionen ergeben.
Die vorliegende Erfindung stellt einen gereinigten Faktor aus menschlicher Milch bereit, der in der Lage ist, den Einstrom von extrazellularem Kalzium zu inhibieren. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „gereinigt" und „Reinigung" auf Zusammensetzungen (und zugehörige Verfahren), in welchen der relative Gehalt an (einer) bestimmten Komponente(n), wie ein CaII Faktor), durch Entfernung von wenigstens einem Teil einer oder mehrerer Verunreinigungen aus der Zusammensetzung erhöht wurde. Obwohl diese Begriffe auf ein Verfahren verweisen können, das eine Zusammensetzung erzeugt, die 90 Gew.-% oder mehr der gewünschten Komponente(n) enthält, erfordern oder implizieren die Begriffe „gereinigt" und „Reinigung" nicht einen so hohen Grad der Entfernung anderer Substanzen aus der Komposition.
Die zentrale Wichtigkeit des Ca⁺⁺ Stoffwechsels für neutrophile Funktion veranlasste die Anmelder zu untersuchen, ob Milchaussetzung neutrophile Ca⁺⁺ Reaktionen auf eine Reihe von Agonisten verändert und wie die Effekte erreicht werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Überlegung, dass es möglich sein sollte, einen Faktor, der in der Lage ist, den Einstrom von extrazellularem Kalzium in PMN (hierin als „CaII Faktor bezeichnet) zu inhibieren, aus menschlicher Milch durch Verwendung einer Untersuchung zu isolieren, die den Kalzium- Einstrom in PMN nach Stimulierung mit einem Agonisten (z.B. formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin („fMLP")) misst.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Faktors aus menschlicher Milch bereit, der in der Lage ist, zumindest teilweise den Einstrom von extrazellularem Kalzium in PMN zu inhibieren (hierin als „Kalziumeinstrominhibierungsaktivität" bezeichnet). Bevorzugt wird der CaII Faktor im wesentlichen gereinigt, das heißt, der CaII Faktor bildet zumindest 50 Gew.-% der Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 1 kDa oder mehr, die in der gereinigten Zusammensetzung vorhanden sind. Wenn die PMN mit gereinigtem CaII Faktor behandelt werden, dann wird der Einstrom von externem Kalzium inhibiert. Daher wird bei weiterer Stimulierung mit einem Agonisten und weiterer Freisetzung von Kalzium aus internen Quellen, PMN eine Depletion des Kalziumgehaltes erfahren und als solches werden eine oder mehrere Funktionen von PMN unterdrückt.
Eine Ausführungsform stellt ein Verfahren zum Reinigen eines aus geklärter menschlicher Milch gewonnenen CaII Faktors bereit. Geklärte Milch wurde im Wesentlichen von zellularer Debris und Fettkügelchen befreit. Dies kann unter Verwendung herkömmlicher Techniken wie Zentrifugation und/oder Filtration erreicht werden. Der CaII Faktor kann durch Isolierung einer Fraktion niedrigen Molekulargewichtes aus geklärter Milch so gereinigt werden, dass die Fraktion Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von nicht weniger als 1 kDa und nicht mehr als 10 kDa enthält. Beispielsweise kann die geklärte Milch behandelt werden, um Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von mehr als 10 kDa zu entfernen; und nachfolgend behandelt werden, um Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von weniger als 1 kDa zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführung kann die geklärte Milch behandelt werden, um eine Fraktion niedrigen Molekulargewichtes bereitzustellen, die Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von nicht höher als 3,5 kDa und nicht weniger als 1 kDa enthält. Die Fraktion niedrigen Molekulargewichtes kann nachfolgend behandelt werden, um fettlösliche Komponenten zu entfernen, um eine wässerige zweite Fraktion bereitzustellen, welche eine Komponente enthält, die Kalziumeinstroninhibierungsaktivität zeigt. Dies kann beispielsweise durch Extrahierung der ersten Fraktion mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. einem Chloroform/Methanol Gemisch) und Zurückbehalten der wässerigen Phase erzielt werden.
Beispielsweise kann ein gereinigter CaII Faktor aus geklärter Milch durch ein Verfahren hergestellt werden, welches aufweist: (i) Dialysieren von geklärter Milch durch eine 10 kDa Ausschlussmembran, um ein Dialysat als erste Fraktion zu sammeln; (ii) Dialysieren der ersten Fraktion durch eine 1 kDa Ausschlussmembran, um ein Retentat als zweite Fraktion zu isolieren; und (iii) Extrahieren der zweiten Fraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das in der Lage ist, fettlösliche Komponenten zu lösen (z.B. Chloroform/Methanol Mischung) um eine dritte Fraktion herzustellen, welche eine wässerige Lösung ist, die eine Kalziumeinstrominhibierungsaktivität zeigende Komponente enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen gereinigten CaII Faktor bereit, der aus menschlicher Milch gewonnen ist. Der CaII Faktor ist in der Lage, den Einstrom von extrazellularem Kalzium in PMN zu inhibieren. Der gereinigte CaII Faktor wird üblicherweise aus geklärter Milch hergestellt. Der CaII Faktor hat typischerweise ein scheinbares Molekulargewicht von nicht weniger als etwa 1 kDa und nicht mehr als etwa 10 kDa. Mehr passend, wird angenommen, dass der CaII Faktor typischerweise ein scheinbares Molekulargewicht von nicht weniger als 1 kDa und nicht höher als etwa 3,5 kDa aufweist. Der CaII Faktor ist in wässriger Lösung löslich und vorzugsweise gereinigt, so dass er im Wesentlichen frei von fettlöslichem Material ist. Es wurde gefunden, dass der Faktor in der Lage ist, seine Einstrominhibierungsaktivität für extrazellulares Kalzium („CaII Aktivität") beizubehalten nachdem er 10 Minuten auf 100°C erhitzt wurde. Der CaII Faktor ist auch in der Lage, seine CaII Aktivität beizubehalten, wenn er auf pH 2 angesäuert 10 Minuten bei 60°C oder aus pH 12 alkalisiert 10 Minuten bei 25°C gehalten wurde. Der CaII Faktor produziert in einer Lowry Untersuchung keine positive Reaktion und ist in der Lage, seine CaII Aktivität beizubehalten, nachdem er mit Proteinase K bei 1 μg/ml 10 Minuten bei 37°C gehalten wurde. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „resistent" auf einen Faktor, der zumindest ein gewisses Ausmaß an Kalziumeinstrominhibierungsaktivität zu zeigen aufrechterhält, wenn er den angegebenen Bedingungen ausgesetzt wurde. Der CaII Faktor ist auch gegenüber Gefrier Auftau Behandlung stabil, das heißt, der CaII Faktor weist Kalziumeinstrominhibierungsaktivität auf, nachdem er einer Gefrier Auftau Behandlung unterworfen wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Inhibieren des Einstroms in polymorphonucleare Leukozyten bereit, welches die Verabreichung eines CaII Faktors an die Leukozyten enthält.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Diagramm, welches die Inhibierung auf den Einstrom von Ca⁺⁺ nach der Stimulierung mit fMLP und Zusatz von freien Ca⁺⁺ in das Medium wiedergibt. Die gereinigte Milchfraktion, die durch eine 10 kDa Ausschlussmembran hindurchgeht, wird als „Filtrat" bezeichnet: Die Fraktion des „Filtrats", die durch eine 1 kDa Ausschlussmembrane zurückgehalten wird, wird als „Konzentrat" („Conc.") bezeichnet. Die „Aqu.Conc." (alternativ dazu hierin auch „mkII" bezeichnet) wurde durch Extraktion der „Conc." Fraktion mit einer Chloroform/Methanol Mischung und Sammeln der wässrigen Phase hergestellt.
2 zeigt ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Skopoletinuntersuchung nach Stimulation mit fMLP wiedergibt. Das „Filtrat", „Konzentrat" („Conc.") und „Aqu.Conc." sind dieselben Komponenten der gereinigten Milch, wie sie in der Beschreibung der 1 genannt sind. In dieser Untersuchung ist der Verlust an Skopoletinfluoreszenz ein Indikator für H₂O₂ Produktion von PMN.
3 zeigt ein Diagramm, welches die Wirkungen von menschlicher Milch und „Konzentrat" („Conc.") auf PMN Aggregationsreaktionen nach Stimulation mit fMLP wiedergibt. „Conc." ist dieselbe gereinigte Milchkomponente, wie sie in der Beschreibung zu 1 genannt ist.
4 zeigt ein Diagramm, welches die Wirkungen von „Filtrat" und „Konzentrat" („Conc.") auf PMN Bewegungsfähigkeit (entweder unstimuliert oder stimuliert mit fMLP oder aktiviertem Serum) wiedergibt. „Filtrat" und „Conc." sind dieselben Komponenten der gereinigten Milch, wie sie in der Beschreibung der 1 genannt sind.
Detaillierte Beschreibung
Diese Anmeldung bezieht sich auf die Isolation und/oder Reinigung eines Faktors aus menschlicher Milch, der in der Lage ist, den Einstrom von Kalzium in PMN zu inhibieren.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „geklärte menschliche Milch" eine menschliche Milch, die im Wesentlichen von zellularen Debris und Fettkügelchen befreit ist, zum Beispiel durch Zentrifugation und/oder Filtration.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Entzündung" eine lokalisierte Schutzreaktion, die durch eine Verletzung und/oder Zerstörung von Gewebe hervorgerufen wurde und dazu dient, einen schädlichen Wirkstoff und/oder geschädigtes Gewebe zu zerstören, zu verdünnen oder abzuschirmen, und welche in der akuten Form mit klassischen Folgen von Schmerz, Hitzen, Rötung, Schwellen und Funktionsverlust charakterisiert ist. Entzündung involviert histologisch eine Serie von Vorgängen, einschließlich Erweiterung der Arteriolen, Kapillaren und Venulen mit erhöhter Durchlässigkeit und Blutfluss, Exsudation von Fluids einschließlich Plasmaproteine, und Leukozytenmigration in den Entzündungsherd.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „polymorphonukleare Leukozyten" (oder „PMN") eine repräsentative Klasse von weißen Blutzellen, die alternativ dazu auch Granulozyten, die Neutrophile, Eosinophile u d Basophile umfassen, genannt werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „HBSSw" Hanks Ausgewogene Salzlösung, ergänzt mit 10 mM MgCl₂ und 10 mM CaCl₂.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „HBSSw/o" Hanks Ausgewogene Salzlösung, ohne 10 mM MgCl₂ und 10 mM CaCl₂.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „fMLP" ein Peptid mit der Sequenz Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Kalzium-Einstrom" die Verlagerung von Kalzium von dem äußeren Medium in eine Zelle.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „freies Kalzium" intrazellulares Kalzium, welches in dem Cytosol vorhanden ist und nicht innerhalb intrazellulärer Vesikel, wie dem endoplasmatischen Retikulum, zurückgehalten wird.
Ein passendes Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Faktors aus geklärter menschlicher Milch weist die folgenden Schritte auf:

1. Dialysieren der geklärten menschlichen Milch durch eine 10 kDa Dialysemembran und Sammeln des Dialysats („Filtrats") als eine erste Fraktion, z.B. mittels einer übernacht dauernde Dialyse der geklärten menschlichen Milch gegen Phosphat gepufferte Salzlösung („PBS") durch eine 10 kDa Dialysemembran;
2. Dialysieren der ersten Fraktion durch eine 1 kDa Dialysemembran und Sammeln des Retentats („Konzentrat") als eine zweite Fraktion, z.B. mittels absorptiver Dialyse/Konzentration der ersten Fraktion über eine 1 kDa Ausschlussmembran;
3. Extrahieren der zweiten Fraktion mit einem organischen Lösungsmittel (wie eine Mischung aus Chloroform und Methanol) und Sammeln der daraus folgenden wässrigen Phase („wässriges Konzentrat").

Die Gegenwart und die relative Menge an CaII Faktor in einer gegebenen Fraktion kann durch Ausführung einer Kalzium-Einstrom Untersuchung bestimmt werden. Die Konzentration an freiem Kalzium („freies Ca⁺⁺") durch Verwendung einer Fura 2 Sonde (Molekular Probes, Eugene, OR) gemessen werden. PMN, wie Neutrophile, können wie bei Boyum, A., „Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood, „Scand. J. Clin. Invest., 97:77–89 (1968) beschrieben isoliert werden. Die PMN oder Neutrophilen, 5 × 10⁶ PMN in HBSSw/o, können mit Fura 2 durch Aussetzen an 2 μM Fura-2AM (die Methylesterform von Fura 2) für 45 min. bei 37,5°C, 5% CO₂, in völliger Dunkelheit markiert werden. Nach der Markierung können die Zellen durch Pelletieren der Zellen und Resuspendieren der Zellen in einem 15 ml Volumen von HSSBw/o gewaschen werden. Die Konzentration der Zellen kann dann wieder auf 10 × 10⁶/ml in HSSBw (mit 10 mM Ca⁺⁺ und 10 mM Mg⁺⁺) eingestellt werden und die Emission der Fura 2 Sonde innerhalb der Zellen kann in einem LS50B Spektrofluorometer (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) bei Erregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm und bei einer Emissionswellenlänge von 510 nm geprüft werden. Wenn die Fura 2 Sonde intrazellulares freies Ca⁺⁺ bindet, emittiert sie eine höhere Lichtintensität wenn sie bei 340 nm als bei 380 nm erregt wird. Diese unterschiedliche Emission wenn die Sonde intrazellulares freies Ca⁺⁺ bindet erlaubt es dem Forscher die Menge an freiem Ca⁺⁺ durch Verwendung der Gleichung: Freies Ca++Conc. = Kd((R – Rmin)/(Rmax – R))Qzu berechnen, worin R das Verhältnis der 340/380-nm Fluoreszenz unter den bestimmten Testbedingungen, R_max das Verhältnis von 340/380-nm Fluoreszenz der Zellen ist, die mit 0,1% Triton X-100 behandelt wurden, R_min das Verhältnis von 340/380-nm Fluoreszenz der Zellen ist, die mit 0,1% Triton X-100 und 20 mM EGTA behandelt wurden, „Q" ist das Verhältnis der 380-nm Fluoreszenz unter Ca⁺⁺-freien/Ca⁺⁺-gesättigten Bedingungen, und K_d ist die Dissoziationskonstante für Ca⁺⁺ Bindung an Fura 2 (K_d = 145 nM basierend auf Kalibrierkurven). Folgend auf die Agoniststimulation, wie Behandlung von PMN mit 1 μM fMLP, können die errechneten Werte an freiem Ca⁺⁺ verwendet werden, um eine Kurve von freien Ca⁺⁺ gegen die Zeit zu erstellen, und der Bereich unter dieser Kurve ist indikativ für die Reaktion des freien Ca⁺⁺ auf den Agonisten.
Die „CaII Aktivität" in einer gegebenen Fraktion kann gemessen werden durch (1) Behandeln von PMNs mit der gereinigten Fraktion aus menschlicher Milch; (2) Stimulieren der PMNs mit einem Agonisten, wie fMLP; (3) Zusetzen von 10 mM CaCl₂ zu dem Zellmedium etwa 30 Sekunden nach Stimulation mit fMLP; und (4) Messen des Anstieges, oder diesen Fehlens, von intrazellularem freiem Ca⁺⁺ gegen die Zeit als Vergleich zu unbehandelten Zellen nach Zusatz von externem CaCl₂. CaII Aktivität ist definiert als Aktivität, welche den Bereich unter der Kurve des intrazellularen Ca⁺⁺ gegen die Zeit im Vergleich zu unbehandelten Zellen nach dem Zusatz von 10 mM CaCl₂ zum externen Medium vermindert. Nach der Stimulierung mit einem Agonisten zeigen PMNs einen vorübergehenden Anstieg an intrazellularer freier Ca⁺⁺ Konzentration, welche dann allmählich abnimmt (1). Nach Zusatz von externem Ca⁺⁺ steigt die Konzentration an intrazellularem freiem Ca⁺⁺ wieder an, ausgenommen dort, wo die Fraktionen eine CaII Aktivität aufweisenden Fraktion enthalten (1).
Reinigung des Faktors
Das vorliegende Verfahren zur Herstellung eines gereinigten CaII Faktors aus menschlicher Milch wird durch Bezugnahme auf die nachfolgende Beschreibung erläutert. Diese Beschreibung ist vorgesehen zu erläutern, aber nicht um den Umfang der Erfindung, die darin dargelegt ist, zu beschränken.
Proben voll entwickelter menschlicher Milch wurden von Müttern mehr als vier Tage nach der Geburt des Kindes durch Entleerung der Brust durch manuelles Ausdrücken oder durch elektrische Brustpumpen gesammelt. Nach dem Sammeln wurde jede Probe bei Kühlschranktemperatur gelagert und innerhalb von drei Stunden in das Labor transportiert. Nach der Ankunft im Labor wurden die Milchproben einer Zentrifugation (380 × g, 10 min, 4°C) unterworfen und der zellfreie, den Rahm und die wässrige Phase enthaltende Überstand wurde gesammelt, wiedervereinigt und bei –70°C bis zur Verwendung gelagert. Vor dem experimentellen Gebrauch wurden die menschlichen Milchproben aufgetaut und einer Zentrifugation (14.000 × g, 25 min, Raumtemperatur) unter Verwendung einer Tisch-Mikrozentrifuge unterworfen, um wieder eine wässrige Phase bereitzustellen („geklärte menschliche Milch").
Die geklärte Milch wurde dann gegen PBS entweder durch eine 10 kDa Ausschlussmembran oder einer 3,5 kDa Ausschlussmembran dialysiert. Das Dialysat („Filtrat") wurde gesammelt und „konzentriert" durch eine zweite Dialyse gegen PBS durch eine 1 kDa Ausschlussmembran und Sammeln des Retentats („Konzentrat"). Das Konzentrat kann dann mit einer Mischung aus Chloroform/Methanol extrahiert werden und die wässrige Fraktion („wässriges Konzentrat") wird gesammelt. Nach der Extraktion wird eine solche wässrige Fraktion („Aq.Conc.") CaII Aktivität beibehalten (siehe 1). Der resultierende gereinigte Faktor hat im Wesentlichen keinen Proteingehalt (wie durch Lowry-Untersuchung ermittelbar) und seine CaII Aktivität ist gegen Proteinase K resistent. Aussetzen einem organischen Lösungsmittel während des Extraktionsschrittes scheint keinen wesentlichen Effekt auf die CaII Aktivität des Faktors zu haben, z.B. keine CaII Aktivität besitzende Komponente von der Aq.Conc. scheint Aktivität während der Denaturierung als Folge des Aussetzens dem organischen Lösungsmittel zu verlieren.
Wie durch die in 2 gezeigten Ergebnisse der Skopoletinuntersuchung dargelegt, erzeugten dem „Filtrat" ausgesetzte PMN nach Stimulation mit fMLP Wasserstoffperoxid („H₂O₂"), wie es durch den Verlust von Skopoletin Fluoreszenz bewiesen wurde. Im Gegensatz dazu führt das Aussetzen von fMLP stimulierten PMN entweder dem „Konzentrat" („Conc.") oder dem „Aqu.Conc." nicht zum Verlust der Skopoletin Fluoreszenz, was Fehlen der H₂O₂ Produktion durch diesen Fraktionen ausgesetzten PMN anzeigt.
Charakterisierung des Faktors
Der gereinigte CaII Faktor hat abhängig von der im ersten Dialyseschritt eingesetzten Membran ein scheinbares Molekulargewicht von entweder 1–10 kDa (das heißt, der Faktor wird durch eine 10 kDa Dialysemembran nicht zurückgehalten, aber wird durch eine 1 kDa Dialysemembran zurückgehalten) oder 1–3,5 kDa (das heißt, der Faktor wird durch eine 3,5 kDa Dialysemembran nicht zurückgehalten, aber wird durch eine 1 kDa Dialysemembran zurückgehalten). Der Faktor partitioniert sich zu der wässrigen Phase bei der Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie einer Chloroform/Methanol Mischung. Der Faktor bindet nicht fest an kationische oder anionische Harze, z.B. der gegenwärtige CaII Faktor bindet nicht an Heparin Sepharose oder Dowex Harz.
Der CaII Faktor inhibiert den Kalzium Einstrom in PMN, nachdem PMN mit einem Agonisten stimuliert wurde, wie dies durch die Verminderung des Bereiches unter der Kurve der Konzentration von intrazellularem freiem Ca⁺⁺ gegen die Zeit für behandelte Zellen relativ zu unbehandelten Zellen (siehe z.B. 1) gemessen wird. Wie durch die in 3 bzw. 4 gezeigten Resultate dargelegt, ist der CaII Faktor in der Lage die Aggregation von dem fMLP ausgesetzten PMN und die Beweglichkeit von entweder mit fMLP oder mit aktiviertem Serum stimulierten PMN zu inhibieren. Während von unfraktionierter menschlicher Milch berichtet wird, dass sie das Anhaften von PMN auf Oberflächen von Gewebekulturplatten vermindert, hat der vorliegende CaII Faktor keine Wirkung auf das Anhaften von PMN (Resultat nicht gezeigt).
Die in der Folge dargelegte Vorgangsweise kann angewendet werden, um (a) die intrazellulare Kalziumkonzentration in PMN zu bestimmen; (b) die Wirkung der Milchfraktionen auf das Abbauen von Oberflächenrezeptoren durch PMN zu bestimmen; (c) die Wirkung von Milchfraktionen auf die Form von fMLP ausgesetzten PMN zu untersuchen; (d) die Wirkung der Milchfraktionen auf das Anhaften von PMN an Gewebekulturplattenvertiefungen zu untersuchen; und (e) die Wirkung von Milchfraktionen auf die Aggregation von fMLP ausgesetzten PMN zu bestimmen.
PMN Reinigung und Herstellung
PMN wurden aus hepariniertem, von erwachsenen freiwilligen Spendern erhaltenem Blut unter Verwendung eines Hypaque-Ficoll/Dextran Sedimentationsverfahrens gereinigt. Die resultierenden Zellpräparate (typischerweise > 95% PMN) wurden auf 10⁷ Zellen/ml in Hanks Ausgewogener Salzlösung mit Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ (HBSSw) eingestellt und in den Experimenten wie beschrieben verwendet.
Serum- und Plasma-Herstellung
Serumproben wurden aus 6 frischen Blutproben hergestellt, die 30 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen gelassen, aufgeschüttelt, 30–60 Minuten auf Eis gehalten, um eine Gerinnungsrückstellung zu ermöglichen, sedimentiert (500 × g, 10 Minuten, 4°C) wurden, und das Serum wurde entfernt und bis zur Verwendung bei –20°C gefroren. Plasmaproben wurden aus 6 unterschiedlichen heparinierten Blutproben durch Sedimentierung (500 × g, 10 Minuten, 4°C), Filtrierung des plättchenreichen Plasmas durch 0,4 μ Filter zur Entfernung von verunreinigenden Plättchen hergestellt und dann bei –20°C bis zur Verwendung gelagert.
Intrazellulare Ca⁺⁺ Messungen in PMN:
Gereinigte PMN wurden in Hanks Ausgewogene Salzlösung ohne Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ (HBSSw/o) überführt, auf 5 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, und mit 2 μM Fura 2-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) für 45 Minuten bei 37°C, 5% CO₂ wie früher (8) beschrieben, kombiniert. Nach Fura 2 Markierung wurden die Zellen zweimal (15 HBSSw/o) gewaschen, auf 10⁷/ml in HBSSw eingestellt und in ein LS-50B Spektrofluorometer (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) mit einer Erregungswellenlänge von 340 bis 380 nm und einer Emissionswellenlänge von 510 nm eingesetzt. Nach der Stabilisierung der Fluoreszenzmesswerte wurde 0–9% Milch zu den Zellen zugesetzt und deren Reaktion aufgezeichnet. Danach wurde 1 μM fMLP zugesetzt und die resultierenden Änderungen der Fluoreszenzemission wurden kontinuierlich aufgezeichnet. Für 10%, 50% und 100% Milchexposition prüfende Experimente wurden Fura 2 markierte Zellen in entsprechend verdünnter Milch resuspendiert, 10 Minuten auf 37°C gehalten, zweimal gewaschen, auf 10⁷/ml in HBSSw eingestellt und in das Spektrofluorometer eingesetzt. Nach der Äquilibrierung auf einen stabilen Grundwert wurde 1 μM fMLP zu den Zellen zugesetzt und ihre Fluoreszenzemission wurde kontinuierlich über die Zeit aufgezeichnet. Intrazellulare freie Ca⁺⁺ Konzentrationen wurden wie vorstehend beschrieben berechnet, und zwar mit R_max und R_min für jede Experimentbedingung basierend auf der Fluoreszenz, die nach der Lysis der Zellen mit 0,1% Triton × 100 zur Berechnung von R_max und Chelatierung von Ca⁺⁺ mit 20 mM EGTA zu Berechnung von R_min beobachtet wurde. Der plötzliche Anstieg und langsame Abfall der Konzentration an intrazellularem freiem Ca⁺⁺ (Übergangs Ca⁺⁺), der nach Formylpeptid- oder Milchexposition auftrat, wurde durch Messen der Differenz zwischen dem Grundspiegel von intrazellularem freiem Ca⁺⁺ und der maximalen Höhe, erreicht nach fMLP Zugabe, quantifiziert. In Experimenten, die die Wirkung von mehrfachem Milchzusatz auf fMLP mobilisierte intrazellulare Ca⁺⁺ Lager untersuchten, waren auf 0–4 aufeinander folgende Zugaben von 3% Milch zu der Fluorometerküvette von einer fMLP Zugabe gefolgt, wonach die Höhe des fMLP-induzierten Übergangs Ca⁺⁺ wie oben gemessen und als Prozentsatz der Kontroll-(keine vorherige Milchzugabe) fMLP-induzierten Übergangshöhe ausgedrückt wurde.
Oberflächenrezeptorabbauuntersuchung
Gereinigte PMN (10⁷) wurden in 0,5 ml Aliquots von Milch/HBSSw Lösungen resuspendiert und bei 37°C 10 Minuten gehalten. Milchkontrollen enthielten identischen Aliquots verdünnter Milch (ohne zugesetzt Zellen), und Plasmakontrollen waren Plasmaverdünnungen ± zugesetzte Zellen. Nach Inkubierung wurden die Zellen sedimentiert (5 Minuten, 14.000 × g, Raumtemperatur), und diese Überstände und deren korrespondierenden Milchverdünnungen wurden entfernt und bis zum Testen auf –70°C gefroren. Zur Quantifizierung des Rezeptorabbaues wurden die Proben (mit und ohne Zellen) auf ihren Gehalt an sTNFRI und sTNFRII durch EASIA (Medgenix Inc, Fleures, Belgien) und ihren Gehalt an sIL-1RII durch ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) geprüft. Die Unterschiede an löslichem Cytokinrezeptorengehalt zwischen den Proben mit und ohne zugesetzten Zellen wurden als die Mengen des Cytokinrezeptorabbaus während Milch-, gereinigtem Faktor-, oder Plasma-Exposition angenommen. Die Experimente können unter Verwendung von 2 unterschiedlichen Proben mit jedem PMN Präparat oder einem unterschiedlichen PMN Präparat je Probe ausgeführt werden.
Formänderungsuntersuchung
Gereinigte PMN wurden auf 2 × 10⁷ Zellen/ml eingestellt und HBSSw, 1 μM fMLP, Milch, Milchfraktionen, oder Serumverdünnungen ausgesetzt und 5 Minuten bei 37°C gehalten. Nach Inkubierung wurden die Zellen fixiert (Formalin 10 Vol./Vol.-%, 25°C, 30 Minuten) sedimentiert, aus dem Formalin entnommen und in kalter HBSSw auf 10⁷ Zellen/ml resupendiert. Fünf 4 μl Zellsuspension wurde 1:1 Kristallviolett in Wasser kombiniert, unter ein Deckplättchen gegeben und unter Verwendung eines Olympus BH2 invertierten Mikroskops untersucht. Mikroskopische Bilder der Zellen wurden digital aufgenommen (400x, Connectix Color QuickCam, Connectix, San Mateo, CA), als Grautondokument gespeichert und in die Bildanalysesoftware (SigmaScan Pro, Jandel Scientific, San Rafael, CA) importiert, um die Haupt- und die Nebenachsenlänge (in Pixel) aller in dem digitalen Bild festgehaltenen Zellen zu messen. Aus diesen Messungen wurde das Verhältnis Hauptachse:Nebenachse für jede Zelle berechnet (für runde Zellen ist das Verhältnis Hauptachse:Nebenachse = 1). Ein Minimum von 25 Bildern (54–120 Einzelzellen) wurden von jeder experimentellen Bedingung gesammelt und gemessen, die Daten zusammengefasst, und das mittlere Achsenverhältnis als Maß der Zellform für jede geprüfte Probe genommen. Diese Mittelwerte für die gleichen Verdünnungen jeder Probe wurden gemittelt und die resultierenden Werte wurden als Maß der Zellform in den entsprechenden Probenverdünnungsbedingungen genommen.
PMN Anhaftungsuntersuchungen:
Gereinigte PMN (5 × 10⁶/ml in HBSSw) in 1 ml Aliquots wurden mit Milch oder Milchfraktionen kombiniert, um eine endgültige Probenkonzentration von 0% bis 50% in 2 ml zu erzielen. Halbe Milliliter Volumina von diesen Zellsuspensionen wurden in Doppelvertiefungen auf 24 Vertiefungen-Gewebekulturplatten eingebracht und 20 ng/ml (endgültig) Phorbol Myristat Acetat (PMA) wurde einer der Doppelvertiefung zugesetzt. Die Kulturplatten wurden bei 30°C, 5% CO₂, für 15 Minuten gehalten, dann wurde jede Vertiefung sanft × 2 gewaschen mit HBSSw, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen, von der Flüssigkeit getrennt, und danach wurde 0,5 ml HTAB Puffer, (0,5% Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromid in 50 mM Kaliumphosphat, pH 6,0) jeder Vertiefung zugesetzt (25°C, 15 Minuten), um anhaftende Zellen zu lösen. Nach der Inkubierung wurde der HTAB Puffer entfernt und bis zur Prüfung der Peroxidaseaktivität auf –70°C gefroren. Um die Untersuchung zu kalibrieren, wurde ein Aliquot von 2,5 × 10⁶ PMN sedimentiert, das Zellpellet in HTAB Puffer gelöst und die Peroxidasaktivität dieser Probe herangezogen, um die in 2,5 × 10⁶ vorliegende Aktivität zu repräsentieren. Für Peroxidasaktivitätsbestimmungen wurden HTAB Pufferüberstände aufgetaut, 0,1 ml wurde mit 2,9 ml Untersuchungspuffer (0,167 mg O-dianisodin HCl/ml und 0,0005% H₂O₂ in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0) und die Ausbildung der Braunfärbung wurde bei OD₄₆₀ unter Verwendung eines Lambda-6 Spektrophotometers (Perkin Elmer Cetus, Norwalk CT) verfolgt. Die Ablesung der Farbintensität wurde alle 10 Sekunden 90 Sekunden hindurch aufgezeichnet, und die ΔOD₄₆₀ über die letzten 60 Sekunden wurden als Maß für die Peroxidasaktivität in der Probe herangezogen. Die beobachtete ΔOD₄₆₀ für jede experimentelle Probe wurde durch die ΔOD₄₆₀ dividiert, die mit dem Standard beobachtet wurde, der 2,5 × 10⁶ Zellen repräsentiert, um die Daten in den Prozentsatz der an den Kunststoff unter jeder Bedingung anhaftenden Zellen umzuwandeln.
PMG Aggregationsuntersuchung
Frisch gereinigte PMN (2 × 10⁷/ml in HBSSw) wurden 1:1 mit Milch oder einer Milchfraktion kombiniert, um die gewünschte Endkonzentration der Probe zu erhalten, und in ein Chrono-Log Modell 560 Plättchen Aggregometer bei 37°C mit kontinuierlichem Rühren mit 500 U/min eingesetzt. Von einem Experiment zum Nächsten wurde die Reihenfolge, in welcher die verschiedenen Probenkonzentrationen überprüft werden, umgekehrt, um systematische Artifakte auf Grund der Zellalterung während jedes Experiments zu vermeiden. Während der Temperaturäqulibrierung wurden die oberen und die unteren Grenzen der Lichttransmission auf 8 × 10⁶ bzw. 10 × 10⁸ Zellen/ml festgelegt, und fMLP (1 μM endgültig) wurde der Zellsuspension zugesetzt um Aggregation zu induzieren. Die Lichttransmission der aggregierenden Zellen wurde 3 Minuten nach der fMLP Zugabe aufgezeichnet, und der ausgedruckte Aggregationskurvenverlauf wurde unter Verwendung eines Flachbettscanners in ein digitales Bild umgewandelt. Die resultierenden Bilder wurden analysiert (SigmaScan Pro, Jandel Scientific, San Rafael, CA) um den 3 Minuten Bereich unter der Aggregationskurve (in pixel²) als Maß für die Aggregationsreaktion unter jeder Bedingung zu quantifizieren. Kontrollexperimente, die die Wirkung von 1%, 4%, 10%, 25% und 50% Serum auf PMN Aggregationsreaktionen auf 1 μM fMLP prüfen, zeigten, dass keine dieser Serumkonzentrationen irgendeine unterdrückende Wirkung auf die PMN Aggregation hatten.
Die Erfindung wurde unter Bezugnahme auf verschiedne spezifische und illustrative Ausführungen und Techniken beschrieben. Allerdings sollte dies verstanden werden, dass viele Variationen und Modifikationen vorgenommen werden können, während derer innerhalb des Geistes und des Umfangs der Erfindung verblieben wird.
Querverweis zu anderen Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US Provisional Application Serial No. 60/322,057, die am 12. September 2001 eingereicht wurde, wobei deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.

Claims

Verfahren zum Reinigen eines Faktors, der von geklärter menschlicher Milch abgeleitet ist, welches aufweist: (i) Isolieren einer ersten Fraktion der geklärten menschlichen Milch, wobei besagte erste Fraktion Komponenten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von nicht weniger als etwa 1 kDa und nicht mehr als etwa 10 kDa enthält; (ii) Entfernen von Lipid-löslichen Komponenten von der besagten ersten Fraktion, um eine zweite Fraktion bereitzustellen, die eine Komponente enthält, die eine Kalzium-Einstrom-inhibierende Aktivität zeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagte Kalzium-Einstrom-inhibierende Aktivität weiters aus besagter zweiter Fraktion durch Isolieren des Faktors basierend auf Hydrophobizität gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Entfernen der Lipid-löslichen Komponenten das Extrahieren der ersten Fraktion mit einem organischen Lösungsmittel und Zurückhalten der wässrigen Phase aufweist.
Verfahren zum Reinigen eines von menschlicher Milch abgeleiteten Faktors, welcher, welches aufweist: (i) Dialysieren der geklärten menschlichen Milch durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa, um ein Dialysat als eine erste Fraktion bereitzustellen; (ii) Dialysieren besagter ersten Fraktion durch eine Membran mit einer Ausschlussgrenze von 1 kDa, um ein Retentat als eine zweite Fraktion zu isolieren; (iii) Extrahieren der besagten zweiten Fraktion mit einem Lösungsmittel, welches in der Lage ist, die Lipid-löslichen Komponenten zu lösen, um eine dritte Fraktion zu ergeben, die eine Komponente enthält, die eine Kalzium-Einstrom-inhibierende Aktivität zeigt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die besagte Kalzium-Einstrom-inhibierende Aktivität weiters aus besagter dritter Fraktion durch Isolieren des Faktors basierend auf Hydrophobizität gereinigt wird.
Ein aus humaner Milch stammender gereinigter Faktor der durch ein Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüchen hergestellt ist.
Ein aus humaner Milch stammender gereinigter Faktor: wobei besagter Faktor ein scheinbares Molekulargewicht von nicht weniger als etwa 1 kDa und nicht mehr als etwa 10 kDa aufweist; besagter Faktor in einer wässrigen Lösung löslich ist und im Wesentlichen frei von Lipid-löslichem Material ist; und besagter Faktor eine Kalzium-Einstrom-inhibierende Aktivität zeigt.
Faktor nach Anspruch 7, wobei besagter Faktor gegenüber einer Wärmebehandlung für 10 Minuten bei 100°C resistent ist.
Faktor nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei besagter Faktor gegenüber einer Ansäuerung auf pH 2 für 10 Minuten bei 60°C resistent ist.
Faktor nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei besagter Faktor gegenüber einer Alkanisierung auf pH 12 für 10 Minuten bei 25°C resistent ist.
Faktor nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei besagter Faktor gegenüber einer Behandlung mit Proteinase K bei 1 μg/ml für 10 Minuten bei 37°C resistent ist
Faktor nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei besagter Faktor gegenüber einer Gefrier/Auftau-Behandlung stabil ist.
Faktor nach einem der Ansprüche 7 bis 12, wobei besagter Faktor keine positive Antwort in einer Lowry-Untersuchung erzeugt.
Faktor nach einem der Ansprüche 7 bis 13, wobei besagter Faktor ein scheinbares Molekulargewicht von nicht mehr als etwa 3,5 kDa aufweist.
In vitro Verfahren zum Inhibieren des Einstroms von Kalzium in polymorphonukleäre Leukozyten, welches das Verabreichen eins Faktors nach Anspruch 6 aufweist.
Verwendung eines Faktors nach einem der Ansprüche 6 bis 14 bei der Herstellung eines Medikamentes für das Verringern einer entzündlichen Reaktion, die durch den Einstrom von Kalzium in polymorphonukleäre Leukozyten entsteht.