DE69434890T2

DE69434890T2 - Klonierung und rekombinante herstellung von vespidengift-hyaluronidase und darauf beruhende immunologische therapien

Info

Publication number: DE69434890T2
Application number: DE69434890T
Authority: DE
Inventors: Te Piao New York KING
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1993-03-11
Filing date: 1994-03-10
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2014-03-11
Also published as: US6287559B1; US5612209A; ES2278379T3; ATE347601T1; JP2006000119A; US6270763B1; EP0688362B1; EP0688362A1; EP1650304B1; US5593877A; JP3816515B2; DK0688362T3; JPH08508399A; AU6404194A; CA2157864A1; EP1650304A2; ATE458817T1; DE69434890D1; EP1650304A3; DK1650304T3

Description

Die zu der vorliegenden Erfindung führende Forschung wurde durch den Forschungsantrag Nr. AI 17021 des Public Health Service der Vereinigten Staaten unterstützt. Die US-Regierung kann bestimmte Rechte an der Erfindung haben.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Nucleinsäuren gerichtet, die Vespidengift-Allergene kodieren, insbesondere die Gift-Hyaluronidase oder Fragmente davon, rekombinante Vektoren, die derartige Nucleinsäuren umfassen, und Wirtszellen, welche die rekombinanten Vektoren enthalten. Die Erfindung ist ferner auf die Expression derartiger Nucleinsäuren gerichtet, um eine rekombinante Vespidengift-Hyaluronidase oder rekombinante Fragmente davon herzustellen. Ein derartiges Allergen und Fragmente davon sind zur Diagnose einer Allergie und zur therapeutischen Behandlung einer Allergie nützlich.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Biochemische Aspekte von Insektengift-Allergenen
Eine Insektenstich-Allergie gegen Bienen und Vespiden kommt häufig vor. Die Vespiden schließen Wespen und Hornissen ein (Golden, et al., 1989, Am. Med. Assoc. 262:240). Empfängliche Menschen können bei Belastung mit winzigen Mengen von Giftproteinen sensibilisiert werden; eine so geringe Menge wie 2–10 μg Protein wird bei einem einzelnen Stich durch eine Vespide in die Haut injiziert (Hoffman und Jacobson, 1984, Ann. Allergy. 52:276).
Es gibt viele Wespen- bzw. Hornissenarten der Gattungen Dolichovespula, Vespula und Polistes in Nordamerika (Akre, et al., 1980, „Yellowjackets of America North of Mexico", Landwirtschaftshandbuch Nr. 552, US-Landwirtschaftsministerium). Die Vespiden haben ähnliche Giftzusammensetzungen (King, et al., 1978, Biochemistry 17:5165; King, et al., 1983, Mol. Immunol. 20:297; King, et al., 1984, Arch. Biochem. Biophys. 230:1; King, et al., 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:621; King, 1987, J. Allergy Clin. Immunol. 79:113; Hoffman, 1985, J. Allergy and Clin. Immunol. 75:611). Ihr Gift enthält jeweils drei Haupt-Giftallergene, Phospholipase (37 kD), Hyaluronidase (43 kD) und Antigen 5 (23 kD) mit bisher unbekannter biologischer Funktion.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Insektengift-Allergenen ist die vollständige Aminosäuresequenz von einigen Hauptallergenen aus unterschiedlichen Gräsern (Perez, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:16210; Ansari, et al., 1989, Biochemistry 26:8665; Silvanovich, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1204), Baumpollen (Breiteneder, 1989, EMBO J. 8:1935; Valenta, et al., 1991, Science, 253:557), Unkrautpollen (Rafnar, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:1229; Griffith, et al., 1991, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 96:296), Milben (Chua, et al., 1988, J. Exp. Med. 167:175), Hautschuppen von Katzen (Griffith, et al., 1992, Gene. 113:263) und Schimmelpilz (Aruda, et al., 1990, J. Exp. Med. 172:1529; Han, et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:327) in den letzten paar Jahren beschrieben worden. Bei diesen Hauptallergenen handelt es sich um Proteine von 10–40 kD und sie haben sehr unterschiedliche biologische Funktionen. Beinahe alle Allergene mit bekannten Sequenzen haben ein variierendes Ausmaß an Sequenzähnlichkeit zu anderen Proteinen in unserer Umwelt.
T- und B-Zell-Epitope von Allergenen
Antikörperreaktionen auf Proteine erfordern die Zusammenarbeit von T-Helfer- und B-Lymphozyten und Antigen-präsentierenden Zellen (APC). Bei den Antigenrezeptoren der B-Zellen handelt es sich um die membrangebundenen Antikörpermoleküle (Ak), die Immunogene direkt erkennen und binden. Die Antigenrezeptoren der T-Zellen (TCR) erkennen und binden Komplexe aus antigenem Peptid und MHC-Klasse-II-Molekül. Immunogene werden zunächst durch APC zu Peptiden prozessiert, die auf der Oberfläche von APC in Verbindung mit den MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden (Unanue, 1992, Current Opinion in Immunol. 4:63). Da MHC-Moleküle in Individuen hoch polymorph sind, haben sie eine unterschiedliche Spezifität beim Binden antigener Peptide (Rothbard und Gefter, 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:527). Dies ist ein Mechanismus zur genetischen Kontrolle der Immunreaktion.
T-Helferzellen werden aktiviert, wenn der Antigenrezeptor den Peptid-MHC-Komplex auf der Oberfläche von APC bindet. Aktivierte T-Zellen sezernieren Lymphokine. Bei Mäusen (Street und Mosmann, 1991, FASEB J. 5:171) und anscheinend bei Menschen (Wierenga, et al., 1990, J. Immunol. 144:4651; Parronchi, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:4538) können die T-Helferzellen beruhend auf ihren Lymphokinproduktionsmustern in unterschiedliche Typen eingeteilt werden. In erster Linie teilen sich T-Helferzellen in zwei Gruppen: TH1-Zellen, die IL-2 und IFN-γ produzieren, und TH2-Zellen, die IL-4 und IL-5 produzieren. Diese Lymphokine wiederum beeinflussen die Antigen-aktivierten B-Zellen so, dass sie zu Plasmazellen differenzieren und proliferieren, die Antikörper unterschiedlicher Isotypen sezernieren. IL-4 ist ein Lymphokin, von dem man weiß, dass es die IgE-Synthese beeinflusst (Finkelman, et al., 1990, Ann. Rev. Immunol. 8:303).
Man glaubt, dass die ganze zugängliche Oberfläche eines Proteinmoleküls durch die Antigenrezeptoren von B-Zellen als Epitope erkannt werden kann, obwohl nicht unbedingt alle Epitope mit gleicher Wahrscheinlichkeit erkannt werden (Benjamin, et al., 1984, Ann. Rev. Immunol. 2:67). B-Zell-Epitope eines Proteins gehören zu zwei Typen; topographisch und linear. Der topographische Typ besteht aus Aminosäureresten, die räumlich benachbart sind, aber bezüglich der Sequenz benachbart sein können oder nicht. Der lineare Type besteht aus nur bezüglich der Sequenz benachbarten Resten. Röntgenkristallographische Daten von Ag-Ak-Komplexen zeigen an, dass die Größe ihres komplementären Bindungsbereichs 16–17 Aminosäurereste beträgt (Amit, et al., 1986, Science 233:747), aber eine Peptidkartierung legt nahe, dass weniger als etwa 8 Reste signifikant zum Bindungsvorgang eines linearen Epitops beitragen (Appel, et al., 1990, J. Immunol. 144:976).
Wie andere Proteinantigene können Allergene beide Typen von B-Zell-Epitopen oder nur einen haben. Zum Beispiel haben die Vespidenantigene 5 beide Typen (King et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 91:283). Bienengift-Mellitin scheint nur ein B-Zell-Epitop des linearen Typs zu haben (King, et al., 1984, J. Immunol. 133:2668).
T-Zell-Epitope von Proteinen bestehen nur aus dem linearen Typ, da es sich um Peptide handelt, die in den Lysosomen von APC durch Proteasen unbekannter Spezifität prozessiert worden sind (Unanue, 1992, Curr. Op. Immunol. 4:63). Eine Analyse natürlich prozessierter antigener Peptide, die an MHC-Klasse-II-Moleküle gebunden sind, zeigt an, dass ihre Größe von etwa 13 bis 17 Aminosäureresten reicht, aber eine Analyse von Komplexen synthetischer Peptide mit MHC-Klasse-II-Molekülen auf ihre proliferative T-Zell-Reaktion hin legt eine minimale Größe von etwa 8 Aminosäureresten nahe (vgl. Rudensky et al., 1991, Nature 353:622). Untersuchungen legen nahe, dass T-Zell-Epitope überall im ganzen Proteinmolekül verteilt sind, und sie können je nach MHC-Haplotyp des immunisierten Wirts als Haupt- oder Nebendeterminanten wirken (Roy, et al., Science 244:572; Gammon, et al., 1987, Immunol. Rev. 98:53; O'Hehir et al., 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:67).
Man weiß, dass eine Hypersensitivität des Sofort-Typs durch die Anwesenheit von Allergen-spezifischem IgE verursacht wird. Man findet IgE im Kreislauf und an spezifische IgE-Fc-Rezeptoren auf Mastzellen und basophilen Zellen gebunden. Das Vernetzen von zellgebundenem IgE durch Allergene führt zur Freisetzung von Histamin, Leukotrienen und anderen chemischen Mediatoren, welche die allergischen Symptome verursachen. Bei IgE handelt es sich um einen der unterschiedlichen Immunglobulin-Isotypen. Wie vorstehend hervorgehoben wurde, beeinflussen durch T-Zellen sezernierte Lymphokine Isotypwechselereignisse in B-Zellen.
Wegen der zentralen Rolle von TH2-Zellen beim Bestimmen des Isotypwechselereignisses von B-Zellen sind die T-Zell-Epitope einiger Allergene kartiert worden (vgl. O'Hehir et al., vorstehend). Diese Allergene schließen Amb α III aus Ambrosie, Lol p I aus Weidelgras, Fel d I aus der Katze, Mus m I aus Mäuseharn, Chi t I aus der Mücke, Bienengift-Phospholipase A₂ (Dhillon, et al., 1992, J. Allergy Clin. Immunol. 90:42), Mellitin (Fehlner, et al., 1991, J. Immunol. 146:799) und Wespen- bzw. Hornissen-Antigen 5 (King et al., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 91:283) ein. Diese Ergebnisse decken keine ungewöhnlichen oder gemeinsamen Strukturmerkmale auf. Jeder Rückschluss aus diesen Ergebnissen ist jedoch bedingt gültig, da diese Ergebnisse aus Menschen und Mäusen unterschiedlicher Haplotypen gesammelt werden.
Modulation von T- und B-Zell-Reaktionen
Normalerweise sind Wirte durch klonale Deletion und Anergie gegenüber den dominanten B- und T-Zell-Epitopen körpereigener Proteine tolerant. Diese Toleranz kann jedoch unter bestimmten Umständen durchbrochen werden (Gammon, et al., 1991, Immunol. Today. 12:193; Basten, et al., 1991, Immunol. Rev. 122:5). Es ist nahe gelegt worden, dass die Toleranz gegenüber körpereigenen Substanzen bei Autoimmunerkrankungen durch Begegnungen mit fremden Proteinen durchbrochen wird, die Wirtsproteinen ähnlich sind. Deshalb ist die Sequenzähnlichkeit von Allergenen zu autologen Proteinen für eine nähere Untersuchung von Interesse.
Reife B-Zellen werden als Reaktion auf multivalente Antigene aktiviert, die Ig-Rezeptoren der Zelloberfläche vernetzen können (DeFranco, 1987, Ann. Rev. Cell Biol. 3:143), und sie werden als Reaktion auf monovalente Antigene anergisch gemacht (Basten, et al., 1991, vorstehend). Eine Antigen-Aktivierung von T-Zellen erfordert nicht nur die Integration von TCR mit einem Peptid-MHC-Komplex sondern auch mit anderen kostimulierenden Signalen auf der Oberfläche von APC (Schwartz, 1990, Science 248:1349; Jenkins und Miller, 1992, FASEB J. 6:2428). Eine Wechselwirkung von TCR mit einem Peptid-MHC-Komplex in Abwesenheit von kostimulierenden Signalen kann zu einer T-Zell-Anergie führen.
Der molekulare Mechanismus einer B- oder T-Zell-Anergie ist noch nicht verstanden (vgl. Schwartz, 1990, vorstehend; Jenkins und Miller, 1992, vorstehend; Ales-Martinez, et al., 1991, Immunol. Today 12:201). In-vitro-Untersuchungen mit T-Zell-Klonen decken auf, dass eine Besetzung von TCR durch einen künstlichen Peptid-MHC-Komplex in Abwesenheit von kostimulierenden Signalen zu veränderter intrazellulärer Signaltransduktion und/oder Repressor-Genaktivierung führt, was die Lymphokin-Transkription verhindern kann.
Frühe Untersuchungen haben gezeigt, dass der physikalische Zustand des Immunogens und der Immunisierungsweg wichtige Variablen beim Bestimmen des Resultats einer Immunreaktion sind. Angesichts unseres derzeitigen Verstehens können diese Variablen die Antigenpräsentation wohl beeinflussen, um T- und B-Zell-Aktivierung oder -Anergie aufzuweisen.
Ein Weg, allergische Erkrankungen zu behandeln, ist durch Immuntherapie, die wiederholte subkutane Injektionen des (der) angreifenden Allergens (Allergene) in Patienten einbezieht. Die Allergenmengen, die injiziert werden können, sind durch die Gefahr unerwünschter, systemischer allergischer Reaktionen bei Patienten beschränkt. Für die meisten Patienten steigen deren Allergen-spezifische IgE-Spiegel nach einer Immuntherapie zunächst, gefolgt von einer allmählichen Senkung ihrer Allergen-spezifischen IgE-Spiegel, und es findet auch eine Herunterregulierung von Allergen-spezifischen T-Zell-Reaktionen statt (P. S. Norman, 1993, Current Op. Immunol. 5:968).
Wegen der unerwünschten systemischen Reaktion auf eine Immuntherapie mit nativen Allergenen hat es ein kontinuierliches Interesse an der Entwicklung modifizierter Allergene mit reduzierten allergenen Aktivitäten für eine Immuntherapie gegeben (T. P. King, 1993, in „Bronchial Asthma," herausgegeben von E. B. Weiss und M. Stein, Little Brown, Boston, S. 43–49; R. E. O'Hehir et al., 1991, vorstehend).
Zwei Berichte über die Verwendung von T-Zell-Epitop-Peptiden zum Modulieren Allergen-spezifischer Immunreaktionen sind kürzlich erschienen. Ein Bericht behandelt die subkutane Injektion von zwei Peptiden aus dem Haupt-Katzenallergen Fel d I in Mäuse, um die T-Zell-Reaktion gegen das ganze Molekül Fel d I zu senken (Briner et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7608–12). Ein anderer behandelt die intranasale Therapie mit einem Peptid aus dem Haupt-Milbenallergen Der p I, um eine Allergen-spezifische Reaktion in naiven oder sensibilisierten Mäusen zu unterdrücken (Hoyne et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1783–1788).
Da ein MHC-Klasse-II-Molekül jeden Haplotyps eine große Auswahl von Peptiden in seiner Bindungsfurche binden kann, kann es möglich sein, die T-Zell-Reaktion durch Hemmung der Allergen-abgeleiteten T-Zell-Epitopbindung an MHC-Moleküle mit anderen Peptiden zu modulieren. Zum Beispiel hemmt ein Peptid des Maus-Lysozyms, das in H-2^k-Mäusen allein nicht immunogen ist, die T-Zell-Reaktion gegen Lysozym aus Hühnereiweiß (Adorini und Nagy, 1990, Immunol. Today. 11:21). Bei einem anderen Beispiel handelt es sich um die in-vitro-Hemmung einer T-Zell-Reaktion gegen ein Milbenallergen durch ein HA-Peptid von Influenza (O'Hehir et al., 1991, J. Allergy Clin. Immunol. 87:1120).
Bei der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen oder Ratten handelt es sich um ein gut untersuchtes Modell für multiple Sklerose. Viele Untersuchungen haben immundominante T-Zell-Determinanten für das basische Myelinprotein identifiziert, das verwendet wird, um diesen Zustand zu induzieren. Peptide, die immundominanten Epitopen des basischen Myelinproteins entsprechen, können eine Toleranz gegenüber dem gleichen Peptidantigen oder gegenüber dem intakten basischen Myelinprotein induzieren. Die gleichen Peptide, die eine Toleranz induzierten, konnten bei einer laufenden Autoimmunreaktion auch eine T-Zell-Anergie induzieren (Gaur et al., 1992, Science 259:1491–1494).
Eine Immunreaktion gegen ein Immunogen/Allergen hängt teilweise von der genetischen Aufmachung des Wirts, vom Weg und von der Art der Immunisierung und dem Immunogen/Allergen ab. Das Ausmaß, zu dem ein Vespidengift-Allergen das Resultat einer IgE-Reaktion bestimmt, ist nicht bekannt. Wieviele B- und T-Zell-Epitope hat jedes Vespidengift-Allergen? Gibt es immundominante B- oder T-Zell-Epitope eines Vespidengift-Allergens, die von unterschiedlichen oder allen empfänglichen Individuen erkannt werden? Gibt es T-Zell-Epitope, die IgE-Klassenwechselereignisse in B-Zellen begünstigen? Spielt die antigene Kreuzreaktivität von Vespidengift-Allergenen mit Wirtsproteinen eine Rolle dabei, warum manche Protein allergener sind als andere? Kann eine Toleranz gegenüber einem multivalenten Vespidengift-Allergen durch Behandlung mit einem einzelnen oder einer Kombination von B- oder T-Zell-Epitopen induziert werden?
Somit gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf, die B- und T-Helferzell-Epitope von Vespidengift-Hauptallergenen voneinander abzugrenzen. Es besteht ein besonderer Bedarf, die B- und T-Helferzell-Epitope der verschiedenen Vespiden Dolichovespula (z. B. Dolichovespula arenaria), Vespula (z. B. Vespula vulgaris) und Polistes (z. B. Polistes annularis) voneinander abzugrenzen. Insbesondere sind die Vespidengift-Hauptallergene Phospholipase und Hyaluronidase geeignete Ziele zum Bestimmen der wichtigen B- und T-Zell-Epitope. Um die Grundlage für eine allergische Reaktion gegen Vespiden-allergene vollständig anzugehen und um auf Allergen beruhende Immuntherapien zu entwickeln, müssen die cDNA- und Proteinsequenzen von mehreren homologen Allergenen untersucht werden. Darüberhinaus sollten Vektoren entwickelt werden, die zur Expression von Vespidenallergenen oder deren Fragmenten auf hohem Niveau in Bakterien und eukaryotischen Zellen geeignet sind. Rekombinante Vespidenallergene und deren Fragmente können dann verwendet werden, um deren B- und T-Zell-Epitope durch Antikörperbindung bzw. T-Zell-Proliferationstests im Maussystem und, noch wichtiger, im menschlichen System zu untersuchen.
Es gibt einen weiteren Bedarf zu bestimmen, ob es eine Kreuzreaktion der T- und B-Zell-Epitope von Vespidenallergenen mit anderen Umwelt- und/oder autologen Proteinen gibt. Somit gibt es einen Bedarf zu bestimmen, ob Vespidenallergene eine partielle Identität mit anderen Umweltproteinen, besonders mit autologen Proteinen teilen, und, noch wichtiger, die Sequenzen der Regionen der partiellen Identität zu erhalten, insbesondere der spezifischen Aminosäuresequenzen derartiger Regionen partieller Identität. Es gibt einen weiteren Bedarf, das Niveau der Kreuzreaktivität von Vespidenallergenen mit anderen Proteinen auf der Ebene von B-Zellen und T-Zellen, die Relevanz dieser Kreuzreaktivität und ob eine derartige Kreuzreaktivität pathologisch ist, d. h. beteiligt an oder verantwortlich für eine Allergie, oder nutzbringend, d. h. allergiehemmend, zu bestimmen.
Es gibt auch einen Bedarf auf dem Fachgebiet, Peptide mit T- oder B-Zell-Epitopen von Vespidengift-Allergenen zu verwenden, um die Induktion von Toleranz bei Mäusen und die Induktion von Toleranz bei Menschen zu untersuchen.
Es gibt einen weiteren Bedarf zu testen, ob ein modifiziertes Peptid das Binden eines T-Zell-Epitops eines Allergens an ein MHC-Klasse-II-Molekül hemmt oder eine T-Zell-Anergie induziert oder beides.
Somit gibt es auf dem Fachgebiet einen Bedarf für die Sequenzinformation über Vespidengift-Allergene und eine reichliche Quelle derartiger Allergene für immunologische Untersuchungen und für eine immunologischen Therapie der Allergie.
Das Zitieren von Referenzen hierin soll nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, dass es sich dabei um den Stand der Technik zu der vorliegenden Erfindung handelt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren bereit, die Vespidengift-Hyaluronidasen und immunmodulatorische Fragmente, Derivate oder Analoga davon kodieren. Insbesondere richtet sich die Erfindung auf Nucleinsäuren, die Vespidengift-Hyaluronidasen kodieren, zum Beispiel die Hyaluronidase aus D. maculata. In spezifischen Ausführungsformen kodiert eine Nucleinsäure der Erfindung einen immunmodulatorischen Anteil eines T-Zell-Epitops einer Vespidengift-Hyaluronidase. In einer anderen spezifischen Ausführungsform kodiert eine Nucleinsäure der Erfindung einen antigenen Anteil eines B-Zell-Epitops einer Vespidengift-Hyaluronidase. Die Expression der Nucleinsäu ren der Erfindung stellt eine reichliche Quelle der Vespidenenzyme zur Diagnose und Therapie bereit.
Es ist ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Nucleinsäuresequenzen, die etliche Vespidengift-Hyaluronidasen kodieren, bereitgestellt werden. Derartige Nucleinsäuresequenzen ermöglichen das Ableiten der Aminosäuresequenz der Vespidengift-Enzyme. Eine Kenntnis der Aminosäuresequenz ermöglicht die Bestimmung relevanter T-Zell- und B-Zell-Epitope eines Enzyms. Noch wichtiger ist, dass die immundominanten T-Zell- und B-Zell-Epitope für jedes gegenüber einem Enzym-Allergen empfindliche Individuum oder für jede Gruppe von Individuen, d. h. solche, die einen empfänglichen MHC-Haplotyp teilen oder für die das T-Zell-Epitop Klassenwechselereignisse zu Antikörpern der IgE-Klasse begünstigt, bestimmt werden können. Sobald derartige T-Zell- und B-Zell-Epitope bestimmt sind, ist es möglich, immunologische Therapien für allergische Leiden, die für Vespidengift-Enzyme spezifisch sind, z. B. für eine Empfindlichkeit gegenüber Vespidengift-Hyaluronidase, zu entwickeln.
Somit stellt die vorliegende Erfindung ferner Polypeptide bereit, die durch die Nucleinsäuren der Erfindung kodiert werden. Inbesondere stellt die Erfindung Polypeptide bereit, die einen immunmodulatorischen Anteil eines T-Zell-Epitops der Vespidengift-Hyaluronidase haben. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Polypeptide bereit, die einen antigenen Anteil eines B-Zell-Epitops der Vespidengift-Hyaluronidase haben. Ganz besonders stellt die Erfindung derartige Polypeptide einer Vespidengift-Hyaluronidase, zum Beispiel der Hyaluronidase aus D. maculata, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner funktionell mit einem Promotor verbundene Expressionsvektoren bereit, welche die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Herstellen der Vespidengift-Hyaluronidasen, die durch die Nucleinsäuren der Erfindung kodiert werden, bereit. Insbesondere stellt die Erfindung das Züchten einer Zelle bereit, die mit einem Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist, so dass die Vespidengift-Hyaluronidase durch die Zelle exprimiert wird, und das Gewinnen des Vespidengift-Enzyms, das so von der Kultur exprimiert wird. Ganz besonders stellt die Erfindung die Expression von Expressionsvektoren bereit, die Nucleinsäuren umfassen, die eine Vespidengift-Hyaluronidase kodieren, zum Beispiel die Hyaluronidase aus D. maculata oder Fragmente, Derivate oder Analoga davon.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die zur Behandlung eines für ein Vespidengift-Allergen spezifischen allergischen Leidens wirksam ist, umfassend ein Polypeptid der Erfindung, das einen immunmodulatorischen Anteil eines T-Zell-Epitops einer Vespidengift-Hyaluronidase oder einen antigenen Anteil eines B-Zell-Epitops einer Vespidengift-Hyaluronidase hat. Ganz besonders stellt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die derartige Polypeptide einer Vespidengift-Hyaluronidase, zum Beispiel der Hyaluronidase aus D. maculata, umfassen.
In noch wieder einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln eines für ein Vespidengift-Allergen spezifischen Leidens bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutische wirksamen Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung.
Somit ist ein Vorteil der Erfindung, dass sie die Herstellung vieler Vespidengift-Hyaluronidasen bereitstellt, die therapeutisch zur Behandlung von für Vespidengift-Enzyme spezifischen allergischen Leiden verwendet werden können. Am allerwichtigsten ist, dass die therapeutische Behandlung hochspezifisch und individualisiert sein kann, da die Erfindung die Herstellung eines Vespidengift-Enzym-Polypeptids ermöglicht, das in jedem Individuum oder in jeder Gruppe von Individuen immunmodulatorische Aktivität hat.
Es ist ein anderer besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, die Nucleinsäuresequenzen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen einer großen Anzahl verschiedener Vespidengift-Hyaluronidasen von unterschiedlichen Vespidenarten zu haben, um einen Vergleich der Homologie analoger Enzyme zwischen Arten zu ermöglichen. Diese Information stellt eine Grundlage zum Auswerten der Kreuzreaktivität der Allergene bereit, was für allergische Reaktionen und für therapeutische Behandlungen wichtig sein kann.
Es ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass der Grad der Ähnlichkeit vieler Vespidengift-Hyaluronidasen mit Umweltproteinen und/oder autologen Proteinen ausgewertet werden kann. Man glaubt, dass die Ähnlichkeit der Vespidengift-Enzyme mit derartigen Umweltproteinen, und besonders mit autologen Proteinen, wichtige Auswirkungen für die allergische Reaktion hat. ABKÜRZUNGEN
KURZE BESCHREIBUNG DER BILDER
6. cDNA- (SEQ ID NO:54) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:55) der Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase (Dol m II). Nucleotid- und Aminosäurepositionen sind rechts nummeriert. Das Nummerieren der Aminosäurereste beginnt und endet an den N- und C-terminalen Resten Serin bzw. Asparagin, die den Nucleotidpositionen von 61–63 bzw. 1051–1053 entsprechen. Die unterstrichene Aminosäuresequenz wurde auch durch Edman-Abbau etabliert.
7. Sequenzvergleich der Hyaluronidasen aus Honigbienen- (SEQ ID NO:56) und Wespen- bzw. Hornissengift (SEQ ID NO:57) und dem Protein PH-20 aus Meerschweinchensperma (SEQ ID NO:58). Das Abgleichen fängt mit Rest 1 für beide Hyaluronidasen und Rest 4 für PH-20 an. Die Bienengift-Hyaluronidase und PH-20 enthalten 349 bzw. 495 Reste. Lücken, durch Bindestriche angezeigt, wurden zugefügt, um die Sequenzhomologie zu maximieren. Die gefüllten Kreise heben die Aminosäurereste hervor, die diesen Proteinen gemeinsam sind.
8. Proliferationsassay mit primären Milzzellen nach zwei Immunisierungen mit Hyaluronidase aus (A) Gift von Dolichovespula maculata („white face hornet") und (B) Bienengift. Milzzellen wurden zehn Tage nach zwei Immunisierungen i. p. mit 10 mg/ml Gift-Hyaluronidase in 5 mg/ml Alaun im Abstand von zwei Wochen erhalten. Die Milzen wurden entnommen und Leukozyten (4 – 5 × 10^–6 Zellen/ml) in vitro mit Hyaluronidase aus Gift von Dolichovespula maculata (o) oder Bienengift-Hyaluronidase
bei den angegebenen Konzentrationen in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen stimuliert. Das Endvolumen jeder Kultur war 200 ml. Proliferationsassays wurden in 10R-Medium, das mit Antibiotika und fötalem Rinderserum ergänzt war, durchgeführt. Nach einer drei Tage langen Inkubation wurde 0,5–1 μCi³H-Thymidin zu jeder Kultur gegeben und die Zellen wurden 20 Stunden später geerntet. Der Hintergrund-Einbau von ³H-Thy betrug 7320 ± 9% cpm für (A) und 8500 ± 15% cpm für (B).
9. Proliferationsassay mit primären Milzzellen nach fünf Immunisierungen mit (A) Hyaluronidase aus Gift von Dolichovespula maculata und (B) Bienengift-Hyaluronidase. Der Abbildungsschlüssel entspricht 8, und die Immunisierungen wurden wie für 8 beschrieben im Abstand von zwei Wochen durchgeführt. Der Proliferationsassay wurde auch wie in 8 beschrieben durchgeführt. Man beachte, dass die Größe der Reaktionen im Vergleich zu den zweimal immunisierten Mäusen etwa 2-fach angestiegen war, obwohl die Leerwerte etwa gleich blieben. Der Hintergrundeinbau von ³H-Thy betrug 11187 ± 4% cpm für (A) und 6084 ± 26% cpm für (B).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante Nucleinsäuren gerichtet, die Vespidengift-Hyaluronidasen und immunmodulatorische Fragmente, Derivate oder Analoga davon kodieren, und durch derartige Nucleinsäuren kodierte Polypeptide, die bei der Diagnose und Therapie einer Vespidengift-spezifischen Allergie nützlich sind. In spezifischen Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung auf eine rekombinante Nucleinsäure gerichtet, die ein immunmodulatorisches Fragment einer Vespidengift-Hyaluronidase, insbesondere der Hyaluronidase aus D. maculata, kodiert.
Die Erfindung ist ferner auf Expressionsvektoren gerichtet, die derartige Nucleinsäuren umfassen, und auf Verfahren zum Herstellen von Vespidengift-Enzym-Polypeptiden der Erfindung durch Exprimieren derartiger Expressionsvektoren und Gewinnen der exprimierten Vespidengift-Enzym-Polypeptide.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die zur Behandlung eines für ein Vespidengift-Allergen spezifischen allergischen Leidens wirksam sind, umfassend ein Polypeptid der Erfindung, und Verfahren zum Behandeln derartiger allergischer Leiden, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung.
Die Polypeptide der Erfindung können auch zur Diagnose von Vespidengift-spezifischen allergischen Leiden nützlich sein.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Vespidengift-Allergen" auf ein Protein, das im Gift einer Vespide gefunden wird, gegen das empfängliche Menschen bei Belastung durch einen Stich des Insekts sensibilisiert werden. Während die meisten Antigene dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mit spezifischen Antikörpern der IgG-Klasse reagieren, ist ein Allergen dadurch gekennzeichnet, dass es auch mit Antikörpern des IgE-Typs reagiert. Die Antikörper des IgE-Typs sind für das Vermitteln der Symptome eines allergischen Leidens verantwortlich, d. h. der Hypersensitivität des Sofort-Typs.
Wie hierin wird der Begriff „Vespide" gemäß der Praxis von Fachleuten auf dem Allergiegebiet verwendet und bezieht sich auf Insekten, die der weltweiten Familie der Vespidae angehören, d. h. soziale Wespen einschließlich verschiedener Wespen und Hornissen. Insbesondere schließen die Vespiden die Unterfamilien Vespinae und Polistinae ein. Ganz besonders schließen die Vespiden die Gattungen Vespa Linnaeus, Vespula Thomson, Dolichovespula Rohwer und Polistes Latreille ein. Arten in der Gattung Vespula schließen V. germanica (Fab.), V. squamosa (Drury), V. maculifrons (Buysson), V. flavopilosa (Jacobson), V. vulgaris (L.) und V. pensylvanica (Saussure) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Arten in der Gattung Polistes schließen P. annularis (Linnaeus), P. exclamans (Viereck), P. metricus (Say), P. fuscatus (Fabricius) und P. apachus (Saussure) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Arten in der Gattung Dolichovespula schließen D. maculata (L.) und D. arenaria (Fab.) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Arten in der Gattung Vespa schließen V. crabro (L.) und V. orientalis (Linnaeus) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Phospholipase" auf die Klasse von Enzymen, die auf Phospholipidsubstrate wirken, z. B. um Fettsäuren zu hydrolysieren. In einer spezifischen Ausführungsform katalysiert eine Phospholipase die schnelle Hydrolyse der Acylgruppe an Position 1 synthetischer Phosphatidylcholine und eine langsame Hydrolyse der Acylgruppe an Position 2. Somit können die Vespiden-Phospholipasen der Erfindung sowohl Phospholipaseaktivitäten des A₁- als auch des B-Typs haben. Die Phospholipasen der Erfindung können auch eine Lipaseaktivität niedrigen Niveaus haben.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Hyaluronidase" auf die Klasse von Enzymen, die auf die Disaccharideinheit von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin wirken. Derartige Enzyme vermitteln die Hydrolyse von Polymeren sich wiederholender Disaccharide, die D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-glucosamin umfassen. Ein Beispiel für ein derartiges Polymer ist Hyaluronsäure. Hyaluronidase katalysiert die Freisetzung reduzierender N-Acetylglucosamingruppen aus Hyaluronsäure.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „immunmodulatorisch" auf die Fähigkeit, eine Antigen-spezifische Immunreaktion zu erhöhen oder zu senken, entweder auf der B-Zell- oder der T-Zell-Ebene. Eine immunmodulatorische Aktivität kann z. B. in T-Zell-Proliferationsassays, durch eine Messung der Antikörperproduktion, Lymphokinproduktion oder T-Zell-Reaktionsfreudigkeit nachgewiesen werden. Insbesondere können die immunmodulatorischen Polypeptide der Erfindung zusätzlich zu Wirkungen auf T-Zell-Reaktionen an Immunglobulin- (d. h. Antikörper-) Moleküle auf der Oberfläche von B-Zellen binden und B-Zell-Reaktionen ebenfalls beeinflussen.
Ein „Nucleinsäuremolekül" bezieht sich auf die polymere Phosphatesterform von Ribonucleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin; „RNA-Moleküle") oder Desoxyribonucleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin; „DNA-Moleküle") entweder in einzelsträngiger Form oder als doppel strängige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Begriff Nucleinsäuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül bezieht sich nur auf die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls und beschränkt es nicht auf bestimmte tertiäre Formen. Somit schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, die unter anderem in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Beim Diskutieren der Struktur bestimmter doppelsträngiger DNA-Moleküle können Sequenzen hierin gemäß der normalen Konvention beschrieben werden, die darin besteht, nur die Sequenz in der 5'-3'-Richtung entlang des nicht transkribierten DNA-Strangs (d. h. des Strangs mit einer Sequenz homolog zur mRNA) anzugeben. Ein „rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, das einer molekularen biologischen Manipulation unterzogen wurde.
Ein Nucleinsäuremolekül ist an ein anderes Nucleinsäuremolekül, wie zum Beispiel eine cDNA, genomische DNA oder RNA „hybridisierbar", wenn sich eine einzelsträngige Form des Nucleinsäuremoleküls unter geeigneten Bedingungen von Temperatur und Ionenstärke der Lösung an das andere Nucleinsäuremolekül anlagern kann (siehe Sambrook et al., 1989, nachstehend). Die Temperatur- und Ionenstärkebedingungen bestimmen die „Stringenz" der Hybridisierung. Eine Hybridisierung erfordert, dass die beiden Nucleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl je nach der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz zum Hybridisieren von Nucleinsäuren hängt von der Länge der Nucleinsäuren und dem Komplementaritätsgrad ab, Variablen, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind.
Bei einer „kodierenden DNA-Sequenz" handelt es sich um eine doppelsträngige DNA-Sequenz, die in vivo transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Start-Codon am 5'-(Amino-) Terminus und ein Translations-Stoppcodon am 3'-(Carboxyl-) Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Falls die kodierende Sequenz zur Expression in einer eukaryotischen Zelle bestimmt ist, werden sich 3' von der kodierenden Sequenz normalerweise ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz befinden.
Bei transkriptionellen und translationalen Kontrollsequenzen handelt es sich um regulatorische DNA-Sequenzen, wie zum Beispiel Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, welche die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle bereitstellen. In eukaryotischen Zellen handelt es sich bei Polyadenylierungssignalen um Kontrollsequenzen.
Bei einer „Promotorsequenz" handelt es sich um eine regulatorische DNA-Region, die fähig ist, in einer Zeile RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer stromabwärts (in 3'-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz zu initiieren. Für die Zwecke des Definierens der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptionsinitiationsstelle begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (in 5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen zu enthalten, die notwendig sind, um die Transkription auf Niveaus zu initiieren, die über dem Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz wird eine Transkriptionsinitiationsstelle zu finden sein (auf geeignete Weise zum Beispiel durch Kartieren mit Nuclease S1 definiert), sowie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen) die für das Binden von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten oft, aber nicht immer „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen.
Eine kodierende Sequenze ist in einer Zelle „unter der Kontrolle" von transkriptionellen und translationalen Kontrollsequenzen, wenn RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das durch die kodierende Sequenz kodierte Protein translatiert wird.
Eine „Signalsequenz" kann vor der kodierenden Sequenz eingeschlossen werden. Diese Sequenz kodiert N-terminal zu dem Polypeptid ein Signalpeptid, das die Wirtszelle so steuert, dass sie das Polypeptid auf die Zelloberfläche transportiert oder das Polypeptid in das Medium sezerniert, und dieses Signalpeptid wird normalerweise nach dem Exportieren selektiv durch die Zelle abgebaut. Signalsequenzen können assoziiert mit einer Vielfalt von Proteinen, die aus Prokaryoten und Eukaryoten stammen, gefunden werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinante DNA-Techniken innerhalb des Stands der Technik eingesetzt werden. Derartige Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt. Siehe z. B. Sambrook, Fritsch & Maniatis, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Zweite Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (hierin „Sambrook et al., 1989"); „DNA Cloning: A Practical Approach," Band I und II (D. N. Glover Hrsg., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg., (1985)]; „Transcription And Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
Die vorliegende Erfindung beruht teilweise auf dem Klonieren und der Sequenzbestimmung von Vespidengift-Hyaluronidasen. Das Klonieren und die Sequenzbestimmung dieser Vespidengift-Enyzme ist hochsignifikant, da allergische Vespidengift-Leiden häufig sind und in manchen empfindlichen Individuen eine allergische Reaktion zur Anaphylaxie fortschreiten kann, die möglicherweise fatal ist. Es ist deshalb sehr wichtig, dass die Nukleotid- und Aminosäuresequenzinformation für die Vespidengift-Allergene bekannt ist, so dass eine exakte diagnostische Information über die Beschaffenheit des allergischen Leidens, besonders spezifischer Allergen-Empfindlichkeiten, bestimmt werden kann und wirksame therapeutische Behandlungen des zugrundeliegenden allergischen Leidens bewirkt werden können.
Der Klarheit halber wird die vorliegende Erfindung im Detail in Abschnitten beschrieben, welche die Isolierung von Genen, die Vespidengift-Enzyme kodieren, die Expression eines Polypeptids, das ein immunmodulatorisches Fragment eines Vespidengift-Enzyms oder Derivate oder Analoga des Vespidengift-Enzyms umfasst, Assays mit dem rekombinanten Vespidengift-Enzym oder Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon und schließlich therapeutische und diagnostische Verwendungen des Vespidengift-Enzyms oder von Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon betreffen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Vespidengift-Enzyme Phospholipase und Hyaluronidase.
Isolierung einer Nucleinsäure, die ein Vespidengift-Enzym kodiert
Die Erfindung betrifft besonders isolierte Nucleinsäuren, die Vespidengift-Enzyme kodieren. Die Erfindung betrifft ferner eine Zelllinie, die eine rekombinante Nucleinsäure, die ein Vespidengift-Enzym kodiert, stabil enthält und fähig ist, eine derartige Nucleinsäure zu exprimieren, um das Protein oder ein immunmodulatorisches Fragment eines Vespidengift-Enzyms zu produzieren.
Derivate eines Vespidengift-Enzyms, wie zum Beispiel Fragmente und Fusionsproteine (siehe unten), werden zusätzlich bereitgestellt, sowie Nucleinsäuren, welche diese kodieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die vollständige Nucleinsäuresequenz eines Vespidengift-Enzyms bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Nucleinsäuresequenz einer Vespiden-Hyaluronidase, insbesondere der Hyaluronidase aus D. maculata bereit.
In einer spezifischen Ausführungsform wird, um eine Nucleinsäure, die ein Vespidengift-Enzym kodiert, zu erhalten, eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit der von Frohman et al. (1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:8998–9002; siehe auch Frohman, 1990, Amplifications: A Forum for PCR Users 5:11) beschriebenen Technik der schnellen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) kombiniert, um vor der Selektion ein Fragment zu amplifizieren, das eine das Vespidengift-Enzym umfassende Sequenz kodiert. Oligonucleotidprimer, die ein Vespidengift-Enzym der Erfindung repräsentieren, können als Primer bei der PCR verwendet werden. Im Allgemeinen werden derartige Primer synthetisch hergestellt. Sequenzen für derartige Oligonucleotidprimer können aus der Aminosäuresequenzinformation abgeleitet werden. Derartige Oligonucleotidsequenzen können nicht degeneriert sein, aber häufiger sind die Sequenzen degeneriert. Stärker bevorzugt beruhen die Primer auf den hierin offenbarten Nucleinsäuresequenzen für die Vespidengift-Enzyme. Die Oligonucleotide können als Primer benutzt werden, um Sequenzen aus einer (RNA- oder DNA-) Quelle, vorzugsweise einer cDNA-Bank, von möglichem Interesse durch PCR zu amplifizieren. Zum Beispiel kann PCR verwendet werden, um eine ein Vespidengift-Enzym kodierende Sequenz aus einer Vespiden-Säuredrüsen-cDNA-Bank zu amplifizieren. Die PCR kann z. B. durch Verwendung eines thermischen Cyclers von Perkin-Elmer Cetus und der Taq-Polymerase (Gene Amp^TM) ausgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner das Isolieren eines Homologs eines Vespidengift-Enzyms aus jeder Vespidenart bereit. Man kann es vorziehen, mehrere unterschiedliche degenerierte Primer zur Verwendung z. B. in PCR-Reaktionen zu synthetisieren. Es ist auch möglich, die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die beim Initiieren von PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um einen höheren oder geringeren Grad von Nucleotidsequenzähnlichkeit zwischen einem Homolog eines Vespidengift-Enzyms und einem spezifischen, hierin offenbarten Vespidengift-Enzym zu ermöglichen. Nach erfolgreicher Amplifikation eines Abschnitts von einem Homolog eines Vespidengift-Enzyms kann dieser Abschnitt kloniert und sequenziert werden und als Sonde benutzt werden, um einen vollständigen cDNA- oder genomischen Klon zu isolieren. Dies wird wiederum die Bestimmung der vollständigen Nucleotidsequenz, die Analyse ihrer Expression und die Herstellung ihres Proteinprodukts zur funktionellen Analyse, wie nachstehend beschrieben, gestatten. Auf diese Weise können zusätzliche Gene, die Vespidengift-Enzyme, insbesondere Phospholipasen und Hyaluronidasen kodieren, identifiziert und exprimiert werden.
In einer anderen Ausführungsform können Gene, die ein Vespidengift-Enzym kodieren, aus einer geeigneten Bank durch Durchmustern mit einer Sonde isoliert werden. Nützliche Sonden zum Isolieren eines Gens für ein Vespidengift-Enzym können aus der hierin bereitgestellten Sequenzinformation erzeugt werden.
Eine Expressionsbank kann durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, konstruiert werden. Vorzugsweise wird eine cDNA-Bank aus Zellen oder Geweben hergestellt, die ein Vespidengift-Enzym exprimieren, d. h. Zellen aus der Giftdrüse, die sich in der Nähe des Giftbeutels befindet. Manchmal wird die Giftdrüse als Säuredrüse bezeichnet. Zum Beispiel kann mRNA oder Gesamt-RNA isoliert werden, cDNA hergestellt und in einen Expressionsvektor (z. B. ein Plasmid- oder Bakteriophagenderivat) ligiert werden, so dass sie fähig ist, durch die Wirtszelle, in die sie dann eingeführt wird, exprimiert zu werden. Verschiedene Durchmusterungsassays können dann verwendet werden, um auf die positiven Klone zu selektieren. Zum Beispiel kann eine PCR mit geeigneten Primern, die beruhend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen synthetisiert werden können, verwendet werden. PCR wird bevorzugt, da die amplifizierte Herstellung direkt nachgewiesen werden kann, z. B. durch Ethidiumbromidfärbung. Alternativ dazu können markierte Sonden, die von den Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Anmeldung abgeleitet werden, verwendet werden, um die Kolonien durchzumustern.
Alternativ dazu kann die Anwesenheit des Gens durch Assays nachgewiesen werden, die auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts beruhen. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, welche die richtigen mRNAs durch Hybridisierung selektieren, selektiert werden, die ein Protein produzieren, das z. B. eine ähnliche oder identische elektrophoretische Wanderung, ein ähnliches oder identisches isoelektrisches Fokussierverhalten, ähnliche oder identische proteolytische Verdaukarten oder antigene Eigenschaften hat, wie sie für ein Vespidengift-Enzym bekannt sind.
Einige durch Bakterien exprimierte rekombinante Proteine, z. B. Vespidengift-Hyaluronidasen, reagieren mit Antikörpern, die für die nativen Proteine spezifisch sind. Andere bakteriell exprimierte rekombinante Proteine, wie zum Beispiel Vespiden-Phospholipasen, reagieren nicht mit Antikörpern, die für das native Protein spezifisch sind. Somit ist es in Fällen, wo die rekombinanten Proteine immunreaktiv sind, möglich, durch Immunblot auf positive Klone zu selektieren.
In einer anderen Ausführungsform kann die spezifische katalytische Aktivität des Enzyms, wie zum Beispiel die Hyaluronidaseaktivität einer exprimierten Vespidengift-Hyaluronidase zur Selektion verwendet werden. Bakteriell exprimierte eukaryotische Proteine falten sich jedoch vielleicht nicht in eine aktive Konformation.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann im Allgemeinen jedes Durchmusterungsverfahren auf positive Klone verwendet werden.
Alternativen zum Isolieren der genomischen DNA oder cDNA für ein Vespidengift-Enzym schließen chemisches Synthetisieren der Gensequenz selbst aus der hierin bereitgestellten Sequenz ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die vorstehenden Verfahren sollen die Verfahren, durch die Klone eines Vespidengift-Enzyms erhalten werden können, nicht beschränken.
Eine große Anzahl von Vektor-Wirts-Systemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, kann verwendet werden. Mögliche Vektoren schließen Plasmide oder modifizierte Viren ein, sind aber nicht darauf beschränkt, aber das Vektorsystem muss mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Derartige Vektoren schließen Bakteriophagen wie zum Beispiel Lambda-Derivate oder Plasmide wie zum Beispiel verschiedene pBR322-Derivate, zum Beispiel die Vektoren pUC, CR, pGEX, pmal-c, pFLAG usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Das Einfügen in einen Klonierungsvektor kann zum Beispiel durch Ligieren des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor erreicht werden, der komplementäre kohäsive Termini hat. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthalten die PCR-amplifizierten Nucleinsäuren der Erfindung 3'-überhängende A-Nucleotide und können direkt für das Klonieren in einen pCR-Vektor mit kompatiblen T-Nucleotidüberhängen (Invitrogen Corp., San Diego, CA) verwendet werden. Falls jedoch die komplementären Restriktrionsstellen, die zum Fragmentieren der DNA verwendet werden, im Klonierungsvektor nicht vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ dazu kann jede gewünschte Stelle durch Ligieren von Nucleotidsequenzen (Linkern) an die DNA-Termini hergestellt werden; diese ligierten Linker können spezifische, chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfassen, die Restriktionsendonuklase-Erkennungssequenzen kodieren. Bei einem alternativen Verfahren können der gespaltene Vektor und ein Gen für ein Vespidengift-Enzym durch Anhängen von Homopolymerenden modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in Wirtszellen eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
In spezifischen Ausführungsformen ermöglicht eine Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, welche das isolierte Gen, die cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenz für ein Vespidengift-Enzyme eingliedern, die Erzeugung von mehreren Kopien des Gens. Somit kann das Gen durch Wachsen-Lassen von Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle von den Transformanten und, falls notwendig, Rückgewinnen des eingefügten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA in großen Mengen erhalten werden.
Expression eines Vespidengift-Allergen-Polypeptids oder -Fragments
Die für ein Vespidengift-Enzym oder ein immunmodulatorisches Fragment, Derivat oder Analogon davon kodierende Nucleotidsequenz kann in einen geeigneten Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die zur Transkription und Translation der eingefügten Protein-kodierenden Sequenz notwendigen Elemente enthält, eingefügt werden. Derartige Elemente werden hierin als ein „Promotor" bezeichnet. Somit ist die das Vespidengift-Enzym kodierende Nucleinsäure mit dem Promotor funktionell assoziiert. Ein Expressionsvektor schließt vorzugsweise auch einen Replikationsursprung ein. Die notwendigen transkriptionellen und translationalen Signale können auch durch das native Gen, das ein Vespidengift-Enzym kodiert, und/oder dessen flankierende Regionen zur Verfügung gestellt werden. Mögliche Wirts-Vektor-Systeme schließen mit Virus (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus usw.) infizierte Säugerzellsysteme, mit Virus (z. B. Baculovirus) infizierte Insektenzellsysteme, Mikroorganismen wie zum Beispiel Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder mit einer Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformierte Bakterien ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. Je nach dem benutzten Wirts-Vektor-System kann jedes von etlichen geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein rekombinantes Vespidengift-Enzym der Erfindung oder ein immunmodulatorisches Fragment, Derivat oder Analogon davon nach der Integration der für das Vespidengift-Enzym kodierenden Sequenz durch Rekombination chromosomal exprimiert werden. Im Hinblick darauf kann jedes von etlichen Amplifikationssystemen verwendet werden, um hohe Niveaus stabiler Genexpression zu erreichen (siehe Sambrook et al., 1989, vorstehend, im Abschnitt 16.28).
Die Zelle, in welche der rekombinante Vektor, umfassend die Nucleinsäure, die das Vespidengift-Enzym kodiert, transformiert wurde, wird in einem geeigneten Zellkulturmedium unter Bedingungen gezüchtet, die eine Expression des Vespidengift-Enzyms durch die Zelle bereitstellen. Das exprimierte Vespidengift-Enzym kann dann gemäß auf dem Fachgebiet wohlbekannter Verfahren aus der Kultur gewonnen werden. Derartige Verfahren werden nachstehend im Detail beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Vespidengift-Enzym-Fusionsprotein exprimiert werden. Ein Vespidengift-Enzym-Fusionsprotein umfasst mindestens einen funktionell aktiven Anteil eines Proteins, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, das mittels einer Peptidbindung mit mindestens einem immunmodulatorischen Anteil eines Vespidengift-Enzyms verbunden ist. Die Sequenzen, bei denen es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, können amino- oder carboxylterminal zu den Vespidengift-Enzym-Sequenzen liegen. Ein rekombinantes DNA-Molekül, das ein derartiges Fusionsprotein kodiert, umfasst eine Sequenz, die mindestens einen funktionell aktiven Anteil eines Enzyms kodiert, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, im Leserahmen verbunden mit der kodierenden Sequenz für ein Vespi dengift-Enzym, und kodiert vorzugsweise eine Spaltungsstelle für eine spezifische Protease, z. B. Faktor Xa, vorzugsweise an der Verbindungsstelle der beiden Proteine.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird ein Fragment des Vespidengift-Enzyms als freies Protein (bei dem es sich nicht um ein Fusionsprotein handelt) exprimiert.
In einer spezifischen Ausführungsform werden die Vespidengift-Phospholipase und immunmodulatorische Fragmente davon mit einer zusätzlichen Sequenz exprimiert, die etwa sechs Histidinreste umfasst, z. B. unter Verwendung des Vektors pQE12 (QIA-GEN, Chatsworth, CA). Die Anwesenheit des Histidins ermöglicht die selektive Isolierung rekombinanter Proteine auf einer Ni-Chelatbildungssäule.
In einer anderen Ausführungsform kann eine periplasmatische Form des Fusionsproteins (das eine Signalsequenz enthält) zum Export des Proteins in das Periplasma von Escherichia coli produziert werden. Der Export in das Periplasma kann das richtige Falten des exprimierten Proteins fördern.
Jedes der zuvor beschriebenen Verfahren für das Einfügen von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein Gen enthalten, das aus geeigneten transkriptionellen/translationalen Kontrollsignalen und den Protein-kodierenden Sequenzen besteht. Diese Verfahren können rekombinante DNA- und synthetische in-vitro-Techniken und in-vivo-Rekombinanten (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer Nucleinsäuresequenz, die ein Vespidengift-Enzym oder ein immunmodulatorisches Fragment davon kodiert, kann durch eine zweite Nucleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das Vespidengift-Enzym-Protein oder -Peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expressions eines Vespidengift-Enzym-Proteins durch jedes auf dem Fachgebiet bekannte Promotor-/Enhancerelement kontrolliert werden, diese regulatorischen Elemente müssen aber in dem zur Expression ausgewählten Wirt funktionell sein. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression eines Gens für ein Vespidengift-Enzym zu kontrollieren, schließen die frühe Promotorregion von SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290:304–310), den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rous-Sarcomvirus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787–797), den Thymidinkinase-Promotor von Herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296:39–42), prokaryotische Expressionsvektoren, wie zum Beispiel den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21–25), siehe auch „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74–94, Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie zum Beispiel den Gal 4 Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase) Promotor, den PGK (Phosphoglycerin-Kinase) Promotor, den Promotor der alkalischen Phosphatase und die tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und bei transgenen Tieren benutzt worden sind, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäure enthalten, die ein Vespidengift-Enzym kodiert, können durch vier allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) PCR-Amplifikation der gewünschten Plasmid-DNA oder spezifischen mRNA, (b) Nucleinsäurehybridisierung, (c) Anwesenheit oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen und (d) Expression eingefügter Sequenzen. Beim ersten Ansatz können die Nucleinsäuren durch PCR amplifiziert werden, um einen Nachweis des amplifizierten Produkts bereitzustellen. Beim zweiten Ansatz kann die Anwesenheit eines fremden, in einen Expressionsvektor eingefügten Gens durch Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die Sequenzen umfassen, die zu einem eingefügten Gen für ein Vespidengift-Enzym homolog sind. Beim dritten Ansatz kann das rekombinante Vektor-/Wirtssystem beruhend auf der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter „Marker"-Genfunktionen (z. B. β-Galactosidase-Aktivität, Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung bei Baculovirus usw.), die durch das Einfügen fremder Gene in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. In einem spezifischen Beispiel umfasst das Fusionsprotein das „Marker"-Genprodukt und ein Vespidengift-Enzym. Bei einem anderen Beispiel können Rekombinanten, die das Vespidengift-Enzym-Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden, falls die ein Vespidengift-Enzym kodierende Nucleinsäure innerhalb der Markergensequenz des Vektors eingefügt ist. Beim vierten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Analysieren auf die Aktivität des Genprodukts identifiziert werden, das durch die Rekombinante bereitgestellt wird, vorausgesetzt, dass sich das exprimierte Protein in die geeignete Konformation faltet. Derartige Assays können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften eines Vespidengift-Enzym-Genprodukts in Assaysystemen in vitro, z. B. der Phospholipase- oder Lipase-Aktivität von Vespidengift-Phospholipasen oder der Hyaluronidase-Aktivität von Vespidengift-Hyaluronidasen oder alternativ dazu einer Antikörperbindung beruhen.
Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist, können einige auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden, um es zu vermehren. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren in großer Menge vermehrt und hergestellt werden. Wie zuvor erklärt wurde, schließen die Expressionsvektoren, die vewendet werden können, die folgenden Vektoren oder ihre Derivate ein, sind aber nicht darauf beschränkt: menschliche oder tierische Viren wie zum Beispiel Vacciniavirus oder Adenovirus, Insektenviren wie zum Beispiel Baculovirus, Hefevektoren, Bakteriophagenvektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt auf die spezifische gewünschte Weise modifiziert und prozessiert. Unterschiedliche Wirtszellen haben charakteristische und spezifische Mechanismen für das translationale und posttranslationale Prozessieren und Modifizieren (z. B. Glycosylierung, Spaltung [z. B. einer Signalsequenz]) von Proteinen. Geeignete Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die gewünschte Modifikation und das Prozessieren des fremden exprimierten Proteins sicherzustellen. Zum Beispiel kann die Expression in einem Bakteriensystem verwendet werden, um ein nicht glycosyliertes Core-Proteinprodukt herzustellen. Es kann jedoch sein, dass das in Bakterien exprimierte Enzymprotein nicht richtig gefaltet ist. Die Expression in Hefe kann ein glycosyliertes Produkt herstellen. Die Expression in Insektenzellen kann verwendet werden, um die Wahrscheinlichkeit von „nativer" Glycosylierung und Faltung eines heterologen Vespidengift-Enzyms zu erhöhen. Darüberhinaus können unterschiedliche Vektor-/Wirts-Expressionssysteme Prozessierungsreaktionen, wie zum Beispiel proteolytische Spaltungen, in unterschiedlichem Ausmaß beeinflussen. Es ist interessant anzumerken, dass beobachtet worden ist, dass Glycosylierung und richtige Neufaltung für eine immunmodulatorische Aktivität eines Vespidengift-Allergens nicht essentiell sind, da ein in Bakterien hergestelltes Allergen in einem T-Zell-Proliferationsassay aktiv ist.
Vektoren werden in die gewünschten Wirtszellen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren eingeführt, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Kalziumphosphatfällung, Lipofektion (Lysosomenfusion), Verwendung einer Genkanone oder eines DNA-Vektor-Transporters (siehe z. B. Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963–967; Wu und Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621–14624; Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2.012.311, eingereicht am 15. März 1990).
Sowohl cDNA- als auch genomische Sequenzen können kloniert und exprimiert werden.
Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die Vespidengift-Enzyme der vorliegen- den Erfindung oder Fragmente, Derivate oder Analoga davon synthetisch hergestellt werden können, z. B. durch Festphasen-Peptidsynthese.
Sobald das rekombinante Vespidengift-Enzym-Protein identifiziert ist, kann es durch Standardverfahren einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Größenauftrennungs-Säulenchromatographie), Zentrifugation, differentielle Löslichkeit oder durch jede andere Standardtechnik zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden.
In einer spezifischen Ausführungsform können ein Vespidengift-Enzym und Fragmente davon gentechnisch so verändert werden, dass sie etwa sechs Histidylreste einschließen, was die selektive Isolierung des rekombinanten Proteins auf einer Ni-Chelatbildungssäule ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine durch Reverse-Phase-Chromatographie weiter gereinigt.
In einer anderen Ausführungsform, bei der das rekombinante Vespidengift-Enzym als Fusionsprotein exprimiert wird, kann man zur Affinitätsreinigung auf den Anteil des Fusionsproteins, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, abzielen. Zum Beispiel kann ein Antikörper, der für den Anteil des Fusionsproteins, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, auf einem festen Träger, z. B. Cyanbromid-aktivierter Sepharose, immobilisiert und verwendet werden, um das Fusionsprotein zu reinigen. In einer anderen Ausführungsform kann ein Bindungspartner des Anteils des Fusionsproteins, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, wie zum Beispiel ein Rezeptor oder Ligand, immobilisiert werden und verwendet werden, um das Fusionsprotein über Affinität zu reinigen.
In einer Ausführungsform wird ein, vorzugsweise gereinigtes, Vespidengift-Enzym-Fusionsprotein ohne weitere Modifikation verwendet, d. h. ohne den Anteil des Fusionsproteins, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym handelt, abzuspalten oder auf andere Weise zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Vespidengift-Enzym-Fusionsprotein therapeutisch verwendet werden, z. B. um eine Immunreaktion zu modulieren.
In einer weiteren Ausführungsform wird das gereinigte Fusionsprotein behandelt, um das Protein, bei dem es sich nicht um ein Vespidengift-Enzym-Protein oder den Anteil davon handelt, vom Vespidengift-Enzym abzuspalten. Zum Beispiel kann das Fusionsprotein, wo es so hergestellt worden ist, dass es eine proteaseempfindliche Spaltungsstelle einschließt, mit der Protease behandelt werden, um die proteasespezifische Stelle zu spalten und das Vespidengift-Enzym freizusetzen. In einer spezi fischen Ausführungsform wird das Fusionsprotein durch Behandlung mit Faktor Xa gespalten.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Vespidengift-Phospholipase-Protein erneut gefaltet werden.
In einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließen derartige rekombinante Vespidengift-Enzyme diejenigen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die als primäre Aminosäuresequenz im Wesentlichen die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz enthalten, die in den 1 (SEQ ID NO:17), 5 (SEQ ID NO:27) oder 6 (SEQ ID NO:55) abgebildet ist, sowie Fragmente und andere Derivate und Analoga davon.
Derivative und Analoga von Vespidengift-Enzymen
Die Erfindung betrifft ferner Derivate und Analoga von Vespidengift-Enzymen. Die Herstellung und Verwendung von Derivaten und Analoga, die mit Vespidengift-Enzymen zusammenhängen, befinden sich innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Das Derivat oder Analogon ist immunmodulatorisch, d. h. fähig, eine Antigen-spezifische Immunreaktion zu modulieren. In einer anderen Ausführungsform kann das Derivat oder Analogon an ein für ein Vespidengift-Enzym spezifisches Immunglobulin, einschließlich IgG und IgE, binden. Derivate oder Analoga von Vespidengift-Enzymen können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die nachstehend beschriebenen Assays, auf die gewünschte immunmodulatorische Aktivität getestet werden.
Insbesondere können die Vespidengift-Enzymderivate durch Verändern der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen hergestellt werden, die funktionell äquivalente Moleküle bereitstellen. Auf Grund der Degeneriertheit kodierender Nucleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz kodieren wie eine Nucleinsäure, die ein Vespidengift-Enzym kodiert, beim Ausüben der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen Nucleotidsequenzen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die ein ganzes Gen oder Teilstücke eines Gens umfassen, welches das Vespidengift-Enzym kodiert, die durch die Substitution unterschiedlicher Codons verändert sind, die den gleichen Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wodurch eine stille Änderung hergestellt wird. Auf ähnliche Weise schließen die Derivate der Erfindung diejenigen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die als primäre Aminosäuresequenz die ganze oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines Vespidengift-Enzyms enthalten, einschließlich veränderter Sequenzen, bei denen funktionell äquivalente Aminosäurereste für Reste innerhalb der Sequenz substituiert sind, was zu einer konservativen Aminosäuresubstitution führt. Zum Beispiel kann ein Aminosäurerest oder können mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Polarität substituiert werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, was zu einer stillen Veränderung führt. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
Derivate oder Analoga eines Vespidengift-Enzyms schließen diejenigen ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die im Wesentlichen homolog zu einem Vespidengift-Enzym oder Fragmenten davon sind, oder deren kodierende Nucleinsäure fähig ist, an eine Nucleinsäure zu hybridisieren, die ein Vespidengift-Enzym kodiert. Die Hybridisierung kann unter mäßig stringenten bis hochstringenten Bedingungen stattfinden, je nach dem Grad der Sequenzähnlichkeit, wie auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist.
Die Derivate und Analoga der Erfindung können durch verschiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Herstellung führen, können auf der Gen- oder Proteinebene stattfinden. Zum Beispiel kann die Nucleinsäuresequenz des klonierten Vespidengift-Enzyms durch eine von zahlreichen Strategien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), modifiziert werden. Die Sequenz kann in vitro an geeigneten Stellen mit (einer) Restriktionsendonuklease(n) gespalten werden, falls gewünscht gefolgt von weiterer enzymatischer Modifikation, isoliert und ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein Derivat oder Analogon eines Vespidengift-Enzyms kodiert, sollte man darauf achten sicherzustellen, dass das modifizierte Gen, nicht durch translationale Stoppsignale unterbrochen, innerhalb des gleichen translationalen Leserahmens wie das Vespidengift-Enzym verbleibt.
Zusätzlich kann das Gen, das ein Vespidengift-Enzym kodiert, in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations und/oder Terminationssequenzen zu schaffen und/oder zu zerstören, oder um Variationen in kodierenden Bereichen zu schaffen und/oder um neue Restriktionsendonukleasestellen zu bilden oder vorbestehende zu zerstören, um die Modifikation in vitro weiter zu erleichtern. Jede auf dem Fachgebiet bekannte Mutagenesetechnik kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ortsgerichtete in-vitro-Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller und Smith, 1984, DNA 3:479–488; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), Verwendung von TAB^®-Linkern (Pharmacia) usw. PCR-Techniken werden für die ortsgerichtete Mutagenese bevorzugt (siehe Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, Kapitel 6, S. 61–70).
Manipulationen des rekombinanten Vespidengift-Enzyms können auch auf der Proteinebene durchgeführt werden. Im Umfang der Erfindung eingeschlossen sind rekombinante Vespidengift-Enzymfragmente oder andere Derivate oder Analoga, die während oder nach der Translation differentiell modifiziert werden, z. B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Reduktion und Carboxylmethylierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockierungsgruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem Antikörpermolekül oder einem anderen zellulären Liganden usw. Jede von zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Techniken ausgeführt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf spezifische chemische Spaltung durch Cyanbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH₄; Acetylierung, Formylierung, Oxidation, Reduktion; metabolische Synthese in Anwesenheit von Tunicamycin usw.
In einer bestimmten Ausführungsform wird das Vespidengift-Enzym oder immunmodulatorische Fragment davon in einem Insektenzell-Expressionssystem, z. B. unter Vewendung eines Baculovirus-Expressionsvektors, exprimiert. Wie vorstehend hervorgehoben wurde, sollte dies eine „native" Glycosylierung und Struktur, besonders Sekundär- und Tertiärstruktur, des exprimierten Polypeptids ergeben. Eine native Glycosylierung und Struktur des exprimierten Polypeptids kann für diagnostische Verwendungen sehr wichtig sein, da die für das Enzym spezifischen Antikörper, die in diagnostischen Assays nachgewiesen werden, für das native Enzym spezifisch sein werden, d. h. so, wie es durch den Stich einer Vespide eingeführt wurde.
Aktivitätsassays mit Peptiden der Erfindung
Zahlreiche Assays sind in der Immunologie zum Auswerten der immunmodulatorischen Aktivität eines Antigens bekannt. Zum Beispiel können die durch die Expression der Nucleinsäuren der Erfindung hergestellten Vespidengift-Enzym-Proteine in diagnostischen Assays für allergische Erkrankungen, die nachstehend im Detail beschrieben werden, verwendet werden. Im Allgemeinen können derartige Proteine auf die Fähigkeit getestet werden, an Antikörper zu binden, die für das Enzym spezifisch sind. Vorzugs weise gehören derartige Antikörper, die in dem diagnostischen Assay nachgewiesen werden, zur IgE-Klasse. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass festgestellt worden ist, dass natürliche, Allergen-spezifische Antikörper schwach an denaturierte Vespidengift-Allergene binden. Vespidengift-Enzyme, die in eukaryotischen Expressionssystemen und besonders Insektenzell-Expressionssystemen hergestellt werden, können die korrekte Struktur für eine Antikörperbindung haben. Vespidengift-Enzyme, die in bakteriellen Expressionssystemen exprimiert werden, haben sie vielleicht nicht, und würden somit vor der Verwendung in einem diagnostischen Assay für eine Antikörperbindung eine Neufaltung erfordern.
In einer anderen Ausführungsform können die Proteine der Erfindung in einem Proliferationsassay für T-Zell-Reaktionen getestet werden. Für derartige T-Zell-Reaktionsassays scheint das zum Herstellen des Enzyms verwendete Expressionssystem die immunmodulatorische Aktivität des Proteins nicht zu beeinflussen. Im Allgemeinen werden Lymphozyten von einem sensibilisierten Wirt erhalten. Bei dem Wirt kann es sich um eine Maus handeln, die mit einer Vespidengift-Hyaluronidase immunisiert worden ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung rekombinant hergestellt worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden periphere Blutleukozyten von einem Menschen erhalten, der gegen Vespidengift empfindlich ist. Unter Verwendung von Techniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, kann die T-Lymphozytenreaktion gegen das Protein in vitro gemessen werden. In einer spezifischen, nachstehend angegebenen Ausführungsform können T-Zell-Reaktionen durch Messen der Eingliederung von ³H-Thymidin nachgewiesen werden, das mit der DNA-Synthese, die mit einer Proliferation assoziiert ist, zunimmt.
Die Zellproliferation kann auch unter Verwendung eines MTT-Assays nachgewiesen werden (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55–63; Niks und Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140–151). Jedes auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum Nachweisen einer T-Zell-Proliferation kann mit dem Vespidenenzym verwendet werden, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
Auf ähnliche Weise können Lymphokinproduktionsassays gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeübt werden. In einer Ausführungsform kann die Lymphokinproduktion unter Verwendung immunologischer oder Kostimulierungs-Assays (siehe z. B. Fehlner et al., 1991, J. Immunol. 146:799) oder unter Verwendung der ELISPOT-Technik (Czerkinsky, et al., 1988, J. Immunol. Methods 110:29) analysiert werden. Alternativ dazu kann mRNA für Lymphokine nachgewiesen werden, z. B. durch Amplifikation (siehe Brenner, et al., 1989, Biotechniques 7:1096) oder in-situ-Hybridisierung (siehe z. B. Kasaian und Biron, 1989, J. Immunol. 142:1287). Von besonderem Interesse sind diejenigen Individuen, deren T-Zellen Lymphokine produzieren, die mit IgE-Isotypwechselereignissen assoziiert sind, z. B. IL-4 und IL-5 (Purkeson und Isakson, 1992, J. Exp. Med. 175:973–982). Auch von Interesse sind die Polypeptidfragmente des Vespidengift-Enzyms, die Epitope enthalten, die von T-Zellen, die an IgE-Wechselereignissen beteiligt sind, erkannt werden.
Somit können, in einer bevorzugten Ausführungsform, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Proteine in in-vitro-Assays mit peripheren Blutlymphozyten oder, stärker bevorzugt, aus peripheren Blutlymphozyten abgeleiteten Zelllinien verwendet werden, die aus Individuen erhalten werden, die gegen Vespidengift-Enzym empfindlich sind, um die Sekretion von Lymphokinen, die normalerweise mit einer allergischen Reaktion assoziiert sind, z. B. IL-4, nachzuweisen. Derartige Assays können anzeigen, welche Giftkomponente oder -komponenten für das allergische Leiden verantwortlich sind. Noch wichtiger, die Fragmente des Vespidengift-Enzyms können getestet werden. Auf diese Weise können spezifische Epitope, die für T-Zell-Reaktionen, die mit allergischen Reaktionen assoziiert sind, verantwortlich sind, identifiziert werden. Die Sequenzen derartiger Epitope können mit anderen Vespidengift-Enzymen und mit Umwelt- oder autologen Proteinen verglichen werden, um zu bestimmen, ob es Sequenzähnlichkeiten gibt, die eine mögliche Kreuzreaktivität nahelegen. Die Peptide können auf die Fähigkeit, T-Zell-Anergie zu induzieren, getestet werden, z. B. durch Verabreichung einer Megadosis, Modifikation, um einen Epitop-Antagonisten herzustellen, Verabreichung in Abwesenheit der geeigneten kostimulatorischen Signale und andere Verfahren, von denen man denkt, dass sie zu T-Zell-Anergie führen. Peptide, die derartige Epitope enthalten, sind ideale Kandidaten für Therapeutika.
In einer weiteren Ausführungsform können die Polypeptide der Erfindung direkt in Assays verwendet werden, um das Ausmaß der Kreuzreaktivität mit anderen Umweltproteinen und/oder homologen Proteinen nachzuweisen, mit denen sie eine Sequenzähnlichkeit teilen. Insbesondere können die Fragmente von Vespidengift-Enzymen, die eine Sequenzähnlichkeit mit derartigen Umwelt- und, genauer gesagt, homologen Proteinen haben, auf eine Kreuzreaktivität mit Antikörpern oder einer T-Zelle, die für derartige Proteine spezifisch sind(ist), ausgewertet werden. In einer spezifischen Ausführungsform kann die Kreuzreaktivität von Vespidengift-Phospholipasen mit menschlichen Lipasen ausgewertet werden. In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird die Kreuzreaktivität einer Vespidengift-Hyaluronidase mit dem Spermamembranprotein PH-20 ausgewertet.
Diagnostische und therapeutische Verwendungen der Vespidengift-Enzym-Polypeptide
Die vorliegende Erfindung stellt eine reichliche Quelle eines reinen Vespidengift-Enzyms oder von Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon bereit, hergestellt durch rekombinante Techniken. Alternativ dazu können Polypeptidfragmente, Derivate oder Analoga der Vespidengift-Enzyme angesichts der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Sequenzinformation zweckmäßigerweise durch Peptidsynthese hergestellt werden.
Die Erfindung zieht die Verwendung von Vespidengift-Enzymen oder immunmodulatorischen Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon für die Herstellung diagnostischer oder therapeutischer Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Diagnose und Therapie von allergischen Leiden in Betracht, die für Vespidengift-Allergene spezifisch sind. Insbesondere wird die Vespiden-Hyaluronidase, insbesondere die Hyaluronidase von D. maculata, oder immunmodulatorische Fragmente, Derivate oder Analoga der Hyaluronidase, zur Verwendung bei der Diagnose und Therapie gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Diagnostische Verfahren
Wie hierin verwendet schließt der Begriff diagnostisch diagnostische Assays in vitro und in vivo ein. Im Allgemeinen werden derartige Assays so gestaltet, dass sie die Aktivität von IgE-Antikörpern, die für ein gegebenes Allergen spezifisch sind, messen. Derartige diagnostische Assays hängen stark von der Erhältlichkeit von reinem Allergen ab. Dies trifft besonders auf das Bestimmen der Empfindlichkeit gegen eine spezifische Allergenkomponente eines Vespidengifts zu. Diagnotische in-vitro-Assays für eine Enzymempfindlichkeit schließen den Radioimmunassay (RIA), den immunradiometrischen Immunassay (IRMA), den Radio-Allergen-Sorbent-Test (RAST), den enzymverbundenen Immunabsorptionsassay (ELISA), ELISPOT, den magnetischen Allergen-Sorbent-Assay, Immunblots, Histaminfreisetzungsassays und dergleichen ein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung das Bestimmen der Anwesenheit von Epitopen bereit, die vorwiegend mit IgE-Antikörpern oder mit anderen Isotypen, z. B. IgG, reagieren. Derartige Epitope können überlappen oder getrennt sein. Insbesondere können Fragmente der Vespidengift-Enzyme der Erfindung verwendet werden, um derartige spezifische B-Zell-Epitope zu identifizieren. Die Identifizierung spezifischer Epitope kann eine Grundlage zum Entwickeln von Therapien, wie nachstehend beschrieben, bereitstellen.
Die vorliegende Erfindung zieht diagnostische in-vitro-Assays auf peripheren Blutlymphozyten, wie vorstehend beschrieben, in Betracht. Derartige diagnostische Assays können eine detaillierte Information über die enzymspezifischen T-Zell-Reaktionen, den Phänotyp der T-Zell-Reaktion und vorzugsweise das T-Zell-Epitop des Enzyms, das an den T-Zell-Reaktionen beteiligt ist, ergeben. Das immundominante Epitop und das an IgE-Isotypklassenwechselereignissen beteiligte Epitop können nachgewiesen werden, falls es sich nicht um das gleiche handelt. Insbesondere können die T-Zell-Epitope von Vespidengift-Enzymen, welche die Proliferation und/oder Lymphokinsekretion von T-Zellen eines mit IgE-Isotypklassenwechselereignissen assoziierten Phänotyps stimulieren, für ein spezifisches Individuum oder für eine Klasse von Individuen, die einen MHC-Haplotyp oder die vorwiegende Expression einer variablen Region des T-Zell-Rezeptors, oder beides, miteinander teilen, identifiziert werden.
In-vivo-Assays für Allergenität bestehen im Allgemeinen aus Empfindlichkeitsassays mit Hautstichen, bei denen seriell verdünnte Mengen eines Allergens entweder subkutan oder interdermal in die Haut eines Patienten verabreicht werden und Hofbildungs- und Hautrötungsreaktionen nachgewiesen werden. Wie bei in-vitro-Assays erhöht die Erhältlichkeit von reinem Giftenzym den Wert der Ergebnisse des diagnostischen in-vivo-Assays sehr, weil eine Kreuzreaktivität mit Verunreinigungen in aus Vespidengiftbeuteln hergestellten Extrakten vermieden werden kann.
Therapeutische Verfahren
Therapeutische Zusammensetzungen der Erfindung (siehe unten) können bei einer Immuntherapie, auch als Hyposensibilisierungstherapie bezeichnet, verwendet werden. Bei allergischen Krankheiten, besonders Insektenallergie, hat sich die Immuntherapie als wirksam erwiesen. Allergene werden über einen langen Zeitraum in allmählich ansteigenden Dosen parenteral verabreicht. Eine derartige Therapie kann besonders wirksam sein, wenn das Allergen oder die Allergene gegen das (die) der Patient empfindlich ist, spezifisch identifiziert worden ist (sind) und die Therapie auf dieses) Allergene) abzielt. Somit ist die Erhältlichkeit von reinem Vespidengift-Enzym in großen Mengen für die Immuntherapie einer Allergie wichtig.
In einer anderen Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden in Betracht, die mindestens ein immunmodulatorisches T-Zell-Epitop eines Vespidengift-Enzyms enthalten, um eine spezifische T-Zell-Anergie gegen das Vespidengift-Enzym zu induzieren. Die Identifizierung derartiger Peptide wird vorstehend beschrieben. Stärker bevorzugt kann ein Peptid, das ein derartiges T-Zell-Epitop umfasst und dem ein B-Zell-Epitop fehlt, einem Patienten verabreicht werden.
Wie im Hintergrund der Erfindung diskutiert, kann die Anwesenheit eines B-Zell-Epitops auf einem Allergen eine unerwünschte systemische Reaktion verursachen, wenn das Allergen zur Immuntherapie verwendet wird. Somit ist ein besonderer Vorteil der Erfindung die Fähigkeit, Allergenpolypeptide bereitzustellen, die keine unerwünschten systemischen Wirkungen verursachen.
In einer Ausführungsform können ein oder mehrere Peptidfragmente subkutan injiziert werden, um die T-Zell-Reaktion auf das ganze Molekül zu senken, wie z. B. von Brine et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:7608–12) beschrieben wird.
In einer anderen Ausführungsform können ein oder mehrere Polypeptidfragmente intranasal verabreicht werden, um Allergen-spezifische Reaktionen in naiven und sensibilisierten Versuchspersonen zu unterdrücken (siehe z. B. Hoyne et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1783–88).
Es wird erwartet, dass die Verabreichung eines Vespidengift-Enzym-Peptids der Erfindung Anergie induziert, was zum Beenden einer Allergen-spezifischen Antikörperproduktion oder einer Allergen-spezifischen T-Zell-Reaktion, oder beidem, führt und somit eine therapeutische Wirkung hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine auf einem Peptid beruhende Therapie, um T-Zell-Anergie zu induzieren, für jedes Individuum oder eine Gruppe von Individuen hergerichtet. Unter Verwendung der diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung kann das spezifische T-Zell-Epitop oder können die spezifischen T-Zell-Epitope eines an der allergischen Reaktion beteiligten Vespidengift-Enzyms identifiziert werden. Peptide, welche diese Epitope umfassen, können dann in einem individualisierten Immuntherapieregime verwendet werden.
Pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen
Die diagnostischen oder therapeutischen in-vivo-Zusammensetzungen der Erfindung können auch geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger, Exzipienten, Verdünnungsmittel und Adjuvanzien enthalten. Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglich" vorzugsweise durch eine regulierende Behörde einer Regierung erlaubt, insbesondere der Bundesregierung oder der Regierung eines Bundesstaates, oder in der US-Pharmakopöe oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmakopöe zur Verwendung bei Tieren und ganz besonders bei Menschen aufgeführt. Geeignete pharmazeutische Träger werden in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben.
Bei derartigen pharmazeutisch verträglichen Trägern kann es sich um sterile Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Wasser und Öle handeln, einschließlich derjenigen, die aus Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung stammen, wie zum Beispiel Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können auch als flüssige Träger eingesetzt werden, besonders für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Exzipienten schließen Mannitol, menschliches Serumalbumin (HSA), Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Magnesiumcarbonat, Magnesiumstearat, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talkum, Natriumchlorid, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen ein. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Retardformulierungen und dergleichen annehmen.
Derartige Zusammensetzungen enthalten eine wirksame diagnostische oder therapeutische Menge des Wirkstoffes zusammen mit einer geeigneten Menge Träger, um so die Form für die richtige Verabreichung an den Patienten bereitzustellen. Während intravenöse Injektion eine sehr wirksame Form der Verabreichung ist, können andere Verfahren eingesetzt werden, wie zum Beispiel durch Injektion oder durch orale, nasale oder parenterale Verabreichung.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter verdeutlicht, die rein beispielhaft für die Erfindung sein sollen.
BEISPIEL 1: HYALURONIDASE AUS DOLICHOVESPULA MACULATA
Hyaluronidase ist eines der drei Hauptallergene des Giftes aus Dolichovespula maculata. Es handelt sich um ein Protein von etwa 43 kD, wie durch SDS-Gelelektrophorese geschätzt wird (King et al., 1978, Biochem. 17:5165–74). Ihre enzymatische Spezifität gehört zum Typ der Endo-N-acetylhexosaminidase (King et al., 1985, Allergy Clin. Immunol. 75:621–628), da sie die Freisetzung von reduzierenden N-Acetylglucosamingruppen aus Hyaluronsäure katalysiert, bei der es sich um ein Polymer sich wiederholender Disaccharide von D-Glucuronsäure und N-Acetyl-D-Glucosamin handelt.
Partielle Aminosäuresequenzdaten wurden durch Edman-Abbau des intakten Proteins und seiner mit Protease von S. aureaus verdauten Peptide erhalten. Zwei degenerierte Oligonucleotide, SEQ ID NO:29 und 31 (Tabelle 2), wurden beruhend auf partiellen Aminosäuresequenzdaten synthetisiert und sie wurden als Primer in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um die für diese Primer spezifische cDNA aus Gift-cDNAs zu amplifizieren. Die Position des Oligonucleotids mit der SEQ ID NO:29 in der Proteinsequenz war bekannt und es kodiert die Reste 8–13 der Hyaluronidase (SEQ ID NO:28). Die Position des Oligonucleotids mit der SEQ ID NO:31 wurde durch Vergleich der translatierten Sequenz des PCR-Produkts mit den partiellen Aminosäuresequenzdaten der Hyaluronidase etabliert und es kodiert die Reste 40–45 (SEQ ID NO:30). Tabelle 2 Oligonucleotidprimer zum Klonieren und Sequenzieren der Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase
Aus den DNA-Sequenzdaten, welche die Reste 8–45 der Hyaluronidase kodieren, wurden zusätzliche Oligonucleotidprimer, SEQ ID NO:33 und 35 (Tabelle 2), synthetisiert. Sie wurden zusammen mit den Oligonucleotiden SEQ ID NO:44 und 45 verwendet, um die 3'-Enden der die Hyaluronidase kodierenden cDNA durch das Verfahren von Frohman et al. (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998–9002) zu amplifizieren, das im Allgemeinen als schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) bekannt ist. Auf diese Weise wurde ein cDNA-Fragment, das die Nucleotide 127–1229 enthält (6; SEQ ID NO:54), erhalten. Ein anderes Set aus den Primern SEQ ID NO:37, 39 und 41 (Tabelle 2) wurde beruhend auf den DNA-Sequenzdaten der 3'-RACE synthetisiert. Sie wurden zusammen mit den Primern SEQ ID NO:43 und 44 verwendet, um das 5'-Ende der cDNA, dem RACE-Protokoll folgend, zu amplifizieren und das cDNA-Fragment, das die Nucleotide 1–246 enthält, wurde erhalten.
Die N-terminale Sequenz der Hyaluronidase für die Reste 1–45, die durch Edman-Abbau abgeleitet wurde, wird durch die Nucleotidposition 61–204 in 6 (SEQ ID NO:54) kodiert. Der Bereich der Nucleotidposition 1–60 kodiert wahrscheinlich einen Anteil des „Prepro"-Abschnittes der Hyaluronidase. Die Anwesenheit eines Stoppcodons an der Nucleotidposition 19–21 ist jedoch unerwartet, und sie kann möglicherweise das unvollständige Spleißen von mRNA repräsentieren. Der kodierende Bereich der DNA in 6 endet an der Position 1053, da dieser Position ein Stoppcodon folgt. Der Bereich der Nucleotidposition 1057–1229 repräsentiert den 3'-untranslatierten Bereich mit einem polyA-Schwanz, aber ohne eine AATAAA-Polyadenylierungssignalstelle.
Die Oligonucleotidprimer SEQ ID NO:47 und 49 (Tabelle 2) wurden aus den Daten in 6 (SEQ ID NO:54) synthetisiert. Sie wurden verwendet, um die cDNA, welche die Hyaluronidase voller Länge kodiert, zur Expression in Bakterien zu amplifizieren.
DNA-Fragmente aus der 3'- oder 5'-RACE und PCR zur Expression von Hyaluronidase wurden in den Vektor pCR (Invitrogen Corp., San Diego, CA) kloniert. Plasmid-DNAs wurden aus geeigneten Klonen isoliert, dann durch das Dideoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren nach Sanger unter Verwendung eines Sequenase Kits der Version 2.0 (U.S. Biochemical, Cleveland, OH) sequenziert. Die DNA-Sequenz in 6 (SEQ ID NO:54) wurde aus den Daten der 5 Klone aus der 3'-RACE, der 4 Klone aus der 5'-RACE und einem Klon aus einer spezifischen PCR zur Expression von Hyaluronidase zusammengesetzt. Es gibt genügend Überlappungen der Sequenzdaten dieser Klone, so dass jede Nucleotidposition in 6 (SEQ ID NO:54) den Konsensus aus 4 oder mehr Klonen repräsentiert. Die einzige Ausnahme ist der Bereich der Position 1–45, der aus 2 Klonen erhalten wurde. Es gibt mehrere Mutationen dieser Klone, die in Tabelle 3 aufgeführt sind. Bei den meisten handelt es sich um stille Mutationen, aber 2 von ihnen führen zu Aminosäuresubstitutionen. Diese Mutationen können auf eine Ungenauigkeit der Baseneingliederung bei der PCR zurückzuführen sein, oder sie können allelische Formen repräsentieren. Tabelle 3 Sequenzmutationen von Klonen aus der 3'- und 5'-RACE und Expressions-PCR*

*Die Konsensussequenz wird in 6 (SEQ ID NO:54) angegeben. Eine Mutation an Position 151 führt zu einer Codonänderung von AAT für Asparagin zu GAT für Asparaginsäure und an Position 199 von ATC für Isoleucin zu TTC für Phenylalanin. Mutationen an den Positionen 251, 259 und 642 führten nicht zu Codonänderungen. Die verbleibenden Mutationen liegen in der nicht translatierten 3'-Region.

Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:55) von den DNA-Daten in 6 (SEQ ID NO:54) zeigt an, dass Hyaluronidase 331 Aminosäurereste mit einem Molekulargewicht von 38.929 Dalton hat. Das Molekulargewicht von Hyaluronidase wurde mit etwa 43 kDa aus SDS-Gelelektrophoresedaten bestimmt. Der Molekulargewichtsunterschied zeigt höchstwahrscheinlich an, dass es sich bei Hyaluronidase um ein Glycoprotein handelt, da die translatierte Sequenz ein mögliches Asn-Glycosylierungsmotiv Asn·X·Thr/Ser an den Resten 79–81 hat.
Die notwendigen Gift-RNAs und alle experimentellen Verfahren bei den vorstehenden Untersuchungen sind die gleichen wie die in unserer früheren Arbeit über Antigen 5 und Phospholipase aus Wespen bzw. Hornissen (siehe Beispiel 1, vorstehend, und Fang et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:895–899; Lu et al., 1993, J. Immunol. 150:2823–30; Soldatova et al., 1993, FEBS Lettr. 320:145–149).
Die Ähnlichkeit der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Hyaluronidase aus Wespen- bzw. Hornissengift zu der Aminosäuresequenz anderer Proteine wurde ausgewertet. Die Sequenzsuche wurde am National Center for Biotechnology Information unter Verwendung des BLAST-Netzwerkservice durchgeführt (Altschul et al., 1990, J. Mol.
Biol. 215:403–410). Die Suche deckte auf, dass die Hyaluronidase aus Wespen- bzw. Hornissengift (SEQ ID NO:57) 54% Sequenzidentität mit der Hyaluronidase aus Honigbienengift hat, die 351 Reste enthält (SEQ ID NO:56) (Omachl und Kreil, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90–3569–73). Beide Gift-Hyaluronidasen zeigen eine signifikante Sequenzhomologie mit einem Membranprotein von Meerschweinchensperma (SEQ ID NO:58) (Lathrop et al., 1990, J. Cell Biol. 111:2939–49). Diese Sequenzvergleiche werden in 7 gezeigt. Es gibt 25% Sequenzidentität der Proteine aus Wespen bzw. Hornissen und Meerschweinchen. Hybridisierungsuntersuchungen mit genomischen Banken zeigten, dass dieses Membranprotein, als PH-20 bekannt, in Säugern, einschließlich Menschen, weit verbreitet ist. Man glaubt, dass PH-20 bei der Sperma-Ei-Adhäsion eine Rolle spielt.
BEISPIEL 2: ANTIGENE KREUZREAKTIVITÄT DER HYALURONIDASEN AUS WESPEN- BZW. HORNISSENGIFT UND HONIGBIENENGIFT
Mäuse des Stammes BALB/c wurden alle zwei Wochen auf dem intraperitonealen Weg in Anwesenheit von Alaun als Adjuvans mit nativen Hyaluronidasen aus Wespen bzw. Hornissengift oder Bienengift immunisiert. Gruppen von vier Mäusen wurden in den Wochen 0, 2, 4 und 6 mit 0,2 ml 10 mg/ml Hyaluronidase und 5 mg/ml Alaun in 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6,2, immunisiert.
Milzen von immunisierten Mäusen wurden für Lymphozytenproliferationsassays erhalten. Der Proliferationsassay in der Woche 3, nach zwei Immunisierungen, zeigte, dass Milzzellen aus Mäusen, die mit Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase immunisiert waren, gleich gut auf eine Stimulierung mit Wespen- bzw. Hornissenprotein oder Bienenprotein reagierten, und dass Milzzellen aus mit Bienenprotein immunisierten Mäusen stark auf eine Stimulierung mit Bienenprotein, aber schwach auf eine Stimulierung mit Wespen- bzw. Hornissenprotein reagierten (8A und B). Sehr ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Hyaluronidase aus V. vulgaris oder P. annularis anstelle von Protein aus Dolichovespula maculata als das stimulierende Allergen in diesen Assays verwendet wurde. Diese Befunde legen eine antigene Kreuzreaktion der T-Zell-Epitope von Hyaluronidasen aus Bienen und Vespiden nahe.
Die Langzeitreaktionen auf eine Immunisierung wurden auch untersucht. In der Woche 9 demonstrierten Milzzellen aus Mäusen, die mit Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase immunisiert waren, eine veränderte Reaktion in vitro mit einem signifikant höheren Proliferationsgrad als Reaktion auf Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase verglichen mit Bienen-Hyaluronidase. Anscheinend stieg das Ausmaß der Milzzellreaktion gegen Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase von Woche 3 bis Woche 9 an, während das Ausmaß der Reaktion auf Bienen-Hyaluronidase etwa gleich blieb (9A).
Milzzellen aus Mäusen, die mit Bienen-Hyaluronidase immunisiert wurden, proliferierten in vitro weiter, wenn sie mit Bienen-Hyaluronidase stimuliert wurden, reagierten aber schwach, wenn sie mit Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase stimuliert wurden (9B).
Die Antikörperreaktionen der Mäuse wurden auch ausgewertet. In den Wochen 0, 5, 7 und 9 wurden Seren erhalten und durch ELISA in mit Bienen-Hyaluronidase oder Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase beschichteten Mikrotitervertiefungen auf Antikörper analysiert. Die Ergebnisse des ELISA werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Seren, die in den Wochen 7 und 9 gesammelt wurden, zeigten, dass für Wespenbzw. Hornissengift-Hyaluronidase spezifische Antikörper stark mit ihr selbst und schwach mit der Bienengift-Hyaluronidase reagierten. Für Bienengift-Hyaluronidase spezifische Antikörper reagierten nur mit dem Immunogen.
Eine Kenntnis der antigenen Kreuzreaktivität dieser beiden Gift-Proteine ist von klinischem Interesse, da bekannt ist, dass es eine Assoziation von Vespiden- und Bienen-Empfindlichkeit bei Patienten gibt.
BEISPIEL 3: EXPRESSION EINER FUNKTIONELLEN WESPEN- BZW. HORNISSENGIFT-HYALURONIDASE
Klon 12 im Vektor pCR von Tabelle 3 enthält das cDNA-Insert, das die Reste 1331 der Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase kodiert. Das cDNA-Insert wird durch BamH I und Bgl II Restriktionsstellen an seinen 5'- bzw. 3'-Enden flankiert. Das Insert wurde durch BamH I- und Bgl II-Verdau aus dem Vektor ausgeschnitten und in geschnittenes Plasmid pQE12 mit komplementären kohäsiven Stellen eingefügt (QIAGEN, Chatsworth, CA). Eine Mutation an der Nucleotidposition 199 in Klon 12 (A→T), die zur Einführung von Phenylalanin für Isoleucin führte (siehe Anmerkung zu Tabelle 3), eliminierte zufälligerweise eine Bgl II -Stelle im kodierenden Bereich der Hyaluronidase.
Das rekombinante Plasmid pQE12 wurde verwendet, um kompetente M15 (pREP)-Bakterien zu transformieren. Bei der Induktion der transformierten Bakterien mit Isopropylthiogalactosid wurden zwei rekombinante Proteine von etwa 43 und 26 kD exprimiert. Beide Proteine reagierten, laut Western-Blot, mit Antikörpern, die für Wespenbzw. Hornissen-Hyaluronidase spezifisch waren. Antikörper, die im Western-Blot verwendet wurden, wurden vom Bluten der Balb/c-Mäuse in Woche 9, wie vorstehend in Beispiel 2 beschrieben, erhalten.
Das Plasmid pQE12 ist so gestaltet, dass das rekombinante Protein die Sequenz MRGS-Insert-SRH₆ hat. Die Anwesenheit der Hexahistidinsequenz in dem rekombinanten Protein ermöglicht dessen Reinigung von anderen bakteriellen Proteinen durch Metallionenchelatbildungschromatographie, gefolgt von Reverse-Phase-Chromatographie.
Das gereinigte rekombinante Protein war frei von Hyaluronidase-Aktivität. Eine Neufaltung des rekombinanten Proteins in 5 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA und 2 M Guanidinhydrochlorid in 0,05 M Tris-HCl-Puffer von pH 7,4 ergab ein Produkt mit etwa 50% der spezifischen Aktivität nativer Hyaluronidase. Die Menge gereinigter rekombinanter Hyaluronidase wurde durch UV-Absorption berechnet. Da die gereinigte Probe sowohl das 23 kD große als auch das 46 kD große Protein enthielt, kann die tatsächliche enzymatische Aktivität des funktionellen rekombinanten Enzyms mehr als 50% von der nativer Hyaluronidase betragen.
Die vorstehenden Experimente unterstützen die These nachhaltig, dass es sich bei dem 43 kD großen rekombinanten Protein um die Wespen- bzw. Hornissen-Hyaluronidase handelt. Das 26 kD große rekombinante Protein kann auf Grund der Initiation der Translation 3' von der gewünschten Stelle entstehen. Derartige interne Zustände können entstehen, wo es eine Konsensussequenz für Ribosomenbindung (Shine-Dalgarno Sequenz) 5' von einem internen ATG- oder GUG-Codon gibt.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Ein Bakterienstamm INFαF', der ein rekombinantes Plasmid pCR enthält, das eine Nucleinsäure hat, die Phospholipase von Dolichovespula maculata kodiert, mit WFH-PLA bezeichnet, ist am 11. März 1993 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt worden und ihm ist die ATCC-Hinterlegungsnummer 69254 zugeteilt worden.
Die vorliegende Erfindung soll durch die hinterlegten Mikroorganismen oder die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen nicht im Umfang beschränkt werden, da derartige Ausführungsformen nur als einzelne Veranschaulichungen einer Ausführungsform der Erfindung beabsichtigt sind und alle Mikroorganismen, die funktionell äquivalent sind, befinden sich innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den gezeigten und hierin beschriebenen, Fachleuten von der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Bildern her offensichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass derartige Modifikationen in den Umfang der angehängten Ansprüche fallen.
Es soll auch selbstverständlich sein, dass alle für Nucleotide angegebenen Basenpaargrößen ungefähr sind und zum Zweck der Beschreibung verwendet werden.
Verschiedene Referenzen werden hierin angeführt, deren Offenbarungen hierin in Gänze durch Referenz aufgenommen werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die eine Vespidengift-Hyaluronidase oder ein Derivat davon kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die isolierte Nucleinsäure unter Bedingungen hoher Stringenz mit einer Nucleinsäure hybridisiert, die ein Polypeptid kodiert, das die in SEQ ID NO:55 oder SEQ ID NO:57 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Vespidengift-Hyaluronidase aus einer Vespide der Gattung Dolichovespula stammt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 2, wobei die Vespidengift-Hyaluronidase aus der Art maculata stammt und die in SEQ ID NO:55 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 3, welche die in SEQ ID NO:54 gezeigte kodierende Nucleotidsequenz aufweist.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Vespidengift-Hyaluronidase aus der Gattung Vespula stammt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 5, wobei die Vespidengift-Hyaluronidase aus der Art vulgaris stammt.
Isolierte Nucleinsäure nach Anspruch 1, die unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisierbar ist, welche die in SEQ ID NO:54 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
Isolierte Nucleinsäure, die eine Vespidengift-Hyaluronidase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53; b) einer Nucleinsäure, die unter Verwendung komplementärer Paare der vorangegangenen Fragmente als Primer in einer Nucleotidsynthese durch Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wird; c) einer Nucleinsäure, die SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52 kodiert; und d) einer Nucleinsäure, die ein 26 Kilodalton großes C-terminales Fragment einer Vespidengift-Hyaluronidase aus der Art Dolichovespula maculata kodiert.
Isolierte Nucleinsäure von einer Vespidengift-Hyaluronidase, die unter hoch stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure hybridisierbar ist, die eine der in Anspruch 8 aufgezählten Nucleotidsequenzen aufweist.
Polypeptid, das durch die Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert wird, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Vespidengift-Enzym-Fusionsprotein handelt, das ein immunmodulatorisches Polypeptid eines Vespidengift-Hyaluronidase-Enzyms und einen funktionell wirksamen Anteil eines Proteins umfasst, das kein Vespidengift-Enzym ist.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei dem funktionell wirksamen Anteil eines Proteins, das kein Vespidengift-Enzym ist, um eine Polyhistidin-Sequenz handelt.
Polypeptid gemäß Anspruch 10, wobei die Vespidengift-Hyaluronidase eine wie in SEQ ID NO:57 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Polypeptid gemäß Anspruch 12 mit einer Modifikation, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Asparaginsäure für ein Asparagin an Rest Nummer 31 in SEQ ID NO:57 und einem Phenylalanin für ein Isoleucin an Rest Nummer 47 in SEQ ID NO:57.
Expressionsvektor, umfassend die Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, funktionell mit einem Promotor verbunden.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, das durch die Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 kodiert wird, umfassend: a) Kultivieren einer Zelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 14 transformiert ist, so dass ein Polypeptid von der Zelle exprimiert wird, das durch die Nucleinsäure kodiert wird; und b) Gewinnen des so exprimierten Polypeptids aus der Kultur.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei es sich bei der Zelle um eine Bakterien- oder eine Hefezelle handelt.
Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 10 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger zur Behandlung eines für ein Vespidengift-Allergen spezifischen Leidens.
Verfahren zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Erhalten eines Polypeptids unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 15 und das Mischen des Peptids mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 10 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 17 für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines für ein Vespidengift-Allergen spezifischen allergischen Leidens.
Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes Vespidengift-Enzym, ausgewählt aus einem Polypeptid, das durch eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1–9 kodiert wird, oder dem Fusionspolypeptid nach Anspruch 10, Zellen, die einen rekombinanten Vektor enthalten, umfassend eine Nucleinsäure, die das Vespidengift-Enzym kodiert, und ein Zellmedium.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 13 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.