ES2205111T3

ES2205111T3 - Uso de una proteina bactericida/potenciadora de la permeabilidad o analogos biologicamente activos de la misma para tratar infecciones gram negativas asociadas con lipopolisacaridos.

Info

Publication number: ES2205111T3
Application number: ES97118279T
Authority: ES
Inventors: Marian N. Marra; Randal W. Scott
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1990-02-14
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2010-02-14
Also published as: EP0460058B1; WO1990009183A1; ATE246933T1; ATE169820T1; DE69034096T2; CA2048619A1; JPH04506510A; DE69032579T2; US5089274A; EP0460058A4; CA2048619C; DE69032579D1; EP0841064A1; AU647734B2; JP2966923B2; AU5170690A; DE69034096D1; IL93360A; KR0160133B1; ES2122958T3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN METODO PARA INHIBIR LA ESTIMULACION DE CELULAS MEDIADA POR LIPOPOLISACARIDOS (LPS). ESTE METODO COMPRENDE PONER EN CONTACTO LAS CELULAS, EN PRESENCIA DE UNA CANTIDAD ESTIMULADORA DE CELULAS DE LIPOPOLISACARIDO, CON UNA PROTEINA BACTERICIDA/AUMENTADORA DE LA PERMEABILIDAD (BPI) EN UNA CANTIDAD EFECTIVA PARA INHIBIR LA ESTIMULACION CELULAR.

Description

Uso de una proteína bastericida/potenciadora de la permeabilidad o análogos biológicamente activos de la misma para tratar infecciones gram negativas asociadas con lipopolisacáridos.

Antecedentes de la invención

Las infecciones por gram-negativos son una causa importante de morbilidad y mortalidad especialmente en pacientes hospitalizados e inmunodeprimidos. [Duma, R.J., Am. J. of Med., 78 (Supl. 6A): 154-164 (1985); y Kreger, B.E., D.E. Craven y W.R. McCabe, Am. J. Med., 68: 344-355 (1980)].

Aunque los antibióticos disponibles son efectivos para contener la infección, no sirven de nada para neutralizar los efectos patofisiológicos asociados con el lipopolisacárido (LPS). El LPS, o endotoxina, es un componente importante de la membrana externa de las bacterias gram-negativas y se libera cuando los organismos son lisados. [Ahenep, J.L. y K.A. Morgan, J. Infect. Dis., 150 (3): 380-388 (1984)].

El LPS liberado durante la terapia con antibióticos es un potente estimulador de la respuesta inflamatoria. Muchos efectos perjudiciales del LPS in vivo se producen como consecuencia de mediadores solubles liberados por células inflamatorias. [Morrison D.C. y R.J. Ulevich, Am. J. Pathol., 93 (2): 527-617 (1978)]. El LPS induce la liberación de mediadores por las células inflamatorias del huésped lo que puede finalmente dar como resultado coagulación intravascular diseminada (DIC), síndrome de disfunción respiratoria del adulto (ARDS), insuficiencia renal y choque irreversible.

Los monocitos y los granulocitos neutrófilos tienen un papel clave en la defensa del huésped frente a infecciones bacterianas y también participan en la patología de la endotoxemia. Estas células ingieren y matan a los microorganismos intracelularmente y responden también al LPS in vivo e in vitro liberando proteínas solubles con efectos microbicidas, proteolíticos, opsónicos, pirógenos, activadores del complemento y lesionantes de tejidos. El factor de necrosis tumoral (TNF), una citoquina liberada por los monocitos estimulados por LPS, imita algunos de los efectos tóxicos del LPS in vivo. Inyectar TNF a animales provoca fiebre, choque y alteraciones en el metabolismo de la glucosa. El TNF es también un potente estimulador de los neutrófilos.

El LPS soluble produce una reducción de la quimiotaxis de los neutrófilos, un aumento de la adhesividad, una elevada actividad de la derivación de la hexosa monofosfato y producción de radicales del O_{2}, una regulación creciente de los receptores de superficie para el complemento, y la liberación de proteínas de los gránulos al medio circundante. [Morrison y Ulevich (1978)].

Tanto el compartimento específico como el azurófilo se desgranulan en respuesta al LPS. [Bannatyne, R.M., N.M. Harnett, K.Y. Lee y W.D. Rigger, J. Infect. Dis., 156 (4): 469-474 (1977)]. Las proteínas azurófilas liberadas en respuesta al LPS pueden ser tanto perjudiciales como beneficiosas para el huésped. La elastasa de los neutrófilos produce degradación de los inhibidores de proteasas responsables de suprimir la cascada de la coagulación. Esto da lugar a coagulopatías tales como la coagulación intravascular diseminada, una consecuencia potencialmente letal de la endotoxemia. Los gránulos azurófilos también contienen moléculas bactericidas tales como la mieloperoxidasa y el Factor Bactericida/Incrementador de la Permeabilidad (BPI).

El BPI de conejo fue primeramente descubierto en 1975. [Weiss, J., R.C. Franson, S., Becherdite, K. Schmeidler y P. Elsbach, J. Clin. Invest., 55: 33 (1975)]. El BPI fue aislado de neutrófilos humanos en 1978. [Weiss, J., P. Elsbach, I. Olson y H. Odeberg, J. Biol. Chem., 253 (8): 2664-2672 (1978)].

En 1984 se aisló de neutrófilos humanos una proteína de 57 kD con propiedades similares. [Shafer, W.M., C.E. Martin y J.K. Spitznagel, Infect. Immun., 45: 29 (1984)]. Esta proteína es idéntica al BPI en la composición de los aminoácidos de la secuencia N-terminal, el peso molecular y la fuente. Sin embargo, los autores no pudieron reproducir el procedimiento de aislamiento cromatográfico utilizado por Elsbach et al. y Weiss et al.

El BPI humano es una proteína de 57 kD que se une a la membrana externa de bacterias gram-negativas susceptibles. [Weiss et al., (1978) y Marra et al., J. Immunology, 144 (2): 662-666 (1990)]. El hecho de que el BPI es una proteína que se une al Lípido A queda evidenciado porque: (1) las cepas rugosas de bacterias son más sensibles a las actividades del BPI tanto bactericidas como de aumento de la permeabilidad [Weiss, J., M. Hutzler y L. Kao, Infect. Immun., 51: 594 (1986)]; (2) las mutaciones en el Lípido A producen una menor unión y aumentan la resistencia a la actividad bactericida tanto de la polimixina B como del BPI [Farley, M.M., W.M. Shafer y J.K. Spitznagel, Infect. Immun., 56:1589 (1988)]; (3) el BPI compite con la polimixina B por la unión a S. typhimurium [Farley, 1988]; (4) el BPI tiene homología de secuencia e inmunoreactividad cruzada con otra proteína que se une al LPS, la Proteína que se une al Lipopolisacárido (LBP). Los complejos LBP-LPS han mostrado estimular la explosión oxidativa en neutrófilos en respuesta a péptidos formilados. La lipoproteína de alta densidad (HDL), otra proteína que se une al LPS, encontrada en el suero humano formando complejos con el LPS, no muestra el efecto estimulador sobre neutrófilos. La unión al BPI rompe la estructura del LPS, altera la permeabilidad microbiana a pequeñas moléculas hidrófobas y produce muerte celular (Weiss et al., 1978 y Weiss et al., J. Immunology 132 (6):3109-3115, 1984). El BPI mata bacterias en condiciones fisiológicas de pH y fuerza iónica in vitro, lo que indica que puede ser activo in vivo fuera del ambiente de bajo pH del fagolisosoma. Todas las actividades bactericidas y de aumento de la permeabilidad del BPI están presentes en el fragmento N-terminal de 25 kD de la proteína. [Ooi, C.E., J. Weiss, P. Elsbach, B. Frangione y B. Marrion, J. Biol. Chem., 262: 14891 (1987)]. Antes de la presente invención, sin embargo, se entendía que los efectos beneficiosos del BPI se limitan a sus efectos bactericidas.

A pesar de las mejoras en la terapia con antibióticos, la morbilidad y la mortalidad asociadas con la endotoxemia siguen siendo altas. Los antibióticos solos no son efectivos para neutralizar los efectos tóxicos del LPS. Por lo tanto, surge la necesidad de una terapia adjunta con actividad directa neutralizante del LPS. Los métodos actuales para el tratamiento de la endotoxemia emplean antibióticos y cuidados de apoyo. La mayor parte de las terapias adjuntas tratan síntomas del choque endotóxico tales como la baja presión sanguínea y la fiebre pero no inactivan la endotoxina. Otras terapias inhiben las respuestas inflamatorias del huésped frente al LPS. Tal como se indica más adelante, las terapias actuales tienen limitaciones importantes debido a la toxicidad, la inmunogenicidad, o la eficacia irreproducible entre los modelos animales y los estudios en humanos.

La polimixina B es un antibiótico básico polipeptídico que se ha demostrado que se une a, y rompe estructuralmente, el componente más tóxico y biológicamente activo de la endotoxina, el Lípido A. Se ha demostrado que la polimixina B inhibe la activación por LPS de la liberación de gránulos de los neutrófilos in vitro y es un tratamiento efectivo para la sepsis por gram-negativos en humanos. Sin embargo, debido a su toxicidad sistémica, este fármaco tiene un uso limitado excepto como agente tópico.

Se ha demostrado que la terapia de combinación usando antibióticos y altas dosis de succinato sódico de metilprednisolona (MPSS) previene la muerte en un modelo experimental de sepsis por gram-negativos que utilizaba perros. Otro estudio que utilizaba MPSS con antibióticos en un estudio clínico multicéntrico doble ciego y controlado con placebo en 223 pacientes con signos clínicos de sepsis sistémica concluyó que la mortalidad no era significativamente diferente entre los grupos del tratamiento y del placebo. Además, los investigadores encontraron que la resolución de la infección secundaria en 14 días era significativamente mayor en el grupo del placebo.

Una aproximación relativamente nueva al tratamiento de la endotoxemia es la inmunización pasiva con anticuerpos neutralizantes de la endotoxina. Se ha demostrado que la inmunoglobulina humana hiperinmune frente a E. coli J5 reduce la mortalidad en pacientes con bacteriemia gram-negativa y choque en un 50%. Otros grupos han mostrado resultados prometedores en modelos animales usando anticuerpos monoclonales de ratón, quiméricos y humanos. Aunque los anticuerpos monoclonales tienen ventajas sobre los sueros hiperinmunes, por ejemplo una potencia más consistente del fármaco y una menor transmisión de patógenos humanos, existen aún muchos problemas asociados con la administración de inmunoglobulina para neutralizar el LPS. Las respuestas del huésped a las inmunoglobulinas mismas pueden dar lugar a hipersensibilidad. La lesión tisular después de la activación del complemento y del depósito de complejos inmunes es otra preocupación en el uso de terapias que implican anticuerpos antiendotoxina en pacientes sépticos. Además, las inmunoglobulinas son moléculas grandes, especialmente las IgM pentaméricas actualmente en estudios clínicos, y son rápidamente eliminadas por el sistema reticuloendotelial, disminuyendo la semivida del fármaco.

Las endotoxinas provocan respuestas que son beneficiosas así como dañinas para el huésped. La endotoxemia induce la producción por el hígado de proteínas que se unen al LPS y provoca la liberación de proteínas microbicidas por los leucocitos. En estudios de los solicitantes de las proteínas de los neutrófilos implicadas en la defensa del huésped, se ha determinado que una de estas proteínas, la BPI, no sólo es un potente agente microbicida in vitro, sino que también interfiere con la capacidad del LPS para estimular a los neutrófilos. Concretamente, se ha demostrado que la BPI se une al LPS soluble y neutraliza su capacidad para activar neutrófilos. De acuerdo con esto, esta invención proporciona un método terapéutico para el tratamiento de la toxicidad del LPS en la septicemia provocada por gram-negativos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para inhibir la estimulación de células mediada por lipopolisacárido (LPS). Esto implica poner en contacto las células, en presencia de una cantidad de lipopolisacárido estimulante de las células, con Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) en una cantidad efectiva para inhibir la estimulación de las células.

De esta forma, la presente invención puede ayudar en el tratamiento de una infección por bacterias gram-negativas. Por ejemplo, esto puede implicar poner en contacto la infección bacteriana con BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la estimulación de células mediada por LPS y con ello tratar la infección bacteriana.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona el uso de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad pirógena de una endotoxina en un ser humano.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la producción por células mononucleares humanas mediada por lipopolisacárido del factor de necrosis tumoral en un ser humano.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de la Proteína Bactericida/Incrementa-
dora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la estimulación de células mediada por una endotoxina en un ser humano.

También está proporcionado por la presente invención el uso de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o inhibir un trastorno que es un choque relacionado con endotoxinas, coagulación intravascular diseminada relacionada con endotoxinas, anemia relacionada con endotoxinas, leucopenia relacionada con endotoxinas, trombocitopenia relacionada con endotoxinas, síndrome de disfunción respiratoria del adulto relacionado con endotoxinas, o insuficiencia renal relacionada con endotoxinas, trastorno que está asociado con la presencia de una endotoxina en un ser humano.

Además está proporcionado por la presente invención el uso de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para tratar la endotoxemia asociada con la presencia de endotoxina en un ser humano.

Adicionalmente está proporcionado por la presente invención el uso de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir la endotoxemia asociada con la presencia de endotoxina en un ser humano susceptible de padecer el trastorno.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para aislar y recuperar Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada que comprende:

(a) obtener una muestra en bruto de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad;

(b) separar la muestra en bruto mediante HPLC en fase inversa;

(c) recoger cada pico;

(d) secar cada pico en presencia de BSA baja en endotoxina;

(e) volver a secar cada pico en presencia de ácido acético al 0,1% libre de pirógenos; y

(f) aislar y recuperar la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) purificada.

En la presente memoria está descrita una composición para el tratamiento de una infección por bacterias gram-negativas. Esta composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la estimulación de células mediada por LPS y un vehículo adecuado.

También está descrito un método para tratar a un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas provocado por una infección por bacterias gram-negativas que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por gram-negativos y tratar al sujeto de forma que se alivie el choque relacionado con endotoxinas.

Además, está descrito un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno que implica una coagulación intravascular diseminada. El método comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para aliviar los síntomas de la coagulación intravascular diseminada y con ello tratar al sujeto.

Además, está descrito un método para tratar a un sujeto que padece endotoxemia provocada por una infección por gram-negativos que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto que padece endotoxemia.

Tal como se utiliza en la presente memoria endotoxemia significa un estado en el que la sangre contiene productos venenosos, ya sean los producidos por las células del cuerpo o los que resultan de microorganismos, es decir, bacterias gram-negativas.

También está descrito un método para tratar a un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas provocada por una infección por bacterias gram-negativas, que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la anemia relacionada con endotoxinas.

Además está descrito un método para tratar a un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas provocada por una infección por bacterias gram-negativas. El método comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la leucopenia relacionada con endotoxinas. Además, está descrito un método para tratar a un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas provocada por una infección por bacterias gram-negativas que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la trombocitopenia relacionada con endotoxinas.

También está descrito un método para inhibir un pirógeno que comprende poner en contacto el pirógeno con una cantidad de BPI de forma que se inhiba el pirógeno.

Más aún, se describe un método para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral que comprende poner en contacto las células en presencia de una cantidad de lipopolisacárido estimulante de las células, con BPI en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral.

También está descrito un método para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral que comprende poner en contacto las bacterias gram-negativas con BPI en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por gram-negativos de factor de necrosis tumoral.

Más aún, se describe una composición para el tratamiento de un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas y un vehículo adecuado.

Además, se describe una composición para el tratamiento de un sujeto que padece coagulación intravascular diseminada. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece coagulación intravascular diseminada y un vehículo adecuado.

También se describe una composición para el tratamiento de un sujeto que padece endotoxemia que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece endotoxemia y un vehículo adecuado.

Adicionalmente está descrita una composición para el tratamiento de un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado.

Adicionalmente, se describe una composición para el tratamiento de un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado. Además está descrita una composición para el tratamiento de un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado.

Tal como se utiliza en la presente memoria la leucopenia relacionada con endotoxinas es un estado asociado con una infección por bacterias gram-negativas, cuya manifestación es una disminución por debajo de lo normal del número de leucocitos en la sangre periférica. Más aún, tal como se utiliza en la presente memoria la trombocitopenia relacionada con endotoxinas es un estado asociado con una infección por bacterias gram-negativas, cuya manifestación es una disminución por debajo de lo normal del número de trombocitos.

También, se describe una composición para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral y un vehículo adecuado. Más aún, se describe una composición para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral y un vehículo adecuado.

En la presente memoria está descrita una composición para inhibir un pirógeno. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir un pirógeno.

Adicionalmente, está descrito un método para prevenir un síntoma asociado con una infección por bacterias gram-negativas en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad efectiva para prevenir la infección por bacterias gram-negativas y con ello prevenir los síntomas.

Más aún, también está descrito un método para prevenir en un sujeto un trastorno que implica una coagulación intravascular diseminada que comprende administrar al sujeto una cantidad de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad efectiva para prevenir los síntomas de la coagulación intravascular diseminada y con ello prevenir el trastorno.

Finalmente, se describe un método para aislar y recuperar Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada que comprende: (a) obtener una muestra en bruto de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad; y (b) separar la muestra en bruto mediante cromatografía en columna utilizando soluciones despirogenadas, aislando y recuperando con ello Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada.

Breve descripción de las figuras

Figura 1a: Se midió la intensidad media de la fluorescencia del CR1 en neutrófilos recién aislados mediante el análisis con un FACS. Las células fueron estimuladas con dosis variables de LPS de E. coli 0111:B4 según se describe en Materiales y Métodos. Como la intensidad media de la fluorescencia varía entre individuos, los datos se expresan como porcentaje de la respuesta máxima observada. Los datos mostrados representan la media \pm el Error Estándar de tres experimentos.

Figura 1b: Se preincubó LPS (10 ng/ml) de 0111:B4 con dosis variables de extracto azurófilo en bruto durante 30 minutos a 37ºC antes de estudiar la estimulación de neutrófilos. Los datos mostrados representan la media \pm el Error Estándar de duplicados de un experimento representativo. Los valores se expresan como % de inhibición de la respuesta al LPS solo.

Figura 2: Se separó el extracto azurófilo en bruto por HPLC en fase inversa. Se recogió cada pico manualmente y se determinaron las concentraciones de proteína mediante análisis de aminoácidos. Se secó una alícuota (1 \mug) de cada pico en presencia de BSA baja en endotoxina, se volvió a secar después en presencia de ácido acético al 0,1% libre de pirógenos. Los datos mostrados representan la media \pm el Error Estándar de duplicados de un experimento representativo.

Figura 3a: Se sometió a HPLC en fase inversa BPI purificada por exclusión por tamaño seguida de HPLC de intercambio catiónico y se estudiaron las fracciones en cuanto a la actividad inhibitoria del LPS.

Figura 3b: Los datos muestran el perfil de RPLC del material purificado 2X junto con la actividad inhibitoria y el análisis mediante PAGE en SDS de las fracciones 20, 21 y 22.

Figura 4: Se preincubó LPS (10 ng/ml) de 0111:B4 con dosis variables de (A) BPI purificada y (B) polimixina B, luego se estudiaron en cuanto a la actividad estimuladora de neutrófilos. Los resultados de dos experimentos muestran la inhibición de la expresión de los receptores del complemento en neutrófilos con los Errores Estándar para las muestras con réplica.

Figura 5: (a) Un gráfico de barras que ilustra la expresión de BPI en la superficie de neutrófilos estimulados con FMLP, TNF, y LPS. (b) Un gráfico de barras que ilustra la regulación creciente máxima de la expresión del CR3 en la superficie de células neutrófilas humanas.

Figura 6: Un gráfico de barras que ilustra que la BPI y la polimixina B inhibían más de un 70% de la respuesta de los neutrófilos al LPS en el tiempo=0.

Figura 7: Un gráfico que ilustra que la BPI inhibe la actividad del LPS en el ensayo del LAL.

Figura 8: Un cromatograma que muestra un extracto de gránulos azurófilos fraccionado mediante HPLC de intercambio catiónico (etapa 1); la línea discontinua representa la actividad inhibitoria del LPS y la línea continua representa la absorbancia de las proteínas.

Figura 9: Un cromatograma que muestra un extracto de gránulos azurófilos fraccionado mediante HPLC de intercambio catiónico (etapa 2); la línea discontinua representa la actividad inhibitoria del LPS y la línea continua representa la absorbancia de las proteínas.

Figura 10: Un cromatograma que muestra un extracto de gránulos azurófilos fraccionado mediante HPLC de exclusión por tamaño (etapa 3); la línea discontinua representa la actividad inhibitoria del LPS y la línea continua representa la absorbancia de las proteínas.

Figura 11: Un gel de SDS-PAGE del extracto de gránulos azurófilos, del extracto precipitado, y de las reuniones de las fracciones de las tres etapas cromatográficas.

Figura 12: Análisis de BPI purificada mediante HPLC en fase inversa en una columna de diámetro interior microscópico ("microbore") en el que se identifica un solo pico principal que representa un 97% de la proteína total.

Figura 13: Un gráfico lineal que ilustra la inhibición por BPI de la respuesta de los neutrófilos a 10 ng/ml de LPS.

Figura 14: Un gráfico lineal que muestra que la BPI se une directamente al LPS.

Figura 15: Un gráfico lineal que muestra que la unión de la BPI a LPS inmovilizado era inhibida por la polimixina B.

Figura 16: Un gráfico lineal que muestra que la BPI se une al LPS en presencia de plasma.

Figura 17: Un gráfico lineal que muestra que la BPI se une al LPS en presencia de suero.

Figura 18: Un gráfico de barras que muestra que la BPI modula la respuesta pirógena al LPS.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método para inhibir la estimulación de células mediada por lipopolisacárido (LPS). Este método comprende poner en contacto las células, en presencia de una cantidad de lipopolisacárido estimulante de las células, con BPI en una cantidad efectiva para inhibir la estimulación de las células.

La cantidad de BPI efectiva para inhibir la estimulación de las células variará de acuerdo con las condiciones presentes. La cantidad efectiva para inhibir la estimulación de las células es preferiblemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 mg, siendo la cantidad que más se prefiere de 10 \mug a 10 mg.

Los neutrófilos y los monocitos son las células de mayor importancia con respecto a la aplicación de la presente invención. Sin embargo, otras células tales como las células endoteliales son afectadas también por el LPS y pueden ser utilizadas en esta invención.

En la realización preferida se utiliza BPI purificada. La BPI comprende también la BPI recombinante y los polipéptidos análogos suyos biológicamente activos. Un análogo adecuado de la BPI consiste en un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y que corresponde a la secuencia N-terminal de aminoácidos de la BPI.

Tal como se utiliza en la presente memoria un polipéptido biológicamente activo análogo de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad significa un polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que, y la actividad biológica de, la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad nativa o presente en la naturaleza.

La invención puede ser útil en un método para tratar una infección por bacterias gram-negativas. Este método comprende poner en contacto la infección bacteriana con BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la estimulación de células mediada por LPS y tratar con ello la infección bacteriana.

Estaría claro para un experto en la técnica que la infección por bacterias gram-negativas incluye la sepsis por gram-negativos, la infección nosocomial más común que causa la muerte. En general, la sepsis por gram-negativos es un estado tóxico febril grave que se produce como consecuencia de la infección con microorganismos piógenos, con o sin septicemia.

La infección por bacterias gram-negativas puede estar asociada con un choque endotóxico o con un estado inflamatorio. El estado inflamatorio puede estar, por ejemplo, asociado con coagulación intravascular diseminada (DIC), síndrome de disfunción respiratoria del adulto (ARDS) o insuficiencia renal.

De acuerdo con la invención, la infección por bacterias gram-negativas está presente en un ser humano.

Preferiblemente, la BPI o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Vehículo farmacéuticamente aceptable incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar tales como solución estéril, comprimidos, comprimidos revestidos y cápsulas. Típicamente tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, gelatina, ácido esténsico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles, u otros excipientes conocidos. Tales vehículos pueden incluir también aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que contienen tales vehículos son formuladas mediante métodos convencionales bien conocidos. Sin embargo, la composición que contiene BPI o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para suprimir la estimulación de neutrófilos o monocitos mediada por LPS es desconocida con anterioridad.

En este método, la administración de la composición puede efectuarse por cualquiera de los métodos bien conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, la administración oral, intravenosa, intramuscular, y subcutánea.

En la práctica de esta invención la cantidad de BPI o de un polipéptido análogo suyo biológicamente activo incorporada a la composición puede variar ampliamente. Los métodos para determinar la cantidad precisa son bien conocidos para los expertos en la técnica y dependen entre otros del sujeto que se esté tratando, del vehículo farmacéutico específico y de la vía de administración que se estén empleando, y de la frecuencia con la que haya que administrar la composición.

La presente invención puede ser útil adicionalmente en un método para tratar a un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas provocado por una infección por bacterias gram-negativas que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por gram-negativos y tratar al sujeto de forma que se alivie el choque relacionado con endotoxinas. Las endotoxinas, tal como se utiliza en la presente memoria, son sustancias que contienen complejos de lipopolisacáridos que se encuentran en las paredes celulares de los microorganismos, principalmente las bacterias gram-negativas.

Además, la invención puede ser útil en un método para tratar a un sujeto que padece un trastorno que implica una coagulación intravascular diseminada. El método comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para aliviar los síntomas de la coagulación intravascular diseminada y tratar con ello al sujeto. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión coagulación intravascular diseminada es un trastorno complejo de los mecanismos de coagulación, en el que los factores de coagulación son consumidos a un ritmo acelerado, con deposición generalizada de fibrina y trombosis, hemorragias y agotamiento adicional de los factores de coagulación. Más aún, la coagulación intravascular diseminada puede ser aguda o crónica.

Además, la presente invención puede ser útil en un método para tratar a un sujeto que padece una endotoxemia provocada por una infección por gram-negativos que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto que padece endotoxemia.

Tal como se utiliza en la presente memoria endotoxemia significa un estado en el que la sangre contiene productos venenosos, ya sean los producidos por las células del cuerpo o los resultantes de microorganismos, es decir bacterias gram-negativas.

La invención puede ser también útil en un método para tratar a un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas provocada por una infección por bacterias gram-negativas que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección con bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la anemia relacionada con endotoxinas.

La presente invención puede además ser útil en un método para tratar a un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas provocada por una infección por bacterias gram-negativas. El método comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la leucopenia relacionada con endotoxinas. Además, la invención puede ser útil en un método para tratar a un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas provocada por una infección con bacterias gram-negativas que comprende administrar al sujeto una cantidad de BPI efectiva para combatir la infección por bacterias gram-negativas y tratar al sujeto de forma que se alivie la trombocitopenia relacionada con endotoxinas.

La invención puede ser también útil en un método para inhibir un pirógeno que comprende poner en contacto el pirógeno con una cantidad de BPI de forma que se inhiba el pirógeno. Tal como se utiliza en la presente memoria, un pirógeno es cualquier sustancia que produce fiebre; los pirógenos exógenos incluyen endotoxinas bacterianas, especialmente de bacterias gram-negativas; el pirógeno endógeno es una proteína termolábil derivada de células tales como leucocitos mononucleares que actúa sobre los centros cerebrales para producir fiebre.

Más aún, la invención puede ser útil en un método para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral que comprende poner en contacto las células en presencia de una cantidad de lipopolisacárido estimulante de las células, con BPI en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral.

La invención puede ser útil también en un método para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral que comprende poner en contacto las bacterias gram-negativas con BPI en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral.

La cantidad de BPI efectiva para inhibir la estimulación de las células variará de acuerdo con las condiciones presentes. La cantidad efectiva para inhibir la estimulación de las células es preferiblemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 mg, siendo la cantidad que más se prefiere de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 10 mg.

En los métodos antes descritos, la BPI comprende la BPI recombinante y los polipéptidos análogos suyos biológicamente activos. Más aún, el polipéptido biológicamente activo análogo de la BPI consiste en un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y que corresponde a la secuencia N-terminal de aminoácidos de la BPI.

Más aún, la invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece un choque relacionado con endotoxinas y un vehículo adecuado.

Además, la invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece coagulación intravascular diseminada. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece coagulación intravascular diseminada y un vehículo adecuado.

\newpage

La invención se puede llevar a cabo también por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece endotoxemia que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece endotoxemia y un vehículo adecuado.

La invención se puede llevar a cabo adicionalmente por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece anemia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado.

Adicionalmente, la invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece leucopenia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado.

La invención se puede llevar a cabo adicionalmente por medio de una composición para el tratamiento de un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para tratar a un sujeto que padece trombocitopenia relacionada con endotoxinas y un vehículo adecuado.

También, la invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral y un vehículo adecuado. Más aún, la invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral que contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir la producción por las células mediada por bacterias gram-negativas de factor de necrosis tumoral y un vehículo adecuado.

La invención se puede llevar a cabo por medio de una composición para inhibir un pirógeno. La composición contiene BPI purificada o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo en una cantidad efectiva para inhibir un pirógeno.

Adicionalmente, la invención puede ser útil en un método para prevenir un estado asociado con una infección por bacterias gram-negativas en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad efectiva para prevenir la infección por bacterias gram-negativas y prevenir con ello el estado. En el método previamente descrito, el estado es cualquiera de los estados seleccionados del grupo que consiste en choque relacionado con endotoxinas, endotoxemia, anemia relacionada con endotoxinas, leucopenia relacionada con endotoxinas, o trombocitopenia relacionada con endotoxinas.

Más aún, la invención puede ser útil en un método para prevenir en un sujeto un trastorno que implica una coagulación intravascular diseminada que comprende administrar al sujeto una cantidad de Proteína Bactericida/Incrementa-
dora de la Permeabilidad efectiva para prevenir los síntomas de la coagulación intravascular diseminada y con ello prevenir el trastorno.

Finalmente, en la presente invención está descrito un método para aislar y recuperar Proteína Bactericida/Incremen-
tadora de la Permeabilidad purificada que comprende: (a) obtener una muestra en bruto de Proteína Bactericida/Incre-
mentadora de la Permeabilidad; y (b) separar la muestra en bruto mediante cromatografía en columna utilizando soluciones despirogenadas aislando y recuperando con ello Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada. Aún más, en este método la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad comprende la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad nativa o un polipéptido análogo suyo biológicamente activo. Además, el polipéptido biológicamente activo análogo de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad consiste en un polipéptido que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y que corresponde a la secuencia N-terminal de aminoácidos de la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad. Los autores de la invención han encontrado que el nivel de actividad biológica de la BPI varía dependiendo del método usado para obtener BPI. Parece que la BPI despirogenada, es decir, la BPI aislada y recuperada por el método antes descrito usando soluciones despirogenadas, muestra un nivel mucho más elevado de actividad biológica que la BPI que contiene pirógenos (Tabla 5 y Figura 4A).

Esta invención se ilustra en las secciones de Detalles Experimentales y Resultados que se dan a continuación.

Detalles experimentales Ejemplo 1 Materiales y métodos Reactivos

Se compró lipopolisacárido de E. coli 0111:B4, S. typhimurium tipo silvestre, glicolípido de S. typhimurium mutante RE, y Lípido A de S. typhimurium mutante RE, y LPS de P. aeruginosa a RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT; Fmet-Leu-Phe (FMLP) y Sulfato de Polimixina B a Sigma Chemical Co., San Luis, MO; Solución Salina Equilibrada de Hank sin calcio, magnesio y rojo fenol (HBSS) a Hazelton Research Products, Denver, PA; Ficoll-Paque, Percoll y Macrodex a Pharmacia Inc., Piscataway, NJ; TNF y anti-TNF a Endogen, Boston, MA; IgG de cabra anti-ratón conjugada con fluoresceína a TAGO Inc., Burlingame, CA; anticuerpo control IgG1 a Coulter Immunology, Hialeah, FL; anti-CR3 (Leu-15) conjugado con ficoeritrina (PE) y IgG2a control a Becton Dickinson, Mountain View, CA; el anticuerpo monoclonal anti-CR1, Yz-1, fue una amable donación del Dr. Rick Jack de la Universidad de Harvard.

Aislamiento y extracción de gránulos azurófilos

Se aislaron granulocitos de capas leuco-plaquetarias ("buffy coats") obtenidas de bancos locales de sangre. Las capas leuco-plaquetarias fueron diluidas 3-4X en HBSS y se separaron los granulocitos de las células mononucleares por centrifugación a través de Percoll al 64%. Se sometió el sedimento a diisopropilfluorofosfato (DFP), se lavó y se resuspendió en tampón de lisis enfriado con hielo (PIPES 10 mM, pH 6,8, KCl 100 mM, NaCl 3 mM, MgCl_{2} 3,5 mM) y se rompió mediante cavitación con nitrógeno (Parr Instrument Co., Moline, IL). Los gránulos azurófilos fueron aislados en gradientes discontinuos de Percoll según describe Borregaard. [Borregaard, N., J.M. Heiple, E.R. Simons y R.A. Clark, J. Cell. Biol., 97: 52-61 (1983)]. Se recogieron los gránulos azurófilos y se separó el Percoll por centrifugación a 180.000 X G durante 2 horas. Los gránulos se lisaron mediante 4 ciclos de congelación-descongelación, seguidos de 1 minuto de tratamiento con ultrasonidos. Los gránulos lisados se extrajeron en un volumen igual de glicina 100 mM, pH 2 agitando en un vórtex de forma intermitente durante 1 hora a temperatura ambiente. El extracto ácido se aclaró por centrifugación a 30.000 X G durante 20 minutos y a 200.000 X G durante 30 minutos.

Aislamiento de neutrófilos

Se sacó sangre venosa a donantes voluntarios sanos pasándola a anticoagulante de ácido, citrato y dextrosa y se colocó inmediatamente en hielo. Se mezclaron 5 partes de sangre con 1 parte de Macrodex frío, y se dejó sedimentar durante 1,5 - 2 horas a 4ºC. Se lavó el plasma rico en leucocitos 1X en HBSS frío, se resuspendió después en HBSS y se depositó sobre Ficoll-Paque. Si había presencia de una contaminación significativa con eritrocitos, se sometió el sobrenadante de granulocitos a lisis hipotónica. Las células fueron lavadas 2X en HBSS y resuspendidas en HBSS + 2% de plasma autólogo para dar una concentración final de granulocitos de 1 X 10^{6}/ml en la mezcla de incubación.

Purificación de BPI

Se separaron por tamaño aproximadamente 2 mg de extracto en bruto de gránulos azurófilos en una columna de exclusión por tamaño de alto rendimiento Biosil (TSK-250) (7,8 mm x 600 mm) usando tampón de glicina 50 mM y NaCl 100 mM, pH 2,0, en condiciones isocráticas, a un caudal de 1 ml/min. Las fracciones de la columna con la mayor actividad inhibitoria de LPS contenían una gran proporción de la especie de 54 kD según se muestra por PAGE en SDS. Se reunieron estas fracciones de TSK y se hicieron pasar por una columna de intercambio de cationes débiles Aquapore (WCX) (2,1 mm X 30 mm) usando citrato 50 mM, pH 5,5, y se eluyó en un gradiente de 0-75%, de citrato 50 mM y NaCl 1 M (Tampón B) en 25 minutos, luego 75-100% de Tampón B en 5 minutos con un caudal de 200 ml/min. Se recuperó del intercambio catiónico un material de 57 kD y apareció como una sola banda en la PAGE en SDS. En algunos experimentos se volvió a purificar la BPI por HPLC en fase inversa en una columna Vydac C4 cargada durante 12 minutos en CH_{3}CN al 0,1% más TFA al 0,1%, en 30 minutos con un caudal de 200 ml/min (Rainin Instruments, Emeryville, CA).

Estimulación de neutrófilos

Se mantuvieron en hielo neutrófilos aislados hasta incubarlos con y sin estímulos a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación, las células fueron lavadas en un gran volumen de PBS frío + Azida de Na al 0,05% + plasma autólogo al 2%. Se dividieron los sedimentos en dos, uno teñido con 50 \mul de anticuerpo IgG1 control (20 \mug/1x10^{6} células), el otro con 50 \mul de anti-CR1 a 20 \mug/1x10^{6} células durante 30 minutos a 0ºC. Después de esta incubación las células fueron lavadas 2X con PBS + plasma autólogo, tenidas luego con IgG de cabra anti-ratón-FITC y, en algunos experimentos, 20 \mul de IgG2a-ficoeritrina (PE) en los pocillos control, y 20 \mul de Leu-15 PE en los pocillos de ensayo. Después de una incubación de 30 minutos a 0ºC y 2 lavados más, las células fueron analizadas por citometría de flujo en un citómetro de flujo FACStar de Becton Dickinson (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se midió la estimulación de los neutrófilos comparando la intensidad media de la fluorescencia de muestras que habían sido incubadas en HBSS + 2% de plasma autólogo solo (control) con las incubadas con LPS o LPS que había sido preincubado durante 30 minutos a 37ºC con BPI o polimixina B. Los datos se expresan como % de estimulación o % de inhibición y se calcularon utilizando la intensidad media de la fluorescencia (IF), en una escala logarítmica, según:

% Estimulación = [(Experimental-Control)/(Máxima-Control)] X 100

y

% Inhibición = 1-[(+Inhibidor)-(Control)]/[(-Inhibidor)-(Control)] X 100.

Análisis de aminoácidos

Se llevó a cabo una hidrólisis en fase de vapor de la BPI y una derivatización de aminoácidos usando una Estación de Trabajo Pico-tag (Waters, Milford, MA) y se llevó a cabo el análisis cromatográfico de los feniltiocarbamilaminoácidos en un MPLC 130 A de Applied Biosystems usando los Protocolos suministrados por el fabricante.

Análisis de secuencia

Se analizó la secuencia N-terminal de la BPI por degradación de Edman automatizada usando un secuenciador de pulsos de fase líquida 477A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se realizó el análisis en línea de los derivados de aminoácidos tipo feniltiohidantoína usando un cromatógrafo de líquidos Modelo 120A de Applied Biosystems.

Resultados

Los neutrófilos humanos pueden ser estimulados tanto in vivo como in vitro por el lipopolisacárido. Tras la activación, aumenta la expresión en superficie de los receptores del C3b y el C3bi (CR1 y CR3, respectivamente). Utilizando el Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS), se midió la intensidad de la fluorescencia de neutrófilos humanos recién aislados tras la estimulación con dosis crecientes de LPS de 0111:B4 (Figura 1a). Como la máxima estimulación comúnmente observada se produjo con o por encima de 10 ng/ml, los experimentos en los que se ensayaba la inhibición del LPS de 0111:B4 utilizaron 10 ng/ml como dosis estimuladora. Todos los experimentos fueron realizados por duplicado. En la mayoría de los experimentos, sólo se muestran los datos para el CR1 ya que los autores de la invención no observaron ninguna condición en la que la estimulación de los neutrófilos causara una regulación creciente del CR1 o del CR3 solos (M. Marra et al. (1990), J. Immunol. 144(2): 662-666).

Para determinar si las proteínas encontradas en los gránulos azurófilos de los neutrófilos podían interferir con la respuesta de los neutrófilos al LPS, se preincubaron extractos ácidos en bruto de gránulos azurófilos con LPS durante 30 minutos a 37ºC. Se estudió entonces la muestra en cuanto a su capacidad para estimular neutrófilos. La proteína azurófila (1 \mug/ml) podía bloquear de manera efectiva la estimulación de 1 X 10^{6} leucocitos polimorfonucleares (PMN)/ml por 10 ng/ml de LPS (Figura 1b). No se observó este efecto utilizando tampón de extracción de glicina preincubado con LPS, ni hubo ninguna estimulación de los neutrófilos usando el extracto en bruto o el tampón de glicina control (datos no mostrados).

Para investigar aún más cuál/cuáles de las proteínas del extracto era/eran responsable/s del efecto inhibitorio, se separaron extractos ácidos en bruto por HPLC en fase inversa; se estudió cada pico por separado en cuanto a la actividad inhibitoria del LPS. Se determinó previamente la identidad de cada uno de los picos usando una aproximación de purificación bidimensional que incluía una HPLC en fase inversa con una columna de diámetro interior microscópico en la primera dimensión, seguida de una PAGE en SDS, electrotransferencia y microsecuenciación. Las proteínas azurófilas pueden ser resueltas en 10 picos discretos cuyas identidades se muestran en la Tabla 1. Las secuencias de aminoácidos mostradas son de los primeros 15 aminoácidos del extremo amino.

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Proteínas derivadas de gránulos azurófilos

1

En la Figura 2 se muestra la actividad inhibitoria del LPS de 1 \mug de cada pico. Tal como se muestra, el pico 9 tenía la mayor actividad neutralizante del LPS. La especie proteica principal en este pico tiene identidad en el extremo amino con la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) descrita anteriormente (Weiss, J., P. Elsbach, I. Olsson y H. Odeberg, J. Biol. Chem., 253 (8): 2664-2672 (1978)). Se ha demostrado que la BPI contiene la mayor parte de la actividad bactericida sobre gram-negativos de los extractos proteicos de gránulos azurófilos. La catepsina G mostró alguna inhibición del LPS, pero los datos entre los experimentos no eran tan reproducibles como para el pico 9. Se ha demostrado que la catepsina G se une al LPS in vitro y mata a los organismos gram-negativos, aunque en menor grado que la BPI. Otras proteínas que han demostrado actividad microbicida frente a organismos gram-negativos son la elastasa y las defensinas. Sin embargo, estas proteínas (1 \mug/ml) no inhibían la actividad estimuladora del LPS sobre los neutrófilos.

\newpage

La actividad inhibitoria del LPS de los extractos en bruto de azurófilos fue caracterizada y purificada más aún usando cromatografía de exclusión por tamaño y de intercambio iónico seguida de cromatografía en fase inversa. La actividad inhibitoria del LPS comigra con una banda pura de 57 kD observada en la PAGE en SDS (Figura 3b).

Como el tampón usado en las separaciones por RPLC [CH_{3}CN y ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%] disminuye significativamente la actividad inhibitoria del LPS de la BPI (datos no mostrados) y, como el material purificado por cromatografía de intercambio iónico era de una alta pureza según se juzgó por PAGE en SDS, el material obtenido por exclusión por tamaño/intercambio iónico fue utilizado para generar una curva de dosis-respuesta (Figura 4a). Se muestran los datos de dos experimentos, cada uno realizado por duplicado. Se confirmó que este material purificado por exclusión por tamaño/intercambio iónico era BPI mediante el análisis de la secuencia N-terminal. Se determinó la concentración de proteína por análisis de aminoácidos.

Tal como se ve en la Figura 4a, se requieren aproximadamente 90 ng/ml de BPI para una inhibición máxima de la respuesta de los neutrófilos a 10 ng/ml de LPS de 0111/B4. La respuesta de los neutrófilos al péptido formulado (FMLP 10^{-7} M) no fue inhibida por la BPI (datos no mostrados).

La Figura 4b muestra una curva de dosis-respuesta similar para el antibiótico polipeptídico Polimixina B (PMB). La polimixina B se une al resto de Lípido A del LPS y neutraliza algunos de sus efectos tóxicos tanto in vivo como in vitro. Se ha demostrado que la polimixina B se une al LPS estequiométricamente (Morrison, D.C. y D.M. Jacobs, Immunochem., 13: 813-818 (1976)). La cantidad calculada de PMB requerida para inhibir 10 ng/ml de LPS liso es aproximadamente 0,67 nM. En los experimentos en cuestión, se requirieron 0,4 ng/ml, o 0,36 nM de polimixina B para inhibir completamente la estimulación de neutrófilos usando 10 ng/ml de LPS. Se requirieron 90 ng/ml, o 1,58 nM de BPI para un 100% de inhibición de 10 ng/ml de LPS. Por lo tanto, en una base molar, la cantidad de BPI requerida para inhibir la estimulación por LPS de neutrófilos in vitro fue aproximadamente 4X la cantidad requerida por la polimixina B.

Para estudiar si la BPI puede inhibir al LPS de otros organismos gram-negativos, se estudiaron moléculas de LPS con longitudes variables de la cadena del polisacárido y Lípido A en el sistema en cuestión frente a 90 ng/ml de BPI purificada 2X. Los datos mostrados en la Tabla 2 demuestran que aunque la dosis estimuladora puede variar entre estas moléculas, el LPS de quimiotipos tanto lisos como rugosos así como el Lípido A son todos ellos inhibidos por la BPI.

TABLA 2

2

\hskip0.7cm

*Baja a ninguna estimulación a esta concentración de endotoxina. Ejemplo 2 I. Estudios preliminares sobre la BPI de neutrófilos

Tal como se ha discutido con anterioridad, la proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) es una proteína catiónica de 50-60.000 de PM purificada por vez primera a partir de gránulos de neutrófilos humanos por Weiss et al. (Weiss, J., P. Elsbach, I. Olsson y H. Odegerg, 1978, J. Biol. Chem., 253: 2664). La BPI altera la permeabilidad de la membrana celular bacteriana y tiene actividad bactericida específicamente frente a organismos gram-negativos. Hasta la fecha, la literatura sobre la BPI ha estado exclusivamente enfocada hacia su actividad bactericida.

Los autores de la invención describen que la BPI se une al LPS e inhibe las respuestas tanto de neutrófilos como de monocitos al LPS soluble in vitro. La BPI inhibe también la actividad del LPS en el ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus. La investigación de los autores ha identificado la BPI como una molécula en la vanguardia del desarrollo de nuevas terapias frente al choque endotóxico.

En respuesta al LPS, los neutrófilos humanos regulan de forma creciente la expresión en la superficie celular de los receptores del complemento CR1 y CR3 (Figuras 1a y 5b). Para medir esta respuesta de los neutrófilos al LPS, los autores incubaron neutrófilos humanos recién aislados con LPS de E. coli 0111:B4 (Figura 4a), y mostraron que se observa la regulación creciente máxima del CR1 usando 10 ng/ml de LPS (Figura 4). La estimulación de neutrófilos con LPS no fue inhibida por anticuerpos anti-TNF exógenos, lo que sugiere que el LPS actuaba directamente sobre los neutrófilos en este sistema.

La BPI inhibe la respuesta de los neutrófilos al LPS (Figura 4a). La inhibición de la regulación creciente de los CR era completa a una dosis de aproximadamente 1,8-3,6 nM (100-200 ng/ml) de BPI, en comparación con los 0,4 nM de polimixina B requeridos para inhibir 10 ng/ml de LPS liso (aproximadamente un PM de 15.000 ) es aproximadamente 0,7 nM, lo que se halla en estrecha correspondencia con el valor observado de 0,4 nM. En una base molar, la cantidad de BPI requerida para inhibir el LPS era aproximadamente 5 veces mayor que la cantidad requerida por la polimixina B.

La BPI inhibe la estimulación de neutrófilos mediada por LPS pero no la estimulación por FMLP o TNF (Tabla 3). Estos datos demuestran que la BPI inhibe el LPS directamente y no altera los mecanismos de los neutrófilos implicados en la regulación creciente de los CR.

La neutralización del LPS por BPI se produjo rápidamente. Incluso sin preincubación, tanto la BPI (y la polimixina B) inhibieron más de un 70% de la respuesta de los neutrófilos al LPS (Figura 6). La inhibición máxima se vio después de sólo 5 minutos de preincubación.

La BPI inhibe la regulación creciente de los CR estimulada por LPS de cepas bacterianas lisas y rugosas, así como por lípido A (Tabla 4). Debido a la amplia gama de actividad de la BPI frente a estas formas diferentes de LPS, entre las cuales sólo el lípido A y el 2-ceto-3-desoxioctonato son determinantes compartidos, es probable que la inhibición del LPS por la BPI se efectúe a través del lípido A.

La BPI inhibe otras actividades mediadas por el LPS. A una concentración de aproximadamente 9 nM, o 500 ng/ml, la BPI inhibía significativamente la actividad del LPS en el ensayo del LAL (Figura 7). Cuando se añadieron LPS y BPI juntos sin preincubación no se observó ninguna inhibición (datos no mostrados), lo que indica que la BPI actuaba sobre el LPS, y no tenía ningún efecto sobre el sistema de ensayo del LAL. La BPI inhibe también la producción por las células mononucleares adherentes humanas mediada por LPS de TNF (Tabla 5).

TABLA 3 Efecto de la BPI sobre la estimulación de neutrófilos por diversos agentes

Inhibición de la regulación creciente de los CR en neutrófilos

3

Los neutrófilos fueron incubados con LPS de E. coli 0111:B4, FMLP o TNF preincubados en presencia o ausencia de BPI 2,7 nM. Los datos se dan como porcentaje de inhibición de la expresión del CR en respuesta a cada estímulo preincubado sólo con tampón.

\newpage

TABLA 4 Inhibición por BPI de la estimulación de neutrófilos inducida por LPS y Lípido A

Inhibición de la regulación creciente de los CR en neutrófilos

4

Los neutrófilos fueron estimulados con LPS y lípido A preincubados con y sin BPI purificada 2,7 nM. Los resultados se expresan como porcentaje de inhibición de la intensidad de la fluorescencia observada con cada tipo de LPS solo.

TABLA 5 La BPI inhibe la producción de TNF por monocitos humanos inducida por LPS

TNF (pg/ml) producido en respuesta a LPS preincubado con*:

5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 * El LPS de  E. coli  0111:B4 fue preincubado con BPI o
polimixina B (PMB),  luego añadido a células\cr  mononucleares
adherentes de sangre periférica. La producción de TNF fue ensayada
por
ELISA.\cr}

La BPI fue purificada por vez primera por Elsbach y Weiss en 1978. En los estudios iniciales de los autores de la invención se aisló BPI de extractos de gránulos azurófilos en una sola etapa por HPLC en fase inversa. La recuperación de actividad de la BPI de la fase inversa fue pobre, probablemente debido a las condiciones desnaturalizantes. Aquí se muestra la purificación de la actividad inhibitoria del LPS usando sólo etapas no desnaturalizantes y se demuestra que la mayor parte de la actividad procedente de neutrófilos comigra con la BPI. Las mejoras en la purificación han conducido también a un material de muy alta actividad específica según se mostrará en la siguiente sección.

Las Figuras 8-10 muestran las tres etapas cromatográficas empleadas actualmente en el laboratorio de los autores de la invención. La absorbancia se representa con la línea continua y la actividad inhibitoria del LPS con las líneas discontinuas. La Tabla 6 muestra la recuperación de actividad y proteína y la actividad específica, medida en unidades neutralizantes (UN) de LPS arbitrarias. Una unidad neutralizante es aquella cantidad de BPI que inhibe en un 50% 0,5 U.E. de LPS en la prueba del LAL. En la Figura 11 se muestra un gel de estas reuniones de SDS-PAGE teñido con Commassie. El análisis de la BPI purificada por HPLC en fase inversa en una columna de diámetro interior microscópico (Figura 12) identificó un único pico principal que representaba un 97% de la proteína total por integración. Un mapeo por digestión con tripsina de la BPI permitió a los autores secuenciar varios fragmentos de gran tamaño, que confirman aún más la identidad de la proteína. Se conoce la secuencia publicada para la BPI en toda su longitud (P.W. Gray et al. (1989), J. Biol. Chem., 264(16): 9505).

II. Purificación de BPI en condiciones rigurosamente libres de pirógenos Materiales y métodos

Reactivos: Se obtuvo agua de irrigación estéril de grado USP de Travenol Laboratories Inc., Deerfield IL; filtros Pyrosart de Sartorius GmbH, Alemania Occidental; Sefarosa-CM FF de Pharmacia, Upsala, Suecia; columna de HPLC de intercambio de cationes débiles de poliaspartamida (100 X 4,6 mm) del Nest Group, Southborough MA; glicina y columna de HPLC de exclusión por tamaño Bio-Sil G250 (600 X 7,5 mm) de Bio-Rad Laboratories, Richmond CA; geles de electroforesis de poliacrilamida de Novex, Encitas CA; reactivos y tampones de secuenciación y análisis de aminoácidos de Applied Biosystems Inc., Foster City, CA; ácido trifluoroacético, HCl de ebullición constante, patrón de aminoácidos hidrolizado, y reactivos del ensayo de proteínas del BCA de Peirce Chemical Co., Rockford, IL; ensayo del lisado de amebocitos de Limulus de Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD; lipopolisacárido de RIBI Immunochem Research, Inc., Hamilton, MT; acetonitrilo de grado de HPLC de J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, todos los demás tampones y sales usados eran de grado reactivo. Se preparó agua de 18 megaohmios de pureza por el sistema de agua ultrapura Lab Five de Technic, Seattle, WA. Se preparó NaOH 0,5 M para higienización a partir de lentejas de NaOH de grado reactivo y agua USP.

Extractos de gránulos de neutrófilos: Se prepararon según se ha descrito (Serie de EE.UU. Nº 199.206, presentada el 26 de Mayo de 1988), excepto por el hecho de que se omitió la separación por percoll de los gránulos azurófilos. En su lugar, se obtuvieron fracciones de gránulos completos centrifugando el sobrenadante postnuclear a 17.000 g durante 20 minutos. Se suspendió entonces el sedimento de gránulos en un volumen de 1 ml de glicina 50 mM, pH 2, por cada 4X10E8 células lisadas. Los gránulos resuspendidos fueron lisados mediante cinco ciclos de congelación/descongelación en etanol en hielo seco seguidos de agitación vigorosa durante una hora a 4 grados centígrados. El extracto soluble se obtuvo por centrifugación a 30.000 g durante 30 minutos.

Ensayo del lisado de amebocitos de Limulus: Se realizó según las directrices del fabricante. Cuando fue necesario se ajustó el pH de las muestras a neutralidad mediante la adición de tampón fosfato 0,5 M libre de pirógenos de pH 7,4, y se redujo la salinidad a <150 mM por dilución con agua USP.

Ensayo de neutralización del LPS: Se realizó según se ha descrito previamente (M. Marra et al. (1990), J. Immunol., 144(2): 662-666).

Fraccionamiento de extractos de gránulos con elevada concentración de sal: Se juntaron 200 mg de proteína extraída de diversas preparaciones y se mantuvieron en hielo. Se añadió 1 volumen de NaCl 5 M estéril por cada 4 volúmenes de extracto. Se hizo sedimentar el precipitado resultante por centrifugación a 20.000 g durante 20 minutos a 4ºC. Se preparó este sobrenadante para cromatografía en sefarosa CM diluyendo con 4 volúmenes de agua de irrigación USP y ajustando el pH con suficiente Tris 1 M pH 7,4 para dar una concentración final de 50 mM. Sólo se utilizaron sales y tampones de disoluciones concentradas de partida de preparación reciente, estériles y libres de pirógenos.

Cromatografía en sefarosa CM: Se empaquetó una columna XK-16 (Pharmacia) con suficiente resina para dar un volumen de lecho de 5 ml. Se instaló la columna en un FPLC en gradiente equipado con una bomba P1 para la carga de muestras. Antes de su uso, todas las superficies en contacto con la fase móvil fueron extensamente lavadas con NaOH 0,5 M. Se higienizó la columna lavándola a 0,2 ml/min con NaOH 0,5 M durante 4 h. Se volvió a equilibrar entonces la columna y se realizó una operación cromatográfica con un blanco. Se estudió la pirogenicidad en las fracciones de la operación con el blanco y en los eluyentes por medio del ensayo del LAL. Se cargó el extracto preparado a un caudal de 400 ml/h. Una vez cargada se lavó la columna con 2 a 3 veces el volumen de la columna de tampón de partida. Se mantuvo el extracto de gránulos en hielo durante la carga. Se realizó la operación cromatográfica a través de la columna a temperatura ambiente.

HPLC de intercambio de cationes débiles: Se realizó usando una bomba de gradiente ternario Eldex equipada con un inyector Rheodyne y un detector de U.V. modelo 111B de Gilson. Se lavaron las superficies humectables con NaOH 0,5 M seguida de un aclarado extensivo con agua USP para eliminar todas las trazas de base antes de instalar la columna. Se estudiaron las fracciones del blanco y los eluyentes en cuanto a su pirogenicidad como antes.

HPLC de permeación en gel: Se realizó con las mismas precauciones y equipo señalados para la HPLC de intercambio de cationes débiles.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: Se compraron a Novex geles con un gradiente de acrilamida del 8 al 16% y se trabajó con ellos según las especificaciones de los fabricantes.

Determinación de la secuencia proteica: Se utilizó para la degradación de Edmund automatizada un secuenciador de pulsos de fase líquida 477A de Applied Biosystems equipado con un analizador de PTH-aminoácidos 120A.

HPLC en fase inversa en columna de diámetro interior microscópico: Se preparó el material para la secuenciación de proteínas desalándolo en una columna de butilo Aquapore de 30 X 2,1 mm. El gradiente utilizado fue de B del 30 al 100% en 30 minutos a un caudal de 200 ml/minuto. Los ajustes de los detectores fueron 214 nm de longitud de onda a 2,0 unidades de absorbancia de la escala completa (véase el inserto de la figura X). Se utilizó un HP 3396A para integrar y representar los datos.

Análisis de aminoácidos: Se llevó a cabo en el sistema descrito anteriormente usando la columna de PTC, los tampones y las condiciones de separación facilitados por ABI. La hidrólisis de la muestra y los derivados PTC fueron preparados usando una estación de trabajo Pico-Tag de la división de cromatografía Waters de Millipore utilizando los protocolos del fabricante.

Ensayos de proteínas: Se determinaron las concentraciones de proteínas usando las instrucciones 23230, 23225 del método del BCA de Peirce Chemical Co. Con objeto de minimizar la interferencia del tampón, las muestras se diluyeron 10 veces y se utilizó el protocolo de microrreactivos.

Resultados

Se demostró previamente que la BPI purificada de gránulos azurófilos inhibía la activación de neutrófilos por el LPS e inhibía el LPS directamente en el ensayo del LAL. Con objeto de definir aún más el papel de la BPI e investigar la presencia de otras moléculas similares en gránulos tanto azurófilos como específicos, los autores de la invención realizaron la purificación de la actividad inhibitoria del LPS a partir de gránulos completos extraídos a pH ácido. Estudios preliminares verificaron la presencia de actividad inhibitoria del LPS en el extracto en bruto.

Para identificar la actividad neutralizante de endotoxina los autores de la invención intentaron su purificación a partir de extractos de gránulos completos. La purificación de actividad neutralizante del LPS fue potenciada en gran medida por la observación de que altas concentraciones de NaCl (1 M) producían la precipitación reversible de aproximadamente un noventa por ciento de la proteína presente en el extracto de los gránulos. Esencialmente toda la actividad inhibitoria del LPS permanecía en el sobrenadante soluble. La fracción soluble fue entonces diluida, para reducir la fuerza iónica, y purificada más aún y concentrada por cromatografía de intercambio catiónico en sefarosa CM. Eluyó un pico de actividad ancho que a continuación fue purificado más aún usando una columna de intercambio catiónico de alto rendimiento de poliaspartamida. Se recuperó un pico de actividad algo más pronunciado que comigraba con una proteína importante de un peso molecular de aproximadamente 55.000 en la SDS-PAGE junto con varias proteínas de peso molecular inferior. Se utilizó HPLC de permeación en gel como etapa final de purificación y se identificó un pico de actividad que eluía con un solo pico pronunciado de proteína. La proteína purificada migraba en la SDS-PAGE como dos bandas estrechamente espaciadas a un peso molecular de 55.000. Se recuperó un 25% de la actividad neutralizante de endotoxina total con una purificación de 250 veces.

La proteína neutralizante de endotoxina purificada fue sometida a HPLC en fase inversa seguida del análisis de la secuencia N-terminal por degradación de Edman automatizada. La secuencia, mostrada en la figura 6, fue identificada como proteína bacteriana incrementadora de la permeabilidad en virtud de una completa homología a lo largo de 39 residuos. Además la composición de aminoácidos de la molécula purificada era virtualmente idéntica a la de la BPI (datos no mostrados).

Para investigar si ambas bandas estrechamente espaciadas eran BPI los autores de la invención sometieron las proteínas purificadas a análisis por transferencia tipo Western usando antisueros policlonales de conejo específicos para BPI producidos frente a un péptido sintético consistente en los aminoácidos 1-20 de la BPI. Ambas bandas eran inmunorreactivas. Las diferencias pueden surgir de la glicosilación.

III. Actividades de la BPI inhibitorias del LPS in vitro

La purificación de BPI en condiciones rigurosamente libres de pirógenos, según se describe en la sección II dio lugar a una preparación más potente de BPI según se muestra por la curva de dosis-respuesta de la Figura 13.

TABLA 6

6

La inhibición de la regulación creciente de los CR mediada por LPS era completa a 25 ng/ml de BPI, lo que representa un aumento de 4 veces en la actividad en comparación con el material utilizado en la sección I. En una base molar esta preparación de BPI inhibía al LPS en proporciones aproximadamente estequiométricas, equivalentes a concentraciones inhibitorias molares de polimixina B. La BPI inhibía también la producción por las células mononucleares adherentes humanas de TNF mediada por LPS a una concentración menor después de la purificación en condiciones libres de pirógenos (Tablas 7 y 8).

La BPI se une al LPS (Figura 14). En estos experimentos, se inmovilizaron 4 \mug de LPS/pocillo en placas de plástico de 96 pocillos, se incubaron después con concentraciones variables de BPI y se reveló con antisueros policlonales anti-BPI. La unión de BPI a LPS era inhibida por polimixina B (Figura 15), lo que demuestra la especificidad de la unión de la BPI. La BPI se une al LPS en presencia tanto de plasma (Figura 16) como de suero (Figura 17), lo que demuestra la eficacia potencial in vivo de la BPI.

TABLA 7 La BPI inhibe la producción de TNF por monocitos humanos inducida por LPS

TNF (pg/ml) producido en respuesta a LPS preincubado con*:

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 *El LPS de  E. coli  0111:B4 fue preincubado con BPI o
polimixina B (PMB), luego añadido a células\cr  mononucleares
adherentes de sangre
periférica.\cr}

La producción de TNF fue ensayada por ELISA.

\newpage

TABLA 8 Inhibición de la producción de TNF por monocitos humanos inducida por LPS

TNF (pg/ml) producido en respuesta a LPS preincubado con*:

8

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ *Se preincubaron BPI o sulfato de polimixina B con
0-10 ng/ml de LPS de   E. coli  0111:B4 o  0,1%
en  p/v\cr  \+ de     S. aureus     muerto y
se añadieron después a células mononucleares adherentes de sangre
periférica.  La\cr  \+ producción de TNF fue ensayada por
ELISA.\cr}

Ejemplo 3 Pirogenicidad de BPI/endotoxina

Etapa IA

Pirogenicidad del tampón de glicina

Se diluyeron en PBS (suministrado por Redwood City) hasta obtener 7 ml 305 \mul del tampón de glicina control (Redwood City) y se mezclaron en tubos de polipropileno (libres de pirógenos). Se marcó el tubo con la referencia #1990 y se estudió en un ensayo USP de Pirógenos en Conejo de tres conejos a una dosis de 2 ml/conejo (la dosis real de inyección era 2,1 ml/conejo).

El producto era no pirógeno; produjo una elevación total de la temperatura en los tres conejos de 0,4ºC.

Etapa IB

Pirogenicidad de 2 \mug de BPI

Se diluyeron 304 \mul de BPI (Lote 78038, de fecha 19/8/89) hasta obtener 7 ml usando PBS (Redwood City) y se mezclaron en tubos de polipropileno (libres de pirógenos). Se marcó el tubo con la referencia #20170 y se estudió en un ensayo USP de Pirógenos de tres conejos a una dosis de 2,0 ml/conejo.

El producto era no pirógeno según se demostró por una elevación total de la temperatura de 0,2ºC.

Etapa II

Pirogenicidad de la BPI preincubada con endotoxina

Se diluyó endotoxina de E. coli 055.B5 (Sigma Chemicals) en PBS (Redwood City) hasta obtener 4096 UE/ml. Se confirmó esta concentración por medio del ensayo del LAL. Se diluyeron 304 \mul de BPI (Lote 78038, de fecha 19/8/89) hasta obtener 7 ml con la endotoxina diluida en PBS (4096 UE/ml) anterior de la presente memoria usando tubos de polipropileno. Se mezcló el tubo agitando con un vórtex para efectuar la mezcla. Se incubó la BPI+Endotoxina y la Endotoxina en PBS a 37ºC en un baño de agua durante 30 minutos. Después de la incubación a 37ºC la BPI+Endotoxina mostró una concentración de endotoxina de 122 UE/ml. La endotoxina diluida en PBS no mostró ningún cambio en el punto final de 4096 UE/ml.

La BPI+Endotoxina y la Endotoxina en PBS fueron estudiados en el ensayo USP de pirógenos de tres conejos y resultaron ser pirógenas con elevaciones totales de la temperatura de 4,6ºC y 7,5ºC, respectivamente.

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Etapa II (repetición)

Para conseguir mejores resultados con las manipulaciones de la preparación de endotoxina, los autores de la invención cambiaron de E. coli 055:B5 de Sigma a las Referencias Oficiales de la FDA.

Se rehidrató un vial de EC-5 con PBS (Redwood City) hasta obtener 2 ml para dar una concentración de 5000 UE/ml. Se verificó la reivindicación de la etiqueta de 10.000 UE/ml por medio del ensayo del LAL.

Se preparó la muestra de BPI+Endotoxina añadiendo 38 \mul de PBI (Lote 78038) a 7,3 ml de PBS más 320 \mul de las 5000 UE/ml de endotoxina EC-5. Se mezcló la preparación en un tubo de polipropileno (liberado de pirógenos) y se mezcló bien. Se preparó una muestra de 8,0 ml de endotoxina EC-5 en PBS (Redwood City) a la misma concentración sin la adición de BPI. Ambas muestras fueron incubadas a 37ºC durante 30 minutos en un baño de agua.

Se estudiaron las dos muestras en cuanto a la actividad de la endotoxina usando el ensayo del LAL. La BPI+Endoto-
xina fue negativa. La muestra de endotoxina fue positiva respecto al objetivo de 200 UE/ml (Figura 18).

Se estudiaron ambas muestras en el Ensayo USP de Pirógenos de tres conejos a una dosis de 2,0 ml/conejo.

La BPI+Endotoxina era no pirógena y produjo una elevación total de la temperatura de 1,1ºC. La endotoxina EC-5 en PBS era pirógena y produjo una elevación total de la temperatura de 3,9ºC.

Claims

1. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la actividad pirógena de una endotoxina en un ser humano.

2. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la producción por células mononucleares humanas mediada por lipopolisacárido de factor de necrosis tumoral en un ser humano.

3. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para inhibir la estimulación de células mediada por endotoxina en un ser humano.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que las células son neutrófilos o células endoteliales o mononucleares.

5. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para tratar, prevenir o inhibir un trastorno que es un choque relacionado con endotoxinas, coagulación intravascular diseminada relacionada con endotoxinas, anemia relacionada con endotoxinas, leucopenia relacionada con endotoxinas, trombocitopenia relacionada con endotoxinas, síndrome de disfunción respiratoria del adulto relacionado con endotoxinas o insuficiencia renal relacionada con endotoxinas, trastorno que está asociado con la presencia de una endotoxina en un ser humano.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que el trastorno es un choque relacionado con endotoxinas.

7. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para tratar la endotoxemia asociada con la presencia de endotoxina en un ser humano.

8. El uso de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad (BPI) para la fabricación de un medicamento para prevenir o inhibir la endotoxemia asociada con la presencia de endotoxina en un ser humano susceptible de padecer el trastorno.

9. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que la cantidad de BPI que ha de ser administrada es de 100 ng a 100 mg.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que la cantidad de BPI que ha de ser administrada es de 10 \mug a 10 mg.

11. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que "BPI" incluye no sólo BPI nativa o recombinante, sino también un polipéptido biológicamente activo análogo de la BPI que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y posee la siguiente secuencia N-terminal de la BPI: VNPGVVVRISQKGLD.

12. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el medicamento es para la administración oral, intravenosa, intramuscular o subcutánea.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el tratamiento de una infección por bacterias gram-negativas.

14. El uso según la reivindicación 13, en el que la infección por bacterias gram-negativas incluye la sepsis y/o la septicemia por bacterias gram-negativas.

15. Un método para aislar y recuperar Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada que comprende:

(a): obtener una muestra en bruto de Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad;

(b): separar la muestra en bruto mediante HPLC en fase inversa;

(c): recoger cada pico;

(d): secar cada pico en presencia de BSA baja en endotoxina;

(e): volver a secar cada pico en presencia de ácido acético al 0,1% libre de pirógenos; y

(f): aislar y recuperar la Proteína Bactericida/Incrementadora de la Permeabilidad purificada.

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16. Un método según la reivindicación 15, en el que "BPI" incluye no sólo BPI nativa o recombinante sino también un péptido biológicamente activo análogo de la BPI que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y posee la siguiente secuencia N-terminal de la BPI: VNPGVVVRISQKGLD.